MYCOBACTERIUM

Mycobacterium es el nico gnero de la familia de las bacterias Mycobacteriaceae. Por

las caractersticas nicas entre otros gneros bacterianos y por la importancia mdica de
las mismas, se estudian en la subrama de la Microbiologa llamada micobacteriologia.
El gnero Mycobacterium est formado por bacilos aerbios inmviles y no esporulados
con un tamao de 0,2 a 0,6 x 1 a 10 mcm, algunos de los cules son patgenos que
causan graves enfermedades en los mamferos, incluyendo tuberculosis y lepra.
Caractersticas:

Bacilos aerobios obligados

Inmviles
No esporulados
Miden de 0.2 um a 0.4 um x 2 um a 10 um
Son bacilos acido alcohol resistentes, debido a la complejidad de la pared celular
que poseen.
In vitro, su crecimiento es lento, dividindose cada 12 o 24 horas .

Las caractersticas ms importantes del genero Mycobacterium, estn determinadas por

la complejidad de su pared celular. Las Micobacterias poseen una pared celular
compleja y rica en lpidos. Esta pared celular es la responsable de muchas de las
propiedades caractersticas de las bacterias:

Su cido alcohol resistencia

Crecimiento lento
Resistencia a detergentes
Resistencia a antibacterianos comunes
Antigenecidad

Los lpidos de la pared celular de los microorganismos pertenecientes a los generos

Mycobacterium, Nocardia y Corynebacterium, constituyen ms del 60% del peso seco
de la pared bacteriana. En sus paredes contienen unas molculas llamadas cidos
miclicos.

Adems, la pared celular de las Micobacterias contiene una capa de pptidoglicano,

cuya estructura es similar a la encontrada en las paredes de las bacterias gramnegativos,
denominado; lipoarabinomanano (LAM) esta molcula es compleja, y se extiende desde

la membrana plasmtica hasta la superficie celular. El LAM es anlogo desde el punto

de vista estructural y funcional al lipopolisacrido de las bacterias gramnegativas.

El pptidoglicano est unido a un polisacrido ramificado llamado arabinogalactano por

enlaces fosfodister. Los extremos distales del arabinogalactano estn esterificados con
el cido miclico de alto peso molecular. Estos glucolpidos de alto peso molecular
tienen un esqueleto carbonado cuya longitud oscila entre C78 y C90. En mycobacterium
tuberculosis, el nico cido miclico 6,6 dimicoliltrehalosa es conocido como el
factor cordn.
El complejo peptidoglicano-cido micolico-arabino-galactano forma el esqueleto de las
paredes celulares de las micobacterias.2

A. Mycobacterium tuberculosis3

Es el agente causal de la tuberculosis, una de las enfermedades infectocontagiosas ms

letales y antiguas que afecta al ser humano y que posee una amplia distribucin en el
mundo, produciendo cada ao la muerte de alrededor de 2 millones de personas. Quien
la describi por primera vez, el 24 de marzo de 1882, fue Robert Koch, a quien
posteriormente (en 1905) se otorg el premio Nobel de Fisiologa o Medicina.
Desafortunadamente an no se conoce con claridad cules son los principales factores
de virulencia de M.tuberculosis involucrados en el desarrollo de la patogenicidad de
este microorganismo.
Fisiopatologa:
Es una bacteria alcohol-cido resistente, frecuentemente incolora, aerbica estricta. Su
crecimiento est subordinado a presencia de oxgeno y al valor del pH circundante. Es
muy resistente a las condiciones de fro, congelacin y desecacin. Por el contrario, es
muy sensible a las de calor, luz solar y luz ultravioleta. In vitro se destruye mediante
pasteurizacin a 80 C.

Su multiplicacin es muy lenta: se divide cada 16 a 20 horas. Ante circunstancias

adversas puede entrar en estado latente, y retrasar su multiplicacin desde algunos das
hasta varios aos. El reservorio natural de M. tuberculosis es el ser humano, tanto el
sano infectado como el enfermo.

Puede causar enfermedad en cualquier rgano del cuerpo. Lo ms frecuente es la

infeccin en los pulmones. De ah, por va sangunea o linftica, se propaga a otros
rganos. Los sntomas aparecen cuando las lesiones son ya muy extensas. En estas
condiciones, el diagnstico se establece cuando el padecimiento est muy avanzado.
Los sntomas que lo delatan son: fiebre, sudoracin, adelgazamiento, expectoracin
purulenta y tos. Provocan lesiones tisulares (tubrculos). Donde participan linfocitos
CD4+ y citotxicos generan respuesta inmune. Por su parte, las clulas NK (natural
killer) eliminan macrfagos y linfocitos infectados.
El medio de cultivo ms usado y ms adecuado es el de Lowenstein Jensen. Tambin se
utiliza el medio Ogawa. Para que el desarrollo de la bacteria sea visible
macroscpicamente (a simple vista) sobre el medio de cultivo se requieren por lo menos
15 das, y hasta ocho semanas de incubacin. Se debe incubar un promedio de 30 das.
Sus colonias son de color blanco cremoso, esfricas, secas, rugosas, opacas, polimorfas
y de dimensiones variables.
Los laboratorios especializados realizan pruebas de susceptibilidad antibitica
(antibiogramas) de las cepas aisladas y que oponen resistencia al tratamiento
convencional.

M. tuberculosis resistentes
Un problema que se est extendiendo en los ltimos aos es la aparicin de M.
tuberculosis resistentes a antibiticos. En funcin de la las resistencias a antibiticos
que presentan las distintas cepas, podemos distinguir:
Multiresistentes (MDR): Que son bacterias que desarrollan resistencia frente a
rifampicina (RMP) e isoniacida (INH), que son los tratamientos de primera lnea.
Ultrarresistentes (XDR): Bacterias resistentes a drogas de primera lnea y a cualquier
miembro de la familia de las fluoroquinolonas y al menos frente a uno de segunda lnea
(kanamicina (KAN) o capromicina (CPM)).
Han sido identificadas mutaciones en un nmero limitado de genes y regiones
intergnicas (IGRs) en cepas resistentes de M. tuberculosis, pero an no estn
claras todas las causas genticas de la resistencia a antibiticos
Diagnstico

El diagnstico de la presencia de los Mycobacterium se puede realizar por microscopa

de los frotis de esputo, pus, lquido cerebro espinal, orina, heces fecales, ganglios
linfticos y otros tejidos, mediante el empleo del mtodo de Ziehl-Neelsen caracterstico
para bacterias cido -alcohol resistentes.

En los mataderos se utilizan las lesiones macroscpicas caractersticas. Tambin, se

emplean las pruebas de tuberculina alrgica mediante la reaccin cutnea en los
animales y el hombre. Pueden emplearse mtodos biolgicos mediante la inoculacin de
conejos, caballos y pollos, donde Mycobacterium tuberculoso mata al curiel;
Mycobacterium bovis mata al conejo y al curiel, y Mycobacterium aviar mata al pollo,
este es el nico que la elimina y puede matar al conejo pero sin tuberculomas visibles en
las vsceras.
En la tuberculosis tambin se pueden usar pruebas de fijacin de complemento y
reacciones de hemoaglufinacin indirecta. Para el diagnstico en el laboratorio a partir
de rganos de animales se pue- den enviar pulmones, rganos digestivos y ganglios, en
dependencia de la localizacin de las lesiones.
En Cuba se fabrica y se usa de forma rutinaria la tuberculina mamfera para el
diagnstico preventivo indirecto de la tuberculosis. Esta tuberculina contiene productos
metablicos y estrados de cepas de Mycobacterium tuberculoso humano y bovino, la
cual se inocula por va intradrmica en dosis de 1,2 mL en la regin cervical ya que en
esta las reacciones son ms intensas que en el pliegue anocaudal. Las reacciones
positivas se aprecian a las 72 horas por una hinchazn firme.
La paratuberculosis se diagnostica de acuerdo con el cuadro clnico, tpico de diarreas
crnicas, caquexia y engrosamiento de la mucosa intestinal con aspecto cerebriforime.
Otros mtodos de diagnstico son la demostracin de bacilos cido-alcohol resistentes
en extensiones de heces fecales o raspado intestinal, la prueba alrgica endovenosa de la
Johnina que produce inquietud, temblores y fiebre a las 4 u 8 horas. Adems existe una
prueba alrgica cutnea de aplicacin intradrmica, cuya reaccin positiva en la tabla
del cuello debe producir un aumento de ms de 3 minutos en 48 horas.
Para el diagnstico, no basta con los sntomas clnicos, sino que es necesario el
aislamiento en el laboratorio mediante la siembra de muestras adecuadas y la tincin a
travs del mtodo de Ziehl-Neelsen, adems de utilizar diferentes pruebas bioqumicas y
de la caracterizacin de los cultivos.

B. Mycobacterium leprae,4,5
Mycobacterium leprae, es una especie bacteriana, tambin conocida con el nombre de
bacilo de Hansen, es la bacteria que causa la lepra o "enfermedad de Hansen". Es
intracelular y pleomrfica, aunque usualmente tiene forma de bastn, es cido-alcohol
resistente, aerobia y slo remotamente emparentada con Mycobacterium tuberculosis.

Fue la primera bacteria patgena descubierta en tejidos infectados. Fue descubierta en

1874 por G. Armauer Hansen en Noruega. Presenta una longitud entre 1 y 7 micras y un
espesor entre 0,3-0,5 micras. Este organismo nunca ha podido ser multiplicado
exitosamente en un medio de cultivo artificial.
Mycobacterium leprae es sensible a las dapsonas (el primer tratamiento efectivo
descubierto para la lepra), pero resistente a los antibiticos desarrollados
posteriormente. Normalmente se necesita una combinacin de dapsona, rifampicina y
clofazimina (tratamiento recomendado por la OMS).
El Mycobacterium leprae se trasmite a travs de los objetos contaminados, por contacto.
Esta condicin se favorece cuando disminuye la temperatura. No se ha podido
comprobar su suceptibilidad en los animales, pero se ha comprobado que afecta en gran
medida al hombre (provoca la lepra).
Los grmenes del gnero Mycobacterium no forman esporas, son cido-alcohol
resistente, inmvil, aerobios obligados, grampositivos y crecen lentamente en los
medios de cultivo.
Son bacilos cido-resistentes que tienden a agruparse en heces o masas globulares
(globis), en los frotis de raspados de piel o mucosas.
No se ha podido cultivar este microorganismo en medios artificiales. Se desarrollan
lesiones locales cuando los bacilos de la lepra humana inoculan en la planta de las patas
de ratones y armadillos.

Patogenia
Produce la lepra, una enfermedad granulomatosa crnica, de comienzo insidioso, que
tiene un perodo de incubacin de varios aos.
La lepra es una infeccin causada por el Mycobacterium leprae que es un parsito
intracelular obligado que se multiplica lentamente en clulas fagocitarias
mononucleares como los histiocitos de la piel y en las clulas de Schwann de los
nervios.
Clasificacin:
Existen dos tipos diferentes de Mycobacterium leprae: el lepromatoso y el tuberculoide.
a. Tipo lepramotoso
En l, el curso es el progresivo, con lesiones nodulares cutneas; involucracin insidiosa
de troncos nerviosos; bacilos cido-resistentes abundantes en las lesiones cutneas, y
una prueba cutnea de la lepromina negativa (extracto de tejido lepromatoso).

b. Tipo tuberculoide

En l, el curso es benigno, con lesiones maculares cutneas, involucracin grave de los

troncos nerviosos de iniciacin brusca, con pocos bacilos presentes en las lesiones y una
prueba cutnea de lepromina positiva.

I.

PRETRATAMIENTO DE MUESTRAS

Una vez que la muestra fue recolectada, el proceso siguiente es la descontaminacindigestin. Las micobacterias son ms r es i s ten tes que las dems bacterias de flora
normal o microbiota debido a la alta cantidad de l p i d os en su p ared cel u l ar , por
consecuente estas son ms res i s ten t es a las soluciones acidas y alcalinas que
normalmente eliminan a las dems bacterias. De esta manera, es posible utilizar agentes
descontainantes o bactericidas que eliminen a la microbiota normal que las acompaen
en la muestra a analizar. El cu l ti vo mi crob i ol gi co de las micobacterias se lleva
en promedio hasta 3 semanas, por lo que es importante eliminar la microbiota normal
para evitar un sobrecrecimiento de estas y as obtener un mejor crecimiento el cultivo.
Los procesos de digestin-descontaminacin, solo pueden ser establecidos y realizados
por laboratorios clasificados en el n i vel I I d e s ervi ci os . Estos procesos requieren
de un manejo cuidadoso dentro de una ca mp an a d e s egu ri d ad junto con todas las
medidas de b i o s e g u ri da d disponibles en las instalaciones del laboratorio de n i v el I I .
1 . DIGESTION Y DESCONTAMINACIN
Como anteriormente se ha mencionado, una vez obtenida la muestra a analizar y es
considerado el diagnstico microbiolgico por cu l ti vo , se debe de tener en cuenta el
proceso de digestin-descontaminacin antes del inoculo en el med i o d e cu l ti vo .
Las muestras; respiratorias, lquidos de lavado gstrico, heces, orina, tejidos
postmortem., son las muestras ms frecuentemente sometidas al proceso de digestindescontaminacin, en especial si estas presentan una consistencia mucosa o que de
antemano es reconocida como una muestra que trae consigo un exceso de microbiota.
Los agentes ms comnmente utilizado para este proceso son los que a continuacin se
describen:

Agentes ms utilizados para la descontaminacin de las muestras

AGENTE

N-acetil-L-cistena
ms 2 % de NaOH .

Ditiotreitol ms 2%
de NaOH .

COMENTARIOS
Solucin de descontaminacin leve con una agente mucoltico
NALC para liberar las micobacterias atrapadas en el mucus. Lmite
de exposicin al NaOH de 15 minutos.
Agente mucoltico muy efectivo usado con NaOH al 2%. El nombre
comercial del ditiotreitol es Sputolysin. El reactivo es ms costoso
que el NALC. Lmite de exposicin al NaOH de 15 minutos.
Preferido

por

los

laboratorios

que

no

pueden

controlar

Fosfato trisdico al 13 cuidadosamente el tiempo de exposicin a la solucin de

% ms cloruro de descontaminacin.
benzalconio
(Zephiran).

El Zephiran debe ser neutralizado con lecitina y no inoculado a

medio de cultivo sobre la base de huevo
Es la solucin tradicional de descontaminacin y concentracin. El

NaOH al 4 %

tiempo de exposicin debe de ser cuidadosamente controlado a no

ms de 15 minutos. El NaOH al 4 % ejerce accin mucoltica para
promover la concentracin para la centrifugacin.

Fosfato trisdico al 13
%

cido oxlico al 5 %

Puede ser utilizada para la descontaminacin de muestras cuando el

tiempo de exposicin se puede controlar en forma precisa. No es tan
efectivo como la mezcla FTS-Zephiran.
Ms

til

en

el

procesamiento

de

muestras

que

contienenPseudomona aeruginosa como contaminante.

Cloruro de cetilpiridio Efectivo como solucin de descontaminacin para muestras de

al 1% ms 2% de esputo enviadas a otros laboratorios. El bacilo tuberculoso ha
NaCl

sobrevivido 8 das de trnsito sin prdida significativa.

* N-actil-L-cistena (NALC). Es el agente ms frecuentemente utilizado en los laboratorios

clnicos:

1.1. PRINCIPIO DEL N-ACETIL-L-CISTENA MS 2 % DE NAOH.

Las micobacterias se recuperan de manera ptima a partir de materiales clnicos cuando
se libera de mucina, lquidos corporales y clulas (digestin). La N-acetil-L-Cistena
(NALC) es un agente mucoltico que en concentraciones del 0,5 al 2% puede digerir
con rapidez el esputo adherente y otras muestras mucoides en el trmino de 2 minutos.
El crecimiento de las micobacterias en los medios de cultivo tambin se incrementa
cuando

la

concentracin

de

microorganismos

competidores

es

mnima

(descontaminacin). El agregado de hidrxido de sodio al 4 % (NaOH 4%)a la mezcla

de digestin, hasta alcanzar un concentracin final del 2%, es el procedimiento
descontaminante utilizado con ms frecuencia.

1.2. PROCEDIMIENTO ESTNDAR DE DIGESTIN-DESCONTAMINACIN

ESTANDR DESARROLLADO POR KUBICA Y COL. EN LOS "CENTERS
FOR DISEASE CONTROL (CDC). "

1. Preparacin: Se prepara la sustancia digestiva acetilcistena-lcali como sigue:

Mezclar 50 mL de citrato trisdico-3 H2O al 2,94% (0,1M) con 50 mL de NaOH al 4%.
agregar a esta solucin 0,5 g de N-acetil-L-cistena (NALC) en polvo antes de usarla.
El NaOH (el cual se convierte en una solucin al 2% despus de mezclar partes iguales
con la muestra) sirve como agente descontaminante. En ocasiones la concentracin de
NaOH debe ser aumentada al 3% (solucin original al 6%), en pocas de calor o en el
tratamiento de muestras provenientes de pacientes con grandes cavidadees pulmonares
asociadas con descontaminacin bacteriana persistente.
El NALC es un agente mucoltico sin actividad anti-bactericida que licua el mucus por
clivaje de puentes disulfuro, lo cual libera las micobacterias y hace ms fcil
concentrarlas mediante centrifugacin con alta velocidad.

2. Utilizar tubos de centrfuga de plstico de 50 mL con tapas de cierre hermtico para

el procesamiento de todas las muestras. Agregar la mezcla digestiva NALC en un
volmenes igual al de la muestra. Tpicamente se utiliza un volumen de 10 - 15 mL de
muestra. Cerrar bien fuerte la tapa.
3. Homogenizar la mezcla con un mezclador vortex durante 15 - 20 minutos, agitando
los tubos peridicamente. Se debe poner adecuada atencin al tiempo de digestin, el
cual no debe de exceder de los 20 minutos, de lo contrario ser menor la probabilidad de
obtener un cu l ti vo positivo.
4. Despus del paso de la digestin-descontaminacin,
agregar buffer fosfato a pH 6,8 (preferentemente hecho con
agua estril) hasta el anillo superior del tubo. Mezclar bien.
*NOTA. El buffer fosfato hace menos probable las
desviaciones bruscas de pH y tambin sirve para lavar la
muestra, para diluir y neutralizar las sustancias txicas y
para reducir la densidad de la muestra de modo que la
centrifugacin sea ms efectiva para la sedimentacin de
los microorganismos.
5. Concentrar las muestras por centrifugacin a 2.000 3.000 revoluciones durante 15-20 minutos. Puede utilizarse

una centrfuga refrigerada a velocidades ms altas para aumentar ms la cantidad de

micobacterias.
6. Despus de la centrifugacin, decantar todo el sobrenadante cuidadosamente en un
recipiente a prueba de salpicaduras que contenga un desinfectante fenlico. Limpiar la
boca del tubo con una torunda de algodn embebida con fenol al 5 %. Agregar una
pequea cantidad de buffer-fosfato pH 6,8 (1 - 2mL) y resuspender el sedimento con
una pipeta Pasteur. A pesar de que en el pasado se aconsejaba el agregado de una
pequea cantidad de albmina srica, esto ahora se evita porque aumenta las
posibilidades de contaminacin y constituye un retraso potencial en el tiempo de
deteccin.
7. En este ltimo paso, el sedimento es trasferido en una cantidad de 0,2 a 0,4 mL del
concentrado a los med i os d e cu l ti vo seleccionados. Adems se preparan tres frotis
para tincin y bsqueda de bacilos acidorresistentes.
* NOTA. La b aci l os c op a realizada en este paso se realiza con el fin de confirmar
positiva la presencia de micobacterias en la muestra mas no interpretar los resultados
como un grado o estado de la enfermedad, interpretacin que si es realizada en
una b aci l os co p i a comn en esputo.

2. CENTRIFUGACIN.
Una buena centrifugacin es pieza clave para obtener mayor cantidad de micobacterias
en el sedimento.
Como ya se ha descrito anteriormente, las micobacterias
poseen gran cantidad de lpidos en su pared celular. El lpido
tiene el efecto de que el microorganismo tenga muy baja
densidad. Si se pretende que sedimente la mayor cantidad de
microorganismos durante la centrifugacin, la densidad del
lquido en el que se suspende la muestra debe ser mantenida
tan baja como sea posible, y la fuerza de centrifugacin
aplicada a la muestra debe ser tan alta como sea prctico.

En si, la fuerza de centrifugacin a la que se debe someter las muestras para el

aislamiento de micobacterias, debe de ser a una fuerza de 3.000 g promedio. A esta
fuerza de centrifugacin o una mayor, los tubos de vidrio o de plstico pueden
colapsarse y deben ser colocados en cubetas precintadas. As mismo a altas velocidades
se genera un calor considerable y suelen requerirse centrifugas refrigerada.6,7

II.

MEDIOS DE CULTIVO DE LA MYCOBACTERIAS

El aislamiento de mycobacterias a partir del cultivo de muestras clnicas contina siendo

fundamental

para

el

diagnstico

especfico

de

las

infecciones

por

estos

microorganismos. El cultivo ha demostrado ser ms sensible (101-102 bacterias

viables/ml) que el examen microscpico. Adems, el aislamiento del agente causal
permite la identificacin de la especie, los posteriores estudios de sensibilidad frente a
los antimicrobianos, as como la monitorizacin del tratamiento y curacin del paciente.
Las mycobacterias suelen ser bastante exigentes y requirieren medios ricos y frescos.
Existen medios selectivos con diversos antibiticos para prevenir el crecimiento de la
flora bacteriana o fngica acompaante.
Aunque los medios no selectivos no contienen antibiticos, poseen algunas sustancias
inhibidoras para el control de bacterias contaminantes, como son los colorantes de
anilina (verde de malaquita o cristal violeta). Su concentracin suele ser crucial para
mantener el equilibrio entre la recuperacin microbacteriana deseada y la posible
contaminacin a partir de las muestras de territorios no estriles. Si la concentracin es
muy elevada puede llegar a afectar seriamente el crecimiento micobacteriano.
En general, para el aislamiento primario a partir de muestras clnicas se prefieren
medios no selectivos, lquidos y, a ser posible, la combinacin de uno lquido y uno
slido.

1. MEDIOS SLIDOS.
Se pueden dividir en dos grupos bsicos: medios con huevo o con agar.

1.1. Medios slidos con huevo. Son medios ricos que contienen huevo (entero o slo
yema), fcula de patata, sales, glicerol y un agente inhibidor como es el verde de
malaquita. Las ventajas fundamentales radican en la buena recuperacin de gran parte

de las especies micobacterianas y su buena capacidad tanto, inhibidora de la flora

contaminante, como tamponante que permite neutralizar mltiples productos txicos
presentes en las muestras clnicas, as como algunos restos de diversos productos
descontaminantes. Adems, poseen una vida media prolongada cuando se conservan a
2-8 C (6 meses) y las pruebas fenotpicas de identificacin, realizadas a partir de
subcultivos provienen de estos medios, son bastante fidedignas. Sin embargo, son
medios difciles de preparar (coagulacin a 85-95 C) lo que conlleva algunas
variaciones de un lote a otro. Esto puede influir en la concentracin final de los
antimicrobianos en las pruebas de sensibilidad in vitro. Tambin presentan, a veces,
algunos problemas para distinguir entre los restos del inculo y el crecimiento
micobacteriano. Por ltimo, cuando se contaminan se afecta todo el medio pudiendo
llegar a licuarse.
El medio ms utilizado es el Lwenstein-Jensen, aunque existen otros en virtud de su
mayor (Petragnani) o menor capacidad inhibitoria de la flora acompaante (Coletsos o
American Thoracic Society) que depende tan slo de la concentracin de verde de
malaquita.

1.2. Medios slidos con agar. Estos medios sintticos, tipo 7H10 y 7H11 de
Middlebrook, son transparentes y permiten una deteccin rpida del crecimiento
micobacteriano (10-12 das) que puede distinguirse de los residuos de la muestra en la
siembra. Adems se pueden utilizar para las pruebas de sensibilidad a los
antimicrobianos.
La inclusin de un 2% de glicerol permite un mejor crecimiento del complejo M.
avium-intracellulare. El medio 7H11 contiene un 0,1% de hidrolizado de casena que
favorece la recuperacin de las cepas de M. tuberculosis resistentes a la isoniacida. Los
principales inconvenientes residen en un precio superior a los medios con huevo, una
vida media corta (1 mes a 2-8 C) y una mayor tasa de contaminaciones al contener una
concentracin menor de verde de malaquita. El almacenaje es delicado ya que un exceso
de temperatura o exposicin a la luz puede deteriorar el medio y estimular la produccin
de formaldehdo que es txico para las micobacterias.

1.3. Medios selectivos. Son medios no rutinarios con o sin huevo que contienen agentes
antimicrobianos para inhibir la contaminacin bacteriana y/o mictica acompaante.

Cuando se decida utilizarlos, debera hacerse en combinacin con un medio no

selectivo.
1.4. Medios especiales. Algunas Micobacterias requieren enriquecimientos especiales,
como ocurre en M. haemophilum, donde un suplemento de hemina, hemoglobina o
citrato amnico frrico es necesario.

2. MEDIOS BIFSICOS.

El medio ms conocido es el sistema Septi-Chek que consiste en una botella con un

medio lquido (7H9 de Middlebrook) y suplementos antibiticos y de enriquecimiento,
al que se le aade en la parte superior de la botella diversos medios slidos (agar
chocolate, Lwenstein-Jensen, 7H10 o 7H11 de Middlebrook). Esto permite distinguir
las contaminaciones y los cultivos mixtos. Adems es posible obtener un crecimiento
adecuado tanto en la fase lquida como slida para la identificacin, sin requerir un
subcultivos posterior. En conjunto, sin llegar a la rapidez de deteccin de los sistemas
automticos o semiautomticos, obtiene una sensibilidad similar a stos y mejora
ostensiblemente el rendimiento de los medios convencionales. Por lo tanto, este medio
representa una buena opcin para los laboratorios con bajo nmero de muestras, al ser
algo ms econmico y no precisar un gran equipamiento. Sin embargo, no permite
llevar a cabo estudios de sensibilidad a los antimicrobianos.

3. MEDIOS LQUIDOS.

En general, son medios muy enriquecidos que recuperan un mayor nmero de

micobacterias y es rpidamente que los medios slidos. Por ello se aconseja incluirlos
siempre para el aislamiento primario de muestras clnicas. Adems estos medios se
utilizan como base para diversas pruebas de identificacin bioqumica y de sensibilidad
a los antimicrobianos. Por el contrario, tienen la desventaja de no poder visualizar la
morfologa de la colonia ni valorar los posibles cultivos mixtos. Aparte de los clsicos
7H9 de Middlebrook, Dubos, Youmans, Proskauer-Beck, etc., existen una serie de
sistemas comerciales que, utilizando la base de los convencionales, logran un alto
rendimiento. Los objetivos actuales para el cultivo de micobacterias, se basan en la

utilizacin de sistemas totalmente automatizados de incubacin y lectura, y en los que

pueden realizarse pruebas de sensibilidad in vitro a los antimicrobianos.

3.1. Medios de lectura manual. Aunque los medios convencionales se pueden

confeccionar en el propio laboratorio, existen medios comercializados que intentan
facilitar la lectura para una rpida deteccin del crecimiento bacteriano. Los ms
utilizados son el MB Redox y el MGIT, que ofrecen una rentabilidad superior a los
medios slidos y pueden ser una alternativa en laboratorios con un nmero bajo de
muestras.

3.1.1. MB Redox. Se basa en el medio de Kirchner con unos suplementos de

antibiticos y de enriquecimiento. Para la deteccin del crecimiento micobacteriano
incorpora una sal de tetrazolio como indicador redox. Cuando existe un crecimiento
activo, la sal se reduce y precipita en la pared bacteriana. Esto produce unas partculas
de color rosa o violeta que se pueden ver directamente. Se trata, por tanto, de un medio
simple, fcil de usar y que no precisa instrumentacin especial alguna.

3.1.2. MGIT (Mycobacterial Growth Indicator

Tube). Es un medio fluoromtrico basado en un 7H9 de Middelbrook con un
componente fluorescente (pentahidrato de rutenio) embebido en silicona. Bajo la luz
ultravioleta el crecimiento se aprecia mediante la visualizacin de un brillo fluorescente
anaranjado en la superficie y en el fondo del tubo como consecuencia de una deplecin
de O2. Es un medio sencillo que permite la lectura manual simultnea de diversos
cultivos sin necesitar, al igual que el MB redox, un gran equipamiento, salvo una fuente
de luz ultravioleta. Sin embargo, el MGIT tiene el inconveniente de requerir una mayor
manipulacin, ya que se le deben aadir los suplementos de antibiticos y de
enriquecimiento, y stos, al no utilizar agujas ni jeringuillas, deben aadirse con una
pipeta, teniendo que abrir los tapones de rosca de los tubos. Por otro lado, ello le
permite tener una vida media mayor que el MB redox que, al tener ya incorporados los
suplementos debe, adems, conservarse refrigerado (2-8C). El tubo de MGIT es el
mismo que se emplea en el sistema automtico de cultivo y deteccin MGIT 960.
Asimismo, puede utilizarse para las pruebas de sensibilidad de M. tuberculosis a los
antimicobacterianos de primera lnea.

3.2. Sistemas de deteccin automtica o semiautomtica. La introduccin del

BACTEC 460 TB en la dcada de los ochenta revolucion el cultivo de estos
microorganismos, mejorando la recuperacin de todo tipo de micobacterias y
disminuyendo considerablemente el tiempo de deteccin de las mismas. A pesar de ser
el patrn de referencia desde entonces, sus problemas, sobre todo, derivados de la
utilizacin de istopos radiactivos, han llevado al desarrollo de nuevos sistemas
automatizados no radiomtricos como son: ESP II System, MB/BacT ALERT 3D y
MGIT 960. Aunque estos sistemas presentan un mayor nmero de contaminaciones, la
rentabilidad global obtenida hasta la fecha es comparable al sistema radiomtrico.
Adems de no utilizar istopos radiactivos, presentan otras importantes ventajas como
son: la automatizacin, la sencillez y la desaparicin de la posible contaminacin
cruzada al tener mtodos de deteccin que no implican una manipulacin del contenido
de los tubos.

3.2.1. Sistema BACTEC 460TB. Es un sistema semiautomtico de cultivo y

deteccin del crecimiento micobacteriano para todo tipo de muestras, incluidas las
hemticas. Utiliza el medio lquido 7H12 de Middlebrook que es un caldo base de 7H9
de Middlebrook que contiene cido palmtico marcado con 14C. Tras ser metabolizado
el substrato por la bacteria, libera 14CO2 a la fase area que se mide por el aparato y
cuyo ndice refleja la cantidad de microorganismo existente en el medio. Este mtodo
puede utilizarse tambin para la identificacin presuntiva (utilizando pnitro- aminohidroxipiofenona -NAP) y pruebas de sensibilidad. No obstante, aunque sigue siendo
til, especialmente para las pruebas de sensibilidad, presenta las desventajas de, sobre
todo, utilizar istopos radiactivos (14C), no estar automatizado, contaminacin cruzada
potencial, posible produccin de aerosoles durante la manipulacin y lectura, y tener un
precio elevado. En la actualidad est siendo sustituido por los sistemas automatizados
no radiomtricos que se detallan a continuacin.

3.2.2. Sistema ESP Culture System II. Es un sistema automtico no

radiomtrico de monitorizacin continua, para la deteccin y determinacin de la
sensibilidad de micobacterias. La media base consta de un 7H9 de Middlebrook con
suplementos antibiticos y de enriquecimiento y unas esponjas de celulosa incluidas en
el medio para ofrecer un hbitat natural y mayor superficie de cultivo. La deteccin se
realiza mediante sensores de presin que detectan el consumo de oxgeno. El sistema

efecta lecturas cada dos horas generando un grfico para cada cultivo y a travs de un
sistema experto determina si el cultivo es positivo o negativo. Tiene capacidad para
1920 cultivos simultneos. Admite cualquier mtodo clsico de descontaminacin y
puede utilizarse para todo tipo de muestras, incluyendo sangre y mdula sea. Las
pruebas de sensibilidad estn disponibles para tres frmacos: isoniacida, rifampicina y
etambutol.

3.2.3. Sistema MB/BacT ALERT 3D. Sistema automatizado de cultivo

colorimtrico que detecta la produccin de CO2 como indicador de crecimiento
bacteriano. El medio utilizado es el bsico 7H9 de Middlebrook suplementado con
factores de crecimiento y una solucin antibitica para las muestras de origen no estril.
Con una monitorizacin continua, los cultivos permanecen en el incubador-lector sin un
manejo adicional hasta que el equipo notifica su positividad o bien su negatividad tras el
periodo de incubacin fijado.
La capacidad de cultivo es variable y muy verstil ya que permite la adicin de
mltiples armarios incubadoras de 40 cultivos cada uno. Otra ventaja es que puede
utilizarse, al igual que el ESP Culture System II, con todo tipo de nuestras, incluidas las
sanguneas. A diferencia de este slo admite el mtodo de descontaminacin de la
NaOH-NALC (N-acetil-L-cistena). Recientemente se han empezado a realizar las
pruebas de sensibilidad en M. tuberculosis a los antimicobacterianos de primera lnea,
sin incluir la pirazinamida. La aplicacin de estas pruebas en la rutina de los
laboratorios clnicos se encuentra en evaluacin.

3.2.4. Sistema BACTEC MGIT 960. Es el ltimo sistema automatizado que ha

aparecido en el mercado. Este sistema utiliza el medio MGIT, detectando consumo de
O2 mediante unos sensores fluoromtricos. Un aspecto relevante de este medio (MGIT)
es que los tubos poseen tapones de rosca, evitando el uso de agujas y jeringuillas. Los
resultados se proporcionan como positivos o negativos y en unidades de crecimiento.
Bsicamente, es un sistema de gran capacidad (960 cultivos) diseado para laboratorios
con un gran volumen de muestras (8.000 por ao aprox.). Este mtodo no puede
utilizarse en muestras hemticas y, al igual que el MB/BacT ALERT 3D, slo admite el
mtodo de descontaminacin de NaOH-NALC (N-acetil-L-cistena).
Recientemente, se ha introducido para la realizacin de las pruebas de sensibilidad de
M. tuberculosis a los antimicobacterianos de primera lnea, incluida la pirazinamida.

Aunque ha sido aprobado por la FDA (Food and Drug Administration) y los datos
iniciales son muy prometedores, la utilizacin sistemtica de estas pruebas en los
laboratorios de Microbiologa est en proceso de consolidacin y consenso general.

3.2.5. Sistema BACTEC serie 9000. Se trata de un sistema automatizado de

hemocultivos convencionales que, mediante un software y un medio de cultivo
especfico, puede utilizarse para la recuperacin de micobacterias en muestras
hemticas. Es un sistema colorimtrico con una capacidad de 50 a 240 cultivos que
complementara el MGIT 960. 7.4. CONDICIONES DE INCUBACIN.
La mayora de las especies tienen un buen crecimiento a 35-37C. No obstante, en
algunas muestras clnicas (piel y tejidos blandos) donde pueden intervenir especies (M.
marinum, M. chelonae, M. haemphilum, M. ulcerans, etc.) cuya temperatura de
incubacin ptima es menor, se debern sembrar e incubar un grupo adicional de
cultivos entre 25 y 33C. En la actualidad, ello es factible en los cultivos de lectura
manual.
Un aspecto importante para mejorar el crecimiento en los medios slidos es la
incubacin con un 5-10% de CO2 que, en el caso del Lwenstein-Jensen, puede
reducirse a los primeros 7-10 das tras la siembra, incubando despus en una estufa
convencional.
Como regla general, el tiempo de incubacin debe ser prolongado. Aunque no hay un
acuerdo unnime, el periodo de 6-8 semanas parece ser el ms adecuado. Ante la
sospecha de una Micobacterias de crecimiento muy lento, muestras sanguneas o
aquellas con una baciloscopia o amplificacin gentica positiva, se podra alargar la
incubacin 4 semanas ms.
La lectura de los cultivos manuales se adaptar a las necesidades y posibilidades de cada
laboratorio. Una recomendacin general sera una lectura a los 3-5 das de la siembra y
posteriormente, 2 veces a la semana durante las 4 primeras semanas, seguida de una
lectura semanal hasta el final de la incubacin.8

III.

PRUEBA DE SENSIBILIDAD A TUBERCULOSTTICOS

M. tuberculosis adquiere resistencia a los medicamentos antituberculosos mediante

mutaciones que se producen en el cromosoma bacteriano. Hasta el momento no existen
evidencias de que ocurra otro tipo de mecanismo en M. tuberculosis. Las mutaciones
responsables de la resistencia medicamentosa se producen con una baja frecuencia, pero
constante, y esta frecuencia vara segn el medicamento. La exposicin al medicamento
no induce a mutaciones, sino ms bien permite la seleccin y replicacin de los
mutantes ya existentes, por destruccin de las bacterias sensibles que de otra manera
competiran por los nutrientes.9
El mtodo de las proporciones de CANETTI, RIST Y GROSSET es el que se utiliza
para establecer la sensibilidad o la resistencia de una cepa de M. tuberculosis a las
distintas drogas antituberculosas. Este mtodo consiste en medir la proporcin de
bacterias resistentes que existen en cada cepa.9
UTILIDAD DE LA PRUEBA DE SENSIBILIDAD
Clnica individual:9
Cuando el paciente ha abandonado, en ms de 2 veces, el tratamiento.
Cuando el paciente tiene ms de dos episodios de tratamiento.
Cuando el paciente no negativiza (fracaso) luego de 6to mes de tratamiento.
En todo paciente VIH/SIDA.

Estudios epidemiolgicos9
Para determinar la resistencia primaria (RP) y la resistencia adquirida (RA).
Resistencia Primaria (RP): Es aquella que se observa en pacientes que nunca
recibieron tratamiento antituberculoso.
Resistencia Adquirida (RA): Es aquella que aparece en el curso del tratamiento,
usualmente como resultado de un rgimen teraputico inadecuado, fallas en la
prescripcin, falta de cumplimiento del tratamiento de parte del paciente.

Los criterios de resistencia son9

Concentracin Crtica: Es la concentracin capaz de inhibir el desarrollo de todas o
casi todas las cepas salvajes (cepas aisladas de pacientes nunca tratados).
Proporcin Crtica: Es la proporcin de mutantes resistentes de una poblacin bacilar,
por encima de la cual la cepa es considerada resistente.

Tabla 1. Criterios de Resistencia de M. tuberculosis9

Concentracin

Drogas

Proporcin crtica (%)

crtica (mcg/mL)
Isoniacida (INH)

0.2

Estreptomicina (SM)

4.0

Etambutol (EMB)

2.0

Rifampicina (RFP)

40.0

a=

Nmero de bacilos cultivables (colonias en el medio sin droga).

b=

Nmero de bacilos resistentes de la poblacin total (colonias

desarrolladas en el medio con droga)

(b/a)x100 (Para determinar la resistencia de la cepa)

Se cuentan cuidadosamente las colonias desarrolladas en los tubos controles de la serie

en que es posible hacerlo; la media de la suma de las colonias contadas en los dos tubos
control indica el nmero de bacilos sembrados por tubo.
En la misma serie se cuentan las colonias desarrolladas en cada una de los tubos con
droga. La relacin entre el nmero de mutantes resistentes a determinada droga y el
nmero de bacilos sembrados (tubos control) multiplicada por 100 da el porcentaje de
resistencia a esa droga.
Comparando este porcentaje con la proporcin crtica establecida para esa droga se
determina si la cepa es sensible o resistente.

MATERIALES PARA LA PRUEBA DE SENSIBILIDAD9,10

Patrn turbidimtrico, Escala de McFarland N 1.
Cepa en estudio.
Gradilla de metal.
Propipeta.
Pipeta de 10 mL.
14 pipetas de 1 mL graduadas en centsimos.
Una esptula de acero quirrgico estril.
Un matraz con agua destilada estril.
Seis tubos, cada uno con 9 mL de agua destilada estril y rotulada: 10 -1, 10-2, 103

, 10-4, 10-5, 10-6.

Procedimiento9,10
Todo el procedimiento debe realizarse en una Cabina de Bioseguridad Tipo II.
a) Preparacin de la suspensin bacilar:
Distribuir 3 mL de agua destilada estril en tubos de prueba de 20 x 150 mm
estril, con tapn de algodn.
Extraer las colonias de la cepa en estudio con una esptula, cogiendo el mayor
nmero posible.
Colocar las colonias en la pared interna del tubo, humedecer stas con el agua.
Triturar las colonias con ayuda de una bagueta esmerilada estril, hasta lograr
homogenizarlas.
Mezclar suavemente con la ayuda de la bagueta, hasta obtener una suspensin
homognea.
Dejar reposar la suspensin por unos minutos hasta sedimentar.
Tomar el sobrenadante y ajustar la turbidez de la suspensin (suspensin madre)
comparando con el patrn de turbidez que contiene un miligramo/mL de masa
bacilar.

b) Preparacin de Diluciones:
Distribuir 9 mL de agua destilada estril a cada uno de los 6 tubos (20x150 mm)
Previamente esterilizados y roturarlos del 1 al 6.
Preparar diluciones al dcimo de 10-1 a 10-6.
Con una pipeta aspirar 1 mL del sobrenadante de la suspensin madre agregar al
tubo rotulado con 10-1, cambiar de pipeta y mezclar bien para homogenizarlo.
Tomar 1 mL de la dilucin 10-1 y agregar al tubo rotulado con 10-2, y
homogenizar bien. Continuar con las diluciones as sucesivamente hasta llegar al
tubo rotulado con 10-6.
Es importante cambiar de pipeta en cada dilucin.
Separar los tubos 10-3, 10-5, 10-6.
c) Siembra:
Antes de la siembra verificar si los medios contiene lquido de condensacin, el
cual debe eliminarse.
Serie 1. Dilucin 10-3
Se siembra 0,2 mL de la dilucin a cada uno de los siguientes tubos:
2 tubos de medio Lowenstein-Jensen sin droga, es el tubo Control.
1 tubo con medio Lowenstein-Jensen con Isoniacida.
1 tubo con medio Lowenstein-Jensen con Estreptomicina.
1 tubo con medio Lowenstein-Jensen con Etambutol.
1 tubo con medio Lowenstein-Jensen con Rifampicina.
Serie 2. Dilucin 10-5
Se siembra 0,2 ml de la dilucin a cada uno de los siguientes tubos:
2 tubos de medio Lowenstein-Jensen sin droga, es el tubo Control.
1 tubo con medio Lowenstein-Jensen con Isoniacida.
1 tubo con medio Lowenstein-Jensen con Estreptomicina.
1 tubo con medio Lowenstein-Jensen con Etambutol.
1 tubo con medio Lowenstein-Jensen con Rifampicina.

Serie 3. Dilucin 10-6

Se siembra 0,2 mL de la dilucin a 2 tubos de medio Lowenstein-Jensen sin droga, tubo
Control.
Para la siembra de las diluciones (10-3, 10-5 y 10-6) se utilizarn pipetas
diferentes de 1 mL graduada al dcimo.
Una vez sembradas las tres series, se toma cada tubo por sus extremos
mantenindolo en posicin horizontal y hacindolo rotar suavemente para que la
suspensin sembrada se distribuya sobre toda la superficie del medio.
Los tubos se colocan en una bandeja de madera de fondo inclinado para
mantenerlos en posicin horizontal. La bandeja se lleva a estufa de 37 C,
cuidando que los tubos no roten, pues si esto sucede las colonias se desarrollarn
en el borde del medio y no podrn ser contadas.
Los tubos que se utilizan para el medio de cultivo tienen tapa rosca, stas deben
mantenerse sueltas durante las primeras 48 horas o hasta que se evapore la parte
lquida de la siembra, despus de lo cual se ajustarn fuertemente.
d) Lectura e Interpretacin de Resultados9
Se realizan dos lecturas: 1ra. lectura a las 4 semanas y 2da. lectura a las 6
semanas.
Se cuentan cuidadosamente las colonias desarrolladas en los 2 tubos control de
cada serie, la media de la suma de las colonias contadas indica el nmero de
bacilos sembrados por tubo.
Luego se cuentan las colonias desarrolladas en los tubos con droga.
Como se sabe que la suspensin madre de la cepa en estudio contiene 1 mg/mL de masa
bacilar. Sin embargo la cantidad de bacilos en 1 mg de masa bacilar vara
considerablemente de una cepa a otra; esta variacin puede ser de un milln a 100
millones de gmenes. Por ello es necesario sembrar las dos diluciones 10-3 y 10-5.
A veces no es posible contar las colonias en los tubos de control de ninguna de las series
10-3 y 10-5, en estos casos las colonias en el tubo 10-6 permitir calcular el nmero de
colonias.

En casos en que el nmero de colonias desarrolladas en los tubos de control de la serie

10-3 sea inferior a 200, se debe repetir la prueba.

PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LA PIRAZINAMIDA9,10

PIRAZINAMIDA (PZA) Es una amida del cido pirazinoico, droga activa a pH cido
es bactericida contra Mycobacterium tuberculosis.
PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LA PIRAZINAMIDA MTODO DE WAYNE
Fundamento:
Las cepas de M. tuberculosis que son sensibles a la pirazinamida poseen la enzima
pirazinamidasa, que metaboliza la pirazinamida en cido pirazinoico.
Las cepas pirazinamida resistente han perdido su actividad pirazinamidasa.
Procedimiento:
Con un asa recoger de 5 a 10 mg de masa bacilar de un cultivo de 4 semanas e
inocular sobre la superficie del medio Dubos.
Incubar a 37C x 4 das.
Al cuarto da retirar los tubos de la estufa y agregar 1 ml solucin sulfato ferroso
amoniacal 1% y colocar los tubos a - 4C x 4 horas.
Lectura e interpretacin:
Sensible: Banda rosada de difusin de sal ferrosa indica hidrlisis de la
pirazinamida con formacin de cido pirazinoico.
Resistente: No se observa banda rosada.

Figura

I.

Prueba

de

sensibilidad

la

DE

LA

Pirazinamida.

fuente: Public health Mycobacteriology CDC USA

INDICACIONES

PARA

LA

REALIZACION

PRUEBA

DE

SENSIBILIDAD10
Cultivo positivo obtenido de muestras de pacientes:
Al trmino del quinto mes de tratamiento.
En retratamiento.
Multitratados.
HIV Positivos/SIDA.
Para estudios epidemiolgicos de Resistencia Primaria y Adquirida del M.
tuberculosis, a los medicamentos antituberculosos.
RECOMENDACIONES9,10
Los cultivos deben estar acompaados de sus respectivas fichas.
Anotar en el tubo el N de identificacin y la fecha de siembra.
El cultivo no debe tener menos de 30 das ni ms de 60 das contados a partir de
la fecha de siembra.
El nmero de colonias por tubo no deber ser menor de 10 colonias claramente
diferenciadas.
El medio no deber estar alcalinizado, acidificado ni contaminado con hongos.

 El tubo de cultivo no deber contener lquido, ni el medio encontrarse licuado.

Los tubos de cultivo debern estar sellados con cinta adhesiva para asegurar el
cierre hermtico.
Los tubos de cultivo deben enviarse en cajas de material resistente debidamente
acondicionados para evitar la rotura de los tubos.
Anotar la direccin exacta del laboratorio donde se realizar prueba.

IV.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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Panamericana. Argentina. p. 203.
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2007. Pp: 203- 204.
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Editorial Mdica Panamericana. Argentina. pp. 188-191
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5. Gua de estudio de Microbiologa. (1981). Ministerio de Salud Pblica.
Direccin Docente Metodolgica.
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