Compartimientos

de la va secretora
El transporte de protenas entre compartimientos
requiere de la gemacin, translacin y fusin
de estructuras membranosas.
Microscopa electrnica

Lodish et al. MCB 1999

El retculo endoplsmico (RE) es el compartimiento de entrada de

protenas a la va secretora
El RE consiste en una red de tbulos y sacos membranosos interconectados
La red de tbulos puede visualizarse por inmunofluorescencia (A) o mediante
compuestos lipoflicos fluorescentes como la rodamina hexil ester (B).

El RE se extiende por toda la clula. Delimita un espacio denominado lmen

que ocupa > 10% del volmen de la clula, y que es continuo con el espacio
entre las dos membranas de la envoltura nuclear.

Voeltz et al., EMBORep 2002

(video disponible)

La estructura y dinmica del RE puede examinarse en clulas vivas

empleando protenas fusionadas a GFP
La PTP1B es una fosfatasa asociada al RE por su terminal carboxilo. Debajo se visualiza el RE
en una clula transfectada con un cDNA que codifica para la PTP1B fusionada a la GFP.

ER
lmen
citosol

PTP1B
GFP

La observacin de las clulas vivas requiere de un cuidadoso

control de las condiciones experimentales
microscopio invertido equipado para fluorescencia, con cmara de
incubacin que permite mantener constante la temperatura y el CO2

Los microtbulos contribuyen a la organizacin espacial del RE

Anlisis de la codistribucin y dinamismo de microtbulos y retculo endoplsmico en clulas vivas. Debajo se

muestra una clula microinyectada con tubulina conjugada a rodamina la cual se incorpora en microtbulos (en rojo).
El RE se visualiza incubando las clulas con el compuesto lipoflico fluorescente DiOC6 (en verde).
microtbulos

RE

superposicin

Las flechas blancas

largas sealan la
colocalizacin de
MTs y RE. Las
flechas amarillas
sealan el margen
de la clula.

Los tbulos del RE se extienden hacia la periferia celular empleando dos mecanismos diferentes:
1) asociacin con molculas motoras que se desplazan sobre los microtbulos en direccin del extremo (+)
2) unin a complejos proteicos localizados en los extremos (+) de los microtbulos en fase de crecimiento

(video disponible)
Waterman-Storer & Salmon, CB 1998

La tcnica de FRAP permite visualizar la dinmica de protenas en el RE

FRAP: Fluorescence Recovery After Photobleaching

"photobleaching" es la fotodestruccin de la fluorescencia emitida por un

fluorforo (ej. el de la protena GFP). Usualmente se logra con un laser.
tiempo

El perfil de recuperacin de la intensidad de

fluorescencia revela la cintica de difusin de
la molcula fluorescente y su particin en
compartimientos mviles e inmviles.

molcula
mas dinmica

Experimentalmente se registra la intensidad de la fluorescencia

dentro de una regin definida de la clula en funcin del tiempo,
antes y despus de la fotodestruccin de la fluorescencia.

intensity

fluorescence

100%

time

Cambios en la movilidad de VSVG-GFP

revelados por FRAP

VSVG es una glicoprotena viral que se expresa en

la membrana plasmtica de las clulas infectadas.
La tcnica de FRAP revela su lta movilidad durante
su trnsito por el RE (paneles de la izquierda).

VSVG-GFP

VSVG-GFP
+ Tunicamicina

la ventana muestra
la regin de
fotodestruccin de
la fluorescencia
con el lser

100% de recuperacin
de la fluorescencia

40% de recuperacin
de la fluorescencia

La inhibicin de la glicosilacin de VSVG en el RE

con la droga tunicamicina (TM) provoca su agregacin
y retencin en el RE (paneles de la derecha).

(videos disponibles)
(Nehls et al, Nature CB2000)

La tcnica de FLIP permite analizar la movilidad y continuidad del

compartimiento donde se halla la molcula fluorescente
Experimentalmente se registra la intensidad de la fluorescencia de toda la clula en funcin del tiempo
mientras se fotodestruye continuamente la fluorescencia dentro de una regin definida (rectangulo en rojo).
la intensidad de la fluorescencia total
disminuye como consecuencia del pasaje
de molculas fluorescentes por la
ventana de fotodestruccin definida.

ventana de
fotodestruccin

Ciertas variantes de GFP slo se tornan fluorescentes al ser fotoactivadas con un pulso de energa UV. Asi, la movilidad
y destino de las molculas fluorescentes puede ser examinado independientemente de la sntesis de novo.
la intensidad de la fluorescencia dentro de
la ventana de fotoactivacin disminuye
como consecuencia de la difusin
de las de molculas fluorescentes.

Lippincott-Schwartz et al, Science 2003

La tcnica de FLIP revela la localizacin de KDEL-GFP

en compartimientos discontnuos
Las protenas solubles residentes del RE (ej. BiP) escapan al cis-Golgi como consecuencia del
transporte vesicular y luego son retornadas al RE por transporte retrgrado. Estas protenas
poseen la secuencia KDEL que acta como una seal de recuperacin al RE.
Los paneles superiores muestran que la fotodestruccin solo elimina la fluorescencia de KDEL-GFP del RE
(compartimiento continuo) pero no de las vesculas de transporte entre el ER y Golgi (flechas). Los paneles
inferiores muestran que la fluorescencia de VSVG-GFP localizada en el RE es completamente eliminada.
fotodestruccin

Nehls et al NCB2000

La cintica del transporte de protenas en la va secretora puede

analizarse por microscopa
Microscopa de fluorescencia de clulas en cultivo que expresan una variante mutada termosensible de la protena viral de
membrana VSVG-ts fusionada a GFP. La incubacin de las clulas a 40C provoca la retencin de VSVG-ts en el RE. Cuando
la temperatura se baja a 32C, la VSVG se pliega correctamente y se transporta hacia la superficie. Debajo se muestra la
localizacin de la VSVG-GFP a distintos tiempos despus de comenzar la incubacin a 32C.

ER

Golgi

membrana plasmtica

fusion de vesculas con la membrana plasmtica (flechas)

videos disponibles

Hirschberg et al JCB 1998; Lippincott-Schwartz Hist. Cell Biol 2001

10

La cintica del transporte tambin puede analizarse bioquimicamente

empleando endoglicosidasas especficas

Clulas que expresan la mutante termosensible de la VSVG fueron marcadas con un pulso de aminocidos
radioactivos. A distintos tiempos despus del marcado se prepararon extractos celulares y se incubaron con
endoglicosidasa D. Los productos proteicos son analizados en geles de poliacrilamida por fluorografa.
pasaje al Golgi

la endoglicosidasa D remueve
selectivamente oligosacridos
con alto contenido en manosa
caractersticos del Golgi. Los
precursores del RE no son
eficientemente clivados por la
endoglicosidasa D.

incremento de VSVG en el Golgi

VSVG retenida en el RE

Lodish et al. MCB 2004

11

Anlisis de eventos de exocitosis mediante

epifluorescencia y TIRF en clulas vivas
parte de una clula visualizada simultaneamente
mediante epifluorescencia convencional y TIRF

epifluorescencia
TIRF

vesculas visualizadas por epifluorescencia (rojo) y TIRF (verde) de clulas transfectadas con VSVG-YFP. Cuando
la vescula se fusiona a la MP incrementa la fluorescencia de TIRF la cual difunde post-fusin (flechas).

videos disponibles

TIRFM: Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (mas sobre TIRF en clase de citoesqueleto I)

Toomre et al JCB2000

12

El anlisis gentico en levaduras permiti identificar

genes claves involucrados en el trfico intracelular
Mutantes condicionales sensibles a la temperatura (denominadas mutantes sec) se clasifican
en diferentes clases de acuerdo a la etapa del transporte afectada en los fenotipos mutantes.

El anlisis de doble mutantes revela la secuencia de eventos en la va secretora.

Lodish et al. MCB 2004

13

Retculo endoplsmico rugoso (RER)

14

La secuencia seal o secuencias de insercin determinan la topologa

de las protenas en la membrana el RE
La topologa de una protena de membrana describe el nmero de veces que la cadena
polipeptdica atraviesa la membrana y la orientacin de los dominios de transmembrana.

lmen
del RE

citosol

La orientacin de la secuencia seal y

de los dominios de transmembrana
depende bsicamente de 3 factores:
1) residuos bsicos que flanquean la
secuencia hidrofbica,
2) estructura del terminal amino,
3) hidrofobicidad y largo de la regin
hidrofbica.

Higy et al. Biochem. 2004

15

Topologa de protenas de membrana tipo I

El terminal carboxilo de la protena permanece en el citosol. La secuencia seal se orienta
con el N-terminal hacia el citosol. Es clivada durante la translocacin.
Ej: receptor de la insulina, EGFR, PDGFR, integrinas, caderinas

citosol

Una secuencia interna hidrofbica cerca del terminal carboxilo acta como
secuencia de parada de la translocacin y de insercin a la membrana.

Cooper, The Cell 2000

16

Protenas con secuencia seal no clivable: Tipo II y III

Protenas de tipo II.
El terminal amino
permance en el citosol.
Ej: receptor de transferrina,
sialil transferasa de Golgi.
Una secuencia hidrofbica interna acta como
secuencia seal, de detencin de la translocacin
y de insercin a la membrana. Su orientacin
es similar a la de las protenas de tipo I.

Protenas de tipo III.

El terminal carboxilo
permanece en el citosol.
Ej: citocromo P450.
Una secuencia hidrofbica interna, cercana
al terminal amino, acta como secuencia seal,
de parada de la translocacin y de insercin
en la membrana. La orientacin de esta secuencia
es opuesta a las de protenas de membrana tipo I.

Cooper, The Cell 2000

17

Protenas de tipo IV
las protenas de tipo IV poseen varios segmentos de transmembrana

La primer secuencia hidrofbica interna cercana al terminal amino acta como secuencia seal y de
insercin en la membrana; la segunda secuencia hidrofbica acta como secuencia de parada.
ejemplos de protenas de tipo IV: receptores acoplados a protenas G
(receptor -adrenrgico, transportador de glucosa GLUT1, sec 61, etc.
Cooper, The Cell 2000

18

Algunas protenas se anclan a la hemicapa ectoplsmica de la membrana

plasmtica por un glicosil fosfatidil inositol (GPI)

ER lumen

bicapa

citosol
Las protenas ancladas a membrana por GPI se insertan inicialmente en la membrana del RE como protenas de tipo I.
Una GPI transamidasa cliva el dominio de transmembrana y transfiere el polipptido restante a un grupo GPI preformado.
Las protenas ancladas por GPI son muy mviles en el plano de la membrana.

19

Enzimas asociadas a la cara citoslica de la membrana

del RE liso sintetizan fosfolpidos

hemicapa

hemicapa

La insercin de cido fosfatdico en la hemicapa citoslica del RE, catalizada por una acil transferasa (etapa 1),
contribuye al crecimiento de la membrana. La adicin del grupo polar o cargado es catalizado por otras
enzimas asociadas. La sntesis de fosfatidil serina, etanolamina y fosfatidil inositol ocurre de manera similar.
Alberts et al, MBC 2002

20

Las enzimas scramblasa y flipasa catalizan la translocacin de fosfolpidos

PS, PE
La enzima mezcladora scramblasa del RE equilibra los fosfolpidos en ambas hemicapas de la membrana. La enzima flipasa
en la membrana plasmtica cataliza la translocacin de fosfolpidos especficos, generando asimetra en la distribucin lipdica.

Alberts et al, MBC 2002

21

En su trnsito por la va secretora los polipptidos experimentan

diversas modificaciones antes de alcanzar sus destinos finales:

formacin de puentes disulfuro

plegado (estructura terciaria y cuaternaria)
RE y Golgi glicosilacin
Post-Golgi maduracin proteoltica
RE

Varias familias de chaperonas asisten en el plegado de los polipptidos internalizados en el RE:

- Hsp70 (ej. BiP)
- Hsp40
- Hsp90
- peptidil-prolil isomerasas
- disulfuro isomerasa
- calnexina y calreticulina

22

La formacin y rearreglo de puentes disulfuro en las protenas

es catalizado por la enzima disulfuro isomerasa (PDI)
El lmen del RE es un ambiente oxidante que favorece la formacin de puentes disulfuro.
La enzima PDI posee dos cistenas en su sitio activo que son rpidamente interconvertidas
entre su forma oxidada, formando un puente disulfuro, y su forma reducida (di-tiol).

Lodish et al. MCB 2004

23

La rotacin de los polipptidos en las uniones peptdicas que

preceden a prolinas es catalizada por peptidil-prolil-isomerasas

24

BiP, calnexina y calreticulina contribuyen al plegado del

polipptido de diferentes maneras
La chaperona Bip se une a regiones hidrofbicas del polipptido y evita su agregacin. Las chaperonas Calnexina
y Calreticulina reconocen regiones glicosiladas (monoglucosiladas) y contribuyen a monitorear el plegado del polipptido.

Lodish et al. MCB 2004

25

En protenas N-glicosiladas, oligosacridos de 14 residuos se transfieren

a la cadena naciente en un proceso co-traduccin
La glicosilacin incrementa la solubilidad
de las protenas, inhibe la agregacin y
estabiliza la conformacin del polipptido.

La enzima oligosacaril transferasa, asociada a

la cara luminal del RER, transfiere el oligosacrido
precursor a residuos asparagina en la secuencia
Asn-X-Ser/Thr del polipptido naciente.

Lodish et al. MCB 2004

26

El oligosacrido precursor se sintetiza en el citosol asociado al dolicol,

un lpido poli-isoprenoide inserto en la membrana del RE

Enzimas asociadas a la membrana del RE, catalizan a partir de

nucletido-azcares, la sntesis del oligosacrido precursor. La
tunicamicina es una droga que inhibe a la enzima de la primer reaccin.

Lodish et al. MCB 2004

27

Procesamiento del oligosacrido precursor en el ER

1- transferencia del oligosacrido precursor a la cadena polipeptdica naciente.
2 y 3- Dos glucosas terminales son removidas por GI y GII. Calnexina y calreticulina se unen al oligosacrido monoglucosilado
y facilitan el plegado del polipptido por la accin de las disulfuro isomerasas y prolil isomerasas.
4- La GII eventualmente remueve la ltima glucosa y el polipptido deglucosilado se disocia de las chaperonas. El polipptido
puede ser reglucosilado por la glucosil transferasa si aun no alcanz la conformacin nativa.
5- El polipptido que no alcanz la conformacin nativa es eventualmente demanosilado y exportado al citosol via EDEM.
6- La protena correctamente plegada no se re-glucosila y es competente para su exportacin al Golgi.

ismero reconocido
por EDEM para su
retrotranslocacin

glucosidasa I

glucosidasa II

glucosil transferasa

glucosidasa II

oligosacaril
transferasa

manosidasa
degra
dacin

4
EDEM

calreticulin
calnexin

6
glicoprotena
plegada
A Golgi

EDEM: ER Degradation Enhancing Manosidase

Lodish et al. MCB 2004

28

El ciclo de deglucosilacin-glucosilacin acta

como un control de calidad del plegado

Calnexina y calreticulina retienen a

los polipptidos monoglucosilados en
el RE. Glucosidasa II remueve la
glucosa terminal y termina la
retencin por calnexina/calreticulina.
Glucosil transferasa (GT) acta
como un sensor del plegado y solo
re-glucosila a polipptidos
parcialmente plegados. Estos son
nuevamente retenidos por
calreticulina o calnexina.

sensor del
plegado

Man9

* ERp57 es una disulfuro isomerasa que cataliza la formacin de puentes disulfuro en el polipptido.

Ellgaard et al, Science 1999

29

El control de calidad esta acoplado a mecanismos

de degradacin asociados al RE (ERAD)

ERAD (ER-Associated Degradation)

ERAD es un proceso que involucra varias etapas:

(man8)

EDEM
(lectina)

sec61

- seleccin del substrato con defectos en el plegado ("misfolded")

- desplegado del substrato y transferencia al translocn (1)
- translocacin del substrato hacia el citosol (2)
- ubiquitinacin y degradacin en el proteosoma (3,4)
Ubiquitin-ligasa

EDEM = ER Degradation Enhancing Manosidase es una lectina

de la membrana del RE que se une a un ismero especfico del
oligosacrido con 8 manosas y lo transfiere al translocon.

(Man)8(GlcNAc)2

Tsai et al NRMCB2002

30

El control de calidad en el RE esta acoplado a mecanismos adaptativos

que disparan una respuesta transcripcional (UPR)
(Unfolded protein response = UPR)

Estrs del RE. Es un estado en el cual el

influjo de polipptidos al RE excede su
capacidad de plegar y/o procesar los polipptidos.
En ese estado se acumulan protenas mal plegadas
o estados intermediarios y se dispara la respuesta UPR.

BiP
BiP
BiP

Transmembrane
sensors

IRE1
PERK
ATF6

- IRE1
- PERK
- ATF6

IRE1 oligomerizacin procesamiento de Hac/XBP1 mRNA sntesis de chaperonas (ej. BiP) y de EDEM
PERK oligomerizacin fosforilacin de eIF-2 sntesis de protenas
ATF6 exportacin al Golgi proteasas clivan el TM translocacin al ncleo sntesis de chaperonas (ej. BiP)

31

Mecanismo de respuesta transcripcional mediado por IRE1

1. Ire1 y PERK son protenas de transmembrana del RE
capaces de dimerizar en su porcin luminal. En
condiciones normales BiP se une a la regin
luminal y previene la dimerizacin. Durante el
de estrs del RE, BiP se disocia y se favorece
la dimerizacin de Ire1 y PERK.
2. El dmero de Ire1 se autofosforila y
activa el dominio de endoribonucleasa que remueve
el intrn en el mRNA de Hac1 (XBP1 en mamferos).
3. Los dos exones del factor de transcripcin Hac1/XBP1
son ligados y forman un mRNA maduro.
4. El mRNA es traducido en el citosol, Hac1/XBP1 se
transloca al ncleo y activa la transcripcin de genes que
codifican para chaperonas del RER (ej. BiP) y componentes
de la maquinaria de degradacin (ej. EDEM) .

ATF es una protena de transmembrana de tipo II, que se

une a BiP por el dominio luminal. La disociacin de BiP
como consecuencia de estrs, desenmascara secuencias
de localizacin a Golgi en ATF. En Golgi, el dominio de
transmembrana de ATF es clivado y ATF soluble se
transloca al ncleo, activando transcripcin.

Lodish et al. MCB 2004

32

 ocurre en sitios discretos, sin ribosomas asociados (tER)

requiere del reclutamiento transitorio de protenas
citoslicas y del ensamble de un complejo multiproteico
es en gran medida un proceso selectivo
ocurre en estructuras tubulo-vesiculares cuyo
movimiento depende de microtbulos

33

Las vesculas que emergen del RE se fusionan formando estructuras

tubulo-vesiculares que se tranlocan al cis Golgi por microtbulos
Existe un transporte bi-direccional de protenas entre el RE
y Golgi. El transporte RE Golgi es mediado por vesculas
con cubierta COP II. El transporte retrgrado Golgi RE es
mediado por vesculas con cubierta de protenas COP I.
cis Golgi
network

Los sitios de exportacin del RE, tER o ERES, son

subdominios de la membrana del RE a partir de los
cuales emergen las vesculas con cubierta de COP II.

Debajo se muestra la localizacin de una mutante termosensible de VSVG-GFP que es retenida en el RE a 40C (A).
Cuando la temperatura se baja a 32C la VSVG-GFP se acumula rpidamente en sitios de exportacin tER o ERES (B).
A tiempos posteriores la protena ya ha llegado al Golgi (C).
A

Ellgaard & Helenius, NRMCB 2003

video disponible (Presley et al 1997)

34

El transporte antergrado hacia el Golgi depende de dinenas que se

translocan hacia el extremo (-) de microtbulos
Las estructuras tubulo-vesiculares emergentes e intermediarias se unen a dinenas
y microtbulos y migran en direccin al centrosoma de localizacin perinuclear.
membrana
plasmtica

microtbulos

El Golgi (en naranja) posee

una localizacin perinuclear.
protenas de
coatmeros

ncleo

Donaldson & Lippincott-Schwartz, Cell 2000

35

Las protenas cargo de transmembrana son seleccionadas en base a

seales o motivos localizados en sus dominios citoslicos
Las seales de exportacin consisten en motivos de aminocidos cidos, bsicos o hidrofbicos
y son esenciales para su interaccin con las protenas de la cubierta COP II.

Bonifacino and Glick, Cell 2004

36

La exportacin de las protenas cargo solubles ocurre de manera

pasiva o por mecanismos activos
Se postulan dos modelos de exportacin de protenas cargo solubles del RE: (a) incorporacin pasiva de protenas
en las vesculas COP II; (b) concentracin activa de las protenas mediada por receptores de transmembrana. En ambos
modelos, las protenas residentes del RE (R) son diferencialmente retenidas en el lmen de la vescula en formacin.

pasivo,
no ocurre
concentracin
del cargo

R
activo,
concentracin
del cargo

Las enzimas amilasa y

quimiotripsingeno son
ejemplos de exportacin
pasiva (a) cuya concentracin
ocurre en el compartimiento
tubulovesicular. ERGIC53 es
un receptor requerido para la
secrecin de varias glicoprotenas
que responden al modelo
de exportacin (b)

Barlowe, TICS 2003

37

Modelo de ensamble de la cubierta de protenas COP II

Las protenas de la cubierta deforman la membrana y seleccionan cargos

3
1
2

El proceso de formacin de vesculas con cubierta COP II ocurre de acuerdo a la siguiente secuencia:
1) Asociacin de la GTPasa Sar1 a la membrana del RE. Este paso requiere del intercambio del GDP por GTP en Sar1
catalizado por la protena de membrana sec 12 (GEF). Sar1-GTP inserta una alfa hlice del N-terminal en la membrana
del RE e inicia su deformacin.
2) Sar1-GTP recluta las protenas sec23/sec24 las cuales ensamblan una cubierta que curvan la membrana. Existen al
menos 4 isoformas de protenas Sec24 las cuales poseen diferentes sitios de interaccin para diversas seales de
exportacin de protenas de transmembrana (cargo).
3) La cubierta de sec23-sec24 recluta complejos de protenas sec13/31 que ensamblan una capa externa y completan
la formacin de la vescula cubierta.
4) Fisin de la vescula y desensamble de la cubierta, evento que requiere de la hidrlisis del GTP de Sar1 (no mostrado).
Bonifacino & Glick, Cell 2004

38

Protenas solubles residentes del RE que escapan al Golgi retornan al RE

por un mecanismo especfico dependiente del tetrapptido KDEL

La secuencia KDEL esta presente en el terminal

carboxilo de protenas solubles del RE (ej. BiP).
Esta secuencia es reconocida por un receptor de
transmembrana en el medio ligeramente cido
del cis Golgi. El complejo KDEL/Receptor retorna
al RE en vesculas con cubierta COP I. En el medio
neutro del RE el complejo se disocia.

cis Golgi
pH < 7

RE lumen
pH ~ 7

Lodish et al. MCB 1999

39

Protenas de membrana residentes del RE poseen

seales de retencin especficas en su tallo citoslico
Ejemplos:
KKXX
RXR
Estas seales son requeridas para la interaccin
con protenas COP I que recubren las vesculas
de retorno al RE.
Las seales de retencin al RE representan mecanismos de control de calidad. Algunas protenas oligomricas exponen las
seales de retencin en los monmeros pero estas quedan ocultas en la estructura cuaternaria de los oligmeros (A).
En otros casos, la fosforilacin de serinas adyacentes recluta protenas 14-3-3 que enmascaran la seal de retencin (B).
Algunas protenas de membrana forman complejos con protenas citoslicas que ocultan la seal de retencin (C).

B
RE
lmen

oligomerizacin

citosol

COP I
recuperacin
al RE

Al Golgi

RE
lmen

fosforilacin

Al Golgi

RE
lmen

citosol

COP I
recuperacin
al RE

14-3-3

complejo

Al Golgi

citosol

40

Modelo de ensamble de
cubiertas COP I

ERGIC/VTC y cis Golgi cisterna

1

1. La GTPasa ARF-GDP se asocia a un receptor asociado

a la membrana del Golgi que intercambia el GDP por GTP.
ARF-GTP se inserta en la membrana e inicia su deformacin.
2. ARF-GTP recluta complejos protecos del citosol denominados
coatomeros y que ensamblan la cubierta COP I. Las subunidades
de los coatomeros seleccionan las protenas cargo y tambin una
ARF-GAP.

3. La hidrlisis de ARF-GTP mediada por ARF-GAP dispara

la fisin y desensamblaje de la cubierta COP I.

Las subunidades de los coatmeros reconocen

motivos en los dominios citoslicos de
protenas de transmembrana. Ej: KKXX y RXR
3

ERGIC: ER to Golgi Complex; VTC: Vesicular Tubular Cluster

Lodish et al. MCB 1999

41

El Golgi es una estructura dinmica y polarizada donde

se procesan, de manera secuencial, glicoprotenas y glicolpidos
El Golgi consiste de sacos o cisternas que transportan material de manera antergrada. Puesto que el Golgi es una estructura
dinmica, en estado estacionario, existe un continuo reflujo de protenas por transporte retrgrado. El sitio de entrada del Golgi
se denomina cis-Golgi, las cisternas intermedias constituyen el medial-Golgi, y las mas distales, el trans-Golgi. Vesculas y
tbulos que emergen del trans-Golgi forman la red del trans-Golgi (TGN).

Golgi
Sacos del Golgi en una clula
vegetal. Microscopa electrnica
cis

transporte
antergrado

principales funciones del Golgi

transporte
retrgrado

trans

- Modificacin y procesamiento de carbohidratos en lpidos y protenas

- Distribucin y transporte
- Sitio de anclaje de protenas de sealizacin, distribucin y del citoesqueleto

42

La inhibicin del flujo de protenas a travs del Golgi

provoca su desaparicin
La incubacin de clulas con brefeldina A, una droga que inhibe la exportacin de protenas del RE al Golgi
pero no el transporte Golgi RE provoca la reabsorcin del cis-Golgi en el RE. Este efecto se visualiza filmando
la redistribucin de una galactosil transferasa fusionada a GFP desde el Golgi al RE (fotos debajo).

Golgi

RE

video disponible
Sciaky et al., JCB 1997

43

Las distintas cisternas del Golgi

contienen una batera de enzimas
que modifican los oligosacridos
de las protenas en trnsito

P
GlcNAc fosfo
transferasa

las glicosil transferasas son protenas de

transmembrana, cuyo dominio cataltico
intraluminal agrega monosacridos especficos
a los aceptores en trnsito. Cada enzima
mantiene una localizacin intra-Golgi restringida.

manosidasa
lisosomal
protein

GlcNAc transferasa

manosidasa

GlcNAc transferasa

fucosil
transferasa

Dependiendo de la protena, se observan dos tipos

de N-oligosacridos en las protenas maduras:
- oligosacridos con alto contenido de manosa
(similar al precursor que proviene del RE)
- oligosacridos complejos. Resultan de la
eliminacin de manosas y el agregado de GlcNAc,
galactosa y cido silico en el medial/trans-Golgi.

Gal transferasa

sialil
transferasa

Lodish et al. MCB 1999

44

Estructuras de
oligosacridos
encontrados
en glicoprotenas

(red del
trans Golgi)

(trans Golgi)

tipos:
O-oligosacridos
N-oligosacridos
- alta manosa
- complejos

(red del
trans Golgi)
(trans Golgi)
(ER, red del
cis Golgi)

(motivos en protenas aceptoras:

Asn-X-Ser o Asn-X-Thr)

Lodish et al. MCB 1999

45

Las estructuras tubulo-vesiculares que emergen del trans-Golgi forman una red o TGN. Lass vesculas requieren de una accin
coordinada de traccin de la membrana mediada por molculas motoras asociadas a microtbulos y eventos de fisin mediada
por la generacin y acumulacin de diacil glicerol. Un aumento descontrolado del proceso de fisin produce la fragmentacin del
Golgi en pequeas vesculas (b); en contraste, su inhibicin produce la formacin de largas estructuras tubulares (c).

Bard & Malhotra, ARCDB 2006

46

Transporte a lisosomas: Las hidrolasas lisosomales son direccionadas

del trans-Golgi a endosomas tardos mediante una seal de M6P
M6P

la seal de manosa 6-fosfato es introducida por la GluNac fosfotransferasa

del cis-Golgi. Esta enzima se une a precursores lisosomales N-glicosilados
reconociendo una seal tridimensional en la estructura nativa. En una
primera reaccin la enzima transfiere GluNac fosfato al carbono 6 de
manosas. En un segundo paso otra enzima remueve la GluNac.

47

Los precursores lisosomales se unen a receptores de M6P en el

trans-Golgi y se empaquetan en vesculas cubiertas con clatrina
Receptores de transmembrana de M6P concentran a los precursores lisosomales en el trans-Golgi y son empaquetados en
vesculas de clatrina (1). Estas vesculas se fusionan con endosomas tardos donde el pH cido provoca la disociacin
del complejo M6P-receptor (2). Fosfatasas remueven el fosfato de las M6P. Los precursores lisosomales se segregan en
vesculas de transporte que se fusionan a lisosomas (3). Los receptores de M6P son retornados al Golgi (4) o, raramente
transportados a la superficie donde contribuyen a internalizar precursores lisosomales.

4
1
2

pH 6,5

pH 5-5,5

Lodish et al. MCB 1999

48

La Clatrina contribuye a la formacin de vesculas que emergen de

del trans-Golgi y de la membrana plasmtica

Cada molcula de clatrina consiste de tres subunidades grandes y tres pequeas.

Numerosas molculas de clatrina ensamblan una celda proteica asociada a la membrana.

video

49

Protenas adaptadoras son reclutadas por ARF-GTP a la membrana

que dar origen a vesculas de clatrina
TGN,
endosomas

Las protenas adaptadoras cumplen tres funciones

esenciales:
- seleccionan las protenas cargo
- reclutan molculas de clatrina a la membrana
- interaccionan con protenas accesorias que
regulan el ensamble y desensamble de las
protenas de la cubierta (ej. Arf).
Las protenas adaptadoras descriptas son
monomricas (GGA) o tetramricas (AP1).
Las protenas adaptadoras asociadas a clatrina
reconocen motivos especficos en los dominios
citoslicos de protenas de transmembrana. Ej:
NPXY AP2
YXX AP1 y AP2
LL AP2

TGN,
endosomas

TGN, PM

TGN,
endosomas

Bonifacino & Traub, ARB 2003

50

Modelo de formacin
de vesculas con clatrina

cargo
Arf
(AP)

La formacin de vesculas en el TGN ocurre de acuerdo a la siguiente secuencia:

1. ARF-GTP se asocia al TGN y recluta complejos de protenas adaptadoras
(ej. AP, GGAs) que a su vez reclutan protenas cargo y molculas de clatrina.
2. El ensamble de la canasta de clatrina deforma la membrana.
3. Fisin del cuello y formacin de la vescula. Este evento requiere de la
GTPasa dinamina y de la hidrlisis de GTP.
4. Desensamble de la canasta de clatrina por chaperonas
(hsp70, auxilina), proceso que requiere de hidrlisis de ATP.

51

La GTPasa dinamina es esencial para la fisin de vesculas con clatrina.

Este proceso requiere de la hidrlisis del GTP

microscopa electrnica

cuello

molculas de dinamina detectadas

con un anticuerpo anti-dinamina unido
a granos de oro coloidal

52

Transporte a la membrana plasmtica:

Anlisis por video-microscopa de fluorescencia en clulas vivas revela
que del TGN emergen vesculas y estructuras tubulares

Clulas transfectadas con VSVG-GFP. La flecha seala la produccin de una estructura tubular
y la fisin de una vescula del extremo distal.

video disponible
Hirschberg et al., JCB 1998

53

En clulas epiteliales polarizadas existen mecanismos selectivos de

transporte de protenas a la membrana apical y basolateral
apical
protenas ancladas por GPI
y el virus de la influenza son
marcadores apicales. El virus
VSV, caderinas e integrinas
son marcadores basolaterales.

basolateral

Algunas protenas apicales de membrana se transportan al dominio apical por una va directa a partir del Post-Golgi (A, rojo).
Otras protenas se transportan al dominio apical por una va indirecta que involucra el transporte e insercin en la membrana
basolateral y luego su re-direccionamiento por endocitosis a la cara apical (B, rojo). Este proceso se denomina transcitosis.
The Art of MBC, Garland Publ. 1995

54

Determinantes moleculares que contribuyen al direccionamiento

de protenas a los dominios apical y basolateral
seales para localizacin apical y basolateral
tipo

localizacin de la seal

ejemplos

basolateral
YXX..............................citoplasmtica..............VSVG, caderinas
LL/IL................................citoplasmtica..............receptor de Fc
otras................................citoplasmtica..............TfR, LDLR
apical
anclaje de GPI..................membrana..................Thy-1
N-oligosacridos...............luminal........................eritropoietina
transmembrana.................membrana..................hemaglutinina

Microdominios (~70 nm dimetro) formados en

la membrana del trans-Golgi y en la membrana
apical de las clulas epiteliales, denominados
lipid rafts, concentran protenas ancladas por
GPI y protenas que poseen un dominio de
transmembrana mas largo que el resto.

55

La segregacin de protenas al dominio apical y basolateral puede

visualizarse empleando protenas fluorescentes

Clulas epiteliales polarizadas se transfectaron con cDNAs que codifican para protenas fluorescentes. A la izquierda se
muestra la localizacin apical de una YFP modificada mediante el agregado de un ancla de GPI. A la derecha se muestra la
localizacin basolateral de una YFP fusionada a la protena VSVG. Las clulas se observan en dos planos confocales (A y B).
YFP-GPI

VSVG-YFP
A

B
B

observacin de un
plano superficial (A)

observacin de un
plano ecuatorial (B)

Keller et al, Nature CB 2001

56

Visualizacin de la segregacin de protenas del

dominio apical y basolateral en el Golgi

Clulas transfectadas con CFP-GPI (verde) y VSVG-YFP (rojo). Note la segregacin

de tbulos conteniendo CFP-GPI y VSVG-YFP de la misma estructura (flechas).

(video disponible)
Keller et al, Nature CB 2001

57

El dominio apical en clulas epiteliales es equivalente al axn

en neuronas y el dominio basolateral al soma y dendritas

HA

HA
influenza virus
+ VSV virus

influenza virus
+ VSV virus

VSVG

VSVG

Alberts et al. MBC 2002

58

Las clulas poseen mecanismos de exocitosis constitutivos y regulados

protenas cuya secrecin es regulada

forman agregados en el trans-Golgi
con las protenas cromogranina A y B
y la secretogranina II.

Alberts et al. MBC 2002

59

Ejemplos de protenas secretadas en forma constitutiva y regulada

Protein Type

Example

Site of Synthesis

Constitutive Secretory Proteins

Serum proteins

Albumin
Transferrin (Fe transporter)
Lipoproteins
Immunoglobulins
Extracellular matrix proteins Collagen
Fibronectin
Proteoglycans

Liver (hepatocyte)
Liver
Liver, intestine
Lymphocytes
Fibroblasts, others
Fibroblasts, liver
Fibroblasts, others

Regulated Secretory Proteins

Peptide hormones

Digestive enzymes

Milk proteins

Insulin
Glucagon
Endorphins
Enkephalins
ACTH
Trypsin
Chymotrypsin
Amylase
Ribonuclease
Deoxyribonuclease
Casein
Lactalbumin

Pancreatic -islet cells

Pancreatic -islet cells
Neurosecretory cells
Neurosecretory cells
Anterior pituitary lobe
Pancreatic acini
Pancreatic acini
Pancreatic acini, salivary glands
Pancreatic acini
Pancreatic acini
Mammary gland
Mammary gland

60

Las protenas de secrecin y de membrana frecuentemente requieren del

procesamiento proteoltico en el trans-Golgi para generar la forma madura

Una familia de endoproteasas denominadas

pro-protein convertasas (PC) y furinas se
localizan en la red del trans-Golgi y clivan
polipptidos despus de la secuencia dibsica
Arg-Arg o Lys-Arg.

61

La insulina se secreta de manera regulada en clulas beta del pncreas

El aumento de glucosa en sangre produce una mayor captacin por los receptores GLUT2 (1). La degradacin de la
glucosa a piruvato produce ATP (2) el cual induce el cierre de canales de potasio dependientes de ATP (3). Esto
provoca una depolarizacin localizada de la membrana (4) que induce la apertura de los canales de calcio dependientes
de voltaje (5). El aumento de calcio citoslico dispara la fusin de vesculas secretoras que contienen insulina (6).

Lodish et al. MCB 2004

62

Exocitosis regulada
Microscopa electrnica de una clula beta del pncreas endcrino
que exocita vesculas conteniendo insulina

63

Exocitosis regulada
Secrecin de histamina por mastocitos
Microscopa electrnica de mastocitos antes (A) y despus (B) de liberar sus grnulos de histamina.
La exocitosis es disparada por la agregacin de los receptores de IgE en su superficie

64

Exocitosis regulada
Las neuronas secretan neurotransmisores en respuesta a la
llegada de un potencial de accin al terminal axonal

axn

65

66

Las protenas Rabs y SNARE controlan la especificidad de la fusin

entre membranas del compartimiento donor y aceptor
Eventos posteriores al desensamble de la cubierta

Las GTPasas Rab-GDP se encuentran en el

citosol. El intercambio del GDP por GTP catalizado
por un GEF induce la asociacin de Rab-GTP a
la membrana de la vescula de transporte. Rab-GTP
interacciona con receptores en la membrana aceptora
anclando la vescula a la membrana blanco.

Protenas integrales de membrana denominadas

v-SNARE se incorporan a la vescula durante
su formacin. La fusin requiere de la formacin
de un complejo tetramrico entre v-SNARE, y tSNAREs.

v-SNARE

t-SNAREs

SNARE: Soluble NSF Attachment REceptors

67

Los complejos trans-SNARE se forman

entre dominios coiled coil de
v-SNARE y t-SNAREs. Los
complejos trans-SNARE cumplen dos
funciones: inducir la fusin de las
membranas y contribuir a la
especificidad de la fusin.
El calcio dispara la fusin.

v-SNARE
t-SNAREs
+ Ca2+
fusin
Posterior a la fusin de las membranas, las
protenas -SNAP reclutan a la ATPasa NSF
a los complejos cis-SNARE. NSF hidroliza el ATP
y desensambla los complejos cis-SNARE.

NSF: N-ethylmaleimide Sensitive Factor

68

69

Las vesculas cubiertas median transporte de materiales entre compartimientos.

Eventos esenciales son la asociacin de GTPasas al sitio de emergencia de la
vescula, el reclutamiento de las protenas de la cubierta y la seleccin del cargo.

Lodish et al 2004

70

La cubierta se desensambla despus de formarse la vescula.

Se exponen protenas que determinan la especificidad de la fusin con receptores en la membrana aceptora.

v/t-SNARE
complex

Lodish et al 2004

71

Visualizacin del proceso de formacin de vesculas cubiertas.

El ensamble de la cubierta provoca la curvatura de la membrana.
Microscopa electrnica

Lodish et al 2004

72

Resumen de tipos de vesculas cubiertas y GTPasas involucradas

Lodish et al MBC 2004

73

Resumen de las propiedades de las cubiertas proteicas

involucradas en el transporte vesicular

74

Resumen de la gnesis, transporte y fusin de vesculas

Bonifacino & Glick, Cell 2004

1. Ensamble de la cubierta. Evento disparado por la asociacin de una GTPasa (esfera roja) a la membrana del compartimiento
donor. Las protenas cargo y protenas v-SNARE se concentran en la vescula en formacin.
2. Gemacin. Los componentes externos de la cubierta se ensamblan en una malla que curva la membrana y forman la vescula.
3. Fisin del cuello entre la vescula y el compartimiento donor. En este evento intervienen protenas accesorias.
4. Desensamble de la cubierta. Participan chaperonas, fosfoinostidos y GTPasas. Las protenas de la cubierta son recicladas
5. Transporte de la vescula hasta el compartimiento aceptor mediado por microtbulos y protenas motoras.
6. Anclaje mediado por la interaccin de las GTPasas Rab y sus receptores.
7. Fusin mediada por la formacin de los complejos trans-SNARE (v- y t-SNARE + SNAP 25).

75