Professional Documents
Culture Documents
1.
PRT-712.02-024
Fecha emisin:
Octubre 2002
Revisin: 4
Fecha revisin:
27-05-2008
Pgina 1 de 13
OBJETIVO
FUNDAMENTO
Los Staphylococcus son microorganismos que viven en estrecha relacin con el hombre y la
gran mayora de las cepas son potencialmente capaces de causar enfermedad.
Staphylococcus aureus es un microorganismo fcilmente destruido por tratamientos trmicos
con altas temperaturas y por todos los agentes sanitizantes. Por lo cual la presencia de esta
bacteria o sus toxinas en alimentos procesados o en equipos, generalmente indica falta de
sanitizacin o contaminacin cruzada.
Los alimentos se analizan para pesquisar S.aureus por las siguientes razones:
Confirmar que este microorganismo fue el agente causal de la intoxicacin alimentaria.
Determinar qu alimentos o ingredientes de alimentos son fuente de contaminacin de
Staphylococcus aureus.
Demostrar contaminacin post proceso los cuales usualmente se deben a contacto humano
con alimentos procesados o exposicin del alimento a superficies inadecuadamente
sanitizadas.
Los alimentos comnmente asociados a intoxicaciones son: carne (vacuno, cerdo, pollo),
productos crneos (jamn, salame, vienesas) ,ensaladas (papas, porotos verdes, jamn, pollo),
productos de pastelera (cremas) y productos lcteos (queso, queso de cabra ,etc)
PROCEDIMIENTO METODO DE
PRT-712.02-024
Fecha emisin:
Octubre 2002
Revisin: 4
Fecha revisin:
27-05-2008
Pgina 2 de 13
REFERENCIAS
Bacteriological Analytical Manual Online Enero 2001.
Tcnica de coagulasa en tubo PRT-712.02-026.
Prueba de termonucleasa en cepa de S. aureus PRT-712.02-027
5.
TERMINOLOGA
No Aplica
6.
6.1
MATERIALES
EQUIPOS
6.3.1 Agar Baird Parker pH 6,8-7,0 distribuido en Frascos Schott con 475 mL (o medio
completo plaqueado)
6.3.2 Solucin yema de huevo 50%.
6.3.3 Telurito de potasio al 1% (se puede utilizar solucin yema de huevo comercial con
telurito de potasio).
6.3.4 Solucin sulfametazina 0,1% (opcional para inhibir desarrollo Proteus).
6.3.5 Agar soya tripticasa pH 7,3 0.2
PROCEDIMIENTO METODO DE
PRT-712.02-024
Fecha emisin:
Octubre 2002
Revisin: 4
Fecha revisin:
27-05-2008
Pgina 3 de 13
6.3.6 Caldo infuso cerebro corazn pH 7,4 0.2 en tubo tapa rosca de 13x100 mm
6.3.7 Plasma de conejo con EDTA o plasma fresco diluido 1:3 con agua destilada estril.(usar
preferentemente plasma comercial)
6.3.8 Agar T B-DNA
6.3.9 agar triptona extracto de levadura M 165 BAM para preparar agar glucosa y agar manitol
6.3.10 Lisostafina
6.3.11 Aceite mineral estril
6.3.12 Perxido de hidrgeno al 3%
6.3.13 Agar conservacion de cepas pH 7,2 en tubo 10x75 mm
6.3.14 Cepa control coagulasa positiva: S. aureus.
6.3.15 Cepa control coagulasa negativa: S. epidermidis
7.
DESARROLLO
7.1
7.1.1
7.1.2
7.1.3
7.1.4
Marcar en cada dilucin el volumen a sembrar en cada una de las placas Petri : 0,3 0,3
y 0,4 Ml.
7.1.5
7.1.6
Extender el inculo mediante rastrillo estril, hasta que la superficie est seca. Retener
las placas en posicin no invertida hasta que el inculo se absorba ( aprox 10 minutos).
7.1.7
7.2
LECTURA Y REGISTRO
PROCEDIMIENTO METODO DE
PRT-712.02-024
Fecha emisin:
Octubre 2002
Revisin: 4
Fecha revisin:
27-05-2008
Pgina 4 de 13
Recuento Presuntivo
Registro
7.2.2.1 Si son observados muchos tipos de colonias con apariencia similar a S. aureus en
todas las placas sembradas, registre el nmero de colonias contadas de cada tipo
separadamente.
7.2.2.2 Cuando placas de diluciones bajas tienen < 20 colonias, use este valor.
7.2.2.3 Si las placas contienen > 200 colonias de apariencia tpica y en diluciones ms altas no
hay colonias tpicas, utilizar estas placas para el recuento y no cuente las colonias no
tpicas.
7.2.2.4 Seleccionar ms de una colonia ( 3 a 5) para cada tipo de colonia contada y realizar test
de coagulasa y termonucleasa.
7.3
7.3.1
PRUEBAS CONFIRMATIVAS
Estudiar las colonias o un nmero significativo de ellas si el recuento es alto. El test de
produccin de coagulasa es especfico para la especie. Se pueden realizar otras pruebas
auxiliares como, catalasa, utilizacin anaerbica de glucosa, utilizacin anaerbica de
manitol, nucleasa termoestable, sensibilidad a la lisostafina. La termonucleasa es tan
especfica como la coagulasa pero menos subjetiva y es muy til para complementar y
confirmar los test de coagulasa registrados con lecturas de 3+, 2+ y 1+.
PROCEDIMIENTO METODO DE
PRT-712.02-024
7.3.2
7.3.3
7.4
7.4.1
7.5
Fecha emisin:
Octubre 2002
Revisin: 4
Fecha revisin:
27-05-2008
Pgina 5 de 13
EXPRESION DE RESULTADOS
Segn la proporcin de colonias coagulasa positivas calcular el nmero de ellas por
gramo de la muestra.
CALCULO
INFORME
Se expresa en ufc de S. aureus por g o mL de producto analizado
REGISTROS
Identificacin
del registro
Almacenamiento
Proteccin
Recuperacin Tiempo
retencin y
disposicin
Acceso restringido al Papel
5 aos y
Registro control Archivador verde
Registros
Laboratorio
personal
Seccin
disposicin
en
de Ambiente
N 346 Seccin
Microbiologa
basura normal
cdigo RGMicrobiologa
partidos en
712.00-009.
Alimentos
trozos
Archivador verde
Acceso restringido al Papel
5 aos y
Registro control
Registros
Laboratorio
personal
Seccin
disposicin en
de esterilidad de
Microbiologa
basura normal
medios de cultivo N 346 Seccin
Microbiologa
partidos en
utilizados en el
Alimentos
trozos
anlisis
Laboratorio 346
cdigo RG712.00-010.
PROCEDIMIENTO METODO DE
PRT-712.02-024
Fecha revisin:
27-05-2008
Pgina 6 de 13
Recuperacin Tiempo
retencin y
disposicin
Archivador azul
Acceso restringido al Papel
5 aos y
Registro anlisis
Registro
de
Lecturas
e
personal
Seccin
disposicin en
de muestras de
informes de resultado Microbiologa
basura normal
alimentos y agua
de
laboratorio
partidos en
Laboratorio de
trozos
Recuentos cdigo Recuento aerobios
mesfilos, S.
RG-712.00-023.
aureus,Mohos y
levaduras Seccin
Microbiologa
Alimentos
Archivador
Registros Acceso restringido al Papel
5 aos y
Registro
de
Entrega
diaria
personal
Seccin
disposicin en
entrega diaria de
Microbiologa
basura normal
muestras a los Laboratorio N 346
Seccin
Microbiologa
partidos en
laboratorios
Alimentos
trozos
cdigo
RG712.00-037.
9.
Almacenamiento
Fecha emisin:
Octubre 2002
Revisin: 4
Proteccin
TABLA DE MODIFICACIONES
Revisin N
3
3
Pg.
Motivo del cambio
Modificada
1
Se elimina pgina 1 por cambi en formato
documento institucional.
1 a 10
Se cambi formato del encabezado de pgina en
todo el documento.
Fecha
Aprobacin
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
PROCEDIMIENTO METODO DE
3
3
3
3
3
3
3
3
PRT-712.02-024
Fecha emisin:
Octubre 2002
Revisin: 4
Fecha revisin:
27-05-2008
Pgina 7 de 13
Pg.
Motivo del cambio
Modificada
1
En la frase del punto 2.1 se agreg: ...y agua...se
espera un recuento....
1
Se deja pie de pgina slo en pgina 1 y se
actualizan los cargos.
1
En el punto 3. se corrigi staphylococcus por
Staphylococcus
2
En el punto 4.2. se corrigi PRT-702.02-026 por
PRT-712.02-026.
3
En el punto 4.3 se corrigi PRT-702.02-027 por
PRT-712.02-027.
3
En el punto 6.0 se agreg al listado : solucin de
yema de huevo al 50%, solucin telurito de potasio
1%,( se puede utilizar solucin yema de huevo
comercial con telurito de potasio),Solucin de
sulfametazina 0,1% (opcional para inhibir el
desarrollo de Proteus), lisostafina y aceite mineral
estril.
En el punto plasma s eagreg ...(usar
preferentemente comercial).
En el punto Baird Parker se agreg ...(o medio
completo plaqueado).
4
En el punto 7.1.1 se cambi PRT-702.01-002 por
PRT-712.01-002.
4
En los puntos 7.1.2 y 7.1.3 se agreg ...y clave
interna.
4
En el punto 7.1.4 se corrigi ml por mL.
4
En el punto 7.1.5 se elimin la palabra plaqueada
4
En el punto 7.1.6 se agreg la frase:.. el inculo..
4
En el punto 7.2.1.2 se agreg : en varios alimentos y
productos lcteos pueden encontrarse cepas de
apariencia similar a S. aureus no lipolticas, salvo
que las zonas claras y opacas alrededor de la
colonia estn ausentes.
4
En el punto 7.2.1.3 se cambi RG-702.00-023 por
RG-712.00-023.
5
Se agreg el punto 7.2.2 Registros y lo temes
Fecha
Aprobacin
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
PROCEDIMIENTO METODO DE
Pg.
Modificada
5
10
PRT-712.02-024
Fecha emisin:
Octubre 2002
Revisin: 4
Fecha revisin:
27-05-2008
Pgina 8 de 13
Fecha
Aprobacin
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
PROCEDIMIENTO METODO DE
10.
Pg.
Modificada
10
10
PRT-712.02-024
Fecha emisin:
Octubre 2002
Revisin: 4
Fecha revisin:
27-05-2008
Pgina 9 de 13
Fecha
Aprobacin
27/05/2008
27/05/2008
ANEXOS
Anexo N1 Esquema recuento S. aureus Tcnica Recuento en placa por siembra en superficie.
Anexo N2 Caracterizacin de los diferentes medios de cultivo utilizados para la deteccin de
S. aureus en alimentos.
Anexo N3 Precauciones en la preparacin del medio Baird Parker.
Anexo N4 Secado de placas con agar Baird Parker.
Anexo N5 Hoja Registro anlisis de muestras de alimentos y agua Laboratorio de Recuentos
cdigo RG-712.00-023.
PROCEDIMIENTO METODO DE
PRT-712.02-024
Fecha emisin:
Octubre 2002
Revisin: 4
Fecha revisin:
27-05-2008
Pgina 10 de 13
ANEXO N 1
RECUENTO S. AUREUS
TECNICA RECUENTO EN PLACA POR SIEMBRA EN SUPERFICIE
1 mL
HOMOGENEIZADO:
9 mL AP
10 g muestra
90 mL Agua peptonada 0.1%
Dil 10 -1
10 -2
10 -3
SIEMBRA :
0,3 mL
0,3 mL
0,4 mL
0,3 mL
0,3 mL
0,4 mL
0,3 mL
0,3 mL
35 C por 48 horas
LECTURA PLACAS :
REAISLAMIENTO :
Pruebas bioqumicas
o toxinas
caldo cerebro corazn
Incubar a 35 C por 24 hrs
Agar estra
Prueba de termonucleasa
Agar TB-DNA
CONFIRMACION :
0,4 mL
PROCEDIMIENTO METODO DE
PRT-712.02-024
Fecha emisin:
Octubre 2002
Revisin: 4
Fecha revisin:
27-05-2008
Pgina 11 de 13
INCUBACION:
Incubar a 35 C por
4-18 horas
LECTURA PRUEBAS
CONFIRMATIVAS
CLCULO
INFORME
PROCEDIMIENTO METODO DE
PRT-712.02-024
Fecha emisin:
Octubre 2002
Revisin: 4
Fecha revisin:
27-05-2008
Pgina 12 de 13
ANEXO N 2
CARACTERIZACION DE LOS DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO
UTILIZADOS PARA LA DETECCION DE S. AUREUS EN ALIMENTOS
Medios de cultivo
Incubacin
KRANEP
Tiempo
hrs
48
Temp
C
35
BAIRD PARKER
48
35
TPEY
48
35
AGAR
SANGRE 24
POLIMIXINA
35
P-CSTS *
35
48
Agentes
selectivos Lectura
diferenciales y estimulantes
Cloruro de sodio
cloruro de Litio
Rodanuro de potasio
Azida de sodio
Cicloheximida
Manitol
Piruvato de sodio
Yema de huevo
Cloruro de litio
Telurito de potasio
Glicina
Piruvato de sodio
Yema de huevo
Cloruro de sodio
Cloruro de Litio
Telurito de potasio
Polimixina B
Yema de huevo
Polimixina B
Sangre de cordero
Cloruro de sodio
Piruvato de sodio
Colonias
amarillas
que degradan la yema
de huevo
Colonias negras o
grises
brillantes,
convexas
rodeadas
por un halo de
precipitacin o reas
claras.
Colonias negras o
grises
brillantes,
convexos, rodeadas
por la reaccin yema
de huevo.
Colonias
que
presentan halos de
hemlisis tipo
Turbidez
PROCEDIMIENTO METODO DE
PRT-712.02-024
Fecha emisin:
Octubre 2002
Revisin: 4
Fecha revisin:
27-05-2008
Pgina 13 de 13
ANEXO N 3
PRECAUCIONES EN LA PREPARACION DEL MEDIO BAIRD PARKER
El medio base puede ser almacenado hasta 1 mes en refrigeracin.
El medio completo no debe usarse:
- si se ha almacenado a temperatura ambiente (20C a 25 C ) por ms de 5 das.
- si el medio plaqueado ha perdido la opalescencia inicial.
En perodos prolongados de almacenamiento del medio deshidratado se reduce la
selectividad. Este efecto puede ser revertido por adicin de 0,5 mL de piruvato de sodio al
20% p/v en la superficie del medio de cultivo plaqueado y dejar secar a 50C por 1/2 hora
o hasta que la superficie de la placa est seca.
Realizar control de calidad utilizando el mtodo ecomtrico a cada partida de medio
preparado (IT-712.00- 008).
Solucin stock de sulfametazina
Disolver 0,5 g de sulfametazina en 25 mL de Hidrxido de sodio 0,1 N.
Enrasar a 250 mL con agua destilada. 27,5 mL de esta solucin aportan 0,055 g.
Adicionar la solucin de sulfametazina para reprimir el crecimiento de Proteus.
ANEXO N 4
SECADO DE PLACAS CON AGAR BAIRD PARKER
Las placas a usar deben estar secas a fin de prevenir la extensin y mezcla de colonias.
El secado de las placas se puede efectuar colocando las placas:
En un horno o incubadora a 50 C por 30 minutos, quitando la tapa y colocando la
superficie del agar hacia abajo.
En un horno o incubadora a 50 C por 2 horas con la tapa puesta y la superficie del agar
hacia arriba.
En una incubadora a 37 C por 4 horas con la tapa puesta y la superficie del agar hacia
arriba.
En la mesa del laboratorio por cerca de 16 horas a la temperatura ambiente, con las tapas
puestas y la superficie del agar hacia arriba.