UNIVERSIDAD CENTROCCIDENTAL

LISANDRO ALVARADO
DECANATO DE AGRONOMA
DEPARTAMENTO CIENCIAS BIOLOGICAS
MICROBIOLOGIA AGRICOLA

Microorganismos de la Celulosa,
Fijacin Biolgica del Nitrgeno,
Mineralizacin del Nitrgeno.

Grupo: 8-Mircoles
Integrantes:
Roberth Escalona C.I 22333471
Mary Villares C.I 20241526
Wilmer Sanchez C.I 20045414
Melvin Quintero C.I 20076853
Hctor Snchez C.I 20867159
Crismar Torres C.I 22194660
Andrs Torres C.I 17378716
Cabudare 28/10/2014

Objetivos: Practica N 8 MICROBIOLOGIA DE LA CELULOSA

1. Aislar microorganismos capaces de utilizar la celulosa como nica fuente de
carbono.
2. Observar los diferentes tipos de microorganismos celulticos actuando
sobre el material suministrado.
3. Detectar los posibles cambios fsicos y qumicos en el sustrato utilizado.
Se preparo una dilucin la cual contena 10gr de suelo a una fiola con 90ml de
agua destilada esterilizada (ADE) e identificada como 10 -1 se agito durando 2
minutos y luego se transfirieron 10 ml de la dilucin 10 -1 a otra fiola con 90ml de
ADE y se identifico con 10 -2, a partir de estas diluciones se procedi a realizar los
siguientes experimentos:
Aislamiento de microorganismo en medio liquido:
a.1 Con tiras de papel:
Resultados:
Diluciones
101
102

pH Inicial
7
7

pH Final
6
6

Obtuvimos presencia de colonias en la cual al realizar la tincin se

observaron diplobacilos gram () en ambas diluciones.

No hubo cambio de coloracin durante el periodo de incubacin
No se encontr presencia de burbujas (produccin de gas) en ninguno de
los tubos.

Discusin: hubo presencia del genero bacteroides; bacterias deslizantes

(cytophaga) que se encuentran en el suelo; la mayor parte de las citofagas crecen
como bacilos aislados esbeltos, y son especializadas en la descomposicin de la
celulosa. (Roger Y. Stanier) no hubo consumo de celulosa debido a que

la

celulosa presentada fue en papel de filtro en muy alta cantidad para estos
microorganismos; sin embargo hubo reduccin de PH favorable para dichas
bacterias.
a. Con sustratos molidos:

Cambio de color

Generacin

de Observacin

burbujas
Se
Con tapn

color

un

amarillo Si

genero Presencia

de

intenso, perdiendo burbujas

bacilo gram () en

el color verdoso.

la tincin.
Presencia de una

Se
Sin tapn

observo

visual

observo

amarillo

un No

genero cadena

mas burbujas

de

bacilos gram ()

fuerte

en la tincin.
Presencia
hongos

de
en

la

superficie.

.
(Celulosa molida en pequeos trozos evidencia de cambios y consumo)
Con tapon: (anaerbica) se evidencio complejo celulticos multienzimaticos
(celulosomas) debido a la presencia de burbujas (gram -), gneros pertenecientes
clostridium, acetivibrio, Bacteroides y hemicelusa (rodriguez. C. biotecnologa
celular. 2005)
Sin tapon: (aerbica) accin de bacterias aerbicas (gram -) celulomonas y
thermobifida estas degradan la celulosa a travs de la excrecin de celulasas
extracelulares La presencia de hongos tienen ms xito que las bateras en el
proceso de la degradacin en suelos cidos (Rodrguez. C. biotecnologa celular.
2005)

b. Aislamiento en medio solido:

Dilucin

Placas con agar celulosa

Placas

con

agar

charpentier
Presencia de 7 colonias. Presencia de 9 colonias,
Se pudo observar en la poco desarrollado en el
101

tincin bacterias de tipo papel y color negro. Se

bacilos y diplobacilos.

observaron

bacilos

celulolitico por debajo del

papel.
Presencia de 5 colonias, Se
observaron

10

pero no tuvieron mucho colonias, al igual que la

102

desarrollo

otra
bacilos

se

observaron

celuloliticos

diplobacilos gram -

101: mayor cantidad de colonias debido a mayor concentracin de suelo

accionando bacterias celulticas.
102: menor cantidad debido a menor concentracin de suelo accionando bacterias
celulticas.
Evidenciando que la estructura del suelo franco- arcilloso contienen un importante
contenido parcial de microorganismos celulotiticos. Sin embargo el rea en
MAESTRA CIENCIAS- MICROBIOLOGA BOGOT D.C. 2009 establece que el
desarrollo de microorganismos celulticos es mayor en suelos limo-arcillosos:

Objetivos: Practica N 9
FIJACION BIOLOGICA DEL NITROGENO (ASOCIATIVA Y NO ASOCIATIVA)
1. Observar los ndulos desarrollados y caracterizarlos de acuerdo al tamao
y ubicacin en el sistema radical.
2. Comprobar la efectividad de la simbiosis mediante la observacin de la
coloracin interna de los ndulos.
3. Observar el estado de bacteroide de Rhizobium en los ndulos.
4. Observar desarrollo de colonias de Rhizobium sp.(fijadores biolgicos
asociados del nitrgeno) en agar manita rojo congo.
5. Observar el desarrollo de colonias de fijadores biolgicos de vida libre.
6. Caracterizar aislados de bacterias diazotrficas.

Evaluacin de la nodulacin en plantas de caraotas ( Phaseolus vulgaris) y

frijol (Phaseolus sp.) para aislamiento de Rhizobium sp.
Caractersticas de los ndulos de acuerdo al tamao y ubicacin en el
sistema radical:
Ndulos efectivos: son generalmente grandes y son los que estn ubicados en las
races primarias y en las secundarias superiores. Las plantas que presentan
ndulos efectivos obtienen mayor rendimiento y presentando un crecimiento
normal y hojas de color verde sano.
Ndulos inefectivos: son pequeos, numerosos y con frecuencia estn distribuidos
en todo el sistema radical. Las plantas con ndulos inefectivos se desarrollan
lentamente.
Ndulos en Caraota

Ndulos en Frijol

Para
comprobar la efectividad de la simbiosis se realizo un corte en los ndulos
de la planta:
Los ndulos internamente presentan una coloracin rosado intenso representando
ndulos sanos y efectivos de las leguminosas, esto se debe a una protena de
pigmento rojo (leghemoglobina); esta protena especial contiene hierro (fe) y
molibdeno (Mo) siendo responsable de asociacin activa a la fijacin del nitrgeno
activo; esta condicin crea un ambiente con poco oxigeno dentro del ndulo lo que
permite que la bacteria viva y fije N2 y con llevando la regulacin de la entrada del
oxigeno al ndulo, estos ndulos cambian su coloracin rosa a verde con la edad
pasando a ser inefectivos.
Los ndulos inefectivos son internamente de coloracin blanca o verde plido y no
cambian su coloracin con la edad.
Observacin del estado del bacteroide, (transcurrido 72 horas):
Con la tincin de gram se constato la viabilidad de los ndulos y se observo el
bacteroide con forma de bacilo gram (-), estos viven en simbiosis con la raz de la
planta y despus de un proceso de infeccin inducido por la propia planta;
mediante la secrecin de lectina proporcionando el nitrgeno necesario para que
la planta lo absorba: a cambio la planta le brinda hospedaje.

Bacteroid
e

Cultivo

de

colonias

Rhizobium sp en agar
manita rojo cong.

Caraota

Frijol

A los cuatro das, se observo en general, crecimiento lento, se realizo la tincin de

gram a las colonias y dieron como resultados bacterias de tipo bacilos gram
negativas.

Aislamiento de bacterias

Aislamiento de bacterias
En este aislamiento se obtuvo un crecimiento ligeramente bajo, debido al factor
tiempo, deduciendo la falta de absorcin del rojo congo, ya que presentaban una
coloracin rosada o blanca, estableciendo una analoga con Rojas et. al, 2009,
seala que a los 8 das toma una coloracin; sin embargo se conoce que las
colonias Rhizobium sp. En las plantas llegan al parnquima hipodrmico a travs
de los pelos radiculares en los que forman colonias filamentosas y dentro de
estas se dividen rpidamente, pasando despus

a la fase de bateroides

(Martinez et. Al)

Al aislarla el agar manita rojo congo permite la diferenciacin bioqumica de las
especies de acuerdo a sus componentes, conocindose as la tolerancia de las
colonias a factores abiticos tales como la habilidad para crecer a diferentes tipos
de PH (4.5; 6.8; 9 y 11) y ah diferentes temperaturas (4.5 C; 30C 37C y 40C)
(Bequer et. al., 2000. Moraud et al., 2009)
Mediante el anlisis de correlacin de Pearson se establece que las bacterias
diazotrficas aisladas tienen una correlacin con la materia orgnica, fsforo, pH
del suelo, profundidad de la raz y tipo de riego; estas bacterias tienen capacidad
de fijar el nitrgeno atmosfrico en una forma mas aprovechable como el
amoniaco. En la caracterizacin fenotpica deberan ser las caractersticas de
bacilo largo ovoide y la forma de colonia circular, regular, elevada, lisa, crema
brillante, (Zapater, 1975)

Objetivos: Practica N 10 MINERALIZACION DEL NITROGENO

1. Evaluar cualitativamente el proceso de mineralizacin del nitrgeno por las
poblaciones microbianas.
2. Determinar el poder nitrificador de una muestra de suelo.
3. Comparar la accin desnitrificadora de diferentes poblaciones microbianas.
Leyenda de los cuadros a. b. c. y d:

a. Proceso de amonificacin (Caldo nutritivo):

Muestra
Suelo
Estircol

Da 1
+
+

Da 2
+
++

Da 3
++
+++

Da 4
++
+++

Da 5
++
++

++

++

++

++

++

mono
gstrico
Estircol

poligstrico
(-) no hubo cambio
(+) baja intensidad de color
(++) mediana intensidad de color
(+++)alta intensidad de color
Suelo: durante los primeros dos das hubo baja intensidad de amonio
posteriormente presentaron mediana intensidad de color, los microorganismos del
suelo descomponen sustancias orgnicas y transforman compuestos que
contienen carbono, nitrgeno y azufre. El xido nitroso se produce dentro del ciclo
del nitrgeno a travs de reacciones de nitrificacin y desnitrificacin del nitrgeno
orgnico contenido en orina y heces del ganado.
Estircol monogstrico: el primer da hubo liberacin de amonio en baja
intensidad posteriormente en el 2do, 3er y 4 da presento un aumento de color, sin
embargo al 5to da disminuyo su intensidad de color; (Nitrgeno no proteico) sin
embargo los animales monogstricos tienen un
tienen lugar ligeras modificaciones

estmago "simple", en que solo

microbianas de los nutrientes disponibles

antes de que ocurra el proceso de absorcin. Los microorganismos estn en

contacto con el material

indigestible, y los productos de la

microbiana pueden ser absorbidos parcialmente por el animal

fermentacin
hospedero para

suplir parte de sus necesidades energticas (Wenk, 2001), es decir con una poco
digestibilidad por lo tanto existe una alta productividad de amonio dando presencia
la fuente principal de nitrgeno.
Estircol

poligstrico:

presencia

continua

de

liberacin

de

amonio

medianamente, se sabe que los animales poligstricos presentan un sistema

digestivo complejo formada por 4 compartimientos; haciendo que una gran
cantidad de subproductos con alto contenido de nitrgeno sean sintetizados,
existen bacterias desnitrificadoras anaerbicas como las amelasas y las proteasas
(Wenk, 2001) analgicamente el estircol poligstrico

es menos productor de

amonio que el monogstrico.

Segn los resultados obtenidos el suelo presenta una menor amonificacion que el
estircol poligastrico.

b. Proceso de amonificacion (Caldo a base de Urea)

Muestra
Suelo
Monogstric

Da 1
+
++

Da 2
++
+++

Da 3
++
+++

Da 4
++
+++

Da 5
+++
+++

o
Poligstrico

++

++

+++

+++

+++

(-) no hubo cambio de color

(+)baja intensidad de color
(++) mediana intensidad de color
(+++)alta intensidad de color
Previamente aislado con caldo nutritivo obtuvimos resultados confiables bajo
literatura estudiada, la urea es un compuesto qumico que se encuentra en
abundancia en la orina y en el material fecal, con un contenido de 46% de
nitrgeno, al agregar urea a el aislamiento del material del suelo, monogastrico y
poligastrico acelera la produccin de amonio.

c. Poder nitrificador del suelo:

Muestr

Nitritos

Nitratos

a
Suelo + Da 1

Da

Da

Da

Da

Da

Da

Da

Da

Da

sulfato

++

++

++

de

++

amonio
0.05%
(-) no hubo cambio de color
(+)baja intensidad de color
(++) mediana intensidad de color
(+++)alta intensidad de color
La actividad potencial de las bateras nitrificantes (quimioautotrofos) parecen
haber variado debido a factores adversos; el de la nitrificacin actan
microorganismos aerbicos estrictos, necesitan disponer de oxgeno en el
ambiente para poder llevar a cabo estas reacciones. Por lo tanto en condiciones
anaerbicas la nitrificacin se detiene acumulndose NH4+. Los primeros das se
observ una coloracin algo fuerte, indicando presencia de nitritos y nitratos en la
solucin estudiada, al transcurrir los das va disminuyendo la presencia de nitritos
y van aumentando la presencia de nitratos, sabiendo que para obtener los nitratos,
los nitritos presentes deben oxidarse y as mismo ir produciendo energa, viendo al
final del ensayo, que hay una ausencia total de nitritos y solo se observan nitratos
en menor cantidad, entendiendo que estos nitratos son el producto de la oxidacin
de los nitritos presentes en la solucin.

d. Desnitrificacin:
Muestra

Da 1

Da 2

Da 3

Da 4

Da 5

pH

pH

Inicial

Final

Suelo
Estircol

+
++

+
++

+
+

7
7

8
8

++

+++

monogstric
o
Estircol
poligstrico
(-) no produjo burbujas
(+)baja produccin de burbujas
(++)alta produccin de burbujas
Teniendo en cuenta que en este proceso ocurre una reduccin de los nitratos
hasta obtener nitrgeno gas, se observ que entre los distintos sustratos y a
diferencias de los das, una reduccin de los nitratos ms acelerada entre los
primeros das en el estircol poligstrico y no habiendo reduccin alguna en el
suelo, entendiendo que esto ocurre por la especificidad de los organismos
presentes en los distintos sustratos, al transcurrir los das se observ que hubo un
aumento en la presencia de burbujas en el estircol monogstrico dando a
entender que los microorganismos presentes son un poco ms lentos para la
reduccin de los nitratos, al final del ensayo se presenci la ausencia absoluta de
burbujas en los dos primeros sustratos, entendiendo esto que ya al quinto da no
continuaba el proceso de reduccin de los nitratos a diferencia del estircol
poligstrico que aunque en menor cantidad an los microorganismos presentes se
mantenan en proceso de reduccin de los nitratos presentes.

Conclusin

Existen microorganismos celulticos especializados en la degradacin de

celosa jugando un papel fundamental; es uno de la fuentes de
carbohidratos ms abundantes en la biomasa vegetal pueden proveer
sustratos carbonatos para otros microorganismos, sabiendo que intervienen
mltiples factores como el pH del suelo, la fuente de carbono (celulosa) y
de nitrgeno (urea). (Levin y Forchiassin 1995, 1997).

Los organismos que presentan asociacin simbitica en el sistema radical

de las plantas estudiando ndulos con bacterias del genero rhizobium
demuestran la simbiosis necesaria en plantas de importancia econmica a
nivel agronmico teniendo una alta productividad en ndulos efectivos

.La accin microbiana puede mineralizar o inmovilizar el nitrgeno, el alto

contenido de nitrgeno acelera la velocidad de mineralizacin debido a la
provisin de nutrientes, tambin favorece a la degradacin de materia
orgnica dando as la disponibilidad de nutrientes a las plantas a una
velocidad moderada. (estircoles)

Bibliografia

Angelica chavez V. glosario de biotecnologa autor,2006

Prescott, L. M., Harley, J. P., y Klein, D. A. Microbiologa. 4 edicin.

McGraw-Hill Interamericana, 1999.

Madigan, M. T., Martinko, J. M., y Parker, J. Brock Biologa de los

Microorganismos. 10 edicin. Prentice-Hall. Madrid, 2003.

Daz, R., Gamazo, C, y Lpez-Goi, I. Manual prctico de Microbiologa. 2

edicin. Masson, S.A.. Barcelona, 1999.