MANUAL

MANUALDE
DEPROCEDIMIENTOS
PROCEDIMIENTOS
PARA
PARALA
LACONSERVACIN
CONSERVACIN IN
INVITRO
VITRO DEL
DEL
GERMOPLASMA
GERMOPLASMADEL
DELGNERO
GNERO Manihot
Manihot

Graciela
GracielaMafla
MaflaB.
B.
Julio
JulioCesar
CesarRoa
RoaE.
E.
Ericson
EricsonAranzales
AranzalesR.
R.
D.G.
D.G.Debouck
Debouck

TABLA DE CONTENIDO

1. INTRODUCCION
2. INSTALACIONES
2.1 rea de Lavado
2.2 rea de Neveras y Autoclave
2.3 rea de Preparacin de Medios
2.4 rea de subcultivo
2.5 Cuarto de Crecimiento
2.6 Cuarto de Conservacin
3. DESCRIPCION DE ACTIVIDADES
3.1 Introduccin de Germoplasma
3.2 Cuarentena
3.3 Eliminacin de Patgenos
3.3.1. Procedimiento a partir de estacas
3.3.2. Procedimiento a partir de plantas in vitro
3.4 Micropropagacin
3.5 Indizacin
3.6 Conservacin in vitro
3.6.1. Labores de introduccin
3.6.2 Labores de mantenimiento y renovacin
3.7 Caracterizacin
3.8 Distribucin
3.9 Duplicados de Seguridad
4. CONTROL DE CALIDAD
5. ANEXOS
6. BIBLIOGRAFIA

Pgina
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39
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50

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA LA CONSERVACIN

GERMOPLASMA DEL GNERO Manihot

IN VITRO

DEL

Graciela Mafla B.
Julio Cesar Roa E.
Ericson Aranzales R.
D.G. Debouck
INTRODUCCIN
La Unidad de Recursos Genticos (URG) del Centro Internacional de Agricultura Tropical
(CIAT) conserva y distribuye germoplasma in vitro del gnero Manihot. Regulaciones
cuarentenarias para Manihot han sido aplicadas desde 1980 cuando se estipul que solamente
plantas in vitro podran ser utilizadas para el intercambio a travs de todo el mundo, y guas
tcnicas para el movimiento seguro de germoplasma fueron desarrolladas (Frison & Feliu, 1991).
Las tcnicas in vitro han sido utilizadas con un doble propsito: 1) para introducir al CIAT un
gran nmero de materiales colectadas en los principales centros de variabilidad y conservarlas in
vitro, y 2) para distribuir germoplasma seleccionado desde el CIAT a los programas nacionales y
dems usuarios. Esta coleccin se encuentra actualmente representada por 6,624 materiales y est
constituida por tres categoras: 5,212 materiales de yuca cultivada (Manihot esculenta)
procedentes de 25 pases, 883 materiales de las especies silvestres del gnero Manihot (33
especies) y 529 materiales hbridos. Desde 1994 estos materiales han sido designados a FAO
(Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacin) dentro del marco
del acuerdo FAO-CGIAR y en Octubre de 2006 un total de 6,596 han sido registrados en el
Sistema Multilateral de Acceso y Distribucin de Beneficios del Tratado Internacional sobre
Recursos Filogenticos para la Alimentacin y la Agricultura dentro del marco del acuerdo entre
el Organo Rector del Tratado y el CIAT, y cumple con los estndares para bancos de
germoplasma. Desde 1979 cuando el CIAT acept el mandato mundial para el cultivo, se ha
distribuido hasta el ao 2007 un total de 30,847 muestras (5,865 materiales) a 66 pases a travs
de las tcnicas in vitro.
Las diferentes etapas definidas en el Diagrama de Flujo para el Manejo del Germoplasma de
Manihot son: a) Introduccin, b) Cuarentena, c) Eliminacin de patgenos, d) Indizacin, e)
Micropropagacin, f) Conservacin, g) Caracterizacin, h) Distribucin, y i) Duplicados de
seguridad. Estos procedimientos han sido desarrollados para el mejor manejo de la coleccin in
vitro teniendo como objetivo principal la utilizacin de ste germoplasma de parte de los
diferentes usuarios que la solicitan (Figura 1).
Un total de cinco medios de cultivo han sido desarrollados para los diferentes propsitos
implicados en el manejo de la coleccin: 1) medio de cultivo para el desarrollo de meristemos y
propagacin de nudos (4E) (Roca et al., 1991), 2) medio de cultivo para el desarrollo de raices y
mejor desarrollo de las plantas que van a ser llevadas a condiciones de invernadero (17N) (CIAT,
1982), 3) medio de cultivo para la conservacin (8S) (CIAT, 1984), 4) medio de cultivo para el
crecimiento mnimo (NP) (Mafla et al., 2000), y 5) medio de cultivo para las especies silvestres
(12A3) (Velsquez & Mafla, 1999) (Ver Anexos).
La coleccin es manejada por un grupo de trabajo constituido por dos profesionales y cinco
tcnicos quienes se encargan de todas las labores que se explican a continuacin en ste manual.

DIAGRAMA
DIAGRAMA DE
DE FLUJO
FLUJO PARA
PARA EL
EL MANEJO
MANEJO DEL
DEL
Manihot
GERMOPLASMA
DE
Manihot
GERMOPLASMA DE Manihot
AGRICULTORES

CARACTERIZACIN

DUPLICADO DE
SEGURIDAD

INTRODUCCIN

SEMILLAS

IN VITRO

ESTACAS

DISTRIBUCIN
CUARENTENA

ELIMINACIN
DE PATGENOS
CAMPO

CRIOCONSERVACIN

IN VITRO

TERMOTERAPIA

MERISTEMO

INDIZACIN DE
CLONES
POSITIVO

POSITIVO

ELISA

INJERTO

NEGATIVO

MICROPROPAGACIN

CCMV, CsXV, ACMV

FSD

Figura 1. Diagrama de flujo de actividades para el manejo del germoplasma de Manihot.

2. INSTALACIONES
El cultivo de tejidos, como tcnica consiste esencialmente en aislar una porcin de la planta
(explante), proporcionndole artificialmente las condiciones fsicas y qumicas apropiadas para
que las clulas expresen su potencial intrnseco o inducido. Es necesario adems adoptar
procedimientos de asepsia para mantener los cultivos libres de contaminacin.
Basados en este concepto, el diseo del laboratorio de cultivo de tejidos, puede presentar
variaciones en magnitud y complejidad, dependiendo de los objetivos del laboratorio. Teniendo
en cuenta esto a continuacin se presenta una descripcin del laboratorio de cultivo de tejidos de
la Unidad de Recursos Genticos (URG) presentando las reas, equipos y otros suministros
requeridos para el adecuado desarrollo de las actividades adscritas al mantenimiento in vitro de la
coleccin de Manihot.
Para el laboratorio de conservacin in vitro de la URG se han establecido reas separadas para
las diferentes actividades que se desarrollan en el mismo. A continuacin se presentan las reas o
secciones (Figura 2) con sus respectivos equipos (Tabla 1).

AREA DE LABORATORIO CULTIVO DE TEJIDO (AREA TOTAL: 146.88 m2)

AREA DE NEVERAS
Y AUTOCLAVE
CUARTO DE
CRECIMIENTO

PASILLO
ENTRADA

LAVADO

P
A
S
I
L
L
O

AREA DE
PREPARACIN
DE MEDIOS
CUARTO DE
CONSERVACION

AREA DE
TRANSFERENCIA

CUARTO DE CRECIMIENTO Y CONSERVACION :

AREA DE PREPARACION DE MEDIOS:
AREA DE SUBCULTIVO:
AREA DE LAVADO:

64.92 m 2
19.66 m 2
12.96 m 2
m2

PATIO DE NEVERAS Y AUTOCLAVE:

24.00 m 2

PASILLOS:

13.04 m 2

Figura 2. Diferentes reas del laboratorio de cultivo de tejidos de la Unidad de Recursos

Genticos del CIAT.

Tabla 1. Equipos requeridos en cada una de las reas del laboratorio.

AREA
Lavado

EQUIPOS
Autoclave pequea (1)
Horno de secado (1)
Vitrinas (2)

Neveras y autoclave

Neveras (5)
Autoclave (1)
Destilador (1)
Incubadora (1)
Preparacin de medios de Dispensador (1)
cultivo
Planchas elctricas con agitadores
magnticos (2)
pHmetro (1)
Balanza analtica (1)

Pasillo
Subcultivo

Cuarto de crecimiento
Cuarto de conservacin.

Computador
Extinguidor (1)
Cortina de aire
Cmaras de flujo laminar (6)
Deshumificador (1)
Unidad de aire acondicionado
Filtro electrosttico
Estantera (16)
Higrotermografo (1)
Estantera (41)
Deshumificador (1)
Higrotermografo (1)
Extintor, censor de humo y
temperatura (1)
Controlador fotoperodo (1)

USO
Esterilizar herramientas
Secado de vidrieria
Almacenar vidriera
Almacenar medios de cultivo
Esterilizar medios de cultivo
Proporcionar agua bidestilada-medios
Investigacin
Llenado de tubos con el medio
Calentar y agitar medios (agar)
Ajustar pH del medio de cultivo
Pesar diferentes componentes del
medio
Labores de gestin base de datos
Elemento de seguridad
Elemento de asepsia
Proceso de subcultivo
Controlar humedad relativa
Refrigerar
Mejorar calidad de aire
Ubicar material vegetal
Registrar temperatura y humedad
Ubicar material vegetal
Controlar humedad relativa
Registrar temperatura y humedad
Elementos de seguridad

Regular encendido y apagado de

luces
Unidad de aire acondicionado (1) Refrigerar
Ubicar material como duplicado de
Cuarto de duplicado de Estantenteria ( )
seguridad.
seguridad
Deshumificador (1)
Controlar humedad relativa
Higrotermografo (1)
Extintor, censor de humo y Registrar temperatura y humedad
Elemento de seguridad
temperatura (1)
Unidad de aire acondicionado (1)
Refrigerar

2.1 rea de Lavado

Todo el proceso de lavado y almacenamiento de material de vidrio, material estril y diferentes
tipos de aguas (ionizada, destilada, bidestilada y bidestilada estril) necesarios en las actividades
cotidianas del laboratorio se realizan en este sitio.

Esta rea cuenta con un lavadero grande con tres fuentes de agua: fra, caliente y agua doblemente
bidestilada usada para el enjuague final en el lavado de material de vidrio (Figura 3).
As mismo se dispone en esta rea de estantera para el almacenamiento del material de vidrio y
agua estril bidestilada que va a ser utilizada en los procesos de desinfeccin.

Figura 3. Actividad desarrollada en el rea de lavado.

2.2. rea de Neveras y Autoclave

En esta rea se encuentran localizadas las neveras donde se almacenan los reactivos, soluciones
stock y los diferentes medios de cultivos utilizados en el laboratorio. La autoclave empleada para
la esterilizacin de los medios de cultivo se encuentra ubicada tambin en sta rea e igualmente
el destilador de agua y una cmara de incubacin utilizada con fines de investigacin (Figura 4).

Figura 4. Area de neveras y autoclave. Las neveras son utilizadas para el almacenamiento
de los medios de cultivo.

2.3. rea de Preparacin de Medios

Como su nombre lo indica en esta rea se realiza la preparacin de medios de cultivo, pero
tambin provee un espacio para el almacenamiento de material de vidrio y de plstico, reactivos
qumicos y agua bidestilada. Esta rea cuenta con mesas de trabajo para la preparacin de medios,
balanza analtica, pHmetro, agitadores magnticos, dispensadores de medios entre otros (Figura
5). Tambin se encuentra ubicado en esta rea un computador que sirve para toda la gestin del
banco de germoplasma.

Figura 5. rea de preparacin de medios en donde se puede observar las diferentes soluciones y
equipos utilizados para ste propsito.
2.4. rea de Subcultivo
En esta rea se realiza el trabajo de escisin, inoculacin y transferencia de los explantes a los
medios de cultivo. Un alto nivel de asepsia debe ser mantenido en sta rea, por lo tanto se cuenta
con un filtro electrosttico que se encuentra ubicado en el techo a la salida del aire acondicionado
(Figura 6).

Los filtros electrostticos crean su propia carga de electricidad al unirse una malla de nylon con
la malla de aluminio formando un campo magntico, segn el principio de la electrosttica y esto
hace que el polvo sea retenido con ms eficiencia.

El uso de este filtro no incrementa costos, ya que no necesita de electricidad para hacer su funcin
electrosttica, y al hacer esto se favorece el nivel de asepsia, mantiene el rea y los equipos
limpios de cualquier impureza.

Las operaciones de inoculacin en medios de cultivo son realizadas en cmara de flujo laminar
con la presencia de un mechero de alcohol industrial (alcohol metilito) y las herramientas
estriles necesaria para esta actividad. Un total de seis cmaras de flujo laminar se encuentran
ubicadas en sta rea (Figura 7).
Se disponen tambin de carros transportadores para la ubicacin de los medios de cultivo,
material vegetal, dispensadores de alcohol al 70% y otros implementos requeridos en las
actividades del subcultivo. As mismo se dispone de recipientes para el material vegetal, el
material inorgnico y de vidrio que se descarta.

Figura 6. Filtro electroesttico ubicado en el rea de transferencia.

Figura 7. rea de subcultivo en donde se encuentran ubicadas las cmaras de flujo laminar.

2.5. Cuarto de Crecimiento

Las condiciones de incubacin o crecimiento de material in vitro de yuca son:
Temperatura
: 26-280 C
Iluminacin
: 18.5 mol.m-2.s-1
Fotoperodo
: 12 horas
Calidad de luz
: Lmparas fluorescentes, tipo luz da
Humedad relativa : 50-70%
El cuarto cuenta con un total de 16 estanteras metlicas pintadas de blanco, cada estantera est
constituida por 5 pisos y cada piso permite la ubicacin de ocho gradillas y cada gradilla est
ocupada por 6 materiales (5 tubos/material) lo que da una capacidad para 3,840 materiales.
Cada piso de la estantera contiene una plataforma con perforaciones para facilitar una mejor
aireacin y la dimensin es de 124 cm x 39 cm, la altura entre cada piso es de una 39 cm
permitiendo una buena iluminacin, cada piso est provisto de una lmpara fluorescente luz da
(balastos son instalados en la parte externa del laboratorio. El espacio entre el suelo y el primer
piso debe ser entre 10 y 20 cm para facilitar las labores de limpieza (Figura 8). La regulacin de
la temperatura se realiza a travs de un sistema de refrigeracin el cual esta conectado a censores
de temperatura que permiten detectar alteraciones de la misma. En esta rea se encuentran
tambin ubicados censores de humo (Figura 9). La humedad relativa es controlada con el uso de
un deshumificador (Figura 10).

10

Figura 8. Estantes utilizados en el cuarto de crecimiento.

Figura 9. Sistemas de seguridad para censar presencia de humo y aumento de temperatura en los
cuartos de crecimiento y conservacin.

11

Figura 10. Deshumificador utilizado para el control de humedad relativa en los cuartos de
crecimiento y conservacin.
2.6. Cuarto de conservacin
Las condiciones fsicas para la conservacin in vitro de germoplasma de yuca estn dadas por las
siguientes condiciones:
Temperatura
: 23-240 C
Iluminacin
: 18.5 mol.m-2.s-1
Fotoperodo
: 12 horas
Calidad de luz
: Lmparas fluorescentes, tipo luz da
Humedad relativa : 50-70%
Este cuarto cuenta con un total de 41 estanteras metlicas, cada estantera est constituida por 5
pisos y cada piso permite la ubicacin de ocho gradillas y cada gradilla est ocupada por 6
materiales (5 tubos/material) lo que da un potencial de conservacin para 9,840 materiales
(Figura 11). En el cuarto de conservacin se emplean sistemas de control de parmetros fsicos
similares a los empleados en el cuarto de crecimiento. En esta misma zona se cuenta con un
espacio para la evaluacin y observacin peridica de los cultivos, para lo cual se emplean
lmparas, lupas y esteromicroscopio entre otros.
La evaluacin se realiza in situ para limitar los movimientos de los materiales mantenidos en el
banco y disminuir los diferentes riesgos que puedan afectarlos.
Las unidades de refrigeracin usados para la regulacin de las condiciones de temperatura
requeridas en los cuartos de crecimiento y conservacin estn dados por un sistema interno e
independiente que permite minimizar los riesgos de contaminacin.

12

Figura 11. Cuarto de conservacin y gradillas conteniendo materiales in vitro de yuca.

3. DESCRIPCIN DE ACTIVIDADES

3.1 Introduccin de Germoplasma

La introduccin de los materiales para el inicio del proceso de conservacin generalmente se hace
en tres formas:
1. A partir de material vegetativo (estacas): proveniente de centros experimentales o colectas
realizadas en el pas anfitrin.
2. En forma in vitro: provenientes de los pases donantes.
3. En forma de semilla botnica y posterior rescate de embriones especficamente para las
especies silvestres.
Cualquiera que sea la forma de introduccin se asigna un nmero nico al material, conservando
siempre los datos originales de los materiales los cuales quedan consignados en la base de datos
como sinnimos. En el caso de: a) Manihot esculenta se identifica con las tres primeras letras del
pas de procedencia y posteriormente un nmero consecutivo de acuerdo al orden de entrada (Eje:
ARG 2, material procedente de Argentina), b) materiales de especies silvestres se identifican con
las iniciales de cada una de las especies seguido por el nmero de poblacin y posteriormente el
nmero de genotipo (Eje: PER 411- 1, pertenece a la especie Manihot peruviana, poblacin 411
y genotipo nmero 1), y c) materiales procedentes de mejoramiento van identificados con dos
letras que indican el tipo de cruzamiento (CG, CM, SG, SM), luego el nmero de cruzamiento y
posteriormente el genotipo seleccionado (Ej: CG 1141- 1). A continuacin se hace un registro de
informacin bsica que permite una documentacin eficiente de la misma, conocida esta como
datos de pasaporte. Esta informacin es almacenada en la base datos de la Unidad de Recursos
Genticos (ORACLE V.7.0). Para cada introduccin quedan registrados los datos caractersticos
de las muestras. Estos describen el origen, caractersticas geogrficas de las variedades segn los
descriptores desarrollados para un mejor manejo de la informacin (Gulick et al. 1983).

13

Los datos bsicos proporcionan informacin general de latitud, longitud y altitud que nos permite
conocer el sitio donde fue colectada la muestra, nombre del colector del germoplasma e
informacin de la institucin que hace la donacin (Figura 12). Los datos de pasaporte se
encuentran disponibles on line (www.ciat.cgiar.org/urg, www.singer.cgiar.org).

14

Figura 12. Informacin de pasaporte registrada en la base de datos.

FUENTE DE COLECCIN:
Hbitat silvestre
Campo agrcola
Almacn de agricultor
Jardn hortcola
Bordes campo
No conocida

Mercado rural
Mercado comercial
Institutos
Plantacin
No aplica
Otros (especificar)

TIPO DE SITIO
Plano
Pendiente
Cima
Depresin
Pendiente moderada
Pendiente empinada
Otro

HABITAT
Bosque lluvioso
Bosque hmedo
Bosque semi-hmedo
Bosque seco
Bosque muy seco
Bosque espinoso
Matorral desrtico
Desierto
Otro

HBITO
rbol
Arbusto
Enredadero
Postrado
Erecto
Semirrecto
Postrado Estolonifero
Enredadero Estolonifero
Otro

TEXTURA DE
SUELO
Arenosa
Intermedia
Arcillosa
Pedregosa
Orgnico
Franco arenoso
Franco arcilloso
Franco, Otra.

DRENAJE DE
SUELO
Excesivo
Bueno
Moderado
Pobre
Pantanoso
Otro

TOPOGRAFA
Serrana
Plana
Ondulada
Pie de monte
Montaa
Colinas
Pantanoso
Vega
Otros

15

La introduccin de materiales a partir de 1) material vegetativo (estacas), y 2) a partir de

material in vitro se explica en el punto 3.3 de ste manual. A continuacin explicamos
el procedimiento cuando la introduccin es a partir de semilla botnica.
Protocolo para el rescate de embriones de semillas de especies silvestres de Manihot
El cultivo in vitro de embriones cigticos ha sido utilizado para la introduccin de las especies
silvestres del gnero Manihot. El cultivo de embriones provee una tcnica simple para el
rompimiento de la dormancia de la semilla asegurando una tasa de germinacin bastante
uniforme (Biggs et al., 1986).
Esta tcnica comprende la escisin asptica del embrin de la semilla y la siembra en un medio
de cultivo estril (Hoded, 1977), proporcionando potenciales alternativas en la investigacin de
plantas. Su uso es frecuente para salvar embriones que no alcanzan a desarrollarse naturalmente
en semillas y frutos, embriones procedentes de semillas de cruces interespecificos donde los
endospermos defectuosos son comunes y en la reduccin de los largos perodos de dormancia y
en la eliminacin de las barreras fsicas y qumicas presentes en frutos y semillas.
Desinfeccin de semillas:
Las semillas son superficialmente desinfectadas siguiendo el protocolo descrito a continuacin:
4. Lavado con alcohol 70% durante 1 minuto, seguido de
5. Benlate 0.5 g/l por 15 minutos,
6. Hipoclorito de sodio al 2.5% por 15 minutos, finalmente se realiza tres enjuagues con agua
destilada estril, en cmara de flujo laminar.
Una vez se ha llevado a cabo el protocolo de desinfeccin las semillas son dejadas en una
solucin estril de 200 p.p.m de cido giberlico (GA3) durante 12 horas a temperatura
ambiente.
Posteriormente la solucin es retirada y se procede a realizar el rescate de embriones, para lo
cual las semillas son quebradas transversalmente empleando pinzas, identificado el embrin
este es removido empleando un bistur y plantado en el medio de cultivo (17N) (Figura12).
Los tubos son rotulados, sellados e incubados a 27C en oscuridad durante 7 das,
posteriormente son transferidos a condiciones normales de crecimiento (Temperatura 26-28 C,
iluminacin 18.5 mol.m-2.s-1 y fotoperodo de 12 horas).
Transcurridos 15 das se espera la diferenciacin morfolgica del embrin en planta normal
se procede posteriormente a iniciar la etapa de micropropagacin y conservacin de las mismas
utilizando los medios de cultivo desarrollados para tal fin.

16

EMBRIN

Figura 12. Proceso de excisin y siembra en el medio de cultivo desarrolado para embriones
cigticos.
3.2. Cuarentena
Para el caso de la yuca la reproduccin algama y su constitucin gentica altamente
heterocigtica constituyen la principal razn para propagarla por estacas y no por semilla sexual
(Ceballos y De la Cruz, 2002). Sin embargo la distribucin de materiales a travs de estacas
puede dar lugar a la distribucin de plagas, enfermedades bacterianas y sobretodo de
enfermedades virales (Tabla 2).
El intercambio de material puede conllevar a problemas serios para la agricultura de un pas, ya
que muchos de los patgenos que afectan los cultivos se diseminan a travs de rganos como
semillas, tubrculo entre otros y estos son el medio de introducir razas diferentes a las reas de
produccin ( Huertas, 1992).

Tabla 2. Lista de diferentes plagas y enfermedades de la yuca (Frison, E.A. & Feliu, E. 1991)
AGENTE CAUSAL

PLAGAS

Gusano cachn (Erynnis ello)

caro verde-manchado (Tetranychus urticae)
caro verde (Mononychellus tanajoa)
caro rojo (Tetranychus cinnabarinus)
caro plano (Olygonichus peruvianus)
Mosca blanca (Aleurotrachelus socialis)
Piojos harinosos (Phenacoccus herreni, P. granadensis y P. manihoti)
Trips (Frankliniella williams y Scirtothrips manihoti)
Chinche subterrnea de la viruela (Cyrtomensus bergi)
Chinche del encaje (Vatiga manihotae y V. illudens)
Barrenadores del tallo (Chilomina clarkei, Lagochirus araneiformis y
Coelosternus spp.)
Chisas (Phyllophaga spp. y Leucopholis rorida)

17

ENFERMEDADES

ENFERMEDADES
VIRALES

Superalargamiento (Sphaceloma manihoticola)

Mancha parda de la hoja (Cercosporidium henningsii)
Mancha anillos circulares de la hoja (Phoma spp.)
Mancha angular de la hoja (Xanthomonas campestre pv. cassavae)
Antracnosis de la yuca (Glomerella manihotis)
Ceniza de la yuca (Oidium manihotis)
Roya de la yuca (Uromyces spp.)
Aublo pardo fungoso (Cercospora vicosae)
Aublo bacteriano (Xanthomonas axonopodis pv. manihotis)
Necrosamiento del tallo (Glomerella cingulata)
Pudricin seca de tallo y raz (Diplodia manihotis)
Pudricin bacteriana del tallo (Erwinia carotovora p.v carotovora)
Pudricin radical (Phytophthora sp. , Rosellinia spp. y Pythium spp.)

Mosaico comn de la yuca, CCMV (Potexvirus)

Cuero de sapo, FSD (fitoplasma, virus)
Virus X de la yuca (CsXV)

La mayora de los pases han establecido regulaciones cuarentenarias y toma de medidas

especiales para que plagas y enfermedades no entren a su territorio nacional. En Colombia a
travs del Instituto Colombiano Agropecuario (ICA) se regulan las normas para la importacin
y exportacin del material vegetal.
De comn acuerdo entre ICA y el CIAT se han diseado los procedimientos que permitan
manejar el germoplasma que es introducido a la coleccin in vitro de Manihot:

Revisin de la documentacin con la cual debe llegar el germoplasma:

1. Permiso de importacin expedido por el Instituto Colombiano Agropecuario (ICA)
2. Certificado Fitosanitario expedido por la entidad oficial fitosanitaria del pas
donante.
3. Lista de variedades enviadas.

Inspeccin de las plantas para determinar si existe algn problema fitosanitario ( hongos y
bacterias). Si hay presencia de estos patgenos los materiales deben ser autoclavados para
su eliminacin. Ningn material puede ser distribuido hasta no completar todo el proceso de
eliminacin de patgenos e indizacin.

La actividad de cuarentena cuenta tambin con un sistema de documentacin que nos permite
un mejor manejo de la informacin de parte del ICA-CIAT (Figura 13). En el sistema se
registra toda la informacin relacionada con la introduccin de los materiales.

18

Figura 13. Registro de informacin de cuarentena en la base de datos de la URG.

3.3. Eliminacin de Patgenos
Las enfermedades causadas por virus afectan significativamente el rendimiento y la calidad de
la yuca en las principales regiones cultivadoras de esta raz en el mundo. En Africa, el virus ms
importante es el que causa la enfermedad del mosaico africano de la yuca (ACMD), responsable
de prdidas de rendimiento hasta del 90% (Bock 1976). En Amrica Latina existen diversos
virus y organismos similares a los virus. La enfermedad cuero de sapo (FSD) reduce el
rendimiento en un 80% a 100% (Lozano et al., 1983a); el virus mosaico comn de la yuca
(CsCMV), ampliamente difundido en Amrica Latina, reduce el rendimiento hasta en un 60%
(Costa 1972) y se han descubierto otros como el virus X de la yuca (CsXV) y el que causa la
enfermedad del virus latente, ambos de considerable importancia (CIAT, 1986).
La utilizacin de la tcnica de cultivo de meristemos ofrece la oportunidad de eliminar los virus
existentes en un cultivo. El meristemo es un pequeo tejido (0.2-0.3 mm) localizado en la parte
apical de la yema. El meristemo apical es formado durante el desarrollo embrionario y, excepto
por periodos de dormancia, permanece activo a travs de la vida de la planta. Los reportes
muestran como la tcnica de cultivo de meristemos ha eliminado exitosamente en otras
especies, virus S de la papa (Brown et al. 1988) y el virus del amarillamiento en el camote
(Green and Lo, 1989) entre otros. La tcnica consiste en aislar aspticamente la regin
meristematica de la yema vegetativa apical o axilar, juntamente con 1-2 de los primordios
foliares ms jvenes, e implantarla en un medio de cultivo estril.
Para explicar la sanidad o limpieza de los meristemos se han formulado varias hiptesis. Una de
ellas plantea, que debido a la ausencia de tejido vascular en la proximidad del meristemo apical
y a que las conexiones plasmodesmticas en las clulas de este tejido son muy pequeas, el
virus se desplaza muy lentamente hacia el meristemo. Esta caracterstica morfolgica, unida a la

19

activa multiplicacin celular que all ocurre, puede explicar la baja concentracin o la ausencia
de virus en ese tejido (Wu et al., 1960).
Las tcnicas de cultivo de meristemos relacionadas con la termoterapia se desarrollaron en el
CIAT; el propsito era eliminar los virus de las variedades de yuca infectadas. El desarrollo de
sta tcnica ha contribuido enormemente a la produccin de clones de yuca en que se ha
comprobado la ausencia de organismos patgenos (Roca et al., 1991).
El principio bsico de la termoterapia a los tejidos infectados es que puede alterar la sntesis
viral y retardar la translocacin de los virus en la planta, de tal forma que la regin libre de virus
del meristema apical aumenta de tamao y, por lo tanto, se hace ms factible la limpieza (Roca
et al., 1991).
La termoterapia, al afectar el metabolismo celular, parece que altera la sntesis del virus; por lo
tanto, el xito de la termoterapia depende de la capacidad que tenga el tejido de soportar
periodos largos de alta temperatura que inactiven el virus sin afectar significativamente el
crecimiento del tejido (CIAT, 1982; Roca, 1981).
Los mtodos para el saneamiento de clones infectados por virus se pueden aplicar:
1) a las estacas (in vivo) o,
2) a los materiales in vitro
3.3.1. Pasos a partir de estacas
Fuente de material:

Tomar estacas de 15-20 cm. conteniendo yemas vigorosas.

Sembrar las estacas tratadas en potes que contengan sustrato esterilizado (suelo: arena
1:2), regarlas con agua (Figura 14).

Desinfestar las estacas superficialmente sumergindolas por cinco minutos en

una solucin de Dimetoato (sistemin) al 0.3%, posteriormente dejar secar por 12 horas bajo la sombra.

Figura 14. Proceso de desinfeccin y siembra de estacas para el inicio del tratamiento de
termoterapia.

20

Tratamiento de termoterapia

Colocar los potes con las estacas a crecer en la cmara de termoterapia a una
temperatura de 400 C da/ 35 0 C noche, 3000-4000 lux, humedad relativa alta (Figura
15).

Mantener los potes con las estacas en ste ambiente por 3 semanas, al cabo de
ste tiempo las yemas han brotado y puede iniciarse el cultivo de meristemas; se
pueden cortar 2-3 yemas por estacas

Las yemas que se cortan deben ser las ms vigorosas y las que han tenido una
mayor elongacin. Es importante desinfectar la cuchilla, con un detergente, cada
vez que se cortan yemas de una planta a otra.

Figura 15. Cmara y condiciones requeridas para el proceso de termoterapia a las estacas.

Preparacin del tejido estril

Remover las yemas terminales de las estacas y colocarlas en una vaso precipitado
con una malla que facilita el manejo de estas en el laboratorio.

En el laboratorio bajo una cmara de flujo laminar se desinfectan las yemas

recolectadas siguiendo el siguiente protocolo:

a) Sumergir rpidamente las yemas en 70% alcohol y enjuagar con agua estril.
b) Pasar a hipoclorito de sodio al 0.5% por 5 minutos (blanqueador comercial, con 5.25 %
de ingrediente activo de hipoclorito de sodio)
c) Hacer 3 enjuagues con agua bidestilada estril (Figura 16).

21

Figura 16. Materiales requeridos para el proceso de desinfeccin de las yemas.

Aislamiento y siembra de los meristemos

Esta etapa del proceso consiste en el aislamiento asptico del meristemo (estructura de 0.3-0.5
mm), estructura que comprende la regin meristemtica de la yema vegetativa, acompaada de
1 2 de sus primordios ms jvenes, y su siembra en un medio de cultivo nutritivo y estril (4E)
(Figura 17).

Figura 17. Meristemos de yuca utilizados para el proceso de eliminacin de virus.

a) Herramientas para el aislamiento (Figura. 18)

Un esteroscopio ( 10X ) con lmpara de luz fra (de fibra ptica).

Dos bisturs (cuchillas No. 11)
Dos pinzas pequeas.

22

Figura 18. Esteroscopio y herramientas requeridas para el aislamiento de los meristemos.

b) Esterilizacin de las herramientas
Las herramientas se sumergen en alcohol al 96% y se flamea varias veces o se esteriliza
en autoclave por 15 minutos.
Dejar enfriar las herramientas e introducirlas en un papel cartulina estril.
El material vegetal se puede resentir y deteriorar cuando se maneja las herramientas en
presencia de alcohol o cuando estn demasiado calientes.
Aislamiento

Bajo el campo visual del esteroscopio (10-40X) se toma con la pinza la yema apical y se
van removiendo con el bistur los apndices (hojas y estipulas) que cubren el pice hasta
observar una estructura brillante de 0.3-0.5 mm con 1 o 2 primordios foliares. Se realiza un
corte fino. Esta operacin debe hacerse en una forma muy rpida y cuidadosa para evitar la
deshidratacin excesiva del meristemo que puede ocasionar la muerte del mismo (Figura
19).

Figura 19. Proceso de diseccin de los meristemos utilizando el esteroscopio.

Colocar el explante en el medio de cultivo para su crecimiento y desarrollo (Medio 4E, ver
Anexos).

23

Esta ubicacin del explante en el medio de cultivo es muy importante. Debe quedar la
parte basal sobre la superficie del medio, si queda de lado sobre uno de los primordios no va
a permitir un desarrollo uniforme del meristemo y se va a ver beneficiado el desarrollo del
primordio foliar.

Incubacin del cultivo

Los tubos son debidamente sellados y rotulados indicando el nombre de la accesin y fecha de
siembra, posteriormente son ubicados en gradillas y llevados al cuarto de crecimiento el cual se
encuentra bajo las siguientes condiciones:
Temperatura
: 26-28 C
Iluminacin
: 18.5 mol.m-2.s-1
Fotoperodo
: 12 horas
Calidad de luz : Lmparas fluorescentes, tipo luz da
Humedad relativa : 50-70%
Desarrollo del cultivo

Durante la primera semana del cultivo, poca diferenciacin morfolgica puede ser
observada. Un leve incremento en el volumen del tejido se presenta. El desarrollo de una
pigmentacin verde clara puede ser evidente, siendo sta la primera indicacin de
supervivencia del tejido. Si, por el contrario, el explante tiene una apariencia blancuzca
esto es un indicativo de que ocurri un dao en el momento de la escisin.
Durante las prximas 3-4 semanas, se observa un incremento en el crecimiento pero se hace
necesario pasar nuevamente el tejido al medio 4E, con un corte previo en su base para
eliminar el posible callo que se forma.
Despus de tres semanas de haberse transferido nuevamente a un medio de cultivo se
comienza a observar un crecimiento de los explantes, hay emisin de races y una planta
completamente desarrollada es formada (Figura 20). Con el desarrollo de esa planta se
puede continuar con las pruebas de indizacin (ver protocolos del Lab. de Sanidad de
Germoplasma).

Figura 20. Planta in vitro de yuca para dar inicio al proceso de indizacin.
3.3.2. Pasos a partir de material in vitro
Fuente de material
Los materiales que han sido introducidos in vitro (procedentes de pases diferentes a Colombia)
deben inicialmente ser registrados incluyendo los siguientes datos: lugar de origen, fecha de
introduccin, nmero de tubos, identificacin de las variedades, estado fisiolgico (clorosis,

24

muerte y otros sntomas), estado fitosanitario del cultivo (hongos y bacterias) y condiciones del
medio (fenolizacin, estado de solidificacin). Estos datos suministran informacin para la
evaluacin y el reporte del estado de llegada de los mismos.
Una vez inventariados los materiales estos deben someterse a una fase de establecimiento y
recuperacin la cual se lleva acabo en el cuarto de crecimiento durante dos semanas,
transcurrido este tiempo se espera un reverdecimiento de las plntulas y se procede a realizar
una nueva evaluacin del estado fisiolgico y fitosanitario del cultivo. Esta informacin es
reportada al funcionario/a del Instituto Colombiano Agropecuario quienes se encargan de
realizar la nacionalizacin de los materiales y dan por lo tanto la aprobacin para continuar con
el proceso de micropropagacin.
Logrado el establecimiento y recuperacin de los materiales, viene posteriormente la etapa de
micropropagacin, la cual se lleva a cabo tomando como explantes los pices de 0.5 cms (los
cuales son utilizados para realizar el tratamiento de termoterapia explicada a continuacin) y los
nudos de 0.5 cms (que van a servir de respaldo hasta el momento en que se finaliza el proceso
de termoterapia e indizacin), los pices son sembrados en el medio de cultivo 17N y los nudos
son sembrados en el medio de cultivo 4E .
Tratamiento de termoterapia in vitro
Los tubos de ensayo conteniendo los pices son transferidos a la cmara de termoterapia la
cual se encuentra a una temperatura de 37C da/ 35 C noche, iluminacin de 18.5
mol.m- 2.s-1 y fotoperodo de 12 h (Figura 21).
Bajo esas condiciones se mantienen por un periodo de 12 das, al trmino de ese
periodo se extrae nuevamente los pices y se siembran en el medio 17N. Este proceso se
realiza 3 veces y con una duracin de 12 das cada uno.
Al trmino del tercer ciclo se establece el material en condiciones del cuarto de crecimiento,
se micropropaga y se entrega una o dos plantas al laboratorio de sanidad de germoplasma para
que se realicen las pruebas de indizacin.
Con el desarrollo de estas actividades se ha logrado el saneamiento de clones de las
enfermedades de restriccin cuarentenaria (CsCMV, CsXV y FSD), mostrando que la eficiencia
del control depende no slo del tratamiento previo con calor (intensidad y duracin) de las
estacas infectadas, sino tambin, y significativamente, del tamao del meristemo que se cultiva
posteriormente (Roca et al, 1991)

25

Figura 21. Cmara de termoterapia para realizar los tratamientos de limpieza de virus in vitro.
3.4. Micropropagacin
La micropropagacin es la multiplicacin masiva de una especie a partir de tejidos u rganos,
bajo condiciones in vitro para obtener, mantener y mulplicar los materiales genticos. En cada
uno de los casos se espera la formacin de ramas axilares que puedan separarse y enraizarse;
tericamente los brotes axilares o laterales pueden a su vez producir ramas axilares adicionales a
perpetuidad, a medida que se subcultiva cada brote recin formado o cada explante de nudo
(Krikorian, 1991).
La tcnica de micropropagacin es importante donde pocos materiales son disponibles, donde
material clonal es requerido, donde grandes cantidades de material para sembrar es necesario.
Los materiales que han resultado negativos en las diferentes pruebas de indizacin necesitan ser
micropropagados con el fin de incrementar el nmero de explantes por cada clon y poder
obtener posteriormente los 5 tubos por clon que se requieren para introducirlos al Banco de
Germoplasma in vitro.
El procedimiento es el siguiente:

La planta in vitro negativa es llevada a la cmara de flujo laminar, esta se extrae del tubo de
ensayo y se procede a multiplicarla cortando los pices y respectivos nudos con yemas
axilares los cuales son sembrados posteriormente en el medio 4E (Figura 22).

Los tubos son sellados y llevados a las condiciones ya descritas del cuarto de crecimiento.

Al cabo de 4-5 semanas se tienen plantas desarrolladas para ser sembradas en el medio de
conservacin (8S).

Cuando los materiales han resultado positivos para alguno de los virus se reinicia el
procedimiento de eliminacin de patgenos y posteriormente se realizan nuevamente las
pruebas de indizacin.

26

a.

b.

d.

e.

c.

f.

g.

Figura 22. Proceso de micropropagacin. Las fotografas a), b) y c) muestran el proceso de

corte para la obtencin de los explantes (pices y yemas axilares), d) muestra la seleccin y
siembra de los explantes en el medio, e) pueden verse el tubo rotulado y sellado, finalmente f) y
g) los cuarto de crecimiento y conservacin respectivamente a donde finalmente son llevados.
3.5. Indizacin
Plantas establecidas que han sido obtenidas despus de haber sido sometidas al tratamiento de
termoterapia bien sea a partir de estacas o termoterapia in vitro deben ser evaluadas para los
diferentes virus de importancia cuarentenaria como son el Mosaico Comn de la yuca
(CsCMV), Virus X de la yuca (CsXV) y la enfermedad del Cuero de Sapo (FSD).
Las plantas in vitro que han sido sometidas a los tratamientos de termoterapia deben ser
propagadas de la siguiente manera:

El pice proveniente de la planta in vitro con tratamiento de termoterapia es sembrado en

el medio de cultivo 17N (ver Anexo) y ubicado a continuacin por un periodo de 4-5
semanas en el cuarto de crecimiento. Los nudos de la misma planta son sembrados en el
medio de cultivo 4E y permanecen en el cuarto de crecimiento hasta la obtencin de los
resultados.
La planta que ha sido sembrada en el medio de cultivo 17N y despus de 4 semanas en la
que cumple el periodo de crecimiento y desarrollo es entregada al Laboratorio de Sanidad
de Germoplasma (ver Manual de procedimiento Laboratorio de Sanidad de
Germoplasma) con el propsito de que realicen las respectivas pruebas de indizacin.

3.6 Conservacin in vitro

La necesidad de mantener clones seleccionados e hbridos promisorios para su distribucin, en
condiciones sanas, a programas nacionales de investigacin agrcola estimul algunos de los
primeros estudios sobre el mantenimiento in vitro del germoplasma de yuca (Roca et al., 1989).

27

El mtodo de conservacin in vitro consiste en mantener los cultivos en condiciones fsicas o

qumicas que permiten extender al mximo el intervalo de transferencia a medios frescos sin
que ello afecte la viabilidad y estabilidad de los cultivos (CIAT, 1984) y adems desarrollar
metodologa que permita reducir los costos del mantenimiento de los mismos (Koo et al 2004).
La tasa de crecimiento de los cultivos in vitro puede ser controlada empleando principalmente
factores como temperatura, nutrientes orgnicos e inorgnicos, intensidad de la luz y
fotoperiodo, reguladores de crecimiento, reguladores osmticos e inhibidores de etileno.
El procedimiento del crecimiento controlado desarrollado en el CIAT para el cultivo de la yuca
(medio NP) ha permitido que el material permanezca por un perodo entre 18-24 meses y el
mtodo tradicional (medio 8S) ha permitido que permanezca en un promedio de 11 meses.
El procedimiento establecido para el manejo de la coleccin in vitro es la siguiente:
3.6.1. Labores de introduccin:

El material micropropagado se siembra en el medio de conservacin 8S (3 tubos) y NP (2

tubos). El explante utilizado son pices y nudos, colocando 2 o 3 explantes por tubo. Las
dimensiones del tubo de vidrio empleado para la conservacin es de 25 x 150 mm y el
papel aluminio es utilizado para cubrir los tubos que son sellados inmediatamente con una
cinta extensible.
Tres de los cinco tubos mantenidos por clon han sido sembrados en medio 8S con el fin de
tener disponibilidad de material en el momento de preparar un envio y los dos restantes han
sido sembrados en medio NP en el que la tasa de crecimiento ha sido menor y por lo tanto
constituyen la reserva de material.
El nmero mnimo de tubos in vitro de yuca que se pueden mantener conservados bajo
mnimo crecimiento es obviamente uno, pero como medida de seguridad y respaldo y para
permitir una rpida recuperacin y disponibilidad para la distribucin y pruebas prcticas,
es de 3-5 tubos por material (IPGRI_CIAT, 1994).

Posteriormente se coloca en el tubo de ensayo un anillo de cartn que tiene adherido la

identificacin del clon con cdigo de barras y se ubican los tubos en una gradilla. El uso
del cdigo de barras nos ayuda a minimizar el problema de una incorrecta identificacin de
los materiales y para facilitar la entrada de informacin a la base de datos (Figura 23).

Figura 23. Sistema de identificacin de las accesiones utilizando cdigos de barras.

28

Se registra en el colector de datos, mediante cdigo de barras, la informacin de entrada la

cual consiste en los datos relacionados a la fecha en que entra el material a las condiciones
de conservacin, medio de cultivo en que ha sido sembrado el material y la persona
responsable del subcultivo, posteriormente esta informacin se traslada al final del da a la
base de datos (Figura 24).

Figura 24. Proceso de documentacin en la base de datos de la Unidad de Recursos Genticos.

Se ubican las gradillas en el cuarto de crecimiento por un periodo de 2-3 semanas, al final
de ste periodo se evala el estado de desarrollo y la sanidad de las plantas (observando si
hay presencia de hongos y bacterias).
Los materiales son ubicados posteriormente en el cuarto de conservacin bajo las
condiciones ya descritas para ste cuarto (Figura 25).

Figura 25. Disposicin de las estanteras en el cuarto de conservacin del germoplasma de

Manihot.
3.6.2. Labores de mantenimiento y renovacin de los materiales
El xito de la conservacin in vitro radica en las labores cotidianas que se llevan a cabo para su
buen funcionamiento. Una de las labores principales es la supervisin de las condiciones fsicas
del cuarto de conservacin (temperatura, luz, humedad relativa, asepsia, etc.) como tambin
realizar las revisiones peridicas del estado fisiolgico y fitosanitario de los materiales que se
estn conservando.

29

Mantenimiento
Factores como temperatura, humedad relativa e iluminacin deben ser controladas en una
forma regular debido a que son parte esencial en el esquema de conservacin. Este control es
realizado todos los das teniendo en cuenta lo siguiente:

Temperatura y humedad
En el cuarto de conservacin se tiene ubicado un higrotermgrafo (Figura 26a), que
permite monitorear da y noche la temperatura y humedad relativa del cuarto segn lo
establecido para mantener unas tasas de crecimiento reducido. Una alteracin en la
temperatura conlleva a la revisin de la unidad de refrigeracin. Si la humedad relativa es
mayor al 70%, condicin lo que puede propiciar el desarrollo de microorganismos y
aumentar el riesgo de contaminacin, es necesario en ste caso utilizar el deshumificador
que permiten regular ste factor (Figura 26b).

a.

b.

Figura 26. Equipos para el monitoreo de las condiciones ambientales en el cuarto de

Conservacin: a ) higrotermografo y b) deshumificador.

Iluminacin
Contar con una adecuada intensidad lumnica depende del buen funcionamiento de las
lmparas fluorescentes. Por lo tanto las lmparas daadas deben ser reemplazadas
oportunamente. Con relacin al fotoperodo es controlado con un reloj que funciona con
una batera, que sustituye la energa elctrica en caso de que esta sea interrumpida (Figura
27).

Figura 27. Equipo requeridos para el control del fotoperodo en los respectivos cuartos.

30

Los cultivos
Se debe tener en cuenta que los cultivos tengan hojas y tallos verdes y que las races
presenten crecimiento normal. Los cultivos deben renovarse antes de que presenten una
total defoliacin o presentan una zona necrtica entre la raz y el tallo. Un color amarillento
en los cultivos nos indica que es necesario proceder a realizar el subcultivo y sembrar
nuevamente en un medio de cultivo fresco (Figura 28).

Figura 28. Estado fisiolgico de las plantas para salir al proceso de subcultivo.
Medio nutritivo
Cuando el medio de cultivo est fresco o en buenas condiciones s ve cristalino, pero con el
tiempo se torna ms oscuro y esto puede ser debido a la secrecin de metabolitos de las
races, especialmente de tipo fenlico, el uso de carbn activado disminuye notablemente
ste efecto. Cuando el medio presenta estas caractersticas unidas al deterioro del cultivo es
necesario proceder a la resiembra en un medio nuevo.
Tubos de ensayo
Es importante revisar el estado del tubo de ensayo y observar que el vidrio no tenga fisuras,
igualmente se debe chequear que la tapa y el plstico estn en buenas condiciones, esto con
el fin de prevenir la entrada de contaminantes y evitar la deshidratacin del medio de
cultivo.

Asepsia
Se debe tener limitado el acceso de personal que labore en el campo e invernaderos tanto al
rea de transferencia, cuarto de crecimiento y cuarto de conservacin. Es importante utilizar
en estos espacios blusas de laboratorio exclusivas para laborar en estas reas de trabajo.

Renovacin
Adems de las labores descritas anteriormente para el mantenimiento del cuarto de conservacin
deben realizarse labores de renovacin del material que ha cumplido su ciclo de conservacin.
El procedimiento es el siguiente:

Cada semana se realiza una revisin a cada una de las variedades que se encuentran en
el banco de germoplasma in vitro. Se observa el estado fitosanitario y fisiolgico del
material. Existen diferentes causas que requieren la salida de una variedad a subcultivo:

31

a) Aquel que presente contaminacin con hongos se elimina en el caso de que sea un solo tubo y
si por algn motivo los 5 tubos presentan ste tipo de contaminacin se puede aplicar la
metodologa de desinfeccin con hipoclorito de sodio,
b) si la causa de la contaminacin son bacterias se utiliza antibiticos (vancomicina) a una
concentracin de 40 mg/l o se puede utilizar medios lquidos con un pH de 3.5 (Anexo) y
c) aquel que presente defoliacin, medio de cultivo que comienza a tornarse amarillento y
muerte del tallo es necesario proceder a realizar el subcultivo (Figura 29).

Figura 29. Revisin semanal de las plantas para determinar la renovacin o subcultivo de las
mismas.

Los materiales que salen a subcultivo son registrados en el colector de datos. La

informacin que se registra es la siguiente: Nombre de la variedad, fecha del subcultivo,
nombre de la persona responsable de hacer la transferencia y causa del subcultivo.

Los materiales son llevados al cuarto en donde se realiza el subcultivo y se procede a

su renovacin nuevamente en el medio 8S (3 tubos) y NP (2 tubos). Se procede de igual
manera como en el manejo de introduccin a conservacin (Figura 30).

32

a.

d.

b.

c.

e.

f.

Figura 30. Proceso del subcultivo o renovacin de materiales en el cuarto de subcultivo. Las
fotografas muestran a) estado del material a renovar, b) y c) muestran el proceso de seleccin
y corte para la obtencin de los explantes (pices y yemas axilares), d) y e) muestra explantes
y siembra de los explantes en el medio y en f) pueden verse el tubo sellado.

Una vez sembrados en el medio de cultivo se registra la entrada en el colector de datos

y se hace un registro de los siguientes parmetros: Nombre de la variedad, fecha de
entrada, medio de cultivo y responsable.
Se ubican los tubos nuevamente en el cuarto de crecimiento (2-3 semanas) y
posteriormente, despus de ese tiempo se revisa su estado fisiolgico y fitosanitario,
son ubicados en el cuarto de conservacin permaneciendo en ese lugar hasta el
momento que se requiera nuevamente el subcultivo.
Al finalizar el da los registros acumulados en el colector de datos se colocan en la base
de datos central.

El registro de entrada y salida de una variedad nos permite determinar cual es el tiempo que
puede permanecer una variedad conservada in vitro y con esta informacin tambin podemos
determinar el momento que una variedad debe salir a subcultivo (Figura 31).

33

Figura 31. Registro en la base de datos de la informacin de salida y entrada de las accesiones a
subcultivo.
3.7 CARACTERIZACIN
Resulta importante para una coleccin ex situ que sus materiales estn bien caracterizados, esto
puede ser alcanzado utilizando una serie de tcnicas como: a) descriptores morfolgicos y
agronmicos, b) marcadores bioqumicos, incluyendo anlisis de isoenzimas, y c) marcadores
moleculares incluyendo RFLPs, RAPDs y microsatlites.

Para un efectivo manejo de la coleccin de yuca el uso de esas metodologas han sido utilizadas
para las siguientes etapas:
1) Verificar la integridad gentica de los materiales mantenidos bajo la tcnica de
conservacin in vitro (despus de varios aos de conservacin).
2) Detectar mezclas de los materiales .
3) Identificacin de duplicados genticos (redundancia de los materiales).
Los detalles de esta actividad de caracterizacin se presenta en el Manual de Procedimientos del
Laboratorio de Diversidad Gentica.

34

3.8. DISTRIBUCIN
Otra importante funcin del banco de germoplasma in vitro es la distribucin de germoplasma a
los diferentes usuarios. Esta actividad se ejecuta bajo la normatividad establecida en el Tratado
Internacional sobre Recursos Fitogenticos para la Alimentacin y la Agricultura aprobado por
la Conferencia de la FAO en su 31 o perodo de sesiones, el 3 de noviembre de 2001, y que
est en vigor desde el 29 de junio de 2004. El artculo 12.4 del Tratado establece que deber
facilitarse el acceso al amparo del Sistema Multilateral con arreglo de un Acuerdo Normalizado
de Transferencia de Material (SMTA) para los materiales de Manihot esculenta y el Acuerdo de
Transferencia de Material (ATM) para las especies silvestres del gnero Manihot..
El proceso de distribucin de germoplasma in vitro comprende las etapas descritas a
continuacin:

ANTECEDENTES

LOGISTICA

Solicitud de Germoplasma
Aceptacin del SMTA
Seleccin de materiales
Micropropagacin
Preparacin del envio

REQUERIMIENTOS

Certificado Fitosanitario
Permiso de Importacin

DOCUMENTACIN

Lista de Materiales
Manual de procedimiento
Base de Datos - URG

Solicitud de germoplasma: Los diferentes usuarios pueden realizar las solicitudes por diferentes
medios: correo fsico, correo electrnico o por la pgina Web de la Unidad de Recursos
Genticos ( http://www.ciat.cgiar.org/urg ).
Se debe contar con la aceptacin al Acuerdo Normalizado de Transferencia
(SMTA). Para lo cual pueden elegirse entre tres mtodos de aceptacin:

de Material

Firma del documento de aceptacin del acuerdo normalizado de transferencia de material.

Acuerdos normalizados de transferencia de material en envos sellados. El material se

suministra previa aceptacin expresa de los trminos del Acuerdo. El suministro del
material y su aceptacin y utilizacin por el receptor entraan la aceptacin de los trminos
del acuerdo.

Acuerdos normalizados de transferencia de material electrnicos. A travs del correo

electrnico se acepta las condiciones establecidas supra. Si esta forma es elegida, el
material deber ir tambin acompaado de una copia escrita del Acuerdo normalizado de
transferencia de material.

Seleccin de las accesiones y micropropagacin. Los materiales para la distribucin son

elegidos por los usuarios segn los objetivos y necesidades de la investigacin que estn
desarrollando. Una vez identificadas las accesiones solicitadas por el usuario se procede a la
micropropagacin de las mismas a partir de los materiales conservados en el banco in vitro. Los

35

materiales son transferidos al medio de multiplicacin (Medio 4E) el cual favorece el

crecimiento tanto de la parte area como de de las races facilitando el proceso de transferencia
y aclimatizacin al invernadero o la posterior multiplicacin in vitro por parte del solicitante
del material.
Despus de 4 semanas se tendrn plntulas enraizadas, que es la forma ms adecuada, desde el
punto de vista de su manejo, para el intercambio de germoplasma clonal (CIAT 1982).
Preparacin del envi. Las plntulas in vitro micropropagadas son cuidadosamente revisadas
antes de proceder a su empaque. Se observa el estado general de la planta, el medio de cultivo,
la ausencia de contaminacin bacteriana y/o fngica, el sellado y la adecuada rotulacin de los
materiales, la cual se realiza empleando marcador de tinta permanente de color negro, indicando
en letra y nmeros claros y legibles la respectiva identificacin de los materiales. Todo esto con
el propsito de asegurarse de que estn en adecuadas condiciones.
Los tubos se colocan en bandejas acanaladas de cartn o preferiblemente de poliestireno, se
sujetan a ellas con cinta adhesiva. Las bandejas se van colocando una encima de otra y el
conjunto es asegurado con cinta adhesiva, posteriormente se empacan en cajas de cartn,
rotuladas con informacin acerca del contenido, manejo cuidadoso, destinatario y remitente.
La distribucin incluye el respectivo certificado fitosanitario expedido por el ICA, en el cual se
explican los tratamientos y pruebas de deteccin de enfermedades aplicadas al material
vegetativo. Previamente el solicitante debe enviar el respectivo permiso de importacin
expedido por la autoridad competente del lugar de destino del material o la respectiva
comunicacin escrita en la que se informa la ausencia de requerimiento de este para el ingreso
del material vegetal al pas de destino (Figura 32).

Figura 32. Documentacin y empaque utilizados para la distribucin de germoplasma in vitro.

Adems, se incorpora al envi una lista del material suministrado en virtud del acuerdo
aceptado por el receptor, en esta se incluye los datos de pasaporte disponibles y un folleto con
instrucciones acerca del posterior manejo de los materiales una vez han arribado (Roca et al,
1984). Se aclara que la informacin facilitada tambin puede obtenerse en la direccin de Web:
www.ciat.cgiar.org/urg

36

Base de datos. Una vez se ha preparado el envi la informacin es documentada en la base de

datos en la cual se incluyen datos como: nmero de envio, nmero del acuerdo de transferencia,
nmero del certificado fitosanitario, nmero del permiso de importacin, institucin del
receptor, nombre del receptor, pas del receptor, tipo de usuario (existen 8 categoras),
identificacin de los materiales enviados, fecha de envio y el propsito por el cual se solicit el
material (7 categoras)(Figura33)( Tabla 3).

CATEGORIAS DE DISTRIBUCIN
TIPOS DE USUARIO
PROPOSITOS

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Centros del CGIAR

Compaas comerciales
Agricultores
Bancos de germoplasma
Instituciones nacionales
Organizaciones no gubernamentales ONGs
Organizacioes regionales
Universidades

1.
2.
3.
7.
8.
9.
10.

Mejoramiento
Agronoma
Investigacin Aplicada
Investigacin Bsica
Entrenamiento y capacitacin.
Otros
Conservacin

Tabla 3. Diferentes categoras de usuarios y propsitos empleados en la distribucin de

materiales in vitro.

37

Figura 33. Registro de la informacin bsica y composicin del envio en la base de datos.
3.9. DUPLICADOS DE SEGURIDAD
Si la coleccin in vitro es la nica fuente de material esta debe ser duplicada por lo menos en
dos sitios como medida de seguridad. A partir del 2005 se firm un acuerdo con el Centro
Internacional de la Papa (CIP) en Per para mantener el Black box de yuca (un duplicado no
activo mantenido en otro sitio). Un total de 3 tubos por material son enviados (en el medio de
crecimiento mnimo, NP)(Figura 34).
La coleccin core de yuca (630 accesiones) es tambin conservada como duplicado de seguridas
en nitrgeno lquido.

38

Figura 34. Forma de empaque del duplicado de seguridad de yuca para ser enviado al
CIP.
4. CONTROL DE CALIDAD
La totalidad de las actividades desarrolladas por el laboratorio de cultivo de tejidos para el
mantenimiento de la coleccin in vitro de yuca exigen un cuidadoso manejo, algunos de los
posibles riesgos y sus mecanismos de control se indican a continuacin:
MEZCLA MECNICA. Existe la posibilidad de la mezcla mecnica, este riesgo se ha logrado
reducir con el etiquetado de las accesiones con su respectivo cdigo de barras, esto es aplicado a
cada uno de los 5 tubos mantenidos en el banco. Posibles dudas son despejadas con la ayuda de
la informacin registrada en la base de datos en el momento de salida y de ingreso al banco
previo y posterior al subcultivo, respectivamente. Algunas caractersticas morfolgicas
desarrolladas in vitro pueden brindar informacin adicional, en el mejor de los casos cuando no
ha sido posible determinar con claridad y certeza el nombre de la accesin se recomienda
descartar el material y realizar la propagacin empleando el tubo que se mantiene como reserva
en el banco.
Las actividades de subcultivo se realizan de manera individual (por accesin) es decir una vez
se ha terminado completamente el subcultivo de un material se procede a empezar el siguiente.
El personal que realiza las actividades de subcultivo ha sido instruido en el manejo cuidadoso
para evitar confusiones.
PREPARACIN DE SOLUCIONES STOCK Y MEDIOS DE CULTIVO. Para una correcta
preparacin de las soluciones stock es importante:

El uso de una balanza analtica para el pesaje de los componentes.

Asegurarse de que los materiales empleados en la preparacin y almacenamiento de la
misma se encuentren limpios y secos. Estos deben haberse lavado y enjuagados con
agua destilada para retirar los restos de sales del agua corriente.
La mezcla de los componentes debe hacerse con la ayuda de un agitador magntico.
Una vez finalizada la preparacin se debe rotular el recipiente en que se almacenara
indicando el nombre de la solucin, concentracin, fecha de preparacin y responsable
de la misma

El adecuado marcado y rotulado de los recipientes de vidrio permite la identificacin, facilita su

manejo y ubicacin en el momento de ser empleados en la preparacin de medios de cultivo.
Para facilitar y reducir los riesgos en la preparacin de medios se han establecido formatos con
las formulaciones indicando las cantidades y el orden en que deben agregarse las soluciones
stock. Tambin debe tenerse en cuenta:

Ubicar en la mesa de trabajo las soluciones stock en el orden establecido en la

formulacin. Una vez agregada al medio esta debe retirarse para evitar confusiones o
dudas en el momento de continuar con la preparacin.
Cada solucin debe agregarse empleando una pipeta limpia, no deben reutilizarse en la
adicin de otra solucin ya que podra contaminarse y mezclarse las soluciones.
Una vez terminada la preparacin del medio de cultivo este debe ser rpidamente
dispensado en los tubos o recipientes donde sern dispuestos, seguidamente se tapan.
Cabe resaltar que los tubos, recipientes y tapas empleados deben estar limpios.
Posteriormente las gradillas son cubiertas con papel el cual se rotula con el nombre del
medio y la fecha de preparacin.

39

PROCEDIMIENTO DE ESTERILIZACIN. La esterilizacin es el proceso mediante el cual

cualquier material, sitio o superficie se libera completamente de cualquier microorganismo vivo
o espora. Se dice que tales materiales o sitios son estriles o se han esterilizado. En la
terminologa mdica se utiliza generalmente la palabra asepsia para designar la condicin en la
que estn ausentes los microorganismos patgenos; quienes trabajan en el cultivo de tejidos de
plantas utilizan la palabra asptico como sinnimo de estril.
La desinfeccin se limita generalmente al proceso de destruccin de los microorganismos
mediante mtodos qumicos; la esterilizacin se refiere a menudo al mtodo fsico para la
destruccin de microorganismos.
Existen tres mtodos de esterilizacin: esterilizacin con calor seco (horno elctrico),
esterilizacin qumica (en fro) y esterilizacin con vapor a presin (autoclave o calor hmedo
con presin) este ultimo es el mtodo usado en el laboratorio de cultivo de tejidos para la
esterilizacin de medios de cultivo, agua y material seco. Algunos aspectos a tener en cuenta en
la fase de esterilizacin son:
-

Es importante conocer el manual de instrucciones especficas para el manejo de la

autoclave. Seguir las instrucciones del fabricante siempre que sea posible garantizan un
adecuado uso y funcionamiento del mismo.
Envolver los elementos (herramientas, cajas de petri entre otros) y medios de cultivo
antes de la esterilizacin, esto ayuda a evitar y disminuir la probabilidad de que se
contaminen antes de usarlos.
Los elementos y gradillas deben acomodarse de manera que permita la circulacin libre
de vapor.
En general, esterilice durante 45 minutos material seco (cajas de petri, botellas con
agua, cartulinas, erlenmeyers y herramientas), para los medios de cultivo, durante 15
minutos a 121oC (250oF) y una presin de 15 libras por pulgada cuadrada. El tiempo se
empieza a contar cuando el autoclave alcanza la presin y la temperatura deseadas.
Si el autoclave es automtico, el calor se interrumpir y la presin comenzar a bajar
una vez se completa el ciclo de esterilizacin. Si el autoclave no es automtico, se debe
apagar la fuente calorfica y esperar hasta que el manmetro marque cero para abrir la
autoclave, posteriormente se abre lentamente la tapa o puerta para permitir la salida del
vapor restante durante un periodo de por lo menos 10 minutos , finalmente se procede
a sacar los paquetes.
Tener en cuenta el tiempo necesario para esterilizar lquidos en autoclave depende de
muchos factores, el ms importante es el volumen de lquido que se est esterilizando.
En general es la siguiente:
Rango de volumen
(ml)
< 75
75- 100
250-500
1000
1500
2000

Tiempo
( minutos)
15
20
25
30
35
40

- Posterior al autoclavado los elementos deben almacenarse en condiciones ptimas. Los

medios de cultivo una vez fros son empacados en bolsas plsticas y refrigerados, el
material seco (cajas de petri, cartulinas y herramientas) son mantenidos en el horno de
secado, erlenmeyers y agua bidestilada estril es colocada en la respectiva estantera.

40

Cuando existan dudas acerca de la esterilidad de cualquiera de los elementos a utilizar,

este debe considerarse contaminado y debe descartarse.
-

Existen tres formas para vigilar la efectividad de la esterilizacin estos son: indicadores
mecnicos, qumicos y biolgicos. El ms usado en nuestro laboratorio son las cintas
indicadoras con lneas que cambian de color cuando se alcanza la combinacin esperada
de temperatura, vapor a presin y tiempo. Se debe colocar a cada paquete o elemento a
esterilizar un pequeo pedazo de cinta indicadora.

Hay que tener en cuenta que algunas substancias qumicas (hormonas y

antibioticos) son termolbiles a las temperaturas de esterilizacin con autoclave.
En esos casos es preciso utilizar otros sistemas de esterilizacin, como el
filtrado.

CONDICIONES AMBIENTALES. Las condiciones de los cuartos de crecimiento y

conservacin son monitoreadas diariamente. Una vez son detectadas por los sistemas de
seguridad se toman medidas correctivas para evitar que estas alteraciones puedan causar daos
significativos en los materiales. El mantenimiento peridico de los sistemas de refrigeracin e
iluminacin es realizado por el personal de la unidad de mantenimiento del centro.
CONTAMINACIN Y PRDIDA DE MATERIALES. La revisin peridica del estado de
conservacin de los materiales en el banco previene perdidas por deterioro de los materiales. La
base de datos y la inspeccin visual constituyen las principales herramientas en el momento de
determinar el cumplimiento del periodo de conservacin.
La evaluacin de la presencia de contaminacin bacteriana o fngica se realiza por inspeccin
visual, una vez determinado el nmero de tubos contaminados y el agente causal se decide el
proceso a seguir, si la contaminacin es bacteriana se emplea antibitico o medios con pH de
3.5 y si la contaminacin es fngica se realiza desinfeccin empleando diferentes
concentraciones de hipoclorito de sodio. De ser posible a partir de los tubos no contaminados
puede realizarse la recuperacin del material y el posterior retorno a las condiciones de
conservacin.
A continuacin se describen los puntos crticos de control que se han identificado para prevenir
la contaminacin:

Al iniciar la jornada de trabajo es importante lavarse las manos con agua y jabn y
posteriormente enjuagar con alcohol al 70% antes de iniciar la sesin de siembra. Es
indispensable el uso de la bata de laboratorio la cual solo debe emplearse dentro de las
instalaciones del laboratorio.
Al iniciar la jornada de trabajo en la cmara de flujo laminar, el primer paso es el encendido del
flujo y la luz, posteriormente se realiza la limpieza usando algodn y alcohol al 96%.
Igualmente debe limpiarse la parte externa de los recipientes que entran del exterior al rea de
trabajo con alcohol al 70% y flamear la boca de cada tubo antes y despus de sembrar el
explante.

Las labores de siembra y diseccin deben realizarse lo ms cerca posible a la llama del mechero
evitando la exposicin prolongada al ambiente de los explantes y los medios de cultivo. La
manipulacin de los explantes debe ser del centro hacia el interior de la cmara de flujo laminar.

41

Cada vez que las manos salgan de la cmara de flujo, se deben rociar con alcohol al 70% antes
de introducirlos nuevamente en la cmara. Debe evitarse hablar durante la realizacin de las
actividades de subcultivo.
El manejo de varios juegos de las herramientas y el mantenimiento de la asepsia de las mismas.
La alternacin del flameo despus de la inmersin de los instrumentos en alcohol, con la
colocacin de los mismos contra la corriente de aire. Se recomienda utilizar varios juegos de las
mismas herramientas esterilizadas con el propsito de evitar sobreexposicin de calor en los
explantes en el momento del corte y siembra de los mismos.

La limpieza y aseo del laboratorio se realiza diariamente. Esta incluye aspirado de pisos y
trapeado con una solucin de hipoclorito de sodio al 5.25%. De igual forma mensualmente se
programa una limpieza y desinfeccin general que incluye lavado de pisos, mesones y paredes
con detergente, aspirado de superficies y estanteras, desinfeccin y limpieza de sillas, cmaras
de flujo laminar, carros transportadores reas, ventanas en todas las reas de trabajo empleando
alcohol al 70%, seguido de una solucin al 0.5% de hipoclorito de sodio. En algunos casos en la
limpieza de mesones se emplea esencia de menta.

42

5. ANEXOS
Actividad Preparacin de soluciones nutritivas y medios de cultivo
a) Medio Basal. Puede ser preparado de dos formas:
1. Usando soluciones stock de sales minerals, vitaminas y reguladores de crecimiento.
Para preparar 1Litro de medio, se adicionan a 500 ml de agua bidestilada lo siguiente:
20.0 ml de solucin stock N 1
1.0 ml de solucin stock N 2
1.0 ml de solucin stock N 3
2.9 ml de solucin stock N 4
5.0 ml de solucin stock N 5
2.Usando el medio prehecho en forma de polvo ( sin sacarosa y sin vitaminas y agar). Cada
sobre contiene 4.3 gr. de polvo, los cuales sirven para preparar 1litro de medio basal. Estos
sobres pueden ser almacenados a 8-10 C, de manera seca hasta por 2 aos. Para preparar el
medio basal disuelva el contenido entero de una sobre en 500 ml de agua bidestilada estril. Se
adicionan los mismos volmenes de los stocks de las soluciones 1 a 5 como se explic en el
paso 1.

b) Suplementos. Una vez se tiene listo el medio basal se continua agregando lo siguiente

Adiciona 5.0 ml de solucin stock N 6 y 6.25 ml de solucin stock N 7.

Disuelve 20.0 gr de sacarosa
Adiciona 5.0 ml de

43

Stock a

5b

Sustancia

NH4NO3
KNO3
MgSO4 .H2O
KH2PO4

Cantidad

82.5 gr
95.0
18.5
8.5

Volumen de Stock por litro

16500 mg
19000 mg
3700 mg
1700 mg

en 100ml de H2O bidestilada

H3BO3
MnSO4 . H2O
ZnSO4 . 7H2O
Na2MO4.2H2O
CuSO4.5H2O
CoCl2.6H2O

620 mg
2176 mg
860 mg
25 mg
2.5 mg
2.5 mg

en 100ml de H2O bidestilada

KI

75 mg

en 100ml de H2O bidestilada

VS 1L = 1 ml

CaCl2.2H2O

15000 mg

en 100ml de H2O bidestilada

VS 1L = 3 ml

a) Na 2EDTA
b) FeSO4.7H2O

1492 mg
1114 mg

en 200ml de H2O bidestilada

VS 1L = 5ml

Thiamina-HCl

20 mg

M-inositol

1600 mg

VS 1L =

VS 1L =

20 ml

1 ml

en 200ml de H2O bidestilada

VS 1L = 5ml

en 200ml de H2O bidestilada

VS 1L = 6.25 ml

Soluciones stock para preparacin de medio

a. Las soluciones stock 2 y 6 deben ser guardadas en el congelador, las restantes a 8-10 oC. el
stock 5 debe almacenarse protegido de la luz.
b. Separadamente se disuelve a y b en 50 ml de agua cada uno, la b es calentada en bao de
mara, se mezclan bien ambas soluciones, se deja enfriar y se completa con agua hasta 200 ml.

Fuente: Roca, W.M., Rodrguez, J.A., Mafla, G., and Roa, J.C. 1984. Procedures for recovering
cassava clones distributed in vitro. Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT).
Cali, Colombia. 8 p.

44

MEDIO DE PROPAGACION
( 4E)
MS (2% sacarosa) + 0.04 mg/l BAP + 0.05 mg/l GA + 0.02 mg/l ANA
AGAR 0.7%.
Preparacin:
En un volmen de aprox. 200 ml de H2O bid. agregar:
4.3 g de sales MS (se puede reemplazar por 1-5).
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
14.
15.

Solc. stock 1 (MS)

Solc. stock 2 (MS)
Solc. stock 3 (MS)
Solc. stock 4 (MS)
Solc. stock 5 (MS)
Tiamina HCl (stock 100 ppm)
Inositol (stock 8000 ppm)
Sacarosa
BAP (stock 10 ppm)
GA (stock 10 ppm)
ANA (stock 10 ppm)
Completar a 500 ml con H2O bidestilada
Ajustar pm 5.7-5.8
Disolver 7 g AGAR en 500 ml de H2O bid.
Mezclar las dos soluciones
Volmen final 1000 ml.

20 ml
1 ml
1 ml
2.9 ml
5 ml
10 ml
12.5 ml
20 g
4 ml
5 ml
2 ml

Para preparar el medio de Murashige y Skoog a partir de soluciones stock (ver Apndice
1).

Fuente: Roca, W.M., Nolt, B., Mafla, G., Roa, J.C., Reyes, R. 1991. Eliminacin de virus y
propagacin de clones en la yuca (Manihot esculenta Crantz) In:' Roca, W.M., Mroginski, L.A.,
Fundamentos y Aplicaciones'. pp 403-421.

45

MEDIO DE CONSERVACION
( 8S)
MS (2% Sucrose) + 0.02 mg/l BAP + 0.1 mg/l GA + 0.01 mg/lANA.
AGAR 0.7%: 7 g in 500 ml of H2O bid.
Preparacinn:
en 200 ml of H2O bidestilada:
-4.3 g/l of M.S. (reemplaza de 1 a 5).
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.

Solc. stock 1 (MS)

Solc. stock 2 (MS)
Solc. stock 3 (MS)
Solc. stock 4 (MS)
Solc. stock 5 (MS)
Tiamina HCl (stock 100 ppm)
Inositol (stock 8000 ppm)
Sucrose
BAP (stock 10 ppm)
GA (stock 10 ppm)
ANA (stock 10 ppm)
Completar con 500 ml de H2O bidestilada
Ajustar el pH 5.7-5.8
Mexclar las dos soluciones (1000 ml)

20 ml
1 ml
1 ml
2.9 ml
5 ml
10 ml
12.5 ml
20 g
2 ml
10 ml
1 ml

Fuente: CIAT.1984. El cultivo de meristemas para la conservacin de germoplasma de yuca in

vitro. Gua de estudio. Centro Internacional de Agricultura Tropical, Cali, Colombia. 41pp.

46

MEDIO DE ENRAIZAMIENTO
(17N)
1/3 MS (2% sucrosa) + 0.01 mg/lt ANA + 0.01 mg/l GA + 25 mg/pp.
Preparacin:
En un volmen aprox. de 200 ml de H2O bid agregar: 1.43 g de sales MS (se pueden reemplazar
por 1-5).
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
14.
15.

Solc. stock 1 (MS)

Solc. stock 2 (MS)
Solc. stock 3 (MS)
Solc. stock 4 (MS)
Solc. stock 5 (MS)
Tiamina HCl (stock 100 ppm)
Inositol (stock 8000 ppm)
Sacarosa
ANA (stock 1 ppm)
GA (stock 1 ppm)
P.P. (Plant Product 10-52-10,
stock 5000 ppm)
Completar a 500 ml con H2O bidestilada
Ajustar pH 5.7-5.8
Disolver 7 g agar en 500 ml de H2O bid.
Mezclar las dos soluciones
Volmen final 1000 ml.

6.7 ml
0.3 ml
0.3 ml
1.0 ml
1.7 ml
10.0 ml
12.5 ml
20.0 g
10.0 ml
10.0 ml
5.0 ml

Fuente: CIAT. 1982. El cultivo de meristemas para el saneamiento de clones de yuca. Gua de
estudio. Centro Internacional de Agricultura Tropical, Cali, Colombia. 45pp.

47

MEDIO DE SILVESTRES
(12A3)
MS (3% sucrosa) + 0.2 mg/lt Kinetin + Vitaminas + 1.0 g/l carbn activado
Preparacin:
en 200 ml of H2O bidestilada:

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.

Solc. stock 1 (MS)

Solc. stock 2 (MS)
Solc. stock 3 (MS)
Solc. stock 4 (MS)
Solc. stock 5 (MS)
Tiamina HCl (stock 100 ppm)
Inositol (stock 8000 ppm)
Sacarosa
Kinetin (100ppm)
CuSO4 (100ppm)
Carbn activado
Completar a 500 ml con H2O bidestilada
Ajustar pH 5.7-5.8

14.
14.
15.

Disolver 7 g agar en 500 ml de H2O bid.

Mezclar las dos soluciones
Volmen final 1000 ml.

20,0 ml
1,0 ml
1,0 ml
3,0 ml
5,0 ml
10,0 ml
12,5 ml
30,0 gr
2,0 ml
4,8 ml
1,0 gr

Fuente: Velsquez, E. &; Mafla, G. 1999. Conservacin in vitro : Una alternativa segura para
preservar especies silvestres de Manihot spp (Euphorbiaceae) . In: Congreso Nacional de
Conservacin de la Biodiversidad (2, 1999, Bogota, Colombia). [Memorias] . Pontificia
Universidad Javeriana, Bogot, DC, CO. p. 1-14.

48

PREPARACION DE ANTIBIOTICO
1. Cortar pequeos cuadrados de papel filtro (0.5 cm X 0.5 cms)
2. Colocarlos en una caja petri , envolver la caja con papel y esterilizarlos por un periodo
de 45 minutos.
3. En la cmara de flujo laminar separar uno de otro cada papel.
4. Pesar 75 mgs de Vancomicina directamente en la cmara de flujo laminar y disolver en
15 ml de agua destilada esteril.
5. Colocar 1 o 2 gotas del antibiotico con una micropipeta en cada cuadrado.
6. Dejar que el antibiotico se seque.
7. Con una pinza esteril tome un papel conteniendo el antibiotico e introduzcalo en el tubo
de ensayo.

49

6. BIBLIOGRAFA
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