Fosfoenolpiruvato carboxilasa, y el Ciclo de Krebs a la respiracin y

la biosntesis y para intracelular Reglamento pH durante la hipoxia

en Consejos Maz raz Observado por Resonancia Magntica Nuclear
y cromatografa de gases-espectrometra de masas
ABSTRACT
En sntesis in vivo piruvato por la enzima mlica (ME) y piruvato quinasa y la
sntesis in vivo malato por la fosfoenolpiruvato carboxilasa y el ciclo de
Krebs se midieron por la incorporacin de 13C a partir de [1-13C] glucosa en
glucosa-6-fosfato, alanina, glutamato, aspartato, y malato. Estos
metabolitos se aislaron a partir de maz (Zea mays L.) puntas de las races
en condiciones aerbicas y de hipoxia. 13CNuclear espectroscopia de
resonancia magntica y espectrometra de chromatographymass gas se
utilizaron para discernir la distribucin isotpica posicional dentro de cada
metabolito. Esta informacin se aplic a un modelo simple precursorproducto que permiti el clculo de los flujos metablicos especficos. En
respiran puntas de las races, ME se descubri que contribua slo
aproximadamente el 3% de la piruvato sintetizado, mientras piruvato
quinasa contribuy el balance. La actividad de ME aument mayor que 6
veces temprano en la hipoxia y, a continuacin, disminuy coincidente con
el agotamiento de malato citoslica y aspartato. Se encontr que en
respiran puntas de las races, anaplertico actividad fosfoenolpiruvato
carboxilasa fue alto en relacin a m, y por lo tanto no limitar la sntesis de
piruvato por ME. La importancia de la sntesis in vivo piruvato por ME se
discute con respecto a malato y la utilizacin de piruvato por las
mitocondrias aisladas y la regulacin intracelular pH en condiciones de
hipoxia.
El papel de malato en muchos procesos metablicos importantes que
contribuyen a la produccin de energa, la biosntesis, y la nutricin mineral
en plantas ha sido reconocida (Lance y Rustin, 1984), sin embargo, nuestra
comprensin cuantitativa de cmo las muchas reacciones del metabolismo
malato contribuyen a plantar funcin es rudimentaria. Un ejemplo notable
se refiere al abastecimiento de combustible de las mitocondrias en las
clulas vegetales oxidantes carbohidratos. Ha sido ampliamente
considerado que el malato es un sustrato importante para las mitocondrias,
de manera que una fraccin significativa de productos glucolticas entra en
el ciclo de Krebs a travs de la accin combinada de PEPC, malato
deshidrogenasa, y ME en lugar de a travs de PK (ver Fig. 1) (Fowler , 1974;
Day y Hanson, 1977; Wiskich, 1980; Bryce y ap Rees, 1985). Sin embargo, la
validez de este modelo an no se ha demostrado de manera inequvoca en
las clulas vegetales intactas (para una revisin, ver ap Rees, 1990; Douce y
Neuburger, 1990; Lambers, 1990). Una estrategia general para resolver este
problema se basa en el uso de RMN y / o GC-MS para observar el
metabolismo de los sustratos marcados con 13C, y luego analizar los
patrones de etiquetado por diversos modelos para deducir los flujos
metablicos (para una revisin, ver Ku nnecke, 1995) . Hemos presentado

anteriormente pruebas cualitativas de que en [1-13C] maz marcado con Glc

(Zea mays L.) puntas de las races ME es activa en condiciones de hipoxia
(Roberts et al., 1992), y puede desempear un papel en la regulacin del pH
citoplasmtico a travs del consumo de protones (Davies, 1986;. Roberts et
al, 1992). Dieuaide-Noubhani et al. (1995) compararon el patrn de
etiquetado de Glu y Ala en puntas de las races de maz oxigenados
marcadas con [1-13C] Glc, y, usando un modelo metablico complejo,
deduce que poco malato se convierte en piruvato a travs de ME. En el
presente estudio se midi el enriquecimiento 13C de precursores y
productos para reacciones catalizadas por ME y PK, y los flujos relativos
deducidas a travs de cada ruta con un modelo ms simple. Se demuestra
que me tiene muy baja actividad en la que respiran puntas de las races,
pero est activado aproximadamente 6 veces durante los primeros minutos
de la hipoxia. Tambin utilizamos este enfoque precursor-producto simple
para medir las actividades in vivo de otras enzimas importantes del
metabolismo malato, PEPC, y enzimas del ciclo de Krebs, y discutir su papel
en la respiracin y la biosntesis.
MATERIALES Y METODOS
El maz (Zea mays L.) semillas (B73, Pioneer Hi-Bred International, Des
Moines, IA) se sumergieron durante aproximadamente 24 h en el fluir, agua
desionizada, y luego se les permiti a germinar entre toallas de papel
hmedas en una bandeja forrada con papel aluminio durante
aproximadamente 48 h. Puntas de las races de 4 a 5 mm de largo se
cortaron 1 en el hielo con una hoja de afeitar y se lavaron con agua
desionizada para eliminar la raz tapa de limo. Puntas de las races lavadas
se transfirieron a 10 mL jeringas, cada una con un tabique de malla de
plstico.
Condiciones de perfusin
Cuatro jeringas de 10 ml que contienen 2 a 6 g de puntas de las races
estaban conectados en serie utilizando tubos y tapones de goma. Una
bomba peristltica recircula 100 ml de medio oxigenado durante 12 a 15 h
en 30 a 40 ml / min a temperatura ambiente. Este medio contena 50 mm
[1-13C] Glc en 10 mM MES (llev a pH 6,5 con Tris), 0,1 mm CaSO4, 50 mg /
L de gentamicina, 2,5 mg / l de anfotericina, y 2,5 mm (NH4) 2SO4. [1-13C]
Glc se obtuvo de Isotech (Miamisburg, OH). Para los experimentos que
requieren tratamiento hipxico, las muestras fueron perfundidos con
solucin saturada de CaSO4-N2 0,1 mm a las 10 a 20 mL / min sin
recirculacin. Jeringas individuales fueron retirados en el momento
apropiado y se congelaron inmediatamente en N2 lquido y se almacenan
hasta la extraccin. Las condiciones de tratamiento usadas aqu son
similares a los utilizados en los estudios anteriores de metabolismo en
puntas de las races de maz (Roberts et al., 1992; Roberts y Xia, 1996). 13C
etiquetado de los metabolitos de la punta de la raz a estado estacionario se
hizo con recirculacin para reducir al mnimo el uso de caros [1-13C] Glc.
(NH4) 2SO4 y Glc tambin se omitieron en el tratamiento hipoxia debido a

que no se encontraron efectos significativos de estos componentes sobre el

metabolismo de hipoxia en los experimentos anteriores (Roberts et al.,
1992). Metabolito extraccin y fraccionamiento metabolitos de bajo peso
molecular se extrajeron con cido perclrico 4% y se centrifuga a 2000 g.
TABA (100 o 50 mm) se aadi a cada muestra justo antes de la extraccin
como patrn interno. El sobrenadante se neutraliz con KOH, se centrifug,
y se coloca en una columna de intercambio H1 (modelo AG50W-X8, BioRad). Despus de ser lavado con agua, los aminocidos se eluyeron con 4 n
NH4OH, se liofilizaron y se reconstituyeron en 800 ml de H2O 2 para el
anlisis de RMN. Despus de anlisis de RMN, los aminocidos eran ms
fraccionada para separar Glu y Asp partir de otros aminocidos, debido a las
altas temperaturas de derivatizacin y GC-MS convierte Gln y Asn en
derivados de Glu y Asp, respectivamente. Esto se logr mediante la
conversin de una columna de cloruro de 1-X8 AG (Bio-Rad) a una columna
de etilo usando 3 M de acetato de sodio. A continuacin, la columna se lav
con tres cargas de lecho de agua desionizada. Los aminocidos fueron
retirados del tubo de RMN y se colocan en la columna. Fracciones de un
mililitro se eluyeron con 0,5 M de cido actico, lo que result en tres picos
ninhidrina. Los picos se reunieron, se liofilizaron y se reconstituyeron en 700
ml de 2 H2O.
Glu y Asp fueron identificados como el segundo y tercer picos,
respectivamente, por RMN. Todos los otros aminocidos se eluyeron en el
primer pico (en la columna de volumen vaco). Estas fracciones se
congelaron a 220 C y se guardan para la derivatizacin y anlisis GC-MS.
El enriquecimiento total de Glu, medida por GC-MS, no fue estadsticamente
diferente de la de enriquecimiento total de no separado Glu y Gln medido en
las fracciones de aminocidos totales (datos no mostrados). cidos
orgnicos, incluyendo Glc-6-P, eluidas en el volumen vaco de la columna de
H1 de intercambio fueron separados de metabolitos neutros mediante
cromatografa de intercambio aninico (AG 1-X8 formiato, Bio-Rad). cidos
orgnicos y Glc-6-P se eluyeron a granel con 5 n cido frmico. El eluyente
se dividi en alcuotas, ya sea para GC-MS anlisis de malato o
desfosforilacin y derivatizacin de Glc-6-P antes del secado y tratamiento
posterior (descrito a continuacin). Ala, Asp, Glu, y malato se ensayaron
enzimticamente (Bergmeyer, 1974)
NMR Spectroscopy
Todos los espectros de RMN se obtuvieron utilizando un espectrmetro
(modelo GN500, General Electric). 13C-RMN datos se recogieron a 125,7
MHz con pulsos cada 15 s, una anchura espectral de 24 kHz, y 32.000
puntos de datos. TABA, que tiene seales distintas a travs de la gama de
desplazamiento qumico 13C, se utiliz como un patrn interno, y el
desacoplamiento de protones se aplic slo durante la adquisicin de datos,
que, junto con el intervalo de pulso largo, alivia la necesidad de
correcciones de Overhauser nuclear (Roberts y Xia, 1995). Las asignaciones

se basan en correspondencia con desplazamientos qumicos de normas

(Roberts et al., 1992; Roberts y Xia, 1995).
GC-MS
Muestras de aminocidos (25 ml) se convirtieron a heptafluorobutyry
steres de isobutilo utilizando un protocolo modificado de MacKenzie y
Tenaschuk (1979). Las muestras se liofilizaron en viales con tapn de tefln
al que se aadieron 200 ml de HCl 3 N en isobutanol. Viales de reaccin se
colocaron a continuacin en un bao de aceite de silicona a 120 C durante
20 min. Las muestras se dejaron volver a la temperatura ambiente, y
despus los reactivos sin reaccionar se evaporaron en una corriente de N2.
A continuacin, 140 ml de acetato de etilo y 60 ml de anhdrido
heptafluorobutrico (Sigma) se aadieron a muestras secas, que se calienta
entonces a 150 C en el bao de aceite durante 10 min. Las muestras se
evapor de nuevo en una corriente de N2 y se resuspendieron en acetato de
etilo a una concentracin adecuada para GC-MS. Malate se derivatiz como
un ster de isobutilo heptafluorobutirilo, como se describi anteriormente.
Este nuevo derivado de malato proporcion tres iones (m / e 443, 387, y
331) que eran similares en abundancia. Glc-6-P se desfosforil por la adicin
de 20 a 100 unidades de fosfatasa alcalina (Sigma) durante 2 h a
temperatura ambiente. Las muestras fueron luego desproteinizado con
cido perclrico 4% (como se ha descrito anteriormente bajo "Metabolito de
extraccin y fraccionamiento"). El Glc liberado se derivatiza a un aldonitrile
penta-acetato, segn lo descrito por Katz et al. (1989). Las muestras
liofilizadas se mezclaron con 0,5% (w / v) de clorhidrato de hidroxilamina en
piridina y se calent en un bao de aceite a 100 C durante 1 h. Reactivos
sin reaccionar se evaporaron en una corriente de N2. Cien microlitros de
piridina y 20 ml de anhdrido actico se aadieron a la muestra se evapor y
se deja reaccionar durante 20 min a temperatura ambiente. Los reactivos en
exceso se evaporaron de nuevo en una corriente de N2 y las muestras
fueron llevados a volumen con acetato de etilo para el anlisis por GC-MS.
Un microlitro de cada muestra derivatizada (100- 500 ng / ml) se inyect en
un cromatgrafo de masas de un solo cuadrupolo del espectrmetro de gas
(HP5890 HP5989 y modelos, respectivamente, Hewlett-Packard), y los datos
se analizaron por el programa de la Estacin Chem ( HP59940, HewlettPackard). La temperatura de la fuente se mantuvo a 200 C. Ionizacin
qumica de metano dio como resultado el ion molecular o el ion molecular57 (el grupo isobutilo) como el ion de base para todos los metabolitos
medidos. El rango de exploracin en masa era m / e 60 a 600. A
continuacin se utiliz el monitoreo individual de iones para medir la
abundancia de m / e 286, 287, 288, y 289 para el Ala; m / e 442, 443, y 444
para Asp; m / e 456, 457, y 458 para Glu; m / e 443, 444, y 445 para la
malato; y m / e 328, 329, y 330 para Glc. Productos derivatizados se
confirmaron con las normas y, a excepcin de malato, publicado valores
(MacKenzie y Hogge, 1977; MacKenzie y Tenaschuk, 1979;. Katz et al, 1989).
reas de los picos se utilizaron para la cuantificacin. Todos los anlisis se
realizaron en una columna capilar de 3 mm 0,25-30-m de 5% fenilo (DB 5, J

& W Scientific, Folsom, CA) con un gas portador He a 4 mL / min. El

programa de temperatura para los aminocidos y malato era 60 a 250 C a
20 C / min, y era isotrmico para Glc a 235 C. La temperatura del
inyector se mantuvo a 240 C para todas las aplicaciones. Estndares
marcados isotpicamente mezclados con los estndares abundancia natural
a cuatro diferentes enriquecimientos 13C se utilizaron para generar curvas
estndar. El porcentaje tomo conocido del exceso de 13C se represent
frente a las abundancias relativas de los grupos de iones especficos
representados como: ECUACION 1
donde el nmero de tomos de 13C que contribuyen a cada abundancia
inica dentro del grupo de iones de una molcula dada se dividi por la
abundancia total de la agrupacin. Las curvas estndar se encontraban
dentro de 5% de cada valor de curvas tericas, y los coeficientes de
correlacin de las lneas de regresin fueron superiores a 0.999 (Beylot et
al., 1986). Los enriquecimientos isotpicas de muestras de races de maz se
determinaron entonces por la ecuacin y 5 mx 1 b, donde y representa la
Ecuacin 1, m es la pendiente de la curva estndar, y b es la interseccin.
Se encontr que la distribucin de 13C dentro de Asp a ser estadsticamente
idntica a la de malato, lo que refleja la rapidez de transaminasa y la accin
malato deshidrogenasa in vivo.
Determinacin de Relativas C fundentes
El enriquecimiento absoluta de cada C en Ala, Glu, Asp, y malato se
determin como sigue: En primer lugar, las cantidades relativas de 13C en
cada posicin de estos metabolitos se determinaron directamente desde las
reas de pico relativas de cada seal de 13C-RMN (por ejemplo, Ala C1 , C2,
C3 o; ver Xia y Roberts, 1995). Relativos enriquecimientos ciento 13C as
obtenidos fueron luego multiplicado por el enriquecimiento isotpico total
determinado por GC-MS espectros para dar el 13C absoluta de
enriquecimiento en cada posicin C. C en metabolitos no derivados de [113C] Glc tiene un enriquecimiento 13C del 1,1% (abundancia natural).
Enriquecimiento isotpico posicional de Glc-6-P no fue determinada, slo su
enriquecimiento totales. Estas mediciones no dependen de porcentaje de
recuperacin de metabolitos a travs de diversos procedimientos descritos
anteriormente, porque la recuperacin no es discriminatoria entre los
diferentes isotopomers. Para determinar la sensibilidad de la RMN para la
determinacin de la abundancia natural de enriquecimiento de 13C, Ala fue
aislado de puntas de las races de control maz (alimentado natural
abundancia Glc bajo normxico o condiciones de hipoxia). 13C abundancia
se determin usando la relacin de alturas de los picos de los espectros de
13C NMR de cada C individual de Ala y Taba (patrn interno). La relacin de
las cantidades totales de Ala andTABA se midi a partir GC-MS espectros.
Medicin del enriquecimiento 13C C para cada individuo de Ala se
determin que era 1,021 6 0,103% 13C (media 6 sd, n 5 27, a partir de
nueve muestras separadas). Alturas relativas pico de RMN para cada C
individual de la abundancia natural Ala, se mostr a ser igual a los 32 6 3.4,

36 6 1,7 y 32 6 2,6%, respectivamente (media de 6 sd), en los extractos de

raz de punta. A partir de estos datos sobre los relativos y absolutos 13C
enriquecimientos, flujos relativos C a travs de vas especficas se
determinaron utilizando los siguientes supuestos: se ha llegado (a) el estado
de equilibrio metablico y isotpica Esta hiptesis fue validado por las
mediciones de enriquecimiento de 13C en metabolitos (datos no
mostrados). (b) Intercambio de mitocondrial, citoslica y metabolitos
vacuolares es rpida en relacin con los flujos metablicos. Los estudios de
metabolismo de apoyo malato esta suposicin (ver Chang y Roberts, 1989,
1991;. Kalt et al, 1990). (c) Hay canalizacin insignificante de metabolitos
hacia abajo vas especficas, es decir, la composicin isotpica de sustratos
de enzimas es la misma que la composicin isotpica mayor parte de los
metabolitos. Hay poca informacin disponible con la cual juzgar la validez
de este supuesto. Estudios como los aqu presentados pueden dar lugar a
puntos de vista sobre la transferencia directa de metabolitos entre enzimas
(ver Voet y Voet, 1995). (d) Las vas de sntesis para los metabolitos
estudiados aqu son las nicas reacciones metablicas importantes que
ocurren en vivo. Esta suposicin se justifica por el hecho de que las vas
tales como la gluconeognesis y el ciclo del glioxilato no son significativas
en puntas de las races del maz extirpados. En estas condiciones, el
enriquecimiento observado del producto C es igual a la contribucin de V1
ciento precursor A y el V2 ciento contribucin de precursor B: SCHEME 1
y V3 puede representar la suma de ms de una reaccin de salida (por
ejemplo, consumo de piruvato para las reacciones de oxidacin y
fermentacin). Si hay una diferencia entre los enriquecimientos isotpicos
posicionales en las molculas A y B, la contribucin de A y B a C se pueden
deducir mediante la expresin: 3
donde Ce es el enriquecimiento isotpico observado de un tomo de C
especfica dentro de la molcula C, y Ae y Be estn lo observado
enriquecimientos isotpicas de los tomos en las molculas precursoras de
A y B, respectivamente, que se convierten en el tomo de C que tiene Ce
enriquecimiento. Este anlisis se puede aplicar a cada tomo en el precursor
y el producto. La sensibilidad con la que V1 y V2 se puede medir aumenta a
medida que la diferencia entre Ae y Be aumenta. Durante la hipoxia Ala
niveles de aumento, por lo que no podemos asumir el estado de equilibrio.
Por lo tanto, se aplic una correccin para la dilucin de la etiqueta recin
sintetizado incorporado en la piscina Ala. La correccin determina el
enriquecimiento isotpico real de la Ala sintetizada entre los puntos de
tiempo secuenciales i y f, Aa, por la siguiente ecuacin: 4
donde Af y Ai son los 13C enriquecimientos isotpicos de Ala desde el punto
de tiempo ms reciente y el punto de tiempo anterior, respectivamente.
Esta correccin representa el caso extremo en el que Ala sintetiza durante el
tiempo designado intervalo se aade simplemente a la preexistente y
piscina inerte de Ala. En contraste, el modelo de estado estacionario asume
que no hay piscina inerte de Ala. Estos dos modelos representan la dos

posibilidades extremas; los flujos relativos reales bajo condiciones de estado

no estacionario se encuentran en algn punto intermedio.
RESULTADOS
ME actividad es relativa Insignificante al PK en que respiran Maz Consejos
Raz Determinamos los flujos a travs de las diferentes vas de sntesis de
piruvato en [1-13C] puntas de las races alimentados Glc del marcaje
isotpico de Ala. Actividad alta transaminasa in vivo en relacin con otros
resultados actividades enzimticas en el etiquetado equivalente de piruvato
y Ala (Dieuaide Noubhani et al., 1995). La distribucin relativa de la etiqueta
dentro de 13C Ala depende de la va utilizado para la sntesis de piruvato,
como se muestra en la Tabla I (vase tambin la Fig. 1). Los predichos 13C
enriquecimientos mostrados en la Tabla I se determinaron a partir de los
13C enriquecimientos de los precursores de Glc-6-P y malato, medido como
se describe en "Materiales y Mtodos". Ala sintetiza a partir de Glc-6-P por la
va glucoltica clsica a travs de PK est marcado en C3 (Voet y Voet,
1995). En contraste, Ala sintetiza a partir de malato a travs de ME se
etiqueta en los tres Cs (figura 1, las reacciones 1, 2 y 3.); C2 y C3 de malato
estn etiquetados de manera similar, como resultado de la asignacin al
azar por la actividad fumarasa (Osmond y Holtum, 1981), y C1 es labele
despus de mltiples vueltas de el ciclo de Krebs (Chance et al., 1983).
Sntesis Ala de [1-13C] Glc que los ciclos a travs de la va pentosa fosfato
(Fig. 1) no va a cambiar el patrn de etiquetado de Ala, pero diluye la
etiqueta incorporada en C3 Ala relacin con Glc-6-P enriquecimiento
(Dieuaide-Noubhani et al., 1995). Al comparar el enriquecimiento de 13C en
C1, C2, y C3 Ala derivada de los precursores alternativos Glc-6-P y malato
travs de la va indicada (Tabla I), es evidente que C2 Ala es el ms
adecuado para la medicin de las actividades relativas de ME y PK. En
primer lugar, el enriquecimiento de 13C en C2 Ala difiere en ms de 15
veces al comparar la sntesis a travs de PK o ME, y as proporciona un
indicador ms sensible que el enriquecimiento en cualquiera C1 o C3, que
se diferencian por menos de 7 y 2 veces,
TABLA 1

respectivamente (Tabla I). En segundo lugar, el enriquecimiento en 13C C2

Ala no es sensible a la operacin de la va de las pentosas fosfato, a
diferencia de etiquetado en C3 Ala (Dieuaide-Noubhani et al., 1995). Por lo
tanto, utilizamos el enriquecimiento 13C de C2 Ala y sus precursores para
medir la contribucin fraccional de PK y ME a la sntesis de piruvato, como
se describe en "Materiales y Mtodos" (Esquema 1 y. Las ecuaciones 2 y 3).
En puntas de las races del maz oxigenados, enriquecimiento 13C en C2 Ala
result ser 1,59 6 0,37% (Tabla I), mientras que los precursores C2 y C5 de
Glc-6-P eran 1,1.% 13C (abundancia natural)

(Dieuaide-Noubhani et al., 1995), y el precursor C2 de malato fue 17,47 6

1,2%. Resolucin de ecuaciones 2 y 3 con estos valores indica que slo 3 6
1.1% de la piruvato in vivo se sintetiz mediante ME, el resto se sintetiza
por PK.
ME se activa durante la temprana Hipoxia
Hemos descrito previamente un aumento de 13C incorporacin en C2 Ala en
puntas de las races de hipoxia, y presentamos evidencia cualitativa que
este aumento se debe a la accin de ME (Roberts et al., 1992). Nuestro
objetivo fue cuantificar ME actividad despus de la aparicin de hipoxia para
probar la validez de nuestras conclusiones anteriores. Niveles Ala aumentan
durante la hipoxia (Roberts et al., 1992; Xia y Roberts, 1994), y por lo que el
enfoque de la medicin de ME actividad tomada en la seccin anterior se
adapt a la condicin de estado no estacionario, como se describe en
"Materiales y Mtodos . "Observamos un aumento mayor que 2 veces en la
incorporacin de 13C en C2 Ala en puntas de las races dentro de 20 min del
inicio de la hipoxia (Fig. 2A).
Anlisis de flujo usando las Ecuaciones 2, 3, y 4 indica que la actividad de
ME en relacin con PK aumenta aproximadamente 6 veces durante los
primeros pocos minutos de hipoxia (Fig. 2B). Los dos conjuntos de datos
mostrados en la Figura 2B muestran que el anlisis utilizando el modelo de
estado estacionario o los rendimientos de modelo de estado nonsteady
resultados muy similares, lo que indica que los cambios en los niveles de Ala
no causan cambios significativos en isotpica enriquecimiento relativo a la
estacionario condicin de estado antes del inicio de la hipoxia. La activacin
de ME temprano en la hipoxia sigui el rpido agotamiento de los
intracelular Asp (Fig. 3B), y aproximadamente paralelo a los cambios en
malato intracelular (Fig. 3A).
Anaplertico Malate Sntesis travs PEPC en que respira
Puntas de las races

La distribucin isotpica 13C en malato y Glu se utiliz para estimar la

contribucin de la C flujo anaplerotic a malato a travs de PEPC. Malate se
enriquece de manera diferente dependiendo de si se sintetiza a travs de
anaplerotically PEPC o mediante el ciclo de Krebs, como se muestra en la
Tabla II. Si malato se sintetiza a travs de PEPC, su precursor es PEP (Fig 1,
la reaccin de 4.); si se sintetiza a travs del ciclo de Krebs, que se deriva
de AKG (Fig. 1, la reaccin 5). El etiquetado de PEP se determin como se
describe en la Tabla II, mientras que el patrn de marcacin en Glu refleja
que en aKG (Dieuaide-Noubhani et al., 1995). Encontramos que el
enriquecimiento 13C del malato se encuentra entre los valores previstos
para cada va (Tabla II), lo que indica que ambos son fuentes activas de
malato en vivo.

La cuantificacin de los flujos relativos C a malato a travs de cada va se

determin individualmente de C1, C2, C3, C4 y malato usando ambos
valores predichos y reales de enriquecimiento para cada C (Tabla II). Los
cuatro Cs de malato se utilizaron de manera similar, ya que son sensibles a
los cambios en el flujo relativo entre las dos vas, en contraste con las
mediciones de ME / PK, descrito anteriormente. Resolviendo las ecuaciones
2 y 3 utilizando los valores dados en la Tabla II, se determin que PEPC
aport 62 6 5,2% (media 6 se) del malato sintetizado en que respiran
puntas de las races.

El gran flujo de PEPC, comparable a la que a travs del ciclo de Krebs,

tambin se puede inferir a partir del patrn de enriquecimiento 13C
observado en Glu, como se ha demostrado previamente por DieuaideNoubhani et al. (1995). En la ausencia de actividad anaplerotic, el
enriquecimiento de estado estacionario de Glu C es un simple reflejo de
etiquetado de piruvato, como se describe por Chance et al. (1983) (Tabla III).
La observacin de enriquecimientos inferiores en C1, C2, C3 y C4 de que en
Glu (Tabla III) refleja la accin de PEPC, que diluye la etiqueta 13C en estos
primeros tres C (Dieuaide-Noubhani et al., 1995). Hemos encontrado que el
enriquecimiento 13C predicho en Glu, calculada a partir de enriquecimientos
observados de los precursores malato y piruvato / Ala, coincide con el
enriquecimiento observado en Glu (Tabla III). Esta observacin apoya la
validez del modelo de Dieuaide-Noubhani et al. (1995).
PEPC ME Excede actividad en ms de 10 veces en que respiran
puntas de las races

Relacionar las dos mediciones de flujo pareadas descritos anteriormente (ME

/ PK y PEPC / KrebsaKG3malate), primero es necesario considerar cmo los
flujos de C individuales de todo el ciclo de Krebs completa variarn en
funcin de la salida de biosntesis particular. Cuando la biosntesis est
ausente, el flujo neto de C a travs de cada paso del ciclo de Krebs ser
igual, y asimismo si la salida de biosntesis del ciclo de Krebs es
exclusivamente a partir de oxaloacetato a Asp. Por el contrario, si la salida
de biosntesis del ciclo de Krebs es exclusivamente de AKG a Glu, entonces
el flujo de malato a aKG ser proporcionalmente mayor que el flujo de AKG a
malato (Fig. 1).
Del mismo modo, la tasa de entrada de piruvato en el ciclo de Krebs (igual a
la accin combinada de PK y ME) se incrementar en relacin con el flujo de
AKG a malato cuando el flujo de biosntesis a los aumentos Glu (Fig. 1). A
partir de estas consideraciones, se determin los lmites de los flujos
relativos a travs de PK, ME y PEPC en que respiran puntas de las races
(Tabla IV). Est claro que el flujo a travs de anaplerotic PEPC es comparable

en magnitud a la velocidad de entrada de piruvato en el ciclo de Krebs.

Adems, el flujo a malato a travs de PEPC es al menos 1 orden de
magnitud mayor que el flujo de malato a travs de ME.
DISCUSIN

La contribucin de la ME para la actividad respiratoria

El uso de los mtodos de anlisis combinados de GC-MS y RMN, hemos

medido actividades in vivo de los enzimas ME y PK. Se encontr que durante
la respiracin, ME actividad representa aproximadamente el 3% del piruvato
sintetizado en el que respiran puntas de las races de maz (Tabla IV). Estos
resultados son consistentes con el anlisis de Dieuaide Noubhani et al.
(1995), y apoyar su modelo que relaciona los patrones de etiquetado de Glu
y malato. Sin embargo, nuestros resultados son contrarios a los resultados
obtenidos en las mitocondrias aisladas. Por ejemplo, el da y Hanson (1977)
determinaron que en mitocondrias aisladas a partir de maz, ME
representaron el 42% de la piruvato utilizada por el ciclo de Krebs.

Ha sido ampliamente aceptado que mitocondrial ME puede servir para

compensar para el transporte de piruvato limitada travs de la membrana
mitocondrial (Day y Hanson, 1977; Brailsford et al, 1986;. Hill et al., 1994),
proporcionando el ciclo de Krebs con piruvato bajo alto demandas y
energticos (para una revisin, ver Wiskich, 1980; ap Rees, 1990; Douce y
Neuburger, 1990; Lambers, 1990). Sin embargo, nuestro trabajo aqu indica
que este no parece ser el caso en puntas de las races de maz extirpados.
Aunque no podemos en este momento excluir la posibilidad de que los
tejidos de las plantas que no sean puntas de las races del maz podran
confiar ms en m para alimentar la respiracin, se sugiere la posibilidad de
que la mayor actividad de la EM observada en mitocondrias de maz
aislados refleja nada ms que su activacin aparente por la baja pH, como
se explica en la siguiente seccin.

Regulacin de ME actividad in vivo e in vitro

Hemos observado que en respiran puntas de las races del flujo a malato
mediante PEPC es un 1 para menos de magnitud mayor que la tasa de
consumo de malato por ME (Tabla IV). Esto indica que la actividad de ME no
est limitada por el suministro de malato in vivo. Adems, demostramos que
me est activado aproximadamente 6 veces durante los primeros pocos
minutos de hipoxia (Fig. 2B), que es consistente con nuestra hiptesis

anterior (Roberts et al., 1992). La activacin de ME en la hipoxia, que se

midi con respecto al flujo a travs de PK (Tabla IV), representa un
incremento en la actividad absoluta, no una inhibicin de la PK, ya que
aumenta el flujo glucoltico durante la hipoxia (Roberts et al., 1984).

Estas observaciones indican que ME actividad se suprime alguna manera en

oxigenada, respiran puntas de las races, y especulan que esta inhibicin es
causada principalmente por el alto pH citoplasmtico (aproximadamente
7,6) en puntas de las races oxigenados (Roberts et al., 1992). Hay evidencia
circunstancial significativo que el comportamiento de los ME en puntas de
las races bajo alta O2 y la hipoxia est regulada por el pH. En primer lugar,
la actividad ME in vitro est fuertemente afectada por el pH, aumentando
cuando el pH disminuye entre 7,6 reaccin y 6,5 (Davies y Patil, 1974; boda
y Negro, 1983). En segundo lugar, pH citoplasmtico disminuye
rpidamente de aproximadamente 7,5 a 6,9 durante los primeros pocos
minutos de hipoxia (Roberts et al., 1.984, 1992).
En tercer lugar, la actividad ME en mitocondrias aisladas se activa a pH bajo
(Neuburger y Douce, 1980; la boda y Whatley, 1984), lo que indica que la
acidosis citoplasmtica puede ser detectado por mitocondrial ME. En cuarto
lugar, los estudios con mitocondrias aisladas muestran que la sntesis de
piruvato significativa a travs de ME se obtuvo con tampones de pH 6,8 a
7.2 (Day y Hanson, 1977;. Brailsford et al, 1986;. Hill et al, 1994). Estas
observaciones proporcionan una explicacin para nuestro resultado que
muy poco la sntesis de piruvato se produce a travs de ME en que respiran
puntas de las races (Tabla IV). Aunque ME es activado por la acidosis
citoplasmtica, in vivo esta condicin se cumple slo bajo la hipoxia severa,
en la cual la respiracin se vuelve insignificante. Por lo tanto, parecera que
slo bajo condiciones inusuales sern tanto alta demanda respiratoria y
acidosis citoplasmtica existir juntos en las clulas vegetales, y me
permitir cumplir su papel ampliamente considerados en respiracin de las
plantas (para una revisin, ver Wiskich, 1980; ap Rees, 1990; Lambers,
1990; Douce y Neuburger, 1990).

Esta visin estrecha espera claramente estudios experimentales de

actividades ME en otros tejidos vegetales y en diferentes condiciones
fisiolgicas. Adems de la regulacin de pH, ME actividad tambin puede
estar influenciada por los niveles de malato (Davies y Patil, 1974; boda y
negro, 1983; Davies, 1984), dado que la concentracin de malato
citoplasmtica en las puntas de la raz del maz extirpados es de
aproximadamente 3,5 mm (Chang y Roberts, 1991). De acuerdo con esta
posibilidad es la activacin coincidente de ME (Fig. 2B) y el aumento de
malato durante los primeros pocos minutos de hipoxia (Fig. 3A). Este
aumento de malato es al menos en parte atribuible a su sntesis a partir de
Asp, que se agota (Fig. 3B) (Roberts et al., 1992).

La disminucin en la actividad ME despus de aproximadamente 20 min de

la hipoxia (Fig. 2B) puede ser parcialmente causado por un ligero aumento
de pH citoplasmtico despus de la acidificacin inicial grande (Roberts et
al., 1992; Roberts y Xia, 1996). De hecho, hemos sugerido que la accin de
ME temprano en la hipoxia puede servir para compensar la acidificacin
citoplasmtica, porque esta reaccin consume protones (Davies y Patil,
1974; Davies, 1980; Roberts et al., 1992). En ltima instancia, sin embargo,
la actividad de ME en puntas de las races de hipoxia est limitada por
malato citoplasmtica, porque tanto intracelular Asp y malato se agotan
(Fig. 3). El malato intracelular residual encontrado despus de 1 h o ms de
la hipoxia se encuentra predominantemente en la vacuola (Roberts, 1993), y
es por lo tanto esencialmente no disponible para la descarboxilacin por ME.
La relacin de PEPC al ciclo de Krebs en Consejos Maz Root

El flujo a travs de PEPC es comparable en magnitud a la velocidad de la

gluclisis (que se midi a nivel de PK) (Tabla IV) y la tasa de sntesis de
malato a travs de la
Ciclo de Krebs (Tabla IV). En contraste, muy poco malato sintetizado por
PEPC se convierte en piruvato a travs de ME (Tabla IV). Por consiguiente,
concluimos que el papel principal de PEPC en puntas de las races de maz
oxigenados es anaplertico, y por lo tanto la biosntesis sustenta en lugar de
la respiracin. Cul es la contribucin del ciclo de Krebs en la biosntesis
asociado con la actividad PEPC? Si el ciclo de Krebs se drena a travs de
oxaloacetato, la actividad requiere el apoyo de PEPC ni PK ni ninguna parte
del ciclo de Krebs. Por el contrario, si la actividad de PEPC sostiene sntesis
de Glu, hay un requisito para la participacin} estequiomtrica de PK y el
ciclo de Krebs (de oxaloacetato a aKG) (ver Fig. 1). Por lo tanto, la
naturaleza de la salida biosinttica que resulta de la accin anaplerotic de
PEPC determina las actividades relativas de PEPC, PK, y las diferentes partes
del ciclo de Krebs. Esta interdependencia es evidente en la Tabla IV, en la
que se describe la actividad de PEPC con respecto al flujo de AKG a malato.
Teniendo en cuenta esta relacin de las actividades, se muestra que el flujo
de acompaamiento a travs de PK puede variar de 0,67 a 1,8 veces el flujo
PEPC (Tabla IV), dependiendo de si Asp o Glu es el producto principal.

Aunque las mediciones de flujo en el presente estudio no permiten distinguir

entre estas posibilidades, la consideracin de trabajo previo sobre el
metabolismo de C inorgnico es til.

En primer lugar, hace tiempo se sabe que el cociente respiratorio en puntas

de las races oxigenados es cercano a 1 (Beevers, 1961). Un gran flujo de
Glc a Asp dar menos CO2 neta evolucin relativa al consumo de O2,

mientras que C inorgnico fijado por PEPC para sostener sntesis de Glu es
acompaado por descarboxilacin, y as, en este caso el consumo de O2
(asociado con el reciclado de nucletidos de piridina) se aproxima liberacin
de CO2. Este anlisis indica que en puntas de las races de maz del flujo a
Asp es mucho ms pequeo que eso para Glu. En segundo lugar, la
comparacin de mediciones de la actividad PEPC, obtiene siguiendo el
destino de 14C y bicarbonato marcado con 13C (Chang y Roberts, 1992) con
las mediciones de la respiracin (Roberts et al., 1984), sugieren que la
produccin neta de CO2 es varias veces mayor que la actividad PEPC, una
inferencia similar al dibujado por Dieuaide-Noubhani et al. (1995). Al igual
que en el primer caso, estos datos parecen impedir la biosntesis de Asp
como la salida principal del ciclo de Krebs, porque bajo las condiciones de
flujo relativas mostradas en la Tabla IV, lnea 3, la evolucin de CO2 de la
oxidacin de piruvato (a travs de PK) sera compensado considerablemente
por HCO3 2 fijacin atribuibles a la actividad de PEPC. En contraste, la
biosntesis de Glu en las condiciones de flujo relativas mostradas en la Tabla
IV, lnea 4, requiere la evolucin de CO2 a ser ms que 3 veces mayor que
Actividad PEPC, resultado de una mayor conformidad con las mediciones
separadas apenas sealadas. Por lo tanto, estas consideraciones tanto
indican que Glu es un producto de biosntesis mucho ms importante que
Asp en puntas de las races del maz y, como corolario a esta conclusin,
que el flujo neto de C a travs del ciclo de Krebs es ms rpido de malato a
aKG que de AKG a malato. Adems, sealan que el valor potencial de las
mediciones de la evolucin de CO2, simultneas con el anlisis de istopos
de metabolitos como se realiz en este estudio, a la comprensin de estos
importantes flujos metablicos en plantas