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Invest Clin 45(2): 121 - 130, 2004

Frecuencia de la mutacin F508 en


pacientes venezolanos afectados con fibrosis
qustica.
Alisandra Morales-Machin, Lisbeth Borjas-Fajardo, Lennie Pineda, Sandra Gonzlez,
Wilmer Delgado, Wiliam Zabala y Erika Fernndez.
Unidad de Gentica Mdica, Facultad de Medicina, Universidad del Zulia, Maracaibo,
Venezuela.
Palabras clave: Fibrosis qustica, mutacin F508, reaccin en cadena de la
polimerasa.

Resumen. La Fibrosis Qustica (FQ), es la enfermedad autosmica recesi-


va severa ms frecuente en poblaciones caucsicas, en las que tiene una inci-
dencia de 1/2500 individuos. Se caracteriza por una alteracin generalizada
de las glndulas exocrinas y es producida por ms de mil mutaciones de un
gen localizado en la regin 7q31, que codifica una protena llamada Regula-
dor de la Conductancia Transmembrana de FQ (RCTFQ). La mutacin ms
frecuente es la F508, que consiste en la delecin del codn que codifica a la
fenilalanina en la posicin 508. El objetivo de este trabajo fue determinar la
frecuencia de la mutacin F508 en pacientes venezolanos afectados con FQ
mediante la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (RCP). Se estudiaron 30 pa-
cientes pertenecientes a 28 familias, que por clnica y 2 determinaciones de
cloruros en sudor > 60 meq/L fueron diagnosticados como afectados con FQ.
La deteccin de la mutacin se realiz a partir de amplificacin por RCP de
un segmento del gen de FQ de 98 pares de bases (pb) que contiene el codn
que codifica a la fenilalanina en la posicin 508 y el cual est ausente en los
que tienen la mutacin. La frecuencia del alelo F508 fue de 26,79%, distri-
budos en 6 homocigotos F508 y 7 heterocigotos compuestos F508/X. El
resto de las mutaciones, no F508, representaron el 73,21%. La frecuencia
del alelo F508 en esta muestra es menor a la reportada en pases europeos.
En Amrica Latina se ha observado una gran heterogeneidad en su frecuencia,
esta variacin podra explicarse por los diferentes patrones de mestizaje dados
por migracin externa y de las alteraciones moleculares de FQ que existen en
la poblacin que se analice. En este trabajo, la mutacin F508 proviene de
abuelos en su mayora (79,41%) nacidos en pases mediterrneos y en Colom-
bia y en las no F508, los abuelos son nacidos preferentemente en Venezuela
(79,27%) y Colombia (17,07%).

Autor de Correspondencia: Alisandra Morales-Machin, Unidad de Gentica Mdica, Facultad de Medicina, Uni-
versidad del Zulia, Hospital Universitario de Maracaibo. Maracaibo, Venezuela.
122 Morales-Machin y col.

Frequency of F508 mutation in venezuelan patients with cystic


fibrosis.
Invest Cln 2004; 45(2): 121 - 130

Key words: Cystic fibrosis, F508 mutation, polymerase chain reaction.

Abstract. Cystic Fibrosis (CF) is the most common and severe autosomal
recessive disease in Caucasian populations, with an incidence of 1 in 2500 live
births. It is characterized by a generalized disturbance in exocrine glands and
it is caused by over one thousand mutations at the cystic fibrosis conductance
regulator gene (CFTR) mapped at 7q31. F508 is the most frequent mutation
worldwide and it consists in a deletion of the codon that encodes fenilalanine
at the 508 proteins position. The aim of this study was to determine the fre-
quency of the F508 mutation in Venezuelan patients with CF using the Poly-
merase Chain Reaction (PCR). We studied thirty patients of twenty eight fam-
ilies who were diagnosed with CF based on their clinical features and sweat
chloride level > 60 mEq/l in two determinations. Detection of the mutation
was performed from the amplification of a 98 pair of bases (pb) CF gene seg-
ment which contains the codon that encodes fenilalanine in the 508 position
by PCR. This PCR product is absent in those who have the mutation. The
F508 allelic frequency was 26.79%, distributed in six homozygous and seven
compound heterozygote F508/X. The reminder mutations (no F508) repre-
sent 73.21%. The F508 frequency in our sample is less than the reported in
European countries. On the other hand, a F508 frequency highly heteroge-
neous has been observed in Latin-American countries. This variation results
from mixed populations with a different genetic background influenced by ex-
ternal migration and CF molecular alterations, which exists in the analyzed
populations. In this study, the F508 mutation comes mainly from grandpar-
ents (79.41%) who were born in Mediterranean countries and Colombia, while
the no F508 mutations come from grandparents who were born in Venezuela
(79.27%) and Colombia (17.07%).

Recibido: 06-06-2002. Aceptado: 19-01-2004.

INTRODUCCIN La FQ cursa con un incremento de la


viscosidad del moco en diferentes rganos,
La Fibrosis Qustica (FQ), es la enfer- con sntomas de carcter predominante-
medad autosmica recesiva severa ms fre- mente gastrointestinal, pulmonar obstructi-
cuente en la poblacin blanca, con una inci- vo crnico y genitourinario, manifestndose
dencia de 1 en 2.500 nacidos vivos y una en la piel por sudor con alto contenido de
frecuencia de portadores de 1 en 25 (1-4). sal. Es una enfermedad con variabilidad fe-
En Venezuela se ha publicado que la fre- notpica que puede simular varios cuadros
cuencia del fenotipo en la poblacin general clnicos (6-8). Dada la gran variabilidad cl-
es de 1 en 42.733, y la frecuencia estimada nica de la FQ, se han establecido criterios
de portadores es de 1 en 104 personas (5). diagnsticos, tales como: presentar una o

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ms caractersticas fenotpicas de FQ, o his- La segunda hiptesis, sugiere que el


toria de FQ en hermanos o primos herma- gradiente observado se debe a un efecto
nos, o un examen de pesquizaje neonatal fundador. Segn esta hiptesis, el alelo ori-
positivo para FQ ( elevacin de los niveles ginado en las comunidades de agricultores
sricos de tripsina inmunoreactiva) junto a procedentes del Asia Menor, se disemin
un incremento en la concentracin de Cl- durante las migraciones y los procesos de
en sudor mayor de 60 meq/L utilizando la sedentarizacin que comenzaron en el suro-
tcnica de Iontoforesis con Pilocarpina en riente del continente y avanzaron lenta-
dos o ms ocasiones, o identificacin de dos mente hacia el noroccidente, durante el pe-
mutaciones en ambos alelos del gen de FQ, rodo neoltico, que corresponde a un pero-
o diferencia de potencial nasal alterado do temprano de la divergencia de las razas
(9,10). humanas y que, probablemente, fue favore-
El gen de la FQ fue identificado en la cido por una ventaja selectiva para los hete-
banda 31 del brazo largo del cromosoma 7 rocigotos. La hiptesis sealada, es apoyada
(7q31) en el ao 1985 y fue clonado en el por el fenmeno de desequilibrio de liga-
ao 1989 (11-14). Mide 250 kilobases (Kb), miento entre el alelo F508 y varios haplo-
tiene 27 exones y codifica una protena lla- tipos determinados por marcadores genti-
mada regulador de la conductancia trans- cos, entre los cuales el haplotipo B, revela-
membrana de FQ (RCTFQ) que funciona do por las sondas KM19 y XV2C, ha sido el
como un canal de cloro (15, 16). Han sido ms analizado. Este fenmeno sugiere fuer-
reportadas ms de 1000 mutaciones cau- temente la preservacin ancestral de un
santes de la enfermedad y sus frecuencias segmento genmico que incluye al gen
varan en las diferentes poblaciones (9, 17), mutado (12, 22, 25).
La mutacin ms frecuente a nivel mundial El objetivo de este trabajo fue determi-
(66%) (18) es la denominada F508, que nar la frecuencia de la mutacin F508 en
consiste en la delecin de 3 pares de bases pacientes afectados con FQ, atendidos en la
(pb) en el gen, resultando en la delecin Unidad de Gentica Mdica de la Universi-
del aminocido fenilalanina en la posicin dad del Zulia (UGM-LUZ) de Maracaibo, Ve-
508 de la protena. La distribucin geogr- nezuela, utilizando la Reaccin en Cadena
fica en gradiente de este alelo en Europa de la Polimerasa (RCP).
muestra un gradiente noroeste-sureste con
una frecuencia mxima, en Dinamarca MATERIALES Y MTODOS
(87,2%) (19) y mnima en Turqua (21,3%)
(20). Para explicar este hecho se han plan- Se estudiaron 30 individuos, pertene-
teado dos hiptesis complementarias apoya- cientes a 28 familias evaluadas en la Unidad
das por evidencias de tipo experimental y de Gentica Mdica de la Universidad del
poblacional, respectivamente. La primera Zulia, a quienes se les realiz historia clni-
sugiere que existe una ventaja selectiva de ca familiar y en los cuales se estableci el
los heterocigotos, quienes estaran protegi- diagnstico de FQ por la presencia de sig-
dos de la accin deshidratante de las ente- nos clnicos caractersticos y 2 determina-
rotoxinas del Vibrio cholerae, Escherichia ciones de Cl en sudor mayor de 60 mEq/L,
coli y Salmonella typhi (21-24) y esta pro- utilizando la tcnica de Iontoforesis con Pi-
teccin hara que la presin selectiva au- locarpina (26). As mismo, se estudiaron
mentara la frecuencia de FQ fuera de Euro- molecularmente los 56 progenitores de
pa, donde esas enfermedades son ms esos pacientes. Se utiliz un control negati-
prevalentes. vo (C-) representado por un individuo vene-

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zolano, sano, sin signos clnicos de FQ, con cada reaccin y se coloc en un controlador
2 determinaciones de Cl en sudor, meno- trmico programable PTC-100 de la MJ Re-
res de 60 mEq/L y con patrn molecular search, Inc., con el siguiente programa:
sin la mutacin F508 y dos controles po- desnaturalizacin prolongada a 94C duran-
sitivos; uno (C1+) obtenido de un afecta- te 5 min y 30 ciclos de: desnaturalizacin a
do con FQ homocigoto para la mutacin 94C durante 1 min, alineamiento a 62C
F508 y otro (C2+), obtenido de un afec- durante 45 seg, extensin a 72C durante 1
tado con FQ heterocigoto compuesto para min y una extensin prolongada a 72C de
la mutacin F508. Tambin se us un 12 min (28). Los productos de la amplifica-
control de sistema (CS) o mezcla de reac- cin se separaron por electroforesis vertical
cin sin ADN. en gel de poliacrilamida al 12% en buffer
Se registr el lugar de nacimiento de Tris-EDTA-Borato 1 x.
los cuatro abuelos de los afectados, con la Se utiliz como marcador de peso mo-
finalidad de conocer el probable origen geo- lecular el 174, digerido con Hae III. El
grfico de la mutacin. gel se colore con una solucin de 5
Para la realizacin de este trabajo, se mg/mL de Bromuro de Etidio, se visualiz
cont con el consentimiento informado de en un transiluminador de luz ultravioleta
las familias estudiadas y la aprobacin del (Hoefer Mod. UVTM-25) y se tom fotogra-
Comit de Biotica de la Unidad de Genti- fa con pelcula Polaroid instantnea 667.
ca Mdica de LUZ. El alelo normal se evidenci por la pre-
Para el anlisis molecular de la muta- sencia de un fragmento de 98 pb y el alelo
cin F508 se le extrajo a cada individuo 5 mutado por un fragmento de 95 pb. En los
mL de sangre perifrica anticoagulada con heterocigotos se observaron dos bandas co-
EDTA 5 mM, a la cual se le extrajo el cido rrespondientes a ambos fragmentos (95 y
desoxirribonucleco (ADN) genmico segn 98 pb) y dos bandas de mayor tamao, co-
la tcnica Fenol Sevag (27). rrespondientes a los llamados heteroduplex,
La deteccin de la mutacin F508 se los cuales son el resultado del apareamien-
realiz a travs de la amplificacin de parte to de los 2 alelos.
del exon 10 del gen de FQ, mediante la La diferencia observada entre el traba-
RCP. Se utilizaron los iniciadores CF1 5- jo de Arias y col. (28) y este trabajo fue va-
GTT TTC CTG GAT TAT GCC TGG CAC- 3 lorada utilizando el estadstico d, y la dife-
y CF2 5- GTT GGC ATG GTT TGA TGA rencia de la frecuencia allica entre varios
CGC TTC- 3 donados por el Dr. Hugo Ba- pases latinoamericanos y Venezuela se va-
rrera, de la Facultad de Medicina de la Uni- lor con el estadstico 2.
versidad Autnoma de Nuevo Len (UANL),
Monterrey, Mxico. Estos iniciadores cons- RESULTADOS
tan de 24 bases cada uno y limitan un seg-
mento de 98 pb en cuyo interior se localiza Se estudiaron 28 familias y se analiza-
el codn que codifica para el aminocido fe- ron molecularmente 30 afectados con FQ.
nilalanina en la posicin 508. El montaje de En 2 familias se estudiaron 2 hermanos
la RCP se realiz con 200 ng de ADN gen- afectados. En 5 familias se recogi antece-
mico en un volumen de 45 L de reaccin, dente de isonimia entre las parejas, obser-
conteniendo 25,2 L de agua ultrapura, 5 vndose consanguinidad parental en 4.
L de solucin amortiguadora 10X, 5 L de En la Tabla I se observan los resultados
cada iniciador, 3 L de MgCl2, 1,3 L de obtenidos en el estudio molecular: 14,29%
dNTPs y 0,5 L de Taq polimerasa por de los afectados con FQ resultaron homoci-

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TABLA I
ESTUDIO MOLECULAR DE AFECTADOS CON FIBROSIS QUSTICA

Genotipos Pacientes Alelos AlelosF508 Alelos No F508 (X)


n % (n) n % n %
Homocigoto F508/F508 4 14,29 8 8 14,29 0 0
Heterocigoto F508/no F508 7 25 14 7 12,5 7 12,5
No F508 (X/X) 17 60,71 34 0 0 34 60,71
Total 28 100 56 15 26,79 41 73,21

TABLA II
FRECUENCIA DE LA MUTACIN F508 EN DIFERENTES PASES

Pases Afectados Alelos Frecuencia Referencia


N %
Argentina 114 228 130 57 35
Brasil 190 380 180 47 37
Mxico 10 20 13 59,1 28
Chile 36 72 21 29,2 41
Cuba 72 144 49 34 38
Colombia 24 48 17 35,4 39
Venezuela 49 98 53 54 28
28 56 15 26,79 Este trabajo

gotos para el alelo F508 (F508/F508), En la Fig. 1 se muestra el patrn mole-


25% fueron heterocigotos compuestos cular de los afectados homocigotos
F508/X, la X representa un alelo no F508/F508, de los heterocigotos com-
F508 y 60,71% no se pudo evidenciar la puestos F508/X y de los afectados en cuyo
presencia de alelos F508, por lo cual se patrn molecular no se detect la mutacin
asume la presencia de dos mutaciones no F508.
F508 o genotipo X/X. La Fig. 2 representa la procedencia
La frecuencia del alelo F508 en los probable de las mutaciones de FQ, la cual
venezolanos afectados con FQ en este tra- fue determinada a travs del lugar de naci-
bajo fue de 26,79%. En todos los progenito- miento de los abuelos de los afectados, lo-
res de los homocigotos F508 y en 7 de los calizados en 5 pases: Venezuela, Colombia,
heterocigotos compuestos F508 fue corro- Espaa, Italia y Portugal. Los 19 alelos
borada la presencia de la mutacin F508. F508 provinieron de familias cuyos abue-
El 73,21% de los alelos restantes eran no los en un 55,88% eran nacidos en Colom-
F508 (X). bia, 23,53% en Europa y 20,59% en Vene-
En la Tabla II se observa la frecuencia zuela; en 2 alelos no se logr determinar el
de la mutacin F508 en diferentes pases lugar de origen. Los alelos no F508, mayo-
latinoamericanos incluyendo Venezuela. ritariamente correspondieron a 79,27% fa-

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M Cs C+1 C+2 C- A1 A2 A3 M

194pb

Heteroduplex
118 pb

98pb
95pb

Fig. 1. Diagnstico molecular de la mutacin F508 en afectados con Fibrosis Qustica. M: Marcador
de peso molecular (174 digerido con Hae III). Cs: Control de sistema (mezcla de reaccin
sin ADN). C+1: Control positivo 1 (afectado con Fibrosis Qustica, homocigoto
F508/F508). C+2: Control positivo 2 (afectado con Fibrosis Qustica, Heterocigoto com-
puesto F508/X). C: Control negativo (individuo sin Fibrosis Qustica). A1: Patrn molecu-
lar de afectado con Fibrosis Qustica homocigoto F508/F508. A2: Patrn molecular de
afectado con Fibrosis Qustica heterocigoto compuesto F508/X. A3: Patrn molecular de
afectado con Fibrosis Qustica sin la mutacin F508 (X/X). Heteroduplex: Dos bandas de
mayor tamao, las cuales son el resultado del apareamiento del fragmento de 95 y de 98 pb.

milias con abuelos nacidos en Venezuela,


80
17,07% de Colombia y 3,66% de Europa.
70 D F508

60 NO D F508 DISCUSIN
50
La mutacin F508 es la alteracin
40 molecular ms frecuente en los pacientes
con FQ. Varios estudios han demostrado
30 una variacin considerable en la distribu-
cin de la mutacin F508 en diferentes
20
poblaciones. Entre las poblaciones con ma-
10 yor frecuencia reportada se encuentran: Di-
namarca 88% (19), Blgica y Francia 80%
0
Venezuela Colombia Europa
(3, 30) y Norteamrica 75% (11). En Euro-
pa esta frecuencia decrece progresivamente
Fig. 2. Lugar de nacimiento de los abuelos de
hacia la zona del Mediterrneo siendo de 48
los pacientes afectados con Fibrosis a 50,6% en Espaa (31), 45 a 55% en Italia
Qustica. (32, 33) y 20,3 a 27% en Turqua (20, 34).

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El rastreo de la mutacin F508 en La- ropa. La mezcla con poblacin negra tam-
tinoamrica resulta de particular inters, ya bin debe influir en la variacin observada,
que es posible que este alelo haya sido in- as como el obviamente diferente ancestro
troducido y diseminado a travs de procesos indgena de las diferentes poblaciones que
de migracin y mestizaje. dieron asiento a distintas ondas migrato-
El primer reporte de la frecuencia del rias.
alelo F508 para las comunidades latinoa- La frecuencia de 26,79% del alelo
mericanas fue un estudio realizado en F508 encontrada en la muestra de 56 cro-
Argentina, en el cual se analizaron princi- mosomas analizados en el presente estudio
palmente descendientes de italianos y de difiere significativamente de la reportada
otros grupos europeos, con una frecuencia por Arias y col para pacientes venezolanos,
del alelo F508 de 63% (35), en otro repor- quienes encuentran una frecuencia del ale-
te ms reciente se encontr una frecuencia lo F508 de 54% (28) d: 39,42; p < 0,01.
de 57% (36). En Mxico la frecuencia del Estos resultados son sugerentes de que exis-
alelo oscila entre 10% (37) y 50,1% (29). En ten diferencias en la frecuencia del alelo
Brasil, la frecuencia promedio reportada es F508 dependiendo de la poblacin que se
de 47%, con marcada heterogeneidad intra- analice, pudiendo esto reflejar a su vez ex-
poblacional (38). En Cuba se ha reportado traccin tnica diferencial segn localidad.
una frecuencia de 34% (39), en Colombia la La composicin de la poblacin vene-
frecuencia a nivel nacional vara entre zolana, es heterognea, principalmente
35,4% (40) y 48% (41) con variaciones en mestiza resultante de la mezcla racial entre
los diferentes departamentos y regiones es- europeos del Sur, nativos y de negros. La
tudiadas, con el valor ms bajo de 25% en el contribucin de estos tres grupos puede ex-
Departamento Bolvar y el ms alto 66,6% plicar las variaciones en la frecuencia de la
en Santander (41). En Chile la frecuencia mutacin F508.
es de 29,2% (42). Segn el origen geogrfico de los alelos
En relacin a estos pases latinoameri- con la mutacin F508 en el gen de FQ, el
canos, se observa que la frecuencia en este cual fue determinado a travs del lugar de
estudio es significativamente baja si se nacimiento de los abuelos paternos y mater-
compara con la reportada en Argentina nos de los afectados, en la muestra analizada
(36) p < 0,001, Brasil (38) y Mxico (29) solo el 20,59% de los abuelos de los pacien-
p < 0,01. Con respecto a Chile, Cuba y Co- tes con la mutacin F508 eran de origen
lombia no se observaron diferencias signifi- venezolano y el 55,88% eran de origen co-
cativas en la distribucin del alelo F508 lombiano, seguidos de 23,53% de origen del
Como se observa, la frecuencia de la Sur de Europa, de procedencia espaola e
mutacin F508 vara sustancialmente en- italiana. Mientras que en los pacientes con
tre diferentes grupos poblacionales y tni- mutaciones no F508 (X), el porcentaje de
cos. La variacin de la frecuencia de esta abuelos venezolanos asciende a 79,27%.
mutacin en Latinoamrica puede explicar- La alta frecuencia de mutaciones de
se por el proceso de mestizaje iniciado des- FQ No F508 detectadas (68,33%) en este
pus del descubrimiento de nuestro conti- estudio, nos sugiere la aplicacin de anli-
nente. Segn reportes de varios investiga- sis adicionales para determinar otras muta-
dores la mayor fuente de mutaciones de FQ ciones ya reportadas y frecuentes en pases
provino del Sur de Europa (43), que como tales como Africa, el sur de Europa y Co-
se sabe tiene menor frecuencia de muta- lombia e incluso mutaciones propias de la
cin F508 en relacin con el Norte de Eu- regin.

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