Prediccin del ndice de fermentacin de los granos de cacao (Theobroma cacao L.

)
basado en la medicin del color y de las redes neuronales artificiales
ABSTRACTO:
Varios procedimientos se usan actualmente para evaluar el ndice de fermentacin (FI) de
los granos de cacao (Theobroma cacao L.) para el control de calidad. Sin embargo, todos
ellos presentan varios inconvenientes. El objetivo del presente trabajo fue para desarrollar
y validar un procedimiento cuantitativo basado en una imagen simple, utilizando la
medicin del color y redes neuronales artificiales (RNA). modelos de RNA basados en
mediciones de color se ensayaron para predecir ndice de fermentacin (FI) de los granos
de cacao fermentado. Los valores RGB se midieron a partir de la superficie y Regin
Centro de granos fermentados en imgenes obtenidas por la cmara y escner de
escritorio. La FI se defini como la relacin del total de aminocidos libres en fermentados
frente a muestras no fermentado. El modelo ANN que incluida la medicin del color RGB
de la superficie de cacao fermentado y la relacin R / G en grano de cacao del alcalina
extractos fue capaz de predecir FI sin diferencia estadstica en comparacin con los
valores experimentales. El rendimiento de la ANN modelo se evalu mediante el
coeficiente de determinacin, de Bland-Altman y los anlisis de regresin de PassingBablok. Por otra parte, en los granos fermentados, contenido de azcar total y valorable
acidez mostr un patrn similar al total de aminocidos libres predijo a travs del color
basado en RNA modelo. Los resultados de este trabajo demuestran que la ANN modelo
propuesto puede ser adoptado como una de bajo costo y en el procedimiento in situ para
predecir FI en los granos de cacao fermentado a travs de aplicaciones desarrolladas
para mviles dispositivo.
INTRODUCCION:
Hay varios procedimientos utilizados en la actualidad para evaluar la fermentacin ndice
(FI) de los granos de cacao para el control de calidad. Cortar-prueba es un procedimiento
simple, de uso frecuente, en base a los cambios de color registrado durante la
fermentacin. Cut-test consiste en cortar los granos a lo largo por la mitad y el examen de
su color interno utilizando una puntuacin basada en granos de color prpura y marrn.
Sin embargo, este mtodo no es totalmente cuantitativo y la evaluacin del color es muy
subjetivo. La medicin de la relacin de absorbancia A460 nm / A530 nm de extractos
metanlicos de cido podra ser utilizado. Esta relacin de absorbancia ha mostrado una
buena relacin no lineal con la categora de color sensorial (cut-test) y Hunter L, a,

indicadores b de color durante la fermentacin, sin embargo, no tiene ha utilizado como FI

en cocoabeans totalmente fermentados, donde el mnimo podran producirse diferencias
de color entre las muestras. Grado de fermentacin de los granos de cacao se mide
tradicionalmente por el amonaco contenido (NH3). Una correlacin positiva entre Se ha
observado contenido de amonaco y el nivel de fermentacin. Sin embargo, esto se
evala mediante la tcnica de Conway, que es consume tiempo y, por lo tanto, no es
apropiado para el anlisis de rutina. Los cambios en la cantidad y la composicin de
aminocidos libres se ha informado durante la fermentacin y, por lo tanto, tambin podra
proporcionar informacin sobre FI. Por lo tanto, los granos fermentados se caracterizan
por las altas cantidades de cidos totales amino libre y aumento de la relacin hidrofbica
de la libertad de aminocidos libres cidas, que proporcionan informacin en el grado de
fermentacin. Una correlacin positiva (R0.7; po0.01) entre la cantidad total de
aminocidos libres y la proporcin de hidrfobo a aminocidos libres cidos ha sido
observado en el cacao en bruto de diferentes orgenes. individual y aminocidos libres
totales en muestras de cacao se pueden cuantificar por el lquido cromatografa. Sin
embargo, esta tcnica no siempre est disponible en todos los laboratorios y requiere un
largo tiempo de anlisis aproximadamente 1 h por muestra. qumica analtica basada en
la visin por ordenador (CV-AC), que se centra en el anlisis qumico basado en los
cambios de color, est ganando un inters creciente. CV-AC tiene varias ventajas
significativas, tales como la simplicidad de uso, y el hecho de que es fcilmente
combinablecon porttil y ampliamente distribuido dispositivos de imagen, lo que resulta en
procedimientos de anlisis limpios en muchas reas que demandan fuera de laboratorio
aplicaciones para el seguimiento in situ y en tiempo real. Un limitado nmero de estudios
que utilizan herramientas lineales y no lineales a modelado han sido reportados por la CVCA en la ciencia de los alimentos. Por lo tanto, lineal mltiple regresin se han
desarrollado para predecir la actividad antioxidante (R20.97, po0.001) y compuestos
fenlicos totales (R20.94, po0.001) en la zanahoria de color, basado en los datos
obtenidos por un CIELab sistema de visin artificial. Del mismo modo, el nivel de
amonaco en iceberg lechugas ha sido predicha a partir de parmetros de color (R20.73,
po0.001) por regresin lineal mltiple [9]. el apoyo de los mnimos cuadrados La mquina
de vector, un procedimiento no lineal, y el color fractal ha sido utilizado para predecir el
contenido de acrilamida (error cuadrtico medio (RMSE) 15.70 ng / g, coeficiente de
determinacin (R2) 0.99). Las redes neuronales artificiales (RNA) son herramientas muy
poderosas para modelar tendencias no lineales dentro de los datos en los que hay muy

complejo relaciones para ser modelados. fermentacin del grano de cacao es una
complejo proceso bioqumico en el que se producen varios cambios en macromolculas
como las protenas y los hidratos de carbono, as como en cidos orgnicos y azcares.
Las RNA es una herramienta heurstica til cuando la relacin terica entre las variables
de entrada y de salida que falta como el ndice de fermentacin y el color de los granos de
cacao. Los -Perceptrn multicapa es el ms utilizado Arquitectura RNAs a aproximar las
funciones continuas y de gran cantidad de muestras / variables relacin para desarrollar
un modelo predictivo. El objetivo de este estudio fue predecir FI en el cacao fermentado
totalmente frijoles usando el color RGB y la absorbencia, y las RNA. basada en el color
ANN modelos para la prediccin de FI se validaron utilizando gratis total amino cido
mediante el coeficiente de determinacin, de Bland-Altman y anlisis de correlacin pasaBablok.
2. EXPERIMENTAL:
2.1. Reactivos y soluciones:
Todos los productos qumicos utilizados fueron de grado analtico-reactivo sin purificacin
adicional. Antrona, D-glucosa, cido glico, o-ftalaldehdo (OPA), borato de sodio, L
arginina, 2-mercaptoetanol, fenol indicador rojo, polivinilpirrolidona (PVPP) y sodio
hidrxido se adquirieron de Sigma-Aldrich (Madrid, Espaa). Etanol absoluto, reactivo de
Folin-Ciocalteu, cido clorhdrico y cido sulfrico se adquirieron de Merck (Barcelona,
Espaa). Milli Q Se utiliz agua de calidad ultrapura (o18.2 mO) para la preparacin de
soluciones. solucin madre de L-arginina (10 mg ml 1) se prepar de 0,4 mol L-1 de cido
clorhdrico y soluciones recin de trabajo 0,0.125, 0.25, 0.5, 1.0 se prepararon a partir de
valores de dilucin en serie. Valores de solucin de glucosa 1 mg ml 1 se prepar en
agua y se se utiliz para preparar soluciones de 0, 0,0375, 0,075, 0,15 de trabajo, 0,3 mg
L 1 por dilucin en serie
2.2 GRANOS DE CACAO
2.2.1. MUESTRAS
Dos blanco granos de cacao fino primas de variedades criollas de Piura (M1) y
Cajamarca-Per (M2) y una variedad criolla nativa (M3) desde Tumbes-Per fueron
utilizados. Muestras primas fueron cosechadas en Diciembre de 2015 y fermentado de la
siguiente
2.2.2 LA FERMENTACION Y ES SECADO

La fermentacin del cacao se llev a cabo en tres regiones diferentes del Per (Piura,
Cajamarca y Tumbes) de acuerdo con la productores prcticas habituales. los granos de
cacao primas fueron fermentadas por el mtodo de la caja utilizando cajas de 1,2 0,5 0,5
m, siempre de dos compartimientos para la fermentacin progresiva. A las 48 h, cuando el
la temperatura de fermentacin fue de 40 C, las muestras se agitaron cada 24 h durante
6 das para evitar el aumento excesivo de la temperatura (R48 C). Los granos de cacao
fermentado se secaron-sol para un contenido de humedad final cerca de 6,5%, que se
midi con una medidor de humedad de cacao (Aqua-Boy KMP, Leeds, Reino Unido).
cacao fermentado frijoles (100-200 g) se tomaron muestras de cada bolsa utilizando una
especfica sonda y el mtodo de cuarteo. Las muestras se envasaron en la etiqueta
bolsas de polietileno y se almacenaron a 4 C hasta su anlisis.
2.2.3. LA ADQUISICIN DE IMGENES, PROCESAMIENTO Y ANLISIS
2.2.3.1 ADQUISICIN
Cuarenta granos fermentados de cacao de cada muestra M1, M2 y M3 fueron escogidos
al azar y pelaron manualmente. En primer lugar, la imagen en grano fue adquirido en un
escner de escritorio como se muestra a continuacin y en segundo lugar, cada grano se
cort manualmente en mitades utilizando un cuchillo quirrgico, como para el corte de la
prueba tradicional, y la imagen fue tambin adquirir. A partir de entonces, los granos de
cacao fermentados fueron individualmente molieron en un mezclador de caf
(SELECLINE, Francia) utilizando cinco ciclos de 10 s para evitar calentamiento de la
muestra y se almacenaron a 4 C hasta su anlisis. Cincuenta miligramos de granos de
cacao fermentado de tierra se mezclaron con 1 ml de NaOH (0,28 mol L 1) y se agit a la
velocidad mxima en una "Movil Rod" (JP Selecta S.A., Barcelona, Espaa) agitador
durante 5 min a
temperatura ambiente. Los extractos de cacao fermentados se centrifugaron a 5000 rpm
durante 5 min a temperatura ambiente y el sobrenadante fue se almacena a 4 C hasta
su anlisis. Para los granos de cacao fermentados, las imgenes fueron adquiridos con un
escner de escritorio 1510 HP PSC (Hewlett- Packard Development Company, EE.UU.)
configurado de la siguiente manera: resolution1200 dpi, los bits de color por pixel
depth32 y el formato fileTIFF formato comprimido. Una cubierta de blanco especfico
fue diseado e impreso en una impresora 3D MakerBot (NY, EE.UU.) para cubrir los
granos

para evitar la interferencia de la luz externa y mejorar la reflexin de la luz. Las imgenes
de extractos de cacao fermentados se adquirieron utilizando un telfono mvil Motorola
Moto G bajo la constante las condiciones de luz en la placa de 96 pocillos.
2.2.3.2. PROCESAMIENTO Y ANLISIS
Las imgenes de cacao fermentado frijoles para cada muestra se preprocesados antes
del anlisis usando MATLAB caja de herramientas de procesamiento de imgenes. Las
imgenes fueron corregidos para la iluminacin de fondo no uniforme y se convierte en
una formato binario para el anlisis. Las imgenes de cada grano de cacao fueron
segmentados a partir de imgenes en total (Fig. 1 complementario). valores RGB eran
midi utilizando un plugins de ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). De cacao en grano medio,
los valores medios RGB de cada dos mitades eran calculado.
2.2.4 MEDICIN QUIMICA
2.2.4.1. ESPECTRO DE ABSORCIN DE LOS EXTRACTOS DE CACAO FERMENTADO

FRIJOLES
Los espectros de absorcin fueron adquiridas en un Synergy HT Multi- Modo lector de
microplacas (Biotek, Rochester, Vermont, EE.UU.) a 400- 500 nm.
2.2.4.2. LOS AMINOCIDOS LIBRES Y EL NDICE DE FERMENTACIN
Los aminocidos libres de granos de cacao se recuperaron utilizando un adaptado y
modificado procedimiento de extraccin descrito anteriormente, la cual fue optimizada
para eliminar los compuestos fenlicos en las muestras de cacao fermentados. Cincuenta
miligramos de granos de cacao sin cscara y de tierra eran se extrajo con 1 ml de
solucin acuosa de cido clorhdrico (0,4 mol L 1), que contiene 5,6% w / v de PVPP para
eliminar fenlico compuestos, bajo agitacin constante en un "Mvil Rod" durante 30
minutos a temperatura ambiente (20 C). Las muestras se centrifugaron a 2100 g durante
10 min a 4 C y el sobrenadante se almacen a 20 C hasta el anlisis. La eficiencia en
compuestos fenlicos eliminacin por PVPP se comprob mediante la comparacin con
una muestra sin
PVPP utilizando una metodologa de alto rendimiento rpido de microplaca ensayo de
Folin-Ciocalteu. Los aminocidos libres se determinaron mediante una fluorimtrica
ensayo modificado. En pocas palabras, un ml de volumen 5 de la por encima de
sobrenadante se mezcl con 100 ml de o-ftalaldehdo (OPA) de reactivo en una placa de
96 pocillos durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad. A partir de entonces,
la fluorescencia se ley en un Sinergia HT Multi-Modo lector de microplacas a

wavelength de excitacin 360 740 nm y emisin nm wavelength460740. reactivo OPA

estaba compuesto de 0,8 mg ml 1 OPA y 0,2% de 2-mercaptoetanol en 0,1 mol L 1 borato
de sodio. curva estndar de L-arginina se utiliz para calcular el contenido de cidos
amino libre total y se expres como mg de cido total amino libre como arginina / g de
muestra. Teniendo en cuenta que los granos de cacao sin fermentar contienen como bajo
como 2-4 mg / g de grasa libre de materia seca del total de aminocidos libres, Se utiliz
un valor medio de 3 mg / g en este estudio para calcular el ndice novedoso de
fermentacin (FIFAa) como sigue:
donde: FA es la cantidad de aminocidos libres en el cacao fermentado frijol (FAAF i) y no
fermentada de granos de cacao (FAanf), y N es el nmero de granos de cacao
fermentados evaluados.
2.2.4.3. SIN AZUCAR
pH y acidez titulable. Para determinar sin azcar contenido, se extrajo cada grano de
cacao fermentado (10 mg) con 1 ml de 80% (v / v) de una solucin de etanol en un
agitador de "varilla mvil" en mxima velocidad y temperatura ambiente durante 2 h. El
sobrenadante, obtenido por centrifugacin a 5000 rpm durante 10 min, se mezcl con un
volumen igual de solucin de PVPP (0,1 g ml 1) para eliminar compuestos fenlicos y
luego se centrifugaron como se describe anteriormente Los azcares libres se evaluaron
utilizando un pocillo de microtitulacin antrona sulfrico ensayo colorimtrico de cido.
Brevemente, 30 ml de sobrenadante se se mezcla con 75 ml de reactivo de antrona (0,2%
w / v en concentrado
cido sulfrico). La mezcla se incub a 95 C durante 3 min y despus se enfri a 20 C
en un sistema de termociclador PCR (DeltaCycler I , Ericomp Inc., CA, EE.UU.). Las
mezclas de reaccin se transfirieron a una placa de 96 pocillos y la absorbancia se midi
a 630 nm en un Synergy HT Multi-Modo lector de microplacas. El azcar contenido,
estimada a partir de la curva estndar de glucosa (0 a 0,3 g L 1), fue expresada en
gramos de glucosa por 100 g de muestra. Para la medicin del pH y la acidez titulable, 50
miligramos de los cotiledones de semillas de cacao sin cscara y de tierra se agitaron en
1.0 ml de agua durante 30 minutos a temperatura ambiente. La muestra se centrifug a
5000 rpm durante 5 min a temperatura ambiente y sobrenadante se almacen a 4 C
para el pH y el anlisis de acidez. Un pHmetro (Mettler-Toledo, OH, EE.UU.) se utiliz
para medir el pH a 20 C. la acidez valorable de eachcocoa frijol se cuantific utilizando
un novedoso sistema de micro-valorable (Fig. 2 Complementario). Brevemente, 100 ml de

sobrenadante se valora con hidrxido de sodio (0,1 mol L 1) en presencia de indicador de

mezcla (2 ml) rojo -Diseo Neutro que contiene 0,1% de metileno fiebre catarral en la
placa de 96 pocillos. Una bomba de infusin de jeringa (Harvard aparato, EE.UU.) a un
flujo de 0,1 ml min 1 se utiliz para aadir hidrxido de sodio. acidy titulable se expres
como volumen de hidrxido de sodio -calculated de tiempo y el flujo de datos por gramos
de la muestra.
2.2.5. RED NEURONAL ARTIFICIAL
Una arquitectura de mltiples capas perceptrn (MLP) de las RNA fue aplicado para el
modelado del total de aminocidos libres de fermentado los granos de cacao como
funcin de los parmetros de color. de color RGB de fermentado los granos de cacao y
extractos, as como el espectro de absorcin de extractos de 400 a 450 nm se utilizaron
como variables predictoras. AAN modelos se realizaron en un cien veinte fermentado
granos de cacao. Un tamao de la muestra aleatoria 70:15:15 se utiliz para la formacin,
prueba y validacin pasos usando un algoritmo de alimentacin hacia adelante para
reducir al mnimo la funcin de error. El nmero de neuronas en el oculto capa se
estableci en un intervalo de 3 a 10, de la red para train20 y red para retrain5. funcin
de activacin (identidad, logstica, Tanh, exponencial y Sine) en cuanto a las neuronas
ocultas y de salida. El rendimiento de los modelos de RNA fue evaluada comparando la
Los valores del coeficiente de determinacin (R2), de Bland y Altman y el anlisis de
regresin de Passing-Bablok.
2.2.6. ANALISIS ESTADISTICO
Modelos de RNA se llevaron a cabo utilizando Statistica 13.0 (StatSoft, OK, EE.UU.).
ANOVA de una va se realiz con GraphPad Prism 5.0 software estadstico (GraphPad,
Inc., EE.UU.). Bland y Altman y los anlisis de regresin de Passing-Bablok se realizaron
con Medcal Statistical Software 13.3.3 (MedCalc Software BVBA, Ostende, Blgica).
3. RESULTADOS Y DISCUSIN
3.1.LA FERMENTACIN DE LOS GRANOS DE CACAO Y LOS CAMBIOS EN LAS
PROPIEDADES DE COLOR

La fermentacin es un paso clave para preparar cacao fino a travs de la formacin de

precursores del aroma potentes. Los cambios de color que van de prpura a marrn se

han reportado durante la fermentacin de cacao en grano. -Corte de prueba es un mtodo

visual sencillo para evaluar el color de los granos, que se pueden hacer en el campo; por
lo tanto
se utiliza a menudo como FI. Por otra parte hay varios qumico mtodos disponibles para
evaluar con mayor precisin la FI. Entre otros, un ndice cuantitativo de fermentacin de
los granos de cacao, basado en la relacin de absorbancia A460nm / A530nm de
extractos metanlicos de cido, ha sido propuesto . Este ndice de fermentacin mostr
una buena
relacin no lineal con la categora de color sensorial modificada (corte prueba) y Hunter L,
a, b indicadores de color de la evolucin de la fermentacin a los 0, 12, 36, 60, 84 y 96
horas. Sin embargo, la relacin de absorbancia no tiene sido probado para comparar el
ndice de fermentacin en totalmente fermentada granos de cacao, donde las diferencias
de color mnimas se pueden encontrar, como demostrado en este estudio (Fig. 1A). Por lo
tanto, el espacio CIE 1931color mostr que las propiedades de color de 120 granos de
cacao fermentados tienen cromaticidad gama X entre 0,425 y 0,525 (Fig. 1C) y L0- 30%
y S60-100% (Fig 1D.); mientras que, fermentados y no fermentados cacao en grano (fig.
1B) se discrimin basan en facilidad propiedades de color para ambos espacios de color
(figs. 1C y D). Porque cambio de color es un complejo proceso bioqumico, no lineal y
modelos complejos basados en la medicin del color (mediante un sencillo sistema de
adquisicin de imagen) debe aplicarse para evaluar la calidad de los granos de cacao
fermentado.
3.2. PREDICCIN DEL NDICE DE FERMENTACIN DE LOS GRANOS DE CACAO
BASADA EN EL COLOR Y REDES NEURONALES ARTIFICIALES
3.2.1. NDICE DE FERMENTACIN A BASE DE CONTENIDO LIBRE AMINOCIDOS
Desde un punto de vista qumico, algunos fabricantes de chocolate cuantificar el
contenido de NH3 con el fin de evaluar el control de calidad de granos de cacao. Una
correlacin positiva entre el contenido y el NH3 nivel de la fermentacin se ha observado,
como tradicionalmente se mide por contenido de amonaco. Sin embargo, se evalu por el
Conway tcnica, que es mucho tiempo y por lo tanto no es adecuado para anlisis de
rutina. Por otra parte, los cambios en la cantidad y composicin de los aminocidos libres
son reportados durante fermentacin. Por lo tanto, las semillas fermentadas se
caracterizan por alta cantidades de aminocidos libres totales y una mayor proporcin de
hidrfobo libre de cidos, aminocidos libres, que proporcionan informacin en el grado

de fermentacin. Una correlacin positiva (r0.7, po0.01) entre la cantidad de

aminocidos libres totales y el proporcin de hidrfobo a aminocidos libres cidas se
observa en crudo cacao de diferentes orgenes. procedimiento de cromatografa lquida se
utiliza comnmente para cuantificar un aminocidos libres individuales totales