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MTODOS DE
AISLAMIENTO Y
SEPARACIN.
UNIDAD VI
ALUMNAS:
NIETO MARTIN
ANLISIS DIANA ALEJANDRA
INSTRUMENTAL
PROFESOR: MC. FERNANDO BEDOLLA GZMAN
HERNANDEZ AYALA VIRIDIANA
GUADALUPE
DICIEMBRE 2015
INTRODUCCIN
ANLISIS INSTRUMENTAL
UNIDAD VI
CONCEPTOS Y CLASIFICACIN
DEFINICIN
Es la tcnica para separar componentes de una mezcla, y su posterior anlisis,
basadas en que las distintas sustancias que forman los componentes de una
mezcla se dejan arrastrar a diferentes velocidades sobre un soporte. El soporte
puede ser papel, un gas, otro lquido, etc. Es un mtodo fsico de separacin de
componentes. Es decir, la cromatografa es una separacin fsica de los
componentes de una mezcla basado en la adsorcin selectiva de los
componentes de la mezcla al moverse por un soporte.
De forma general, consiste en pasar una fase mvil (una muestra constituida
por una mezcla que contiene el compuesto deseado en el disolvente) a travs
de una fase estacionaria fija slida (figura 1).
CLASIFICACIN
Aunque hay muchas y variadas tcnicas cromatogrficas, el objetivo de todas
es separar las sustancias que forman una mezcla y enviarlas secuencialmente
a un detector para que las determine y cuantifique.
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Todas se basan en el mismo fenmeno: permitir que las sustancias que forman
una mezcla entren en contacto con dos fases (un lquido y un gas, un slido y
un lquido, etc.) figura 2. Una de las fases es esttica (no se mueve) y tender
a retener las sustancias en mayor o menor grado; la otra, fase mvil, tender a
arrastrarlas. Cada sustancia qumica tiene distinta tendencia a ser retenida y a
ser arrastrada.
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UNIDAD VI
Figura 4. Funcionamiento de una columna,
mostrando la carga de la muestra
y diversos momentos a lo largo de la elucin
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Cromatografa de lquidos
La cromatografa es una tcnica para separar mezclas en sus componentes
individuales para que puedan ser identificados y cuantificados.
La cromatografa liquida consiste en dos fases una estacionaria (polar) y una
fase mvil:
La fase estacionaria es slica que se ha tratado con RMe 2SiCl dnde la R
es una cadena alquil tal como C18H37 o C8H17.
La fase mvil acta de portador de la muestra.
Tipos de HPLC
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En esta tcnica se usa una fase estacionaria no polar y una fase mvil
moderadamente polar. La fase estacionaria tpica es silicio tratado con
RMe2SiCl, donde R es una cadena lineal con un grupo alcalino.
Las columnas de fase inversa son ms difciles de daar que las normales.
Algunas consisten en silicatos alcalinos y nunca se deben usar con sales
acuosas, destruiran el silicato. Pueden ser usados con cidos acuosos, pero no
durante mucho tiempo, pueden corroer metal. El metal debe estar en bajo
contenido para que la separacin de sustancias sea mejor
Cromatografa de bioafinidad
Cromatografa de gases
La cromatografa de gases se emplea para confirmar de la presencia o
ausencia de un compuesto en una muestra determinada.
La idea de esta tcnica se basa en la volatilizacin de la muestra y su
posterior inyeccin en la cabeza de una columna cromatogrfica. Para la
elucin de la muestra se usa un gas inerte como fase mvil, de esta manera la
fase mvil no interacciona con las molculas del analito, simplemente
transporta el analito a travs de la columna. Existen dos tipos de
cromatografa de gases (GC):
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Cromatografa gas-slido (GSC): la fase estacionaria es slida y la retencin de
los analitos se produce mediante adsorcin.
Cromatografa gas-lquido (GLC): la fase estacionaria son molculas de lquido
inmovilizadas sobre la superficie de un gas inerte. Esta es la que se usa ms
ampliamente.
GSC la fase estacionaria es slida y la retencin de los analitos en ella se
produce mediante el proceso de adsorcin. Precisamente este proceso de
adsorcin, que no es lineal, es el que ha provocado que este tipo de
cromatografa tenga aplicacin limitada, ya que la retencin del analito sobre
la superficie es semipermanente y se obtienen picos de elucin con colas. Su
nica aplicacin es la separacin de especies gaseosas de bajo peso
molecular.
La GC es un sistema compuesto de gas portador, sistema de inyeccin de
muestra, columna (generalmente dentro de un horno), y detector.
La instrumentacin requerida para cromatografa de gases es mucho ms
sencilla y econmica que la empleada en la cromatografa de lquidos. Sin
embargo, en cromatografa de gases, la influencia de la temperatura sobre la
distribucin del equilibrio es considerable, a diferencia de la cromatografa
lquida. Por ello, la cromatografa de gases presenta limitaciones en tres casos:
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Figura 5.
Representacin
esquemtica de
un cromatgrafo
de gases
Detectores
Caractersticas de los detectores:
Adecuada sensibilidad
Buena estabilidad y reproducibilidad
Una respuesta lineal para los componentes que se extienda a varios
rdenes de magnitud
Intervalo trmico de trabajo (25 400)C
Un tiempo de respuesta corto que lo haga independiente del caudal
Alta fiabilidad y manejo sencillo
Respuesta semejante para todos los componentes
No destructivo
Figura 6
Otros detectores:
Detector de conductividad trmica.
Detector termoinico.
Detector de captura de electrones.
Detector de emisin atmica.
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Figura 7
Representacin
esquemtica de un
cromatgrafo de
lquidos de alta
resolucin.
Caractersticas
Alta sensibilidad
Adaptacin a determinaciones cuantitativas
Separacin de especies no voltiles
Separacin de especies termolbiles
Electroforesis de biomolculas
Electroforesis es la tcnica mediante en la cual se separan las biomolculas
en disolucin cuando se ven sometidas a un campo elctrico. Es una tcnica
fundamentalmente analtica.
Cada molcula se desplaza por efecto del campo, alcanzando rpidamente una
velocidad constante al equilibrarse la fuerza impulsora (fuerza del campo
elctrico) con la resistencia al avance (fuerza de friccin o rozamiento)
impuesta por el medio en el que se desplaza.
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Continua: la muestra se aplica tambin en una zona, pero se suministra
continuamente a lo largo del proceso
Fundamento.
Cuando una mezcla de molculas ionizadas y con carga neta son colocadas en
un campo elctrico, estas experimentan una fuerza de atraccin hacia el polo
que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las molculas
cargadas positivamente se desplazaran hacia el ctodo (el polo negativo) y
aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el nodo (el polo
positivo).
La suma de todas estas fuerzas provoca que las molculas no migren de una
manera homognea, de tal manera que, si las molculas son colocadas en un
cierto lugar de solucin, los iones comenzaran a moverse formando un frente
cuya anchura aumentara con el tiempo.
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Electroforesis en geles de gradientes.
En un gel en gradiente la protena migra hasta alcanzar una zona donde el
tamao de poro impida cualquier avance. Una vez se alcanza el lmite del poro
no se produce una migracin apreciable aunque no se detiene completamente.
Una de las ventajas de este tipo de geles es que resuelve mejor las bandas
pues las concentra en regiones ms estrechas, adems de incrementar el
rango de pesos moleculares que se pueden resolver en un mismo gel
comparado con los de una concentracin fija.
Electroforesis en geles de agarosa.
La agarosa es un polisacrido (originalmente obtenido de algas, como el agar-
agar, pero de composicin homognea), cuyas disoluciones poseen la
propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 C y formar un gel,
semislido al enfriarse. Este gel est constituido por una matriz o trama
tridimensional de fibras polimricas embebida en gran cantidad de medio
lquido, que retarda el paso de las molculas, se usa usualmente para separar
molculas grandes de alrededor 20.000 nucletidos.
Electroforesis capilar.
La electroforesis capilar se basa en los mismos principios de las tcnicas
electroforticas convencionales, pero utiliza condiciones y tecnologa distinta
que nos permiten obtener una serie de ventajas al respecto, Esta separacin
de pptidos realizada sobre un capilar de slica fundida a potenciales elevados
20 a 30 Kv en un campo de 400 a 500 v/cm refrigerados por aire.
Isoelectroenfoque.
Esta tcnica, habitualmente denominada electro enfoque se basa en el
desplazamiento de las molculas en un gradiente de pH. Las molcula como
los aminocidos, se separan en un medio en el que existe una diferencia de
potencial y un gradiente de pH. La regin del nodo es cida y la del ctodo es
alcalina. Entre ambos se establece un gradiente de pH tal que las molculas
que se han de separar tenga su punto isoelctrico dentro del rango.
Electroforesis bidimensional.
La electroforesis bidimensional se basa en separar las protenas en una mezcla
segn sus dos propiedades moleculares, una en cada dimensin. El
procedimiento ms usado se basa en la separacin en una primera dimensin
mediante isoelectroenfoque y la segunda dimensin segn peso molecular
mediante electroforesis en poliacrilamida.
Bibliografa
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ANLISIS INSTRUMENTAL
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