Universidad del Zulia

Facultad experimental de ciencias

Divisin de Estudios Bsicos sectoriales
Departamento de qumica
Qumica Analtica III
Prof. Chvez Gerson

CROMATOGRAFA LQUIDA

Realizado por:

Marienmy Velsquez
C.I.: 22.606.896.
Maracaibo, febrero de 2015

Introduccin

La Cromatografa lquida o de lquidos, es una tcnica analtica la cual permite separar

fsicamente los distintos componentes de una solucin por la adsorcin selectiva de los
constituyentes de una mezcla. Consiste en un contacto entre dos fases, una fija que
suele llamarse fase estacionaria (puede ser almina, slice o resinas de intercambio
inico que se encuentran disponibles), y una mvil (fase mvil) que fluye permanente
durante el anlisis, y que en este caso es un lquido o mezcla de varios lquidos. Los
intercambiadores inicos son matrices slidas que contienen sitios activos (tambin
llamados grupos ionognicos) con carga electrosttica (positiva o negativa), en ellos
queda retenida la muestra sobre el soporte slido por afinidad electrosttica.
Dependiendo de la relacin carga/tamao unos constituyentes de la mezcla sern
retenidos con mayor fuerza sobre el soporte slido que otros, es decir sern
adsorbidos, lo que provocar su separacin. Las sustancias que permanecen ms tiempo
libre en la fase senil, avanzan ms rpidamente con el fluir de la misma y las que quedan
ms unidas a la fase estacionaria o retenidas avanzan menos y por tanto tardarn ms
en salir o fluir.
Se la denomina cromatografa lquida de alta presin o cromatografa lquida de alta
resolucin (high pressure liquid chromatography) (HPLC), para distinguir los ms nuevos
de los mtodos bsicos an utilizados. El HPLC es una tcnica utilizada para separar los
componentes de una mezcla basndose en diferentes tipos de interacciones qumicas
entre las sustancias analizadas y la columna cromatogrfica. En la HPLC isocrtica el
compuesto pasa por la columna cromatogrfica a travs de la fase estacionaria
(normalmente,

un

cilindro

con

pequeas

partculas

redondeadas

con

ciertas

caractersticas qumicas en su superficie) mediante el bombeo de lquido (fase mvil) a

alta presin a travs de la columna.

Evolucin de las bases de la separacin cromatogrfica.

Cromatografa lquida tal como lo conocemos hoy en da realmente se inici en 1969,
cuando la primera HPLC moderno fue diseado y comercializado como un analizador de
cido nucleico. Columnas toda la dcada de 1970 no eran fiables, las tasas de flujo de la
bomba fueron inconsistentes, y muchos compuestos biolgicamente activos escapado a
la deteccin mediante detectores de UV y de fluorescencia. Centrarse en los mtodos
de purificacin en los aos 70 se transform en anlisis ms rpidos en la dcada de
1980, cuando los controles computarizados fueron integrados en equipos de HPLC. Un
mayor grado de informatizacin y luego llev al nfasis en el equipo ms preciso, ms
rpido y automatizado en la dcada de 1990. Atpico de muchas tecnologas de los aos
60 y 70, el nfasis en la mejora no fue el "ms grande y mejor", sino en "ms pequeo y
mejor". Al mismo tiempo, la interfaz de usuario de HPLC estaba mejorando, era crtico
para ser capaz de aislar cientos de pptidos o biomarcadores de cada vez menor tamao
de las muestras.

Laboratorio de instrumentacin analtica slo ha sido reconocido como una industria

separada y distinta por NAICS y SIC desde el 1987 - Esta segmentacin del mercado
incluye no slo el gas y la cromatografa lquida, sino tambin la espectrometra de
masas y los instrumentos espectrofotomtricos. Desde reconocido por primera vez
como un mercado separado, las ventas de equipos de laboratorio de anlisis aumentaron
de alrededor de $ 3.5 mil millones en 1987 a ms de $ 26 mil millones en 2004. Los
ingresos en el mercado de cromatografa lquida mundo, en concreto, se espera que
crezca de $ 3.4 mil millones en 2007 a $ 4,7 mil millones en 2013, con un ligero
descenso en el gasto previsto en 2008 y 2009 a partir de la crisis econmica mundial y
la disminucin o estancamiento del gasto. La industria farmacutica por s solo

representa el 35% de todos los instrumentos de HPLC en uso. La principal fuente de

crecimiento de la LC se deriva de las ciencias biolgicas y las compaas farmacuticas.

Con respecto a la tcnica se ha mejorado y sobre-llevado los siguientes parmetros:

Proceso de ensanchamiento de banda: Existen varios procesos que tienen lugar en la

columna durante una separacin cromatogrfica y que contribuyen a la variancia del
pico, 2, o ensanchamiento de la banda. Las teoras de la dispersin de la banda en
cromatografa de gases y de lquidos son prcticamente idnticas. La altura del plato
expresa en trminos simples la magnitud del ensanchamiento de la banda y los factores
que lo afectan. Es una funcin de procesos termodinmicos y cinticos dentro de la
columna. Estos son (a) irregularidades del flujo que provocan mezclado convectivo, (b)
difusin transversal y longitudinal en la fase mvil y (c) una velocidad finita en el
equilibrio del soluto entre las fases estacionaria y mvil (transferencia de masa).

Difusin por remolinos: La inhomogeneidad en las velocidades de flujo y en la longitud

de los caminos alrededor de las partculas del empaque es el primero de los factores.
Deben existir caminos de flujo de longitud desigual a travs de cualquier empacado que
no sea perfecto. Algunas molculas de soluto de una especie nica pueden ser barridas a
travs de la columna cerca de la pared, donde la densidad del empacado es
comparativamente baja, en particular en columnas de dimetro pequeo. Otras
molculas del soluto pasan por el centro de la columna, con un empacado ms compacto y
a una correspondiente menor velocidad. Las molculas que siguen un camino ms corto
eluyen antes que aquellas que siguen caminos ms errticos (y largos). Esto provoca para
cada soluto un ensanchamiento de la banda de elucin. Para minimizar el efecto, las
partculas del empaque deben tener un dimetro promedio tan pequeo y deben ser
empacadas tan uniformemente como sea posible. Por supuesto, conforme las partculas
son ms pequeas, la presin necesaria para impulsar la fase mvil a travs de la

columna ser mayor y ms difcil ser empacar la columna de manera uniforme. De todas
formas, debido a la mayor eficiencia que se obtiene con partculas de menor dimetro,
la longitud de la columna puede reducirse en alguna medida. Debe establecerse un
compromiso entre el tamao de las partculas, la longitud de la columna y la presin
requerida. En cromatografa gas-lquido, cuando se utilizan pelculas en el interior de las
columnas capilares el trmino es despreciable.

Difusin longitudinal: La difusin longitudinal, o axial -esto es, movimiento molecular

aleatorio dentro de la fase mvil .es un segundo proceso que produce ensanchamiento
del pico. La contribucin de la difusin longitudinal a la altura del plato es significativa
slo a velocidades bajas de fase mvil. Entonces, las velocidades altas de difusin del
soluto en la fase mvil pueden causar que las molculas se dispersen axialmente
mientras emigran lentamente a travs de la columna. Si esto pasa se produce
ensanchamiento del pico.

Transferencia de masa: La resistencia a la transferencia de masa del soluto en la

superficie de la fase estacionaria es otro factor que contribuye al ensanchamiento del
pico. El movimiento molecular lento dentro de la fase estacionaria significa un mayor
tiempo de residencia en esta fase de una molcula de soluto, mientras que otras
molculas avanzan con la fase mvil. Conforme la fase mvil se mueva ms rpidamente a
travs de la columna y ms lenta sea la transferencia de masa, ms ancha ser la banda
del soluto que eluye de la columna. Se deben escoger lquidos no viscosos para la fase
estacionaria de manera que el coeficiente de difusin no sea indebidamente pequeo. Es
benfico reducir el espesor de la fase estacionaria, aunque disminuye la capacidad de la
columna.

Otro trmino que afecta a la anchura de banda es el correspondiente a la resistencia a

la transferencia de masa radialmente entre lneas de corriente de fase mvil

adyacentes. Disminuir el tamao de las partculas de la fase estacionaria siempre es til

para reducir la altura del plato. En cromatografa lquida en columna, en contraste con la
cromatografa gas-lquido, las mayores diferencias provienen de (1) la disminucin en un
factor de 10000 en el valor del coeficiente de difusin del soluto en la fase mvil
cuando la fase mvil est constituida por un lquido en lugar de un gas y (2) la presencia
de zonas de fase mvil estancada, atrapada dentro de los poros y canales de la fase
estacionaria. Las molculas de soluto se mueven por difusin hacia dentro y hacia
afuera de estos poros. Estas molculas se retrasan en su movimiento hacia adelante,
relativo a la banda principal de un soluto dado, y nuevamente se produce un aumento en
la dispersin molecular.

Tambin la velocidad de la fase mvil difiere entre un punto y otro debido a las
perturbaciones provocadas por las partculas de soporte. Las lneas de corriente del
lquido de la fase mvil cercanas a los lmites de las partculas se mueven lentamente,
mientras que las lneas de corriente cercanas al centro entre partculas se mueven ms
rpidamente. Por difusin lateral las molculas de soluto se transfieren constantemente
a una lnea de corriente diferente. Por lo tanto, la obstruccin del camino de una
molcula de soluto se debe tanto a la difusin entre lneas de corriente, como a la
necesidad de viajar alrededor de las partculas de la fase estacionaria.

El efecto de zonas estancadas se puede minimizar de varias formas. La estructura

interna del empaque se puede hacer impenetrable; un ejemplo son los empaques
peliculares con un ncleo slido y la superficie recubierta. La reduccin del dimetro de
las partculas es muy efectivo. Tambin se puede elegir soportes que tengan poros muy
amplios, de forma que el lquido fluya fcilmente hacia dentro y hacia afuera y aun a
travs de los canales de los poros.

Efecto del tamao de partcula, tamao de poro y longitud de columna en la

resolucin: El tamao de partcula juega un papel importantsimo en la calidad y

eficacia de la columna. Como se observa en la ecuacin de Van Deemter, la altura
equivalente de plato terico es funcin del dimetro de la partcula de relleno:

Donde dp es el dimetro de las partculas y u la velocidad lineal de la fase mvil. De la

ecuacin anterior se desprende la importancia del dimetro de partcula, ya que a
dimetros menores se obtendr una menor altura equivalente de plato terico y, por lo
tanto, una mayor eficacia del sistema.
Las partculas utilizadas inicialmente para rellenos en cromatografa liquida eran
bastante grandes (de ms de 40 picometros) y totalmente porosas. Este tipo de
partculas presentan una gran superficie especfica y, por lo tanto, las columnas
preparadas con ellas presentan una gran capacidad de carga (admiten gran cantidad de
muestra) pero, como contrapartida, dan lugar a un gran ensanchamiento de la banda
cromatogrfica ya que influyen significativamente sobre los trminos de transferencia
de masa de la ecuacin de Van Deemter. Como solucin parcial a este problema, se
comenzaron a utilizar los recubrimientos de estas partculas por capas de fase
estacionaria (adsorbente o intercambiadora de iones). Este tipo de rellenos (rellenos
peliculares) dan lugar a picos ms estrechos (figura 1), aunque no son la solucin ptima.

Figura 1.- Influencia del tamao de partcula.

Los mayores avances se han realizado al reducir los tamaos de las partculas del
relleno a unos niveles en los que consiguen grandes incrementos en la eficacia de la
columna sin que por ello se tengan unas presiones tan excesivamente elevadas en cabeza
de columna que hagan inviable el anlisis (figura 1).

En la actualidad, los tamaos de partcula habituales se encuentran comprendidos entre

10 y 3 picmetros de dimetro, aunque en la gran mayora de los casos, los anlisis se
estn realizando con rellenos de 10 o 5 picmetros.

Un ltimo detalle, aunque de gran importancia, es que cuanto menos sea el tamao de
partcula, la presin en la cabeza de columna se incrementa de forma proporcionalmente
inversa al cuadrado del tamao de la partcula. Por este motivo, es fcil comprender el
por qu no se encuentran en el mercado rellenos con un tamao de partcula de menos
de 3 picmetros.

El efecto de la longitud de la columna en la resolucin se puede comprobar en las

ecuaciones que rigen los procesos cromatogrficos, la eficacia de la columna depende,
entre otros factores, de la longitud de la columna y, a igualdad de otros parmetros,
mayores longitudes de la columna permitirn obtener mayores eficacias.

Por otra parte, debe tenerse en cuenta que, a mayor longitud de la columna, la presin
en cabeza se eleva considerablemente, por lo que hay que alcanzar un compromiso, a la
hora de seleccionar la columna, entre eficacia y cada de presin. Las columnas de

cromatografa liquida en ningn caso pueden tener longitudes extremadamente grandes;

se ha comprobado que para tamaos de partculas de 10 a 5m, resulta difcil conseguir
empaquetar buenas columnas de longitud superior a 30cm; para tamaos de partcula de
3m, la longitud de la columna no podr ser superior a 20cm sin riesgo de que la presin
en cabeza de columna sea excesivamente elevada.

Tipos de cromatografa liquida

Cromatografa de reparto: La cromatografa de reparto ha llegado a ser el tipo de

cromatografa de lquidos ms ampliamente utilizado. En el pasado, la mayora de las
aplicaciones se han referido a compuestos polares no inicos de baja a moderada masa
molecular < 3000). Sin embargo, recientemente se han desarrollado algunos mtodos
que han extendido las separaciones de reparto a los compuestos inicos.

La cromatografa de reparto se puede subdividir en cromatografa lquido-lquido y

cromatografa con fases unidas qumicamente (enlazadas). La diferencia entre estas
tcnicas radica en la forma como se retiene la fase estacionarla sobre las partculas
soporte del relleno. En lquido-lquido, la fase estacionaria lquida se retiene sobre la
superficie del soporte por adsorcin fsica. En fase unida qumicamente, la fase
estacionaria se une qumicamente a la superficie del soporte. La cromatografa de
reparto, al principio era del tipo lquido-lquido; sin embargo, en la actualidad los
mtodos de fase enlazada son los que predominan debido a las desventajas de los
sistemas lquido-lquidos. Una de esas desventajas es la prdida de fase estacionaria
por disolucin en la fase mvil, lo que hace necesario un peridico recubrimiento de las
partculas del soporte. Por otra parte, el problema de la solubilidad de la fase
estacionaria impide el uso de los rellenos de fase lquida en la elucin con gradiente. La
discusin se centrar exclusivamente en la cromatografa de reparto con fases unidas
qumicamente.

Cromatografa de adsorcin: La cromatografa de adsorcin, o lquido-slido, es la

forma clsica de cromatografa de lquidos que introdujo Tswett por vez primera a
principios de este siglo. Ms recientemente, se ha convertido en un mtodo importante
de HPLC.

Las nicas fases que se utilizan en HPLC lquido-slido son la slice y la almina, siendo la
primera la que se prefiere para casi todas las aplicaciones debido a su mayor capacidad
de carga y a su mayor diversidad de presentaciones. Con pocas excepciones, las
caractersticas de adsorcin de los dos adsorbentes son similares. Con ambos, el orden
de tiempos de retencin es: olefinas < hidrocarburos aromticos < haluros = sulfuros <
teres < nitrocompuestos < esteres = aldehdos = cetonas < alcoholes = aminas < sulfonas
< sulfxidos < amidas < cidos carboxlicos.

Cromatografa inica: La cromatografa inica est relacionada con los mtodos

modernos y eficaces para la separacin y determinacin de iones que se basan en el uso
de las resinas de intercambio inico. La cromatografa inica empez a desarrollarse a
mediados de los aos setenta, cuando se demostr que mediante las columnas de HPLC
rellenas con resinas de intercambio catinico o aninico, se podan resolver fcilmente
mezclas de cationes o aniones. Por entonces, la deteccin se realizaba por lo general con
medidas de conductividad.

La cromatografa inica se desarroll durante el proyecto Manhattan que optimizaba la

separacin con resinas de intercambio catinico de los cationes de las tierras raras
estrechamente relacionados. Este espectacular trabajo, en el cual se basa la teora de
las separaciones por intercambio inico, se extendi tras la 2 Guerra Mundial a muchos
otros tipos de materiales y al final condujo a los mtodos automatizados para la
separacin y deteccin de aminocidos y otras especies inicas en mezclas complejas. El

desarrollo de la HPLC moderna empez a finales de los aos sesenta, pero su aplicacin
a la separacin por intercambio inico se retras debido a la inexistencia de un mtodo
general y sensible para la deteccin de especies como los cationes alcalinos y
alcalinotrreos, y aniones como los haluros, acetato y nitrato. Esta situacin se remedi
en 1975 al desarrollarse por tcnicos de Dow Chemical Company la tcnica de supresin
del efluente, la cual hace posible la deteccin conductimtrica de los iones eluidos. Esta
tcnica se describe posteriormente.

Cromatografa de exclusin por tamaos: La cromatografa de exclusin por

tamaos, que tambin se ha denominado cromatografa en geles permeables o de
filtracin en geles, es una tcnica muy valiosa que se aplica particularmente a especies
de alto peso molecular. Los rellenos para la cromatografa de exclusin por tamaos
estn constituidos por pequeas partculas (de unas 10 m) polimricas o de slice que
contienen una red uniforme de poros en los que pueden difundir las molculas del soluto
y del disolvente. En los poros, las molculas son atrapadas efectivamente y eliminadas
del flujo de la fase mvil. El tiempo de residencia medio en los poros depende del
tamao efectivo de las molculas de los analitos. Las molculas que son ms grandes que
el tamao medio de poros del relleno son excluidas y de esta forma, esencialmente no se
retienen y, por tanto, son las primeras que eluyen. Las molculas que tienen dimetros
que son significativamente menores que los poros, pueden penetrar a travs del
laberinto de poros y as resultan atrapadas durante ms tiempo; stas son las ltimas en
eluir. Entre estos dos extremos, estn las molculas de tamao intermedio cuya
penetracin media en los poros depende de su dimetro. Dentro de este grupo, tiene
lugar el fraccionamiento, que est directamente relacionado con el tamao molecular y
en cierto modo con la forma molecular. Obsrvese que las separaciones por exclusin
por tamaos difieren de los otros procedimientos que se han considerado, en que no
implican una interaccin qumica o fsica entre los analitos y la fase estacionaria. De

hecho, se procura evitar este tipo de interacciones dado que originan una mala eficacia
de la columna.

Instrumentacin:

Conocimiento bsico del equipo e instrumental necesario para el anlisis cromatogrfico.

Discusin de deteccin de fallas y/o anomalas en el sistema; correccin y ajustes al
mismo.

Figura 2.- Equipo para HPLC

Solventes: La fase mvil puede ser un solvente puro o una mezcla de solventes. Cuando
se trata de una mezcla, puede programarse la bomba para que tome solventes de
diferentes botellas en una proporcin determinada y realice la mezcla en una cmara de
mezclado. Dependiendo de la forma en que se usa el solvente tenemos dos mtodos:

Mtodo Isocrtico: Cuando, durante toda la separacin, se utiliza siempre el mismo

solvente, se denomina isocrtica, sin embargo es normal realizar un gradiente de
composicin del solvente a lo largo de la cromatografa para mejorar la eficiencia y
acortar la duracin del proceso. Estos gradientes de solvente tambin son realizados en
forma automtica por las bombas.

Mtodo de Gradiente de Elucin: Es un trmino que se utiliza para describir el

proceso mediante el cual se cambia la composicin de la fase mvil. Pueden efectuarse
de dos maneras:

A baja presin
A alta presin

Cuando se desarrolla un anlisis usando el mtodo de gradiente se debe tener presente

dos objetivos:

Obtener la mejor resolucin de los componentes de la muestra en el menor

tiempo posible.
Asegurar alta precisin y exactitud.

Para obtener buenos resultados con el mtodo de gradiente debemos seguir cinco pasos
fundamentales:

Determinar la composicin inicial y final del solvente.

Ajustar el tiempo del gradiente.
Determinar la forma del gradiente (lineal, cncava o convexa).
Ajustar la velocidad del flujo para mejorar la resolucin.
Regresar a las condiciones iniciales la columna.

La bomba enva el solvente a travs de caos de dimetro pequeo, generalmente de

acero inoxidable, hacia la vlvula inyectora. Esta consiste en una vlvula de varias vas
que permite introducir en el flujo de solvente, la muestra contenida en un aro o loop de
volumen calibrado. Luego de que se produzca la separacin en la columna, los
componentes de la mezcla pasan por el detector. Este produce una seal elctrica
proporcional a la cantidad de materia y esa seal es enviada al registrador que realiza
un grfico de intensidad en funcin del tiempo (cromatograma). Idealmente, se trata de
picos gaussianos y cada pico corresponde a un componente de la muestra original. El
integrador calcula adems el rea correspondiente a cada pico, la cual es proporcional a
la cantidad de sustancia. Dado que los detectores de HPLC son no destructivos, es
posible recuperar los productos que salen de l. De esta manera, dependiendo del
tamao del loop de inyeccin, de la columna, y del tipo de bomba, es posible realizar
adems de separaciones analticas, cromatografas preparativas.

Criterios para la eleccin del solvente:

Disponible comercialmente
Precio
Pureza y Estabilidad. En la actualidad contamos con productos de calidad de

pureza cromatogrfica. Bajo contenido de impurezas.

Disolver la muestra
Miscible con otros solventes para formar mezclas tiles
No degradar o disolver la fase estacionaria
Tener baja viscosidad para reducir las cadas de presin
Ser compatible con el detector utilizado. Transparencia ptica (cuando se usan

detectores UV)
Filtracin y Desgasificacin de solventes

Filtros: Hay tres mtodos comunes que se utilizan hoy en da para la filtracin previa
de los Solventes en HPLC:

Filtro a la entrada del solvente: Este tipo de filtro usualmente se construye de

acero inoxidable u otra aleacin resistente a la corrosin y se sita dentro de la botella
de depsito del solvente (depsito de la fase mvil) donde se une a la entrada de la
presin baja. Est al lado de del HPLC, bombea usando un taladro pequeo de Tefln u
otra tubera inerte. El filtro tiene un poro medio, clasificado segn tamao que
usualmente oscila entre rangos de 1 a 5 micra. Debido a los mtodos industriales de
fabricacin de estos filtros,, slo un poro medio clasifica segn tamao. El tamao
absoluto del poro mnimo es usualmente alrededor de 1 micra, para aquel material por
debajo de este mnimo puede alargar el HPLC bomba, columna, y otro componentes del
sistema. Con el tiempo estos tipos de filtros reducen eficacia de la bomba.

Filtracin al vaco: Este aparato consta de un embudo de vidrio, vidrio se filtra

poseedor, y frasco de la recepcin del vidrio. Se aplica vaco al frasco y solvente se
filtra cuando pasa por un disco teclea membrana dentro del poseedor del filtro. Este
sistema tiene la ventaja de usar membrana filtra que tiene un muchos mejor defini
poro clasifica segn tamao y puede bajar a 0.2 poro de la micra clasifica segn tamao.
El poro ms bajo clasifica segn tamao puede eliminar la mayora de materia del
[particulate] hall en el HPLC ambiente del laboratorio.
El problema con este sistema es ese que est muy frgil desde se hace fuera de vidrio y
solvente necesita se transferir del frasco al HPLC botella del solvente del solvente
donde se le expone a la atmsfera el solvente y puede ser fcilmente recontaminado
con partculas del polvo y otros partculas de materia en el aire.

Filtracin en lnea: Este sistema consta de un [polymer] o filtro del [inline] limpio
hecho de acero que tiene un tubo tropieza con la botella solvente de la fabricante y
otro funcionamiento del tubo a una presin baja bombea que dibuja el HPLC solvente por
un disco se filtra alberg dentro del albergue del filtro del [inline] y lo distribuye en un
frasco del almacenamiento o en el depsito solvente. Este sistema como con el sistema

del embudo describi sobre, tiene la ventaja de usar disco filtra con pues defini poro
clasifica segn tamao y un poro mnimo clasifica segn tamao de 0.2 micra que est 5
chronometra ms bajo que la entrada solvente filtra aparato del tipo. La desventaja si
este sistema es ese que requiere una presin separada baja bombea y si construy de
[polymers polypropylene] tal como y/ o niln que contaminara solventes seguros
orgnicos.

Tuberas: Las tuberas deben ser de acero inoxidable, las cuales son resistentes a la
corrosin, se utiliza PEEK (PoliEterCeterona), que son resistentes a los disolventes
fuertes y fases mviles agresivas.

Caractersticas:

Los tubos de PEEK son extremadamente flexibles y pueden cortarse fcilmente

a las longitudes deseadas.

Adems puede emplearse para su conexin, adems de los conectores de material

polimrico, cualquier rosca o cono de acero inoxidable.

Los tubos de PEEK vienen codificados por su color, el cual gracias al especial

proceso de fabricacin es totalmente indeleble.

Los tubos de PEEK pueden trabajar hasta presiones de 5000 psi dependiendo del
dimetro, y hasta temperaturas de 100C.

Sistemas de bombeo: Sistema isobrico y sistema de gradiente

Los requisitos para un sistema de bombeo en HPLC son rigurosos e incluyen:

La generacin de presiones por encima de 400 kg/cm2.

Un flujo libre de pulsaciones.
Un intervalo de caudales de 0.1 a 10 mL/min.
El control y reproducibilidad del caudal mejor del 0,5% relativo.

Componentes resistentes a la corrosin (juntas de acero inoxidable o tefln). Debe

subrayarse que las altas presiones que generan las bombas de HPLC no constituyen un
riesgo de explosin, debido a que los lquidos no son muy compresibles. De este modo, la
rotura de un componente del sistema slo supone una prdida de disolvente. Es evidente
que esta prdida puede suponer un riesgo de incendio.

Una separacin que utiliza un solo disolvente de composicin constante se denomina una
elucin isocrtica. Con frecuencia, la eficiencia de la separacin se aumenta
notablemente por una elucin con gradiente. En este caso se utilizan dos (y a veces ms)
disolventes con una polaridad significativamente distinta. Una vez comienza la elucin,
se vara la relacin de los disolventes de forma programada, a veces continuamente y a
veces mediante una serie de etapas escalonadas. Los instrumentos en la moderna HPLC
a menudo estn equipados con unos dispositivos que permiten introducir los disolventes
desde dos o ms recipientes en una cmara de mezcla a una velocidad que vara
continuamente y la relacin de volumen de los disolventes se puede modificar lineal o
exponencialmente con el tiempo.
La Figura 3 ilustra la ventaja de una elucin con gradiente en la separacin de una
mezcla de clorobencenos. La curva (b) corresponde a la elucin isocrtica con
metanol/agua 50:50 (v/v). La curva (a) muestra la elucin con gradiente, que se inicia
con una mezcla 40:60 de los dos disolventes y se va aumentando la concentracin de
metanol un 8%/min. Obsrvese que la elucin con gradiente acorta notablemente el
tiempo de separacin sin sacrificar la resolucin de los primeros picos. Ntese tambin
que la elucin con gradiente produce unos efectos similares a los producidos por la
programacin de temperatura en cromatografa de gases.

Figura 3.- Mejora de la eficiencia de la separacin mediante la elucin con gradiente.

Columna de 1 m x 2.1 mm d.i. de acero inoxidable, relleno 1% Permaphase

ODS. Muestra: 5 L de bencenos clorados en isopropanol. Detector: fotmetro de UV

(254 nm). Condiciones: temperatura 60C, presin 80 kg/cm2. (a) Elucin con gradiente:
metanol 40% / agua 60% e incremento de la proporcin de metanol a una velocidad de
un 8% / min (b) Elucin isocrtica con metanol 50% / agua 50%.

Sistema de inyeccin

A menudo, el factor limitante en la precisin de las medidas en cromatografa de

lquidos es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la columna. El
problema se agrava por el ensanchamiento de banda que acompaa a la sobrecarga de
las columnas. Por ello, los volmenes que se emplean han de ser muy pequeos, de unas
pocas dcimas de microlitro a tal vez 500 L. Adems, se ha de poder introducir la
muestra sin despresurizar el sistema.

Figura 4.- Bucle de muestra para cromatografa de lquidos .

En cromatografa de lquidos el mtodo ms ampliamente utilizado para la introduccin

de la muestra utiliza bucles de muestra, como el que se muestra en la Figura 4. Estos
dispositivos estn normalmente integrados en el equipo cromatogrfico y hay bucles
intercambiables que permiten la eleccin de tamaos de muestra desde 5 a 500 L. Con
bucles de este tipo se puede introducir la muestra a presiones de hasta 500 kg/cm 2 con
una precisin relativa de unas dcimas por ciento. Tambin existen vlvulas de inyeccin
de micromuestras, con bucles con volmenes de 0,5 a 5 L.

Tipos de Columnas. Nuevos avances (columnas UPLC)

La mayora de las columnas para cromatografa de lquidos tienen una longitud entre 5 y
30 cm. Por lo comn, las columnas son rectas y se pueden alargar, si es necesario,
acoplando dos o ms columnas. El dimetro interno de las columnas es a menudo de 4 a
10 mm y los tamaos de las partculas de los rellenos ms comunes son 3, 5 y 10 m.

Tal vez la columna ms frecuentemente utilizada es la de 25 cm de longitud y 4.6 mm de

dimetro interno, y empaquetada con partculas de 5 m. Estas columnas tienen de 40
000 a 60 000 platos/metro. Tambin, se han empezado a fabricar columnas de alta
resolucin ms rpidas, las cuales tienen menores dimensiones que las anteriormente
descritas. Estas columnas pueden tener dimetros internos que oscilan entre 1 y 4.6 mm
y se rellenan con partculas de 3 o 5 m. A menudo su longitud es de 3 a 7.5 cm. Estas
columnas tienen hasta 100 000 platos/metro y presentan la ventaja de la rapidez y del
mnimo consumo de disolvente. La ltima propiedad es de considerable importancia,

puesto que los disolventes de alta pureza que se requieren en cromatografa de lquidos
son muy caros.

Pre-columnas: En muchas ocasiones, para aumentar la vida de la columna analtica, se

coloca delante una precolumna que elimina la materia en suspensin y los contaminantes
de los disolventes. Adems, en cromatografa lquido-lquido, la precolumna sirve para
saturar la fase mvil con la fase estacionaria y as minimizar las prdidas de sta en la
columna analtica. La composicin del relleno de la precolumna debe ser semejante al de
la columna analtica; sin embargo, el tamao de partcula es por lo comn mayor para
minimizar la cada de presin.

Termostatos: En muchas aplicaciones no se necesita un control estricto de la

temperatura, y las columnas trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, muchas
veces si se controla la temperatura de la columna en unas pocas dcimas de grado
centgrado, se obtienen mejores cromatogramas. La mayora de los instrumentos
comerciales llevan actualmente hornos para las columnas que controlan la temperatura
de la columna a las dcimas de grado, desde la temperatura ambiente hasta 150 C. Para
poder controlar con precisin la temperatura, las columnas tambin se pueden colocar
en camisas con agua que provenga de un bao a temperatura constante.

Tipos de rellenos de la columna: En cromatografa de lquidos se han utilizado dos

tipos bsicos de rellenos, pelicular y de partcula porosa. El primero consiste en bolas de
vidrio o de polmero, no porosas y esfricas con unos dimetros caractersticos de 30 a
40 m. En la superficie de estas bolas se deposita una capa delgada y porosa de slice,
almina o de una resina de intercambio inico. Para algunas aplicaciones se aplica un
recubrimiento adicional, constituido por una fase estacionaria lquida que se mantiene
fija por adsorcin. Las bolas tambin se pueden tratar qumicamente para obtener una
capa superficial orgnica. Por lo general, los rellenos peliculares se utilizan ampliamente

en las pre-columnas y no en las columnas analticas.

Los tpicos rellenos de partculas porosas de cromatografa de lquidos estn formados

por micro-partculas porosas con dimetros entre 3 y 10 m y con la menor dispersin
posible para un tamao determinado. Las partculas son de slice, almina o resinas de
intercambio inico, aunque la slice es el material ms comn. Las partculas de slice se
sintetizan aglomerando partculas de slice de tamaos inferiores al micrn en unas
condiciones tales que se forman partculas mayores con dimetros muy uniformes. Las
partculas que resultan se recubren muchas veces con pelculas orgnicas, que se unen
qumica o fsicamente a la superficie.

Columnas UPLC

La UPLC es el resultado de una innovacin que llev al diseo holstico simultneo de una
nueva tecnologa de partcula para LC, un nuevo diseo de columna, inyectores, bombas y
detectores. La combinacin de la mejora en prestaciones de las columnas rellenas de
material hbrido con tamao de partcula inferior a 2-m y la capacidad nica del
sistema ACQUITY UPLC de suministrar la fase mvil a alta presin y con una mnima
dispersin, que permite aprovechar al mximo los beneficios de ese nuevo material,
produce como resultado picos ms estrechos y ms concentrados. Los Sistemas
ACQUITY UPLC aumentan el rendimiento y reducen el consumo de eluyente sin
comprometer los resultados analticos.

El lanzamiento de la UPLC, Ultra Performance Liquid Chromatography, ha sido uno de

los avances ms significativos en la ciencia de las separaciones en la ltima dcada. El
rendimiento de la HPLC limitaba su eficacia. Los laboratorios ligados al uso del HPLC no
podan seguir el ritmo creciente de demandas de analizar ms muestras, ms
rpidamente y con resultados ms fiables. Eso llev a inventar una nueva categora en

prestaciones cromatogrficas.

Detectores

A diferencia de la cromatografia de gases, en la cromatografa de lquidos no hay

detectores tan aplicables universalmente ni tan fiables como los detectores de
ionizacin de llama y de conductividad trmica. Uno de los mayores retos en el
desarrollo de la cromatografa de lquidos ha sido el perfeccionamiento de los
detectores.

Un detector ideal para cromatografa de lquidos debera poseer todas las propiedades
listadas en relacin con la cromatografa de gases, con la excepcin de que un detector
para cromatografa de lquidos no es necesario que sea sensible en un intervalo tan
grande de temperaturas. Adems, un detector de HPLC debe tener un volumen interno
mnimo a fin de reducir el ensanchamiento de banda.

Los detectores en cromatografia de lquidos son de dos tipos bsicos. Los detectores

basados en una propiedad de la disolucin responden a una propiedad de la fase mvil,

tal como el ndice de refraccin, la constante dielctrica, o la densidad, que se modifica
por la presencia de los analitos. Por contraste, los detectores basados en una propiedad

del soluto responden a alguna de las propiedades del soluto, como la absorbancia UV,
fluorescencia, o intensidad de difusin, que no son propias de la fase mvil. En la Tabla 1
se indican los detectores ms comunes empleados en HPLC y algunas de sus propiedades
ms importantes. Un informe de 1982 sobre 365 trabajos publicados en los que tena un
papel importante la cromatografia de lquidos, revel que el 71 % se utilizaban en la
deteccin de la absorcin UV, el 15% la fluorescencia, el 5,4% el ndice de refraccin, el
4,3% empleaba medidas electroqumicas y el 4,3% restante otras medidas.

Detectores de absorbancia

La Figura 5 muestra el esquema de una cubeta de flujo en forma de Z para la medida de

la absorbancia de los efluentes de una columna cromatogrfica. A fin de minimizar el
ensanchamiento de banda extracolumnar, el volumen de estas cubetas ha de ser lo
menor posible, de modo que los volmenes se limitan por lo comn de 1 a 10 L y las
longitudes de la cubeta de 2 a 10 mm. La utilizacin de cubetas de este tipo est
restringida a presiones no mayores de unos 50 kg/cm2.

Tabla 1. Caractersticas de los detectores de HPLC

Figura 5.- Celda de detector ultravioleta en HPLC

Muchos detectores de absorbancia son dispositivos de doble haz, en los que uno de los
haces pasa por la cubeta de flujo y el otro a travs de un filtro que reduce su
intensidad. Para comparar las intensidades de los dos haces se utilizan detectores
fotoelctricos contrastados. Tambin se utilizan instrumentos de un solo haz. En este
caso, las medidas de intensidad del disolvente se almacenan en la memoria de un
ordenador y al final se recuperan para el clculo de la absorbancia.

Detectores de absorbancia ultravioleta con filtros

Los detectores de absorcin UV ms simples son los fotmetros de filtros con una
lmpara de mercurio como fuente. Lo ms comn en estos casos es aislar la lnea intensa
a 254 nm por medio de filtros; en algunos equipos tambin se pueden utilizar las lneas a
250, 313, 334 y 365 nm empleando otros filtros. Resulta obvio que este tipo de
detector se utiliza de forma restringida para aquellos solutos que absorben a alguna de
estas longitudes de onda. Algunos

grupos funcionales orgnicos y diversas especies inorgnicas exhiben una banda ancha
de absorcin a una o ms de esas longitudes de onda.

Detectores de absorbancia ultravioleta con monocrornadores

La mayora de los fabricantes de instrumentos de HPLC ofrecen detectores que

consisten en un espectrofotmetro de barrido con ptica de red. Algunos se limitan a la
radiacin ultravioleta; mientras que otros abarcan la radiacin ultravioleta y la visible.
Se pueden elegir varios modos operacionales. Por ejemplo, se puede obtener el
cromatograma completo a una sola longitud de onda o alternativamente, cuando los picos
que eluyen estn suficientemente separados, se puede elegir distinta longitud de onda
para cada pico. En este caso, debe emplearse el control por ordenador para elegir la
mejor longitud de onda en cada caso. Cuando se desean los espectros completos con
fines de identificacin, se puede parar el flujo del eluyente durante un tiempo
suficiente que permita el barrido de la regin de longitud de onda que interesa.

Los

detectores

espectrofotomtricos

de

ultravioleta

ms

potentes

son

los

instrumentos de series de diodos. Algunos fabricantes ofrecen este tipo de

instrumentos, que permiten recoger los datos de un espectro completo en
aproximadamente un segundo. De esta forma, los datos espectrales para cada pico
cromatogrfico se pueden recoger y almacenar a medida que van saliendo de la columna.
Una de las formas de presentacin de los datos espectrales, que resulta til para la
identificacin de las especies y para elegir las condiciones de la determinacin
cuantitativa, consiste en un grfico tridimensional tal como el que se muestra en la
Figura 6 En este caso, los espectros se obtuvieron a intervalos de cinco segundos. La
aparicin y desaparicin de cada uno de los esteroides en el efluente de la columna
resulta evidente.

Figura 6.- Espectros de absorcin del efluente de una columna de HPLC tomados
a intervalos de 5 s para una mezcla de tres esteroides.

Detectores de absorbancia en el infrarrojo.

Comercialmente se ofrecen dos tipos de detectores de infrarrojo. El primero con

barrido de longitud de onda que proporcionan tres segmentos de filtro semicirculares.
El segundo, mucho ms sofisticado, es un tipo de detector infrarrojo que se basa en los
instrumentos de transformada de Fourier.

Las cubetas de los detectores de infrarrojo son semejantes a las de radiacin

ultravioleta excepto en que las ventanas se construyen de cloruro de sodio o de
fluoruro de calcio. Las longitudes de la cubeta oscilan de 0.2 a 1.0 mm, y los volmenes
de 1.5 a 10 L. Los instrumentos de infrarrojo ms sencillos pueden trabajar a una o
ms longitudes de onda; alternativamente, se pueden obtener los espectros de los picos
parando el flujo en su tiempo de elucin. Los instrumentos con transformada de Fourier
se utilizan de manera anloga a los instrumentos de series de diodos para las medidas
de absorbancia ultravioleta que se han descrito en la seccin anterior.

Una de las mayores limitaciones al uso de los detectores de infrarrojo se debe a la baja
transparencia de muchos de los disolventes que se utilizan. Por ejemplo, las bandas
anchas de absorcin infrarroja del agua y de los alcoholes impiden prcticamente el uso
de este detector para muchas aplicaciones.

Detectores de fluorescencia

Los detectores de fluorescencia para HPLC son semejantes en diseo a los fluormetros
y espectrofluormetros. En la mayora de ellos, la fluorescencia se detecta por medio de
un detector fotoelctrico colocado perpendicularmente respecto al haz de excitacin.
Los detectores ms sencillos utilizan una fuente de excitacin de mercurio, y uno o ms
filtros para aislar la radiacin fluorescente. Los futuros desarrollos en los detectores
de fluorescencia probablemente se basarn en el uso de fuentes de lser sintonizables,
las cuales permiten una mayor sensibilidad y selectividad.

Una ventaja inherente a los mtodos de fluorescencia es su alta sensibilidad, que

resulta ser ms de un orden de magnitud mayor que la de los sistemas de absorbancia.
En cromatografa de lquidos se ha aprovechado esta ventaja para la separacin y
determinacin de los componentes fluorescentes de las muestras.

Detectores de ndice de refraccin

Estos detectores miden la diferencia de ndice de refraccin, entre el disolvente que

en su camino hacia la columna pasa a travs de una mitad de la cubeta y el efluente de la
columna que pasa por la otra mitad. Los dos compartimentos estn separados por una
placa de vidrio montada a un ngulo de modo que si las dos disoluciones difieren en el
ndice de refraccin se produce una desviacin de un haz de luz incidente. El
desplazamiento del haz con respecto a la superficie fotosensible del detector provoca

una variacin de la seal de salida, la cual, una vez amplificada y registrada, proporciona
el cromatograma.

Los detectores de ndice de refraccin tienen la ventaja de que responden a casi todos
los solutos. Es decir, son detectores universales anlogos a los detectores de llama en
cromatografia de gases. Adems, son fiables y no dependen del caudal. Sin embargo,
son muy sensibles a los cambios de temperatura, y se han de mantener a una
temperatura constante en unas pocas milsimas de grado centgrado. Por otra parte, no
son tan sensibles como la mayora de los otros detectores, y por lo general no se pueden
utilizar en la elucin con gradiente.

Detector de dispersin de luz

Recientemente, se ha comercializado un nuevo tipo de detector general para la HPLC, el

detector de dispersin de luz (ELSD). En este detector, el efluente de la columna se

pasa a un nebulizador donde se convierte en una fina niebla mediante un flujo de
nitrgeno o aire. Las finas gotitas se llevan a travs de un tubo de conduccin a
temperatura controlada donde tiene lugar la evaporacin de la fase mvil, lo que origina
unas finas partculas de analito. La nube de partculas de analito pasa a travs de un haz
lser. Mediante un fotodiodo de silicio se detecta la radiacin dispersada
perpendicularmente al flujo. Una de las mayores ventajas de este tipo de detector es
que su respuesta resulta ser aproximadamente la misma para todos los solutos no
voltiles. Adems es notablemente ms sensible que el detector de ndice de
refraccin.

Detectores electroqumicos

Los fabricantes de instrumentos proporcionan en la actualidad varios tipos de

detectores

electroqumicos.

Estos

dispositivos

se

basan

en

cuatro

mtodos

electroanalticos que incluyen la amperometra, la voltamperometra, la coulombimetra

y la conductimetra.

Calibracin Tratamiento y Evalucacin de datos

El cambio en eluyente detectado por un detector es una forma de seal electrnica, y

as no es visibles a nuestros ojos. En otros tiempos, la pluma-papel-registrador grfico
se utilizaba muy popularmente. Hoy en da, una computadora con un posesor de base de
datos (integrador) es ms comn. Hay varios tipos de procesadores de datos, e incluye
un sistema simple que consiste en construir la impresora y el procesador de textos, y un
tipo de computadora personal que consta de monitor, teclado e impresora. Tambin hay
programas que estn diseados especficamente para el sistema LC. Ofrece no slo la
adquisicin de datos, pero tambin caterticas como mximo de ajuste, la correccin de
lnea base, el clculo automtico de la concentracin, la determinacin del peso
molecular, etc.

Cuantificacin

El uso de la cromatografa se ha extendido en todo el mundo, en las ltimas cuatro

dcadas, no solo por su capacidad de separar compuestos sino porque se puede realizar
un anlisis cuantitativo de las especies proporcionadas. En la cromatografa en columna,
el anlisis cuantitativo se basa en la comparacin de la altura, o del rea, del pico del
analito con la de uno o ms patrones inyectados bajo las mismas condiciones
cromatogrficas. El uso de una u otro termino depender de las caractersticas de la
banda obtenida, aunque en la actualidad con el uso de sistemas de integracin de rea
computarizados, la precisin es muy alta para el clculo de rea, sin embargo siempre es

importante conocer las otras herramientas a utilizar para calcular el rea de una banda
y en qu momento es mejor usar altura en vez de rea por si llega a faltarle sistema
computarizado.

Para lograr un anlisis cuantitativo de los componentes separados de una muestra existe
una gran variedad de mtodos de anlisis entre los que se pueden mencionar:

Calibracin absoluta

Mtodo del estndar interno y normalizacin de rea (con y sin factor de respuesta)
Cada mtodo tiene sus ventajas y desventajas.

Curva de calibracin

Para realizar el clculo de composicin, se inyecta masas exactas del componente puro
al cromatgrafo y se determina el rea. Se realiza un grfico relacionando el rea de
pico con la masa, se obtendr entonces una curva de calibracin que debe ser lineal y
pasar por el origen.

Figura 7.- Curva de Calibracin.

La ecuacin de esta curva vendr dada entonces por

Entonces se inyecta una masa exacta de la muestra (Winj) y se determina el rea del
componente a analizar, por ejemplo el componente A, de la curva extrapolando la masa
de

A por

y despus se aplica la siguiente ecuacin:

Las desventajas de este mtodo son que la inyeccin de la muestra debe ser exacta y
que las condiciones del sistema no deben cambiar de una inyeccin a la otra. Las
inyecciones exactas se logran ms con un sistema automatizado de inyeccin o con el
uso de vlvulas de inyeccin manuales con lazo de volmenes exactos como el caso de
cromatografa liquida de alta resolucin.

Clculo de sensibilidad: Lmite de deteccin y lmite de cuantificacin

Sensibilidad: este parmetro se evala mediante la estimacin del lmite de

cuantificacin (Lc) y el lmite de deteccin (Ld). Para ello es necesario trabajaron con
diferentes concentraciones, respectivamente.

Lmite de deteccin: la menor cantidad de analito que puede detectarse en una

muestra, aunque no necesariamente cuantificarse, bajo las condiciones del experimento
indicadas. As, las pruebas de lmite confirman simplemente que la cantidad de analito se
encuentra por encima o por debajo de un cierto nivel.

Lmite de cuantificacin: La menor cantidad de analito en una muestra que puede

determinarse con precisin y exactitud aceptables bajo las condiciones del experimento
establecidas. En esencia, idntico a ICH Q2A Lmite de cuantificacin (LC) = lmite de
cuantificacin (LOQ). Los mtodos mencionados sern de gran ayuda a la hora de
realizar la estandarizacin del mtodo. Sin embargo, es importante aclarar que en este
documento no se pudo lograr un tratamiento estadstico completo debido a problemas
tcnicos presentados con el cromatgrafo de gases.

Estndar interno

1) Se agrega una cantidad igual del estndar (SI) a la solucin de calibrado y a las
muestras de modo de tener la misma concentracin del estndar
2) Se inyecta la solucin de calibrado (concentracin conocida C1 del componente a
cuantificar)
3) Se mide el rea de las seales del componente a cuantificar (A1) y del SI y
calculo el factor de respuesta relativo:

4) Se inyecta la muestra problema (que contiene una cantidad conocida de SI) y

mido el rea de la seal del componente a cuantificar y del SI.

5)

usando el factor F calculo la concentracin del componente en la muestra

inyectada C1

Ventajas

Es independiente del volumen de inyeccin

No requiere precisin en la preparacin de la solucin de SI ni conocer su pureza, solo
agregar la misma cantidad a muestras y solucin de calibrado

Es independiente de los errores por diluciones una vez agregado el SI

Es independiente de variaciones en el flujo o en las condiciones de corrida
Desventajas

Requiere disponer de una sustancia (el SI) que no se superponga con ninguno de los
componentes de la muestra y que sea eluida en las mismas condiciones

La preparacin de muestras y soluciones de calibrado es ms laboriosa.

Estndar externo

1) Inyecta una masa conocida M1 del componente a cuantificar (solucin de

calibrado de concentracin C1)

2) se mide el rea de la seal (A1) y calculo el factor:

3) inyecto la muestra problema y mido el rea de la seal del componente a A1. Se

Cuantificar.

4) usando el factor calculo la masa del componente en la muestra inyectada y/o la

concentracin.

Ventajas

Sencillo de implementar

Desventajas

Requiere volmenes de inyeccin precisos y reproducibles

Requiere una gran estabilidad en el tiempo del sistema cromatogrfico (flujos, ancho
de picos, etc.)

Si se pasan varias muestras, debe inyectarse la solucin de calibracin peridicamente

(por ejemplo cada 3 o 5 muestras) para verificar que el sistema est estable

El mtodo es susceptible a errores introducidos al hacer diluciones, etc.

Si las muestras a analizar contienen cantidades muy dispares del componente, debe
verificarse el rango de linealidad de respuesta (curva de calibracin) y/o inyectar
cantidad de estndar externo acorde a cada muestra.

Referencias

http://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa_l%C3%ADquida

Skoog W., Holler J., Nieman T, 2001, Principios de anlisis instrumental. Quinta
edicin, Madrid, Espaa, Editorial Mc Graw-Hill/Interamericana.

http://rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/8248/4/T4cromatliquid.pd f

http://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa

http://es.wikipedia.org/wiki/Coeficiente_de_repart o

http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/cromatografia
/cro matografia_liquida_de_alta_eficacia.pdf