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INSTITUTO TECNOLGICO DE MORELIA

JOS MA. MORELOS Y PAVN

MTODOS DE
AISLAMIENTO Y
SEPARACIN.
UNIDAD VI

ALUMNAS:
NIETO MARTIN
ANLISIS DIANA ALEJANDRA
INSTRUMENTAL
PROFESOR: MC. FERNANDO BEDOLLA GZMAN
HERNANDEZ AYALA VIRIDIANA
GUADALUPE

DICIEMBRE 2015
INTRODUCCIN

La separacin de los diferentes componentes de una mezcla que se encuentran


en un lquido o gas es el resultado de las diferentes interacciones de los solutos
a medida que se desplazan alrededor o sobre una sustancia lquida o slida.
Las diversas tcnicas para la separacin de mezclas complejas se fundamentan
en la diversidad de afinidades de las substancias por un medio mvil gas o
lquido y un medio absorbente estacionario a travs del cual circulan.
La mayora de los mtodos de anlisis son en los casos ms favorables
selectivos, pero no especficos. Pr ello, cuando se trata de muestras complejas
la separacin del analito de las posibles interferencias es de una etapa
esencial. An mejor sera la posibilidad de determinar varios analitos despus
de una separacin previa.
La cromatografa es una tcnica de separacin extraordinariamente verstil
que presenta distintas variantes. En toda separacin cromatogrfica hay dos
fases (slida, lquida o gas) una mvil y otra estacionaria, que se mueven una
con respecto de la otra manteniendo un contacto ntimo. La muestra se
introduce en la fase mvil y los componentes de la muestra se distribuyen
entre la fase estacionaria y la mvil. Los componentes de la mezcla a separar
invierten un tiempo diferente en recorrer cada una de las fases, con lo que se
produce la separacin.
En 1910, el botnico ruso M. Tswett descubri por primera vez esta tcnica,
que fue aplicada a la separacin de pigmentos de plantas, dndole el nombre
de cromatografa en referencia a las bandas coloreadas de pigmentos que se
separaban por su adsorcin selectiva sobre columnas de yeso. Tras su
descubrimiento, la cromatografa quedo prcticamente olvidada hasta 1930
ao en que fue redescubierta por Kuhn y Lederer, quienes la aplicaron para la
separacin de carotenoides a partir de este momento, el uso de esta tcnica se
fue extendiendo cada vez ms al tiempo que se desarrollaban diferentes
versiones de la misma. Un hito importante en el desarrollo de la cromatografa
lo constituy el desarrollo de la cromatografa gas-lquido (Martin y James,
1952), tcnica que encontr rpidamente aplicaciones de gran importancia, lo
que llevo a su vez al desarrollo de la teora de la separacin cromatogrfica as
como el desarrollo de una instrumentacin.

ANLISIS INSTRUMENTAL
UNIDAD VI
CONCEPTOS Y CLASIFICACIN

DEFINICIN
Es la tcnica para separar componentes de una mezcla, y su posterior anlisis,
basadas en que las distintas sustancias que forman los componentes de una
mezcla se dejan arrastrar a diferentes velocidades sobre un soporte. El soporte
puede ser papel, un gas, otro lquido, etc. Es un mtodo fsico de separacin de
componentes. Es decir, la cromatografa es una separacin fsica de los
componentes de una mezcla basado en la adsorcin selectiva de los
componentes de la mezcla al moverse por un soporte.
De forma general, consiste en pasar una fase mvil (una muestra constituida
por una mezcla que contiene el compuesto deseado en el disolvente) a travs
de una fase estacionaria fija slida (figura 1).

En la fase esttica o estacionaria, la mezcla se coloca sobre un soporte


fijo, por ejemplo papel. En esta fase tenemos ya la mezcla sobre un
soporte, en nuestro ejemplo un papel.
En la fase mvil se hace mover otra sustancia sobre la mezcla que ya
est sobre el soporte de la fase esttica, por ejemplo un lquido que se
mueve por el papel con la mezcla. En la fase mvil empezar el proceso
de separacin de los componentes de la mezcla al moverse a distintas
velocidades por el lquido los distintos componentes de la mezcla sobre
el papel.

Figura 1. Sistema cromatogrfico.

CLASIFICACIN
Aunque hay muchas y variadas tcnicas cromatogrficas, el objetivo de todas
es separar las sustancias que forman una mezcla y enviarlas secuencialmente
a un detector para que las determine y cuantifique.

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Todas se basan en el mismo fenmeno: permitir que las sustancias que forman
una mezcla entren en contacto con dos fases (un lquido y un gas, un slido y
un lquido, etc.) figura 2. Una de las fases es esttica (no se mueve) y tender
a retener las sustancias en mayor o menor grado; la otra, fase mvil, tender a
arrastrarlas. Cada sustancia qumica tiene distinta tendencia a ser retenida y a
ser arrastrada.

Figura 2. Clasificacin de los mtodos cromatogrficos.

Las tcnicas cromatogrficas pueden clasificarse de acuerdo a la disposicin de


la fase estacionaria como sigue:
a) Cromatografa Plana: La fase estacionaria se sita sobre una placa plana
o sobre un papel. Las principales tcnicas son: Cromatografa en papel
y Cromatografa en capa fina.

Figura 3. Cromatografa ascendente en capa fina. Figura 4.


Cromatografa en papel descendente.

b) Cromatografa en Columna: La fase estacionaria se sita dentro de una


columna. Segn el tipo de fluido empleado como fase mvil se
distinguen: Cromatografa de lquidos (LC), Cromatografa de Gases (GC)
y Cromatografa de fluidos supercrticos (SFF).

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Figura 4. Funcionamiento de una columna,
mostrando la carga de la muestra
y diversos momentos a lo largo de la elucin

Clasificacin de acuerdo al fundamento de la separacin


(naturaleza de las fases y tipo de interacciones).
A) CROMATOGRAFA DE LQUIDOS (fase mvil lquida)
Fase estacionaria slida; se trata de slidos finamente divididos con gran
superficie especfica.

Cromatografa de adsorcin: la fase estacionaria retiene a los


solutos por un doble efecto de adsorcin fsica y qumica. Las
interacciones implicadas son el tipo de fuerzas de van der Waals.
Cromatografa de cambio inico: el slido retiene a los solutos
gracias a atracciones electrostticas. La fase estacionaria slida
lleva en la superficie cargas electrostticas fijas que retiene contra
iones mviles que pueden intercambiarse por iones de la fase
mvil.
Fase estacionaria liquida:

Cromatografa de reparto: la fase estacionaria es un lquido


inmovilizado sobre un material inerte slido que slo acta de
soporte.
Cromatografa de afinidad o de fases enlazadas: la fase
estacionaria es generalmente un polmero de tipo lquido
inmovilizado sobre un slido inerte por enlaces covalentes.

B) CROMATOGRAFA DE GASES (fase mvil gaseosa)


La idea de esta tcnica se basa en la volatilizacin de la muestra y
su posterior inyeccin en la cabeza de una columna cromatogrfica. Para
la elucin de la muestra se usa un gas inerte como fase mvil, de esta
manera la fase mvil no interacciona con las molculas del analito,
simplemente transporta el analito a travs de la columna.
Cromatografa de adsorcin (o cromatografa gas-slido): la fase
estacionaria es un slido finamente dividido, que retiene a los
solutos por adsorcin.
Cromatografa de particin (o cromatografa gas-lquido): la fase
estacionaria es un lquido retenido por impregnacin o por un
enlace sobre un slido inerte. Se basa en equilibrios de
distribucin.

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Cromatografa de lquidos
La cromatografa es una tcnica para separar mezclas en sus componentes
individuales para que puedan ser identificados y cuantificados.
La cromatografa liquida consiste en dos fases una estacionaria (polar) y una
fase mvil:
La fase estacionaria es slica que se ha tratado con RMe 2SiCl dnde la R
es una cadena alquil tal como C18H37 o C8H17.
La fase mvil acta de portador de la muestra.

La muestra en solucin es inyectada en la fase mvil. Los componentes de la


solucin emigran de acuerdo a las interacciones no-covalentes de los
compuestos con la columna. Estas interacciones qumicas, determinan la
separacin de los contenidos en la muestra. La utilizacin de los diferentes
detectores depender de la naturaleza de los compuestos a determinar.
Esta cromatografa tiene especial aplicacin en reas como la farmacutica y
ciencias de la vida, para la separacin e identificacin de compuestos. Como el
anlisis de molculas no voltiles y trmicamente sensibles, incluyendo
compuestos de alto peso molecular como protenas. Adems, puede ser una
herramienta til para purificar molculas pequeas y macromolculas
derivadas de sntesis qumica o procesos naturales. Cada equipo de
cromatografa lquida generalmente incluye los siguientes componentes claves:
Sistema de bombeo para el manejo de los solventes
Inyector de muestra,
Columna o columnas,
Detectores
Sistema de manejo de datos.
Diversas configuraciones (necesidades de la muestra).

Tipos de HPLC

Cromatografa de fase normal

Fue el primer tipo de HPLC, separaba analitos basndose en la polaridad. Este


mtodo usa una fase estacionaria polar y una fase mvil no polar que se usa
cuando el analito es polar. El analito polar es retenido por la fase estacionaria
polar. La adsorcin aumenta con la polaridad del analito y la interaccin entre
analito y fase estacionaria. Esto incrementa el tiempo de elucin. La fuerza de
interaccin depende solo de los grupos funcionales, sino tambin de factores
estricos e ismeros estructurales. El uso de disolventes polares disminuye el
tiempo de retencin, mientras que disolventes hidrfobos aumentan el tiempo
de retencin. Algunos solutos polares interaccionan con la fase estacionaria y
desactivan la columna.

Cromatografa de fase inversa

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En esta tcnica se usa una fase estacionaria no polar y una fase mvil
moderadamente polar. La fase estacionaria tpica es silicio tratado con
RMe2SiCl, donde R es una cadena lineal con un grupo alcalino.
Las columnas de fase inversa son ms difciles de daar que las normales.
Algunas consisten en silicatos alcalinos y nunca se deben usar con sales
acuosas, destruiran el silicato. Pueden ser usados con cidos acuosos, pero no
durante mucho tiempo, pueden corroer metal. El metal debe estar en bajo
contenido para que la separacin de sustancias sea mejor

Cromatografa de exclusin por tamao

Tambin conocida como cromatografa de gel permeante o cromatografa de


gel filtrante. Separa las partculas en funcin del tamao. Es una cromatografa
de baja resolucin y sirve para determinar estructuras terciarias y cuaternarias
de protenas y es la tcnica comn para averiguar el peso molecular de
polmeros sintticos y naturales.

Cromatografa de intercambio inico

Los intercambiadores de iones favorecen la unin de iones de mayor carga y


radio inferior. Un incremento en el contra-ion reduce el tiempo de retencin. Un
incremento del pH reduce el tiempo de retencin en el intercambio catinico,
pero bajar el pH reduce la retencin en intercambio aninico.
Se usa en la purificacin de agua, pre concentracin de componentes traza,
cromatografa de intercambio de ligandos, cromatografa de intercambio de
iones de protenas, intercambio de aniones a alto pH de carbohidratos y
polisacridos.

Cromatografa de bioafinidad

Se basa en las propiedades de sustancias bio-activas para formar complejos


estables, especficos y reversibles. La formacin de los complejos implica
fuerzas moleculares como Van der Waals, electrosttica, dipolo-dipolo,
hidrofobias y puentes de hidrogeno. Una unin bioespecfica se forma por
accin simultnea de estas fuerzas en los sitios de unin.

Cromatografa de gases
La cromatografa de gases se emplea para confirmar de la presencia o
ausencia de un compuesto en una muestra determinada.
La idea de esta tcnica se basa en la volatilizacin de la muestra y su
posterior inyeccin en la cabeza de una columna cromatogrfica. Para la
elucin de la muestra se usa un gas inerte como fase mvil, de esta manera la
fase mvil no interacciona con las molculas del analito, simplemente
transporta el analito a travs de la columna. Existen dos tipos de
cromatografa de gases (GC):

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Cromatografa gas-slido (GSC): la fase estacionaria es slida y la retencin de
los analitos se produce mediante adsorcin.
Cromatografa gas-lquido (GLC): la fase estacionaria son molculas de lquido
inmovilizadas sobre la superficie de un gas inerte. Esta es la que se usa ms
ampliamente.
GSC la fase estacionaria es slida y la retencin de los analitos en ella se
produce mediante el proceso de adsorcin. Precisamente este proceso de
adsorcin, que no es lineal, es el que ha provocado que este tipo de
cromatografa tenga aplicacin limitada, ya que la retencin del analito sobre
la superficie es semipermanente y se obtienen picos de elucin con colas. Su
nica aplicacin es la separacin de especies gaseosas de bajo peso
molecular.
La GC es un sistema compuesto de gas portador, sistema de inyeccin de
muestra, columna (generalmente dentro de un horno), y detector.
La instrumentacin requerida para cromatografa de gases es mucho ms
sencilla y econmica que la empleada en la cromatografa de lquidos. Sin
embargo, en cromatografa de gases, la influencia de la temperatura sobre la
distribucin del equilibrio es considerable, a diferencia de la cromatografa
lquida. Por ello, la cromatografa de gases presenta limitaciones en tres casos:

Compuestos poco voltiles,


Compuestos sensibles a una elevacin de la temperatura incluso
moderada
Compuestos que se encuentran en forma inica
Por esta razn, la cromatografa de gases se emplea cuando los componentes de
la mezcla problema son voltiles o semivoltiles y trmicamente estables a
temperaturas de hasta 350-400C.

Instrumentacin para cromatografa


Cromatografa gas-liquido

En las ltimas dos dcadas, los instrumentos de cromatografa de gases


que han aparecido en el mercado presentan muchos cambios y mejoras. En los
aos setenta, se hicieron habituales los integradores electrnicos y los
integradores electrnicos y los equipos de procesado de datos basados en un
ordenador.

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Figura 5.

Representacin
esquemtica de
un cromatgrafo
de gases

Detectores
Caractersticas de los detectores:
Adecuada sensibilidad
Buena estabilidad y reproducibilidad
Una respuesta lineal para los componentes que se extienda a varios
rdenes de magnitud
Intervalo trmico de trabajo (25 400)C
Un tiempo de respuesta corto que lo haga independiente del caudal
Alta fiabilidad y manejo sencillo
Respuesta semejante para todos los componentes
No destructivo

Figura 6

Detector de ionizacin de llama. Este de detector


es el ms utilizado, responde al nmero de tomos de
carbono que entran en el detector por unidad de
tiempo, por ello es un detector sensible a la masa.

Otros detectores:
Detector de conductividad trmica.
Detector termoinico.
Detector de captura de electrones.
Detector de emisin atmica.

Cromatografa de lquidos de alta resolucin.

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Figura 7

Representacin
esquemtica de un
cromatgrafo de
lquidos de alta
resolucin.

Caractersticas
Alta sensibilidad
Adaptacin a determinaciones cuantitativas
Separacin de especies no voltiles
Separacin de especies termolbiles

Electroforesis de biomolculas
Electroforesis es la tcnica mediante en la cual se separan las biomolculas
en disolucin cuando se ven sometidas a un campo elctrico. Es una tcnica
fundamentalmente analtica.

Cada molcula se desplaza por efecto del campo, alcanzando rpidamente una
velocidad constante al equilibrarse la fuerza impulsora (fuerza del campo
elctrico) con la resistencia al avance (fuerza de friccin o rozamiento)
impuesta por el medio en el que se desplaza.

En general son 3 tipos de electroforesis:

De frente mvil: los componentes de la muestra estn presentes en


toda la disolucin y se determina pticamente la posicin del frente de
avance o frontera con el disolvente.

Zonal: la muestra se aplica como una mancha o banda y sus


componentes migran a travs de un disolvente, utilizando adems un
medio que soporta a ste. En este caso no se determina la movilidad,
sino que el nico objetivo de la tcnica es separar los componentes de la
muestra.

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Continua: la muestra se aplica tambin en una zona, pero se suministra
continuamente a lo largo del proceso

Fundamento.

Cuando una mezcla de molculas ionizadas y con carga neta son colocadas en
un campo elctrico, estas experimentan una fuerza de atraccin hacia el polo
que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las molculas
cargadas positivamente se desplazaran hacia el ctodo (el polo negativo) y
aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el nodo (el polo
positivo).

El movimiento de las molculas est gobernado tambin por dos fuerzas


adicionales; inicialmente la friccin con el solvente dificultar este movimiento
originando una fuerza que se opone , por otro lado las molculas tienen que
moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que poseen
energa cintica propia denominado difusin. La energa cintica de las
molculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor
difusin.

La suma de todas estas fuerzas provoca que las molculas no migren de una
manera homognea, de tal manera que, si las molculas son colocadas en un
cierto lugar de solucin, los iones comenzaran a moverse formando un frente
cuya anchura aumentara con el tiempo.

Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las


molculas empleando un medio que oponga ms resistencia a dicho
movimiento. Una forma comn de hacer esto es formar un gel. El gel consiste
de un polmero soluble de muy alto peso molecular que atrapa molculas de
agua y forma un tamiz que dificulta el movimiento de los solutos,
consecuentemente, la migracin electrofortica de las molculas ser ms
lenta, pero el ensanchamiento del frente se ver reducido tambin.

Mtodos electroforticos zonales.

Electroforesis en gel de poliacrilamida.


Los geles de poliacrilamida se forman por polimerizacin de la acrilamida por
accin de un agente entrecruzado, es qumicamente inerte, de propiedades
uniformes, capaz de ser preparado de forma rpida y reproducible. Forma,
adems, geles transparentes con estabilidad mecnica, insolubles en agua,
relativamente no inicos y que permiten buena visualizacin de las bandas
durante un tiempo prolongado.

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Electroforesis en geles de gradientes.
En un gel en gradiente la protena migra hasta alcanzar una zona donde el
tamao de poro impida cualquier avance. Una vez se alcanza el lmite del poro
no se produce una migracin apreciable aunque no se detiene completamente.
Una de las ventajas de este tipo de geles es que resuelve mejor las bandas
pues las concentra en regiones ms estrechas, adems de incrementar el
rango de pesos moleculares que se pueden resolver en un mismo gel
comparado con los de una concentracin fija.
Electroforesis en geles de agarosa.
La agarosa es un polisacrido (originalmente obtenido de algas, como el agar-
agar, pero de composicin homognea), cuyas disoluciones poseen la
propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 C y formar un gel,
semislido al enfriarse. Este gel est constituido por una matriz o trama
tridimensional de fibras polimricas embebida en gran cantidad de medio
lquido, que retarda el paso de las molculas, se usa usualmente para separar
molculas grandes de alrededor 20.000 nucletidos.
Electroforesis capilar.
La electroforesis capilar se basa en los mismos principios de las tcnicas
electroforticas convencionales, pero utiliza condiciones y tecnologa distinta
que nos permiten obtener una serie de ventajas al respecto, Esta separacin
de pptidos realizada sobre un capilar de slica fundida a potenciales elevados
20 a 30 Kv en un campo de 400 a 500 v/cm refrigerados por aire.
Isoelectroenfoque.
Esta tcnica, habitualmente denominada electro enfoque se basa en el
desplazamiento de las molculas en un gradiente de pH. Las molcula como
los aminocidos, se separan en un medio en el que existe una diferencia de
potencial y un gradiente de pH. La regin del nodo es cida y la del ctodo es
alcalina. Entre ambos se establece un gradiente de pH tal que las molculas
que se han de separar tenga su punto isoelctrico dentro del rango.
Electroforesis bidimensional.
La electroforesis bidimensional se basa en separar las protenas en una mezcla
segn sus dos propiedades moleculares, una en cada dimensin. El
procedimiento ms usado se basa en la separacin en una primera dimensin
mediante isoelectroenfoque y la segunda dimensin segn peso molecular
mediante electroforesis en poliacrilamida.

Bibliografa
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