Optimisation de La Conservation Des Cosmétiques

Optimisation de la conservation des cosm
etiques :
impact de la formulation, recherche de nouveaux
conservateurs naturels, encapsulation
Audrey Kerdudo
To cite this version:

Audrey Kerdudo. Optimisation de la conservation des cosmetiques : impact de la formulation,
recherche de nouveaux conservateurs naturels, encapsulation. Autre. Universite Nice Sophia
Antipolis, 2014. Francais. <NNT : 2014NICE4050>. <tel-01126964>
HAL Id: tel-01126964

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UNIVERSITE NICE SOPHIA-ANTIPOLIS - UFR SCIENCES
Ecole Doctorale Sciences Fondamentale et Appliques

INSTITUT DE CHIMIE DE NICE
THESE
pour obtenir le titre de
DOCTEUR EN SC)ENCES DE LUN)VERS)TE DE N)CE SOPHIA ANTIPOLIS

DISCIPLINE : CHIMIE
prsente et soutenue par
Audrey KERDUDO
OPTIMISATION DE LA CONSERVATION DES COSMETIQUES

IMPACT DE LA FORMULATION, RECHERCHE DE NOUVEAUX
CONSERVATEURS NATURELS, ENCAPSULATION
Thse co-dirige par Pr. Xavier FERNANDEZ et Pr. Chrystel FAURE

soutenue le 10 juillet 2014
JURY
Jean-Marie AUBRY Professeur lENSCL Rapporteur

Philippe PICCERELLE Professeur Universit Aix Marseille Rapporteur
Christophe DI GIORGIO Matre de confrences Universit Examinateur
Nice Sophia Antipolis
Alexandre DINGAS Docteur en Chimie Directeur des Examinateur
laboratoires SO.F.I.A Cosmtiques
Professeur Universit Nice Sophia Directeur de thse
Xavier FERNANDEZ
Antipolis
Chrystel FAURE Professeur lIPB Co-directrice de thse
REMERCIEMENTS
Je tiens tout dabord remercier mon directeur de thse, Xavier Fernandez, professeur
lInstitut de Chimie de Nice (ICN) pour mavoir accueillie dans son quipe et mavoir fait
lhonneur de diriger ce travail. Je lui suis profondment reconnaissante pour sa patience, son
soutien, sa grande confiance et lautonomie quil ma gnreusement offerts tout au long de
ces annes au travers de nos prcieux changes, dans les moments de doutes et les priodes
difficiles.
Je remercie galement le docteur Alexandre Dingas, docteur en Chimie et directeur des

laboratoires SO.F.I.A Cosmtiques pour mavoir accueillie au sein de son entreprise dans le
cadre de cette thse CIFRE et pour mavoir donn les moyens davancer et complter mon
niveau de connaissances et surtout pour son implication personnelle dans linitiation de ce
projet ainsi que pour nos runions rgulires pendant ces trois annes.
Mes remerciements les plus sincres Chrystel Faure, professeur au laboratoire de Chimie et
Biologie des Membranes et Nano-objets, pour avoir accept de co-diriger ce travail et pour
mavoir conseille, aide et soutenue tant dans le travail et lavancement de la thse que
moralement.
Merci galement Elisabet Duach de mavoir accueillie lICN pour ces trois annes de
thse.
Je suis trs reconnaissante Jean-Marie Aubry et Philippe Piccerelle qui me font lhonneur de
juger ce travail en qualit de rapporteurs. De mme, je remercie trs sincrement Christophe
Di Giorgio et Alexandre Dingas pour avoir accept dtre examinateurs de cette thse.
Un grand merci tous les acteurs du projet NATUBAVAL. Merci aux organismes financeurs
de ce projet : OSEO et la rgion PACA notamment. Mes sincres remerciements aux
partenaires et porteurs du projet : SO.F.I.A. Cosmtiques, lICN, Naturex, le Pole PASS. Merci
Florence Merck pour les rsultats gnrs en parallle et ncessaires mes travaux de
thse. Je remercie galement Claude Monin (Acphytaroma) pour la ralisation des nombreux
extraits de plantes valus durant tout le projet. Merci Jean-Paul Ghrardi, de lassociation
Biophyto, davoir gnreusement donn de son temps et de son nergie pour aller cueillir les
plantes tout au long de ses annes. Je remercie Yohan Rolland pour ses judicieux conseils sur
loptimisation des extraits et son approche industrielle. Merci Alexandre Dingas pour ses
ides concernant lapproche cosmtique. Merci galement Francis Hadji-Minaglou pour ses
conseils au dmarrage de cette thse.
Merci au personnel des laboratoires SO.F.I.A. Cosmtiques pour le support et la

collaboration. Merci Corinne et Anne-Laure pour les conseils techniques. Merci Charlotte,
Marylise, Mlanie et Coco pour le soutien apport.
Merci la dynamique quipe de la SATT pour leur prcieuse (et trs efficace !) aide dans le
cadre de la valorisation des rsultats.
Je remercie galement Fabien Fontaine-Vive pour son aide et ses explications en

modlisation molculaire. Merci Jrme Golebiowski pour son apport dans ces discussions.
Je souhaite sincrement remercier Lise et Rmi nouille pour leur prcieuse aide, en
particulier en HPLC. Merci pour votre patience et pour les nombreuses discussions riches
dides. Mais surtout, un grand merci pour les moments passs ensemble rire, changer et
nouer des liens.
Je noublie pas de remercier Emilie, Claire Fauve, Claire 2, Julien, Coni, Carole pour tous ces
moments passs et partags durant ces longues ou trs longues journes. Merci pour le
soutien, laffection, les rires, les changes. Merci aux stagiaires galement, en particulier
Florence Uvernet.
Et enfin, un trs grand merci Tin et Alex. Vous mavez apport soutien moral, affectif,
encouragements. Nous avons partag rires et larmes. Trs simplement, vous avez t l.
Tin, merci pour ton aide en HPTLC et le temps pass et dpens pour le dveloppement des
mthodes. Merci aussi pour ta patience face mes questionsAlex, merci pour ton aide ! Je
noublie pas les heures que tu as consacres maider quand les manips nen finissaient plus !
Je noublie pas non plus loreille attentive et soucieuse que tu mas prte.
Merci tous ceux qui, par leur prsence, leur sourire, leurs propos au labo ou dans le
btiment, mauront apport quelque encouragement direct ou indirect pendant toutes ces
annes de thse.
Ma plus grande reconnaissance mes amies sans qui ces annes nauraient trs
certainement pas t les mmes. Merci Corinn, Cline, Romy, Dina pour les longues
discussions, les prcieux encouragements. Merci de mavoir coute, entendue, soutenue,
fortifie et comprise. Vous avez largement contribu ma persvrance. Merci de vos
amitis qui me sont chres.
Enfin, je terminerais par mes plus chers remerciements ma famille, mes parents, Juju, Mimi,
Bryan. Vous tes chers mon cur.
Avec toute mon affection,
Audrey
LISTE DES ABRVIATIONS ET SYMBOLES UTILISS
ASES Systme d extraction de solvant d arosols (Aerosol Solvent Extraction

System)
BDIH Association Fdrale des Entreprises Commerciales et Industrielles
pour les mdicaments, les produits dittiques, les complments
alimentaires et les soins corporels. (Bundesverband der Industrie une
Handelsunternehmen fr Arzneimittel, Reformwaren,
Nahrungsergnzungsmittel und kosmetische Mittel e.V.)
CFU (UFC) Unit Formant Colonie
COSMO- Cosmetic Organic Standard
Standard
CMC Concentration Micellaire Critique
CMC Carboxymethylcellulose
CMI Concentration Minimale d )nhibition
Cryo-MEB Cryo-Microscopie Electronique Balayage
DAD Barrettes de diodes (Diode-array detector)
DO Densit Optique
FS Fluide Supercritique
HPLC Chromatographie Liquide Haute Performance (High Performance
Liquid Chromatography)
HPMC Hydroxypropylmethylcellulose
HPTLC Chromatographie sur Couche Mince Haute Performance (High
performance thin layer chromatography)
ICEA Istituto Certificazione Etica e Ambientale
INCI Nomenclature Internationale des Ingrdients Cosmtiques
(International Nomenclature of Cosmetic Ingredients)
LysoPC Lysophosphatidylcholine
Na2-EDTA Acide thylne diamine ttra actique disodium
PC Phosphatidylcholine
PCA Prcipitation par utilisation d un antisolvant fluide compress
(Precipitation with a Compressed fluid Antisolvent)
PDA Potato Dextrose Agar
PE Polythylne
PLA Acide Polylactique
PLGA Acide Poly(lactide-co-glycolide)
PP Polypropylne
PS Polystyrne
4
PVC Chlorure de Polyvinyle
RESS Expansion rapide de solutions supercritiques (Rapid Expansion of
Supercritical Solutions)
SAB Sabouraud
SEC Chromatographie d Exclusion de taille (Size Exclusion
Chromatographie)
SPE Extraction sur Phase Solide (Solid Phase Extraction)
TSA Tripcase soja Agar (Tryptic Soy Agar)
TSB Tripcase Soja Bouillon (Tryptic Soy Broth)
UV Ultraviolet
5
TABLE DES MATIERES
INTRODUCTION GENERALE ................................................................................................................................................. 12

CHAPITRE I RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES ......................................................................................... 15
INTRODUCTION..................................................................................................................................................................... 16
PARTIE I : LES COSMETIQUES .......................................................................................................................................... 17
1. Qu est-ce qu un produit cosmtique ? ........................................................................................................... 18
1.1 Dfinition ...................................................................................................................................................... 18
1.2 Composition ................................................................................................................................................ 18
1.2.1 Actifs .......................................................................................................................................................... 18
1.2.2 Excipients ................................................................................................................................................ 18
1.2.3 Additifs...................................................................................................................................................... 19
2 Conservation et conservateurs .......................................................................................................................... 19
2.1 Qu est-ce qu un conservateur ? ........................................................................................................... 19
2.2 Pourquoi la conservation ? ................................................................................................................... 19
2.3 Rglementation.......................................................................................................................................... 20
2.3.1 Directive europenne ......................................................................................................................... 20
2.3.2 Cosmetics Organic Standard (COSMOS-standard) .............................................................. 21
2.3.2.1 Les cosmtiques biologiques ........................................................................................ 21
2.3.2.2 COSMOS-standard ............................................................................................................. 21
2.4 Les conservateurs de synthse............................................................................................................ 23
2.4.1 Conservateurs autoriss et modes dactions ........................................................................... 23
2.4.2 Le cas des parabnes .......................................................................................................................... 24
2.5 Extraits naturels et proprits antimicrobiennes ....................................................................... 26
2.5.1 Dfinition ................................................................................................................................................. 26
2.5.2 Huiles essentielles ................................................................................................................................ 26
2.5.2.1 Mode d obtention ............................................................................................................... 26
2.5.2.2 Mode d action ...................................................................................................................... 27
2.5.2.3 Contraintes de formulation ........................................................................................... 27
2.5.3 Extraits naturels ..................................................................................................................................27
2.5.3.1 Modes d obtention............................................................................................................. 27
2.5.3.2 Avantages .............................................................................................................................. 28
2.5.3.3 Contraintes d utilisation ................................................................................................. 28
2.5.4 Huiles vgtales .................................................................................................................................... 31
3 Les alternatives l utilisation des conservateurs...................................................................................... 31
3.1 Alternatives de formulation ................................................................................................................. 31
3.1.1 Activit de leau .................................................................................................................................... 31
3.1.1.1 Dfinition............................................................................................................................... 31
3.1.1.2 Activit de l eau et conservation.................................................................................. 32
3.1.1.3 Facteurs ayant une influence sur l aw ....................................................................... 33
3.1.1.4 Autres systmes de conservation ............................................................................... 40
3.1.2 De la fabrication au packaging..................................................................................................... 42
6
3.1.2.1 BPF ........................................................................................................................................... 42
3.1.2.2 Packaging .............................................................................................................................. 42
3.1.2.3 Matriaux .............................................................................................................................. 43
4 Les antioxydants...................................................................................................................................................... 44
5 Microbiologie ............................................................................................................................................................ 46
6 Conclusion .................................................................................................................................................................. 49
PARTIE II : ENCAPSULATION ........................................................................................................................................... 50
1. L encapsulation en cosmtique ........................................................................................................................ 53
2. Procds classiques d encapsulation ............................................................................................................. 53
2.1. Procds chimiques ................................................................................................................................ 53
2.1.1. La polymrisation............................................................................................................................... 53
2.2. Procds mcaniques ............................................................................................................................. 54
2.2.1. Le spray drying ou schage par atomisation ........................................................................ 54
2.2.2. Le spray cooling ou prilling (glification/conglation de gouttes) ............................ 54
2.2.3. Le lit dair fluidis ............................................................................................................................... 55
2.2.4. Lextrusion ............................................................................................................................................. 55
2.2.5. Rapid Expansion of Supercritical Solutions (RESS) et Aerosol Solvent Extraction
System (ASES) ....................................................................................................................................................... 56
2.2.6. Rapid Expansion of Supercritical Solutions (RESS)............................................................ 56
2.2.7. Aerosol Solvent Extraction System (ASES) ............................................................................. 57
2.3. Procds physico-chimiques............................................................................................................... 57
2.3.1. Evaporation/extraction de solvant ............................................................................................ 57
2.3.1.1. Emulsion simple (H/H ou H/E)) .............................................................................................. 57
2.3.1.2. Emulsion double (E/H/E) ........................................................................................................... 58
2.3.2. La glation ionotropique ................................................................................................................ 58
2.3.3. La coacervation ................................................................................................................................... 59
2.3.3.1. La coacervation simple ................................................................................................... 59
2.3.3.2. La coacervation complexe ............................................................................................. 59
2.3.4. Les mulsions ........................................................................................................................................ 60
2.3.5. Les systmes vsiculaires ................................................................................................................ 61
2.3.5.1. Les liposomes ..................................................................................................................... 61
2.3.5.2. Les vsicules multilamellaires types oignons ....................................................... 63
3. Conclusion ................................................................................................................................................................. 66
CONCLUSION ......................................................................................................................................................................... 71
CHAPITRE II RESULTATS ET DISCUSSION FORMULATION COSMETIQUE ........................................... 72
INTRODUCTION..................................................................................................................................................................... 73
PARTIE I : OPTIMISATION DE FORMULATIONS PAR DIMINUTION DE L ACTIVITE DE L EAU .................................. 73
1. Formules tmoins ...................................................................................................................................................... 73
2. )mpact de la glycrine et de glycols sur l aw ................................................................................................ 77
2.1 Influence du protocole de formulation ................................................................................................ 82
2.2 Application aux formules ........................................................................................................................... 84
3. Challenge test........................................................................................................................................................... 87
4. )mpact d agents rhologiques sur l aw ........................................................................................................... 90
7
5. )mpact du p( sur l aw ............................................................................................................................................ 91
PARTIE II : EVALUATION DE L ACTIVITE ANTIMICROBIENNE DES EXTRAITS DE PLANTES SELECTIONNEES DANS
LE CADRE DU PROJET ........................................................................................................................................................... 93
1. Activit antimicrobienne des extraits vgtaux ............................................................................................ 94

1.1 Activit antimicrobienne des extraits bruts ...................................................................................... 94
. Optimisation de l extrait de plante A : support solide et dcoloration ................................... 96
1.2.1 Dcoloration sur charbon actif.......................................................................................................... 98
1.2.2 Solubilisation des extraits .................................................................................................................... 99
1.2.3 Dcoloration par distillation molculaire ................................................................................. 101
. Activit antimicrobienne de l extrait de plante A enrichi en actif ......................................... 103
. Activit antimicrobienne de l extrait de plante A sur support liquide ................................ 104
. Activit antimicrobienne de l extrait de plante A associ des agents de chlation ..... 108
2. Formulation cosmtique et challenge test .................................................................................................... 110
2.1 Analyse des challenges test.................................................................................................................... 110
2.1.1 Extraits de plante A sur supports dans la crme tmoin .................................................... 110
2.1.2 Extraits de plante A sur supports dans la crme optimise en aw .................................. 116
2.1.3 Extraits de plante A sur supports et plante C1 dans la crme tmoin.......................... 118
2.1.4 Conclusion ................................................................................................................................................ 120
. Dosage de l actif de la plante A en formulation cosmtique .................................................................. 120
3.1 Dveloppement de la mthode ............................................................................................................. 120
. Dosage de l actif .......................................................................................................................................... 125
3.3 Conclusion ..................................................................................................................................................... 126
PARTIE III : CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ........................................................................................................... 127
CHAPITRE III RESULTATS ET DISCUSSION ENCAPSULATION ...........................................................128
INTRODUCTION.................................................................................................................................................................. 129
PARTIE I : DEVELOPPEMENT ET VALIDATION D UN SYSTEME D ENCAPSULATION .............................................. 133
. Validation d un systme d encapsulation ...................................................................................................... 133
1.1 Emulsions multiples ............................................................................................................................. 133
1.2 Glation ionotropique .......................................................................................................................... 133
1.2.1 Dmarche 1 ......................................................................................................................................... 133
1.2.2 Dmarche 2 ......................................................................................................................................... 134
1.2.3 Conclusion et perspectives............................................................................................................ 134
1.3 Coarcervation complexe : Gomme arabique/lcithines ........................................................ 135
1.4 Vsicules multilamellaires : oignons.............................................................................................. 136
1.5 Conclusion................................................................................................................................................. 137
2. Dveloppement du systme d encapsulation retenu : vsicules multilamellaires type oignons
138
2.1 Choix des analytes ................................................................................................................................. 138
PARTIE II : DEVELOPPEMENT ET OPTIMISATION DES OIGNONS EN FONCTION DES PHOSPHOLIPIDES ............ 139
1. Matires premires ............................................................................................................................................ 139
1.1 Microscopie .............................................................................................................................................. 139
1.2 Granulomtrie ......................................................................................................................................... 140
8
1.3 Nanoparticules et rglementation .................................................................................................. 141
2. Rendements d encapsulation ......................................................................................................................... 142
2.1 Comparaison des mthodes de sparation ................................................................................. 142
2.1.1 Ultracentrifugation Chromatographie dexclusion strique .................................... 142
2.2 Phnomne d adsorption et calcul des rendements d encapsulation .............................. 145
2.3 Rendements d encapsulation des oignons .................................................................................. 147
3. Substitution du phospholipide ...................................................................................................................... 148
3.1 Microscopie .............................................................................................................................................. 148
3.2 Granulomtrie ......................................................................................................................................... 148
3.3 Rendements d encapsulation ............................................................................................................ 149
PARTIE III : OPTIMISATION DES OIGNONS ................................................................................................................. 150
1. Rendements d encapsulation en fonction des concentrations en analytes ................................ 151
2. Rendements d encapsulation en fonction de la composition du systme ................................... 154
Rendements d encapsulation ............................................................................................................ 154
2.1
Dfinition de la composition optimale Modle mathmatique ....................................... 157
2.2
2.2.1 Domaine diphasique : chantillon B ........................................................................................ 157
2.2.2 Domaine monophasique : chantillon C ................................................................................ 158
2.2.3 Limite entre les deux domaines : chantillon A .................................................................. 159
2.2.4 Composition optimale..................................................................................................................... 159
3. Rendements d encapsulation en fonction de la concentration en Rutine Modle
mathmatique ............................................................................................................................................................... 160
3.2 Dfinition de la concentration optimale Modle mathmatique .................................... 161
3.3 Composition optimale .......................................................................................................................... 163
4. Conclusion .............................................................................................................................................................. 164
PARTIE IV : CARACTERISTIQUES DU SYSTEME OPTIMISE ........................................................................................ 164
1. Microscopie ........................................................................................................................................................... 164
2. Granulomtrie ...................................................................................................................................................... 165
3. Cintique de relargage ...................................................................................................................................... 166
4. Test d activit antioxydante ........................................................................................................................... 169
PARTIE V : CAPSULES OPTIMISEES EN MILIEUX FORMULES .................................................................................... 170
1. Formulation des capsules en produits cosmtiques ............................................................................ 170
2. Fractionnement par exclusion sterique ..................................................................................................... 171
3. Dosage de la rutine encapsule par HPTLC .............................................................................................. 172
4. Dosage de la rutine encapsule dans une lotion .................................................................................... 173
4.1 Capsules dans la lotion tonique tmoin ........................................................................................ 173
4.2 Capsules dans la lotion tonique modifie .................................................................................... 173
5. Dosage de la rutine encapsule dans une crme ................................................................................... 174
6. Conclusion .............................................................................................................................................................. 175
PARTIE VI : APPLICATION DU SYSTEME A D AUTRES MOLECULES ......................................................................... 175
9
1. Acides benzoque et salycilique .................................................................................................................... 176
1.1 Microscopie .............................................................................................................................................. 177
2. MethylIsothiazolinone et MethylChloroIzothiazolinone (MI/MCI) ............................................... 178
2.1 Microscopie .............................................................................................................................................. 179
3. Chlorhexidine........................................................................................................................................................ 180
3.1 Microscopie .............................................................................................................................................. 181
PARTIE VII : ENCAPSULATION DE L EXTRAIT DE PLANTE A ................................................................................... 184
1. Observations microscopiques........................................................................................................................ 184
2. Rendements d encapsulation ......................................................................................................................... 186
PARTIE VIII : CONCLUSION ET PERSPECTIVES .......................................................................................................... 187
CHAPITRE IV .................................................................................................................................................189
MATERIEL ET METHODES ........................................................................................................................189
PARTIE I : FORMULATION COSMETIQUE ..................................................................................................................... 190
1. Optimisation de formulations cosmtiques par diminution de l activit de l eau ................... 190
1.2. Aw-mtre.................................................................................................................................................. 190
1.2. Formules tmoins ................................................................................................................................. 190
1.3. Modlisation molculaire .................................................................................................................. 190
2. Analyse HPLC des extraits et dosage .......................................................................................................... 191
2.1 Analyse HPLC des extraits de plantes ........................................................................................... 191
2.2 Dosage de l actif de la plante A ......................................................................................................... 192
3. Analyses microbiologiques ............................................................................................................................. 193
3.1. Analyses microbiologiques des extraits vgtaux................................................................... 193
3.1.1 Principe de la mthode danalyse.............................................................................................. 193
3.1.2 Milieux de culture, souches .......................................................................................................... 193
3.1.2.1 Milieux de culture gloss ........................................................................................... 193
3.1.2.2 Milieux de culture liquide............................................................................................ 193
3.1.2.3 Souches de rfrence..................................................................................................... 194
3.1.3 Mode opratoire ................................................................................................................................ 194
3.1.3.1 Prparation des cultures ............................................................................................. 194
3.1.3.2 Dosage des spores, de la levure et de la suspension bactrienne............... 194
3.1.4 Conduite de lessai ............................................................................................................................ 195
3.2. Challenges tests ..................................................................................................................................... 196
4. Formulation des extraits .................................................................................................................................. 198
4.1. Solubilisation des extraits ................................................................................................................. 198
4.1.1 Support solide..................................................................................................................................... 198
4.1.2 Support liquide .................................................................................................................................. 198
4.2. Dosage de l actif dans les produits cosmtiques : HPTLC .................................................... 199
4.2.1 Prparation et incorporation des extraits en cosmtique ............................................. 199
4.2.2 Dveloppement de la mthode de dosage par HPTLC ..................................................... 199
10
4.2.3 Extraction de lactif de plante A ................................................................................................ 201
4.2.4 Dosage de lactif par (PTLC ........................................................................................................ 201
PARTIE II : ENCAPSULATION ........................................................................................................................................ 202
1 Dveloppement et validation d un systme d encapsulation ............................................................ 202
1.1Glation ionotropique .......................................................................................................................... 202
1.1.1 Matires premires .......................................................................................................................... 202
1.1.2 Rticulation directe ......................................................................................................................... 202
1.1.3 Rticulation indirecte ..................................................................................................................... 202
1.2 Coacervation complexe : gomme arabique/lcithine ............................................................. 203
1.2.1 Matires premires .......................................................................................................................... 203
1.2.2 Protocole opratoire ....................................................................................................................... 203
1.2.3 Essais raliss ..................................................................................................................................... 203
1.3 Vsicules multilamellaires type oignons ...................................................................................... 204
2 Dveloppement et optimisation des vsicules multilamellaires : Oignons.................................. 204
2.1
Phospholipides........................................................................................................................................ 204
2.2
Analytes modles ................................................................................................................................... 205
2.3
Solubilisation des actifs ....................................................................................................................... 205
2.4
Microscope optique............................................................................................................................... 205
2.5
Granulomtrie ......................................................................................................................................... 206
Prparation des chantillons: Chromatographie d exclusion strique ........................... 207
2.6
2.6.1 Fractionnement des oignons : Rutine et Naringnine ..................................................... 208
2.6.2 Fractionnement des oignons : Acides benzoque et salycilique................................... 208
2.6.3 Fractionnement des oignons : Mthylchloroisothiazolinone et
Mthylisothiazolinone.................................................................................................................................... 208
2.6.4 Fractionnement des oignons : Chlorhexidine ...................................................................... 209
2.7 Mthode de sparation : Ultracentrifugation ............................................................................. 209
2.8 Mthode de dosage par HPLC-DAD ................................................................................................ 210
2.9 Test d activit anti-oxydante............................................................................................................. 212
2.10 Mthode de dosage par HPTLC...................................................................................................... 213
2.10.1 Dosage de la Rutine par HPTLC .............................................................................................. 214
2.10.2 Validation de la mthode ........................................................................................................... 214
2.10.3 Prparation des chantillons ................................................................................................... 214
2.10.3.1 Lotion ................................................................................................................................ 214
2.10.3.2 Crme ................................................................................................................................ 215
CONCLUSION GENERALE ......................................................................................................................................... 216
BIBLIOGRAPHIE ........................................................................................................................................................... 232
11
INTRODUCTION GENERALE
L ensemble de ces travaux de thse a t ralis au sein du groupe Mtabolome,

Valorisation de la Biodiversit Vgtale (MVBV) de l )nstitut de Chimie de Nice )CN
ainsi que dans les laboratoires de SO.F.).A. Cosmtiques, dans le cadre d une
collaboration CIFRE. Une co-direction a galement t tablie avec le laboratoire de
Chimie et Biologie des Membranes et Nano-objets (CBMN) de l universit de Bordeaux.
Ces travaux s inscrivent dans une optique de valorisation du vgtal pour l industrie
cosmtique ainsi que pour la mise sur le march de conservateurs naturels.
Dans un contexte socio-conomique o les avances technologiques voluent de plus en
plus vite, le secteur cosmtique doit constamment innover. L accs l information tant
largement facilit, le consommateur se tient au fait des innovations technologiques et
souhaite les utiliser son avantage tout en rejetant celles susceptibles de lui nuire mme
si les preuves scientifiques manquent certaines affirmations mdiatiques.
Fort de cette tendance, l industrie cosmtique valorise et dmontre l efficacit de ses
produits grce des tests toujours plus performants.
Mais dans ce march o la mdiatisation et le marketing orientent largement les
comportements individuels et collectifs, la performance ne suffit pas toujours. Dans une
socit o les modes et tendances sont matresses, les produits cosmtiques doivent
sduire. Aussi, alors que le retour au naturel s impose largement, l industrie cosmtique
doit s adapter. A cela s ajoute l volution des rglementations qui, au fil des
modifications, obligent revoir des produits ou dvelopper de nouveaux tests. C est
ainsi que des rglementations ont vu le jour afin d encadrer le dveloppement de
produits naturels et/ou biologiques. Enfin, le caractre phmre de la nouveaut dans
le domaine des produits cosmtiques, intimement li la multiplication de la
concurrence, oblige innover constamment et trs rapidement. En effet, aprs 2-3 ans
sur le march, un principe actif qui aura sduit sera pass et devra tre remplac par
une nouvelle ide.
C est dans ce contexte que s inscrit le projet NATUBAVAL NATUrel BActericide
VALorisation). En effet, alors que des conservateurs de synthses tels que les parabnes
remplissent leur rle avec succs depuis de nombreuses annes, une polmique mettant
en cause leur innocuit ainsi qu une rcente rvision de la rglementation obligent les
scientifiques et industriels concerns chercher des alternatives. Ce projet a donc t
instaur afin de trouver des alternatives naturelles aux conservateurs de synthse. Le
but est d apporter des rponses aux volutions de la rglementation et aux demandes
des consommateurs. De plus, ce projet pour objectif de valoriser le patrimoine vgtal
et de crer de nouvelles filires vgtales. En effet, les vgtaux ont la capacit de
s adapter leur environnement en dveloppant par exemple des systmes de dfense
pour rsister quantit d attaques microbiennes. Fort de plusieurs acteurs, les
premires tapes du projet ont permis de slectionner une soixantaine de plantes dont
20 ont t testes pour valuer leur potentiel antimicrobien.
12
Parmi ces plantes, 3 se sont montres prometteuses et ont t tudies par Florence
Merck, doctorante l )CN. L tude phytochimique de ces plantes avait pour objectif
d identifier les molcules jouant un rle dans l activit recherche.
Les objectifs de ce travail de thse ont donc t de comprendre et d tudier les facteurs
d impacts sur la conservation de produits cosmtiques et d optimiser et tester les
extraits de plantes conservateurs (parmi les 3 plantes prometteuses) dans ces matrices
spcifiques. De plus, ayant l esprit que les conservateurs naturels tendent tre moins
efficaces que les molcules de synthse, un systme d encapsulation et vectorisation
d actifs a t dvelopp afin d optimiser un ingrdient conservateur efficace plus long
terme.
Le premier chapitre de cette thse est consacr l tude bibliographique. Dans une
premire partie, des gnralits sur la composition des produits cosmtiques et les
contraintes rglementaires sont prsentes. Puis un rappel sur les conservateurs
gnralement utiliss et autoriss est ajout avant d aborder l utilisation de substances
naturelles aux proprits antimicrobiennes en cosmtique. Finalement, les facteurs de
formulations, production et conditionnement impactant la conservation sont tudis.
Les techniques d encapsulation d actifs tant nombreuses, la deuxime partie de ce
premier chapitre examine les procds les plus communs ainsi que leurs spcificits. De
plus, les contraintes de formulation ainsi que l origine des matires premires
composant les systmes (naturel ou synthtique) sont values.
Le deuxime chapitre de ce manuscrit dcrit les rsultats obtenus dans le cadre le
l optimisation de la conservation cosmtique. La premire partie est consacre
l impact de diffrentes matires premires cosmtiques sur l activit de l eau, facteur
d influence sur la croissance microbienne. Les rsultats antimicrobiens ont alors t
discuts. Puis les extraits conservateurs slectionns dans le cadre de l tude ont t
valus seuls et en milieux formuls pour leurs activits antibactrienne et antifongique.
Les extraits prometteurs ont alors t optimiss en fonction des contraintes de
formulation et de l activit antimicrobienne mesure. Une mthode de dosage a t
dveloppe afin de suivre la potentielle dgradation de l actif d intrt dans l extrait
antimicrobien incorpor dans des formulations cosmtiques.
Le troisime chapitre est consacr la slection d un systme d encapsulation
rpondant nos critres de slection. Le procd choisi est alors optimis pour
l encapsulation d analytes modles : la rutine et la naringnine. Une cintique de fuite de
la rutine encapsule est ensuite ralise ainsi que la mise au point d un test antioxidant
pour valuer la bonne protection de l actif. Une mthode de dosage est alors applique
pour comparer le comportement des capsules dans diffrents produits cosmtiques.
L encapsulation est ensuite largie d autres molcules slectionnes parmi les
conservateurs autoriss par la rglementation cosmtique afin de comprendre et
discuter la slectivit du systme. Enfin, le systme dvelopp est appliqu
l encapsulation d extraits naturels.
13
Le dernier chapitre dveloppe les mthodes et techniques utilises dans le cadre de ces
travaux de thse. Des mthodes de prparations d chantillons ont t compares et
optimises selon les contraintes poses par les matrices complexes que sont les produits
cosmtiques et les capsules. Des modles mathmatiques ont t proposs pour dfinir
un systme d encapsulation optimal. Puis des mthodes de dosages ont t dveloppes
par chromatographie liquide sur couche mince afin de caractriser le comportement des
actifs et extraits dans les matrices utilises. Enfin, des tests d activits antioxydant et
antimicrobien ont t raliss afin de valider le potentiel des ingrdients conservateurs
dvelopps tout au long de ces travaux.
14
CHAPITRE I
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
15
CHAPITRE I : RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE
INTRODUCTION
Avec une rglementation en constante volution, l industrie cosmtique doit sans cesse
s adapter et revoir ses habitudes. De plus, dans ce secteur, la dure de vie d un produit
sur le march est trs courte ans environ ce qui impose un rythme d innovation
plus que soutenu. )l est donc normal d tre constamment la recherche de produits
innovants et adapts au march. Ainsi, alors que la rglementation cosmtique vient
d interdire l utilisation de certains parabnes avril , il est primordial de trouver
des substituts ces molcules. Afin de les remplacer efficacement et durablement, il est
ncessaire de comprendre et matriser les sources de contaminations et rsistances
microbiologiques. Ce chapitre bibliographique a donc pour objectif de dfinir les
contraintes rglementaires de la conservation cosmtique puis d indiquer les
alternatives naturelles aux conservateurs classiques permettant de protger plus ou
moins efficacement ces produits. Cet tat de l art permettra alors de dfinir la nature des
extraits naturels prometteurs dans cette perspective.
La connaissance du potentiel antimicrobien de certaines matires premires
cosmtiques est galement ncessaire pour avancer dans une logique d optimisation de
la conservation. Enfin, une bonne comprhension des modes de contamination
bactrienne et fongique ainsi que la connaissance des facteurs de croissance et de
multiplication des microorganismes permettent d adopter une stratgie de lutte contre
les dveloppements microbiologiques.
Les produits cosmtiques protgs l aide de conservateurs naturels actuels prsentent
bien souvent une dure de vie rduite par comparaison avec les produits conservs avec
les molcules de synthse usuelles. Aussi, l objectif de la deuxime partie de cette revue
bibliographique consacre l encapsulation est de dfinir un systme de protection
d extraits naturels antimicrobiens adapt une incorporation dans des matrices
cosmtiques, tout en permettant une prservation de la biodisponibilit et un relargage
ralenti des actifs d intrts. La slectivit des systmes pour l encapsulation d actifs en
fonction de leurs proprits ainsi que les contraintes de formulations sont
particulirement mises en avant. Des facteurs tels que l absence de solvants organiques
et/ou de matires premires issues de la synthse sont tout particulirement mis en
avant, en adquation avec les contraintes du projet.
16
PARTIE I : LES COSMETIQUES
La mise sur le march d un produit cosmtique est soumise une rglementation en

constante volution et toujours plus rigoureuse. Les critres de spcificit d une
formulation usage cosmtique sont prcisment dfinis dans la rglementation
cosmtique (rglement (CE) n1223/2009 du Parlement europen et du conseil du 30
novembre 2009). Ce rglement est entr en vigueur dans sa totalit le 11 juillet 2013.
Parmi les critres dfinis dans ce document, l annexe ) exige la rdaction d un rapport
sur la scurit du produit cosmtique. Les renseignements concernant la qualit
microbiologique du produit cosmtique font partie des spcifications devant apparaitre
dans cet crit. Afin de rpondre une qualit optimale dans ce domaine, la mme
rglementation fournit une liste de conservateurs autoriss ainsi que les critres
permettant de valider l innocuit du produit pour le consommateur [1].
La liste des conservateurs autoriss prsente dans ce document rglementaire,
comporte parmi les 57 substances cites les mthyl, thyl, propyl et butyl parabnes
et leurs sels. Ces quatre familles de molcules dont l utilisation est aujourd hui fortement
controverse sont pourtant dotes d une activit et d une efficacit bien connues et
rarement gales. Cette liste de conservateurs contient galement des alternatives
chimiques que l on retrouve l tat naturel. Certaines de ces alternatives, telles les
acides benzoque ou salicylique, sont galement acceptes par la rglementation
COSMOS, organisme de certification des produits biologiques.
Outre ces conservateurs, certaines autres matires premires possdent une activit
antimicrobienne notoire, sans pour autant se voir assigner le titre de conservateur car
elles ne sont tout simplement pas rfrences comme tel. De nombreux extraits
vgtaux entrent dans cette catgorie.
Bien que la dmarche classique du dveloppement d un produit cosmtique en vue
d optimiser son systme de conservation soit l incorporation de conservateur et/ou de
matires premires aux proprits antimicrobiennes, d autres alternatives sont
envisageables. En effet, la modification de certains paramtres physico-chimiques au
sein des formulations peut avoir une influence plus ou moins significative sur la capacit
du produit fini rsister aux dveloppements bactriens et/ou fongiques.
L tude bibliographique de ces diffrents points permettra de comprendre tout l enjeu et
la ncessit pour l industrie cosmtique de mieux comprendre les phnomnes physico-
chimiques influenant la conservation des produits finis et d y associer des matires
premires au potentiel antimicrobien les plus adaptes. L obligation pour l industriel est
que le produit fini mis sur le march rponde aux exigences microbiologiques de la
rglementation.
17
1. QUEST-CE QUUN PRODUIT COSMETIQUE ?

1.1 Dfinition
Le mot franais cosmtique drive du mot grec kosmtikos, qui signifie habile pour
parer . Dans l tat des connaissances actuelles, force est de constater que l homme a
toujours eu le dsir de se constituer une belle parure, usant cet effet de toutes sortes
de ressources disposition afin d en faire des objets d embellissement et de soins.
Ce constat n a pas chang, preuve en est la dfinition que donne le rglement (CE)
n1223/2009 du Parlement europen et du conseil du 30 novembre 2009 relatif aux
produits cosmtiques :
On entend par produit cosmtique toute substance ou mlange destin tre mis en
contact avec les diverses parties superficielles du corps humain, notamment lpiderme, les
systmes pileux et capillaires, les ongles, les lvres et les organes gnitaux externes, ou avec
les dents et les muqueuses buccales, en vue, exclusivement ou principalement, de les
nettoyer, de les parfumer, den modifier laspect, de les protger, de les maintenir en bon
tat ou de corriger les odeurs corporelles .
1.2 Composition
La forme finale d un produit cosmtique rsulte du mlange d ingrdients
judicieusement choisis et associs, appartenant trois grandes familles de composs :
Le principe actif qui dfinit l efficacit du produit cosmtique,
L excipient, qui dfinit la forme finale du produit et vectorise les actifs [2],
Les additifs, qui contribuent l amlioration des proprits du produit fini.
1.2.1 Actifs
L activit et l efficacit cibles des produits cosmtiques dpendent tout

particulirement du ou des principes actifs introduits. Le pourcentage en actifs est
gnralement de 2 3 %. Les activits les plus revendiques par le secteur sont
l hydratation agents humectants, filmognes, occlusifs)[3], les effets anti-ge (anti-
rides, antioxydants) [4] et photoprotecteurs (anti-UVA et UVB) [5].
1.2.2 Excipients
L excipient joue le rle de support dans le produit. )l dfinit la forme finale (gel,
mulsion fluide ou paisse, mulsion huile/eau ou eau/huile et donne une texture. )l
participe en particulier la pntration de l actif dans l piderme, au dpt des actifs sur
les fibres capillaires, sur les dents, etc...
Il peut tre de nature hydrophobe (huiles, cires, acides et alcools gras, glifiants),
hydrophile (glifiants) ou amphiphile (tensioactifs).
18
Par exemple, les tensioactifs, quasi omniprsents dans la formulation des mulsions,
modulent la pntration des molcules actives tout en ayant une capacit de pntration
propre [2].
1.2.3 Additifs
Les additifs regroupent les ingrdients ayant pour objectif de conserver, parfumer,
colorer le produit cosmtique.
Les conservateurs ont pour but d empcher la prolifration des

microorganismes. Aujourd hui, ils sont majoritairement d origine synthtique,
mais de plus en plus de conservateurs d origine naturelle sont prsents
dans les cosmtiques.
Les parfums sont des compositions liposolubles de substances odorantes,
participant au plaisir de l utilisation du produit. Ils apportent galement une
spcificit propre au produit dont l utilisateur se souvient. De plus, certaines
substances parfumantes (huiles essentielles) peuvent prsenter une activit.
Les colorants confrent au produit une couleur adapte et un aspect plus
attractif [6].
2 CONSERVATION ET CONSERVATEURS
2.1 Quest-ce quun conservateur ?
La rglementation cosmtique ((CE) n1223/2009) dfinit par agents conservateurs les
substances qui sont exclusivement ou principalement destines empcher le
dveloppement de micro-organismes dans le produit cosmtique . Cette dfinition
n inclue donc pas les actions contre la dgradation chimique apportes par les
antioxydants par exemple.
2.2 Pourquoi la conservation ?

Les conservateurs jouent plusieurs rles dans la protection des produits cosmtiques. Ils
permettent tout d abord la protection des produits cosmtiques des contaminations
pouvant tre apportes lors de leur production par :
les matires premires (principes actifs, eau, colorants...) ;

les articles de conditionnement ;
l atmosphre des locaux ;
le personnel.
Or, les contaminations gnrent la dgradation anticipe du produit cosmtique, le
rendant inapte l utilisation, voire dangereux pour le consommateur.
)ls ont galement un rle de protection lors de l utilisation du produit par le
consommateur qui le pollue lors du prlvement.
19
La majorit des produits cosmtiques doivent donc contenir des conservateurs.

Nanmoins, selon leur nature, composition ou packaging, leur prsence et concentration
peuvent tre trs diffrentes. Certains produits font exception et ne ncessitent pas de
conservateur. C est le cas par exemple des lotions alcooliques dont la concentration en
alcool est suprieure 20 %.
2.3 Rglementation
2.3.1 Directive europenne
O COOH O
H H OH H OH
Formol Acide lactique Acide formique
COOH
HO OH O O O
H H OH
O OH O
Acide
Acide citrique Glutaraldhyde
propionique
Cl OH Cl-+
Br NO2 O N R
HO OH
Cl Cl R = CnH2n+1 avec n = 8, 10 12, 14, 16, 18
Bromonitropropanediol Triclosan Chlorure de benzalkonium
O H H H H
N O
N N N
HO N CH2 (CH2)6
N N NH NH
H H Cl
O 2
2
Imidazolidine ure Chlorhexidine

Encart 1 : exemple de conservateurs utiliss en cosmtique.
En Europe, les conservateurs antimicrobiens pouvant tre utiliss dans les produits
cosmtiques sont inscrits sur une liste positive : l annexe V de la Directive cosmtique
europenne (arrt du 6 fvrier 2001 pour la lgislation franaise). Cette
rglementation fixe galement leurs concentrations, leurs limites et conditions
d utilisation (ANNEXE 1). Cette liste (tout comme les diffrentes listes de la
rglementation) est en constante volution en fonction des connaissances
toxicologiques relatives aux divers ingrdients cosmtiques et aux utilisations qui en
sont faites. Les antioxydants n en font pas partie. L Encart 1 expose quelques exemples
de conservateurs utiliss.
20
Certaines substances peuvent galement tre utilises dans la formulation de produits

cosmtiques et possder des proprits antimicrobiennes, elles contribuent ainsi la
conservation du produit. Nanmoins, ces substances principalement des alcools et
huiles essentielles n tant pas dans l annexe V, ne sont pas considres comme des
conservateurs.
2.3.2 Cosmetics Organic Standard (COSMOS-standard)
2.3.2.1 Les cosmtiques biologiques
Pour se voir attribuer l appellation biologique, les produits cosmtiques doivent

rpondre plusieurs critres relatifs leur production, fabrication et conservation.
En France, les produits cosmtiques bio labelliss ECOCERT doivent contenir au
minimum 95 % de matires premires d origine naturelle pour tre certifis. Les
vgtaux utiliss doivent tre issus de l agriculture biologique ou biodynamique et les
procds de transformation que doivent subir certaines matires premires doivent tre
verts. Les concentrations en substances de synthses dans ces produits sont trs
limites (< 5 % pour ECOCERT).
2.3.2.2 COSMOS-standard
COSMOS est une norme prive chelle europenne dveloppe par cinq membres
fondateurs :
BDIH (Allemagne)
Cosmebio (France)
Ecocert Greenlife SAS (France)
ICEA (Italie)
Soil Association (Grande Bretagne)
Deux des objectifs de cet organisme sont de dfinir des exigences minimales communes
et d harmoniser des rgles de certification des cosmtiques biologiques et naturels.
La version 1.1 du 31 Janvier 2011 de COSMOS-standard (Annexe V) autorise les
conservateurs suivants :
Acide benzoque et ses sels
Alcool benzylique
Acide dhydroactique et ses sels
Acide salicylique et ses sels
Acide sorbique et ses sels
Benzoate de dnatonium et alcool butylique tertiaire
Les conservateurs autoriss par ce rfrentiel sont des molcules obtenues par synthse
mais prsentes dans la nature (Tableau 1).
21
CHAPITRE I : RAPPELS BIBLIOGRPAHIQUES
Tableau 1 : donnes sur lorigine, la nature et le potentiel antimicrobien des agents de conservation autoriss par le rfrentiel Cosmo-Standard
Agent conservateur Exemple de prsence dans la nature pKa Structure chimique Activit antimicrobienne Rfrences
O
Dans certains lgumes tels que les carottes
Acide benzoque et Surtout efficace contre les
et fruits rouges tels que les framboises ou 4,2 OH [7,8]
ses sels levures
les canneberges.
Surtout actif contre Gram (+)

Activit plus limite contre
(uile essentielle d Ylang Ylang Cananga OH
Alcool benzylique ~ 16 Gram (-) et les levures [9,10,11,]
odorata Lam.)
Faible activit contre les
moisissures
O O Surtout efficace contre les
Acide levures et moisissures
Fleurs de Solandre ou Liane trompette
dhydroactique et 5,3 [18,12]
(Solandra grandiflora) Inefficace contre
ses sels
O O Pseudomonas
OH O
Meilleure activit contre
Acide salicylique et Sous forme d htrosides dans la reine des
3,0 OH Gram(+) et certaines Gram(-). [13]
ses sels prs (Filipendula ulmaria L.)
Bonne activit antifongique
Essentiellement antifongique,
O
Acide sorbique et ses Graines de Sorbier de l oiseleur Sorbus actif galement contre les
4,8 [15]
sels aucuparia L.) OH
levures et certaines bactries
Gram (-)
2.4 Les conservateurs de synthse

2.4.1 Conservateurs autoriss et modes dactions
Les conservateurs autoriss sont tous d origine synthtique. )ls prsentent des modes
d action, des activits et des proprits physico-chimiques trs variables. La liste
positive des conservateurs autoriss est prsente en ANNEXE 1.
Le choix du conservateur (ou mlange de conservateurs) utilis pour protger un
produit cosmtique se fait selon les critres suivants [14]:
Spectre dactivit : il doit tre le plus large possible (activit vis vis des
bactries, levures et moisissures). Des mlanges sont souvent utiliss (et vendus
tels quels afin d atteindre de bons rsultats.
Compatibilit avec le procd de fabrication, en particulier si une tape
de chauffage intervient.
Solubilit dans leau : la phase protger en priorit tant la phase
aqueuse car au centre des dveloppements microbiens, le conservateur doit tre
soluble dans celle-ci la concentration efficace [15].
pH de la formulation : nombreux sont les conservateurs dont l activit
est lie au p( du milieu. Les phnols et esters de l acide p-hydroxybenzoque se
comportent comme des acides faibles et sont donc moins affects par le pH. Les
conservateurs cationiques sont,quant eux, plus actifs sous leur forme ionise.
Coefficient de partage huile/eau : lorsque la formule protger est une
mulsion, le conservateur va se partager en fonction de ses solubilits dans la
phase aqueuse et la phase lipidique. Afin d tre le plus efficace possible, son
coefficient de partage huile/eau doit donc tre le plus faible possible.
Compatibilit avec les autres ingrdients : la prsence de certaines
matires premires peut abaisser le potentiel antimicrobien des molcules
conservatrices. Par exemple certains agents de surface inhiberaient l activit
antimicrobienne par solubilisation micellaire (ex : tensioactifs non-ioniques).
Compatibilit avec les matriaux de conditionnement : certains
matriaux polymriques peuvent adsorber les conservateurs et abaisser ainsi
leur concentration effective dans le produit fini.
Les acides organiques sont l une des classes de conservateurs trs utilise. Ils possdent
un double effet antimicrobien. Tout d abord par l acidification du milieu (3.1.1.3) mais
galement par un effet spcifique de l acide utilis.
En effet, les acides organiques faibles peuvent agir pour inhiber les microorganismes. Ils
sont lipophiles, donc capables de traverser la membrane de ces organismes vivants et
ainsi de pouvoir modifier le p( cytoplasmique. C est la forme non dissocie ou protone
(COOH) qui prsente un effet spcifique sur les microorganismes. En effet, une fois la
membrane cellulaire traverse, l acide se dissocie, ce qui a pour effet de changer le p(
intracellulaire. Les microorganismes doivent alors vacuer les protons et absorber des
ions sodium pour maintenir le pH physiologique de la cellule. Ce procd est nergivore
23
pour la bactrie ce qui diminue sa vitesse de reproduction. Ce procd abaisse

galement le pH en priphrie de la cellule, favorisant ainsi la formation de la forme
protone de l acide qui est l espce active. L aboutissement de ce procd est la mort du
microorganisme. Ce sont donc ces acides qu il faut privilgier dans le cas d une formule
dont on veut optimiser l autoconservation. Les acides organiques sont pour la plupart
des acides faibles et sont donc privilgier. Ainsi, plus le pH est acide, plus la
concentration sous forme protone de l acide est importante et plus son efficacit est
leve. Donc, pour un pH donn, l acide est d autant plus actif qu il possde un pKa lev.
Mais il faut galement tenir compte de la solubilit de l acide qui doit tre suffisante en
phase aqueuse. De plus, l acide doit tre disponible dans sa forme protone au p( de la
formule [16,17].
Les acides citrique et lactique sont galement trs utiliss en cosmtique pour ajuster le
p(. L acide citrique agit plus en tant qu agent chlatant et prsente donc une activit
antibactrienne. L acide lactique est un agent bactriostatique.
Les acides lvulinique et anisique sont galement deux formes actives contre les
microorganismes mais dont la fonction premire est de parfumer le produit cosmtique.
Ils figurent donc comme parfum dans la liste des ingrdients [16,17].
2.4.2 Le cas des parabnes

Les parabnes sont des conservateurs large spectre antimicrobien. Ils sont utiliss
depuis 1920 pour de nombreux produits que nous consommons quotidiennement :
aliments, produits cosmtiques, mdicaments. Les concentrations et types de parabnes
utiliss diffrent selon les produits. )ls existent galement l tat naturel dans de
nombreux aliments comme les fruits rouges mres, fraises, cassis , l oignon ou encore
la carotte [18,19,20,21,22].
En cosmtique, ils sont autoriss aux concentrations de 0,4 % (forme acide) pour les
esters et 0,5 % acide pour les mlanges d esters mais sont employs trs faibles
concentrations. )ls sont hydrolysables par l organisme et prsentent une bonne
tolrance.
Les plus utiliss, sous leur forme sode ou non sode, sont :
Le mthyl parabne,
L thyl parabne,
Le propyl parabne,
Le butyl parabne.
Ils sont gnralement vendus sous forme de mlanges qui contiennent 3 ou 4 parabnes
diffrents, pouvant parfois tre associs un alcool (Nipastat, Phenonip) ou des
prcurseurs du formaldhyde ou des isothiazolinones. Ces mlanges sont ncessaires
car ces parabnes ont des profils de solubilit diffrents ainsi qu une activit
antimicrobienne spcifique. Plus la chaine alkyle est longue et plus le parabne est
liposoluble. Ainsi les mlanges permettent de couvrir un spectre d activit plus large.
24
Les parabnes sont des composs simples, constitus d un cycle aromatique, d une
fonction hydroxy et ester en position para. Leur nom vient de la compression du nom
PARAhydroxyBENZOATE.
Le Tableau 2 prsente la structure et les proprits physico-chimiques des principaux
parabnes utiliss en cosmtique.
Tableau 2 : structures et proprits physico-chimique des parabnes
Structure gnrale
R mthyl thyl propyl butyl
N CAS 99-76-3 120-47-8 94-13-3 94-26-8
N EINECS 202-785-7 204-399-4 202-307-7 202-318-7
Masse molaire
152,05 166,6 180,08 194,0
(g/mol)
Point de fusion (C) 131 116-118 96-98 68-69
Point dbullition
270-280 397-298 Dgradation 156-157
(C)
Solubilit dans leau

0,25 0,17 0,05 0,02
25 C (en %)
pKa 8,17 8,22 8,35 8,37

Apparence ( 25 C) Cristaux sans couleur, odeur, ni got
Lorsque la longueur de leur chane alkyle augmente, leurs proprits antibactriennes

augmentent, mais leur solubilit en phase aqueuse diminue. Cette dernire tant la plus
sensible aux attaques microbiennes, il est alors frquent d utiliser les plus solubles dans
l eau, bien que moins actifs.
Cette diffrence d activit/solubilit selon la longueur de la chane explique l utilisation
de la combinaison de plusieurs parabnes.
Les parabnes sont bactricides. Leur mcanisme d action sur les microorganismes est
encore mal connu. Ils agissent contre un grand nombre de microorganismes au niveau
de voies mtaboliques cls. En effet, il est suppos que les parabnes inhibent la
synthse de l ADN et de l ARN ou de certaines enzymes clefs des microorganismes ou
encore qu ils perturbent les processus de transport membranaire au sein de ces cellules
vivantes [23].
Ils agiraient en se fixant sur la membrane cytoplasmique des microorganismes
entrainant une rupture puis une destruction de cette dernire. L organisme se viderait
alors d une partie de son contenu, ce qui conduirait sa mort.
25
2.5 Extraits naturels et proprits antimicrobiennes

2.5.1 Dfinition
Parmi les extraits naturels possdant un potentiel antimicrobien, on peut distinguer les
huiles essentielles, les extraits aux solvants et certaines huiles vgtales. Ils sont tous
obtenus partir de matires premires vgtales mais selon des mthodes d extraction
plus ou moins sophistiques et innovantes dfinissant le type de molcules extraites
(volatiles ou non par exemple), ainsi que la forme finale (liquide, poudre, pte...). La
plupart des vgtaux dveloppent, au cours de leur croissance, des mcanismes de
dfense contre les attaques et stress environnementaux. Ils produisent alors des
molcules les rendant rsistants ces phnomnes, notamment des molcules
antibactriennes et antifongiques. Ces molcules et activits associes sont retrouves
dans les extraits vgtaux [46].
2.5.2 Huiles essentielles

Les huiles essentielles sont utilises depuis des centaines d annes pour leurs proprits
odorantes. Ces dernires annes, leurs proprits antimicrobiennes et antifongiques ont
t le centre d intrt d un grand nombre d tudes [24]. Aujourd hui, les industriels de la
cosmtique tendent les utiliser pour substituer les conservateurs de synthse.
Ces proprits multiples sont lies la grande complexit des huiles essentielles,
puisqu elles peuvent tre constitues de plusieurs dizaines, voire centaines de
constituants [25]. Les molcules responsables de l activit antimicrobienne des huiles
essentielles sont principalement des hydrocarbures (terpnes), des alcools,
particulirement des phnols, des esters, des acides, des aldhydes ou encore des
ctones. Plus particulirement, les phnols thymol, carvacrol, eugnol - font partie des
composs ayant montr un excellent potentiel antibactrien ainsi qu un large spectre
d activit. De tels composs sont par exemple prsents dans l huile essentielle de thym
[46, 26].
2.5.2.1 Mode d obtention

Selon la norme AFNOR [24], les huiles essentielles sont des extraits obtenus :
Soit partir de matires premires vgtales par distillation l eau

hydrodistillation ou la vapeur d eau ;
Soit partir des fruits de Citrus par des procds mcaniques, l huile
essentielle tant ensuite spare de la phase aqueuse par des procds
physiques ;
Soit par pyrognation de certaines corces ou bois comme le cade (distillation
sche).
Toutes ces techniques ont en commun de ne jamais utiliser de solvants organiques ou
produits chimiques.
26
2.5.2.2 Mode d action

En ce qui concerne leur activit antimicrobienne, les huiles essentielles peuvent agir
selon deux modes en fonction des micro-organismes concerns et du type de molcules
qu elles contiennent. Elles peuvent :
Soit inhiber la multiplication cellulaire microbienne et ainsi avoir un effet
microbiostatique ;
Soit entraner la mort des micro-organismes et ainsi avoir un effet
microbiocide.
Le mode d action prcis des huiles essentielles reste irrsolu, mais il semblerait que,
dans le cas des bactries, les molcules actives tels que les composs phnoliques
attaquent la paroi cellulaire, provoquant une perte du matriel cellulaire par
augmentation de la permabilit. L intrieur de la cellule serait alors acidifi, entranant
la perte d ions et la rduction du potentiel membranaire, puis la mort de la cellule des
suites de la destruction du matriel gntique [46, 27, 28]. Le systme enzymatique
bactrien peut galement tre affect. Le mode d action des extraits naturels reste trs
peu dcrit, mais leur activit peut tre corrle avec la prsence de certains composs.
2.5.2.3 Contraintes de formulation

L utilisation des huiles essentielles pour leurs proprits conservatrices pose cependant
un certain nombre de problmes tels qu une odeur marque, parfois problmatique
pour une utilisation cosmtique incompatibilit entre l odeur de l huile essentielle et le
produit cosmtique protger), ou la prsence d allergnes, sources de ractions
cutanes, voire d allergies de contact. Par exemple, le linalol prsent dans l huile
essentielle de lavande et le cinnamaldhyde de la cannelle sont des allergnes naturels.
Notons galement que dans certains cas, l emploi des huiles essentielles est limit,
notamment chez les personnes dont la peau est sensible, chez les femmes enceintes et
les enfants [90].
2.5.3 Extraits naturels
Avec la diminution de l utilisation des matires premires animales, la consommation en

extraits vgtaux par l industrie cosmtique ne cesse de crotre chaque anne.
Paradoxalement, il n existe pas de dfinition rglementaire officielle pour qualifier les
extraits cosmtiques. Il en rsulte donc que la dnomination INCI (International
Nomenclature of Cosmetic Ingredients d un extrait peut dsigner des produits trs
diffrents en termes de technologies d extraction, de concentration en actif, de test
d efficacit et finalement en terme de prix.
2.5.3.1 Modes d obtention

Les extraits naturels peuvent tre obtenus au moyen de solvants (eau et solvants
organiques). Le vgtal, gnralement hach ou broy, est mlang avec un solvant qui a
la capacit de solubiliser les mtabolites d intrts. Une fois les dbris vgtaux limins,
27
le solvant est limin (gnralement par vaporation sous pression rduite) pour
conduire l extrait qui se prsente sous la forme d une pte plus ou moins visqueuse ou
d un solide.
Plusieurs solvants peuvent tre utiliss. Ils sont le plus souvent organiques (hexane,
ther de ptrole, actate d thyle, thanol, actone... . L thanol et l actone peuvent tre
utiliss en mlange avec l eau.
Depuis peu, on assiste au dveloppement de l extraction l aide de fluides
supercritiques, et plus particulirement au dioxyde de carbone. En effet, dans des
conditions de temprature et de pression bien prcises, ces fluides l tat supercritique
possdent des proprits particulirement intressantes pour l extraction. L extraction
assiste par micro-ondes prend galement beaucoup d ampleur ces dernires annes
[29]. Ces deux derniers exemples s inscrivent dans le dveloppement de la chimie verte,
notamment l utilisation de solvants verts co-solvants). Pour tre ainsi dfinis, les
solvants doivent prsenter une faible toxicit, tre facile recycler, faciles liminer du
produit final et prsenter une faible ractivit.
2.5.3.2 Avantages
Les extraits naturels prsentent une grande complexit chimique ; leur composition
chimique n est souvent pas bien connue. Un certain nombre d extraits vgtaux ont t
tudis pour leurs proprits antimicrobiennes et sont aujourd hui prsents sur le
march de la cosmtique, tels que l extrait de ppins de pamplemousse ou l extrait de
lichen (Tableau 3) [30,31].
2.5.3.1 Contraintes d utilisation

2.5.3.1.1 Le problme de la solubilit
De trs nombreux travaux portent sur les proprits biologiques d extraits vgtaux.
Des paramtres tels que le mode d extraction, la provenance de la matire vgtale ou
encore la partie de la plante tudie sont compars afin de dfinir les conditions
confrant la meilleure activit biologique mais, bien souvent, un extrait dvelopp de la
sorte ne tient pas compte de l utilisation qui en sera faite ensuite. En fonction de
l utilisation prvue, il est souvent ncessaire de disperser ou solubiliser l extrait dans
des matrices adaptes pour une bonne utilisation de celui ci. Certains extraits peuvent
alors s avrer difficiles solubiliser dans les solvants usuels [90,32].
2.5.3.1.2 Couleur des extraits

Les extraits contiennent de nombreuses molcules colores. Parmi celles-ci, solubles
dans les alcools ou mlanges eau-alcool, figurent les flavonodes (jaunes orangs), les
anthocyanes (bleus, violet, rouges), les tannins (marrons bruns) et la chlorophylle
[33]. L incorporation d un extrait vgtal contenant de telles molcules dans un produit
cosmtique gnre une coloration souvent peu esthtique et limitant le domaine
d application.
28
Tableau 3 : exemples dextraits aux proprits conservatrices prsents sur le march de la cosmtique
Extraits Noms commerciaux Actifs Activit Fournisseurs Rfrences

Extrait de lichen (Barbe Lichen Herbsasol Acides usnique et Antimicrobienne Cosmetochem [31,34]
de Jupiter) Extract PG vulpinique International
Asparagopsis armata Ysaline 100 Composs organiques Antimicrobienne Algues & Mer [35,36]
(Algue rouge) INCI* : asparagopsis armata halogns (C. albicans, E. coli, P.
extract aeruginosa, V.
anguillarum, E.
gergiviae, S. aureus)
Podocarpus totara (bois TotarolTM Totarol (diterpne Antimicrobienne (S. Essentially NZ [37,38,34]
de cur recycl INCI : podocarpus totara aromatique C20H30O) aureus )
wood extract Antioxydante
Citrus grandis P50 VTF-0373 Flavonodes Antimicrobienne Chemie Research [39,40,34]
(pamplemousse, extrait INCI : citrus grandis seed polyphnoliques Antifongique & Manufacturing
de ppins) extract Vege Tech
Bio-Botanica
Lonicera japonica Plantservative WSr, WMr Lonicrine (alcalode Antimicrobienne Campo [34,41]
Extrait de chvrefeuille INCI : Lonicera Caprifolium indolique) acide p-
du Japon (bourgeons) hydroxybenzoque
extract, Lonicera Japonica
(parabne)
extract
naturel
Viola Tricolor Extrait INCI : viola tricolor extract Flavonodes, saponines, Antimicrobienne Alban Mller [42]
de penses sauvage acide salicylique, vitamine International
E
Pimpinella anisum INCI : pimpinella anisum Acide p-anisique Antimicrobienne Active Concepts [43]
Extrait danis extract LLC
Alban Mller
Extraits Noms commerciaux Actifs Activit Fournisseurs Rfrences

Wasabia japonica ACB Wasabi )sothiocyanate d allyle Antimicrobienne Active Concepts [34,44]
Extrait de wasabi INCI : Lactobacillus/ Wasabia LLC
(ferment de rhizome) Japonica Root Ferment
Extract
*INCI: International Nomenclature of Cosmetic Ingredients.
2.5.4 Huiles vgtales
Les huiles vgtales sont galement des extraits naturels pouvant influencer la
conservation des produits cosmtiques via une activit antioxydante. Ces produits sont
obtenus par un procd mcanique traditionnel de pression, appliqu des graines ou
fruits issus de plantes olagineuses. La pression dite froid donne une huile qualifie
de vierge, et peut tre ensuite traite par centrifugation ou filtration. Un procd de
chauffage peut tre appliqu aux graines en amont de la pression. Dans ce cas, les huiles
doivent tre raffines afin d tre nettoyes de toutes impurets pour leur
commercialisation. Ce procd de raffinage est souvent effectu au niveau industriel
pour des questions de rendement [90].
Les huiles vgtales sont naturellement plus ou moins riches en antioxydants, composs
protgeant contre l oxydation.
3 LES ALTERNATIVES A LUTILISATION DES CONSERVATEURS

3.1 Alternatives de formulation
3.1.1 Activit de leau
Afin de se multiplier, les microorganismes doivent tre en prsence d eau en quantit

suffisante. La quantit d eau ncessaire cette croissance microbienne correspond la
quantit d eau libre , ou eau disponible , prsente dans la formule [45]. L eau libre
est communment dfinie par le terme activit de l eau , not aw (water activity) [46,47].
3.1.1.1 Dfinition
L activit de l eau correspond la mesure des molcules d eau non complexes

d autres molcules prsentes dans la formule. Elle est dfinie par la pression de vapeur
de la solution P soluts dans l eau divise par la pression de vapeur du solvant P0 l eau
pure) temprature constante [14] :
P
aw
P0
Par dfinition, la pression de vapeur est la pression sous laquelle la formule, place seule
une temprature constante, est en quilibre avec sa vapeur. L activit de l eau a w et
l humidit relative d quilibre (RE (%) sont lies par la relation suivante :
HRE (%) = 100 * aw
Ainsi, l activit de l eau peut tre comprise entre , absence totale d eau et , eau
pure) [46,47,48].
31
3.1.1.2 Activit de l eau et conservation
Pour se dvelopper de manire optimale, les microorganismes doivent tre en prsence

d eau libre en quantit suffisante. Gnralement, une diminution de l aw entraine donc
un net ralentissement de la croissance microbienne [49]. En effet, afin de survivre et de
se dvelopper, les microorganismes doivent maintenir un tat de turgescence
l intrieur de la cellule, phnomne possible par osmose phnomne de diffusion
travers une membrane semi permable, sous l effet d un gradient de concentration avec
le milieu extracellulaire. La perte de turgescence aboutira une augmentation de la
phase de latence, une diminution de la croissance et une rduction du nombre total des
cellules microbiennes (NF EN ISO 29621). Ainsi, des produits tels que le talc ou des
dodorants sticks, relativement anhydres, ne ncessitent pas que des conservateurs y
soient ajouts. Les industriels choisissent souvent d en incorporer afin d viter toute
contamination inhrente au consommateur. Ce dernier peut en effet ajouter de l eau au
produit par inadvertance [47].
Chaque espce de microorganisme tant spcifique, la valeur minimale de l aw pour
laquelle la multiplication cellulaire peut avoir lieu varie. Typiquement, les levures et
moisissures peuvent se dvelopper des valeurs d aw plus faibles que les bactries.
Le Tableau 4 donne quelques valeurs minimales d aw pour la croissance de
microorganismes spcifiques pour la cosmtique. Il faut cependant noter que ces valeurs
peuvent varier en fonction de nombreux facteurs spcifiques la formulation ou au
conditionnement.
Tableau 4 : Valeurs daw minimales permettant la croissance de microorganismes reprsentatifs,

25C
Microorganismes Aw minimum
Bactries
Pseudomonas aeruginosa 0,97
Escherichia coli 0,95
Staphylococcus aureus 0,86
Levures et Moisissures
Aspergillus niger 0,77
Candida albicans 0,87
Ainsi, la diminution de l aw d une formulation permet une protection contre la

multiplication des microorganismes mais ne permet pas la destruction d une population
contaminante, comme peuvent le faire des conservateurs microbicides. Ainsi, si des
microorganismes sont introduits dans le produit au moment de la fabrication (matires
32
premires contamines, mauvais nettoyage du matriel de fabrication , ils resteront

prsents dans le produit fini. Un produit cosmtique qui serait uniquement conserv
selon le facteur activit de l eau doit donc tre fabriqu dans des conditions de
fabrication strictes et tre conditionn dans un packaging appropri [46,48-50].
3.1.1.3 Facteurs ayant une influence sur l aw
D aprs la dfinition de l aw, il est ais de comprendre qu en diminuant le pourcentage

d eau prsent dans une formule, l activit de l eau s en trouve abaisse. Mais en ralit,
l eau est l ingrdient principal d une grande majorit de produits cosmtiques. Ce
facteur n est donc pas suffisant pour affecter notablement la valeur de l aw.
Des tudes ont montr que certaines matires premires spcifiques et trs frquentes
dans l industrie cosmtique ont une influence sur cette valeur. Les humectants, tels que
le glycrol, propylne glycol, et sorbitol et autres matriaux hydrosolubles diminuent
l aw grce la formation de liaisons hydrognes entre les molcules d eau et les
fonctions hydroxyles de ces molcules. La diminution de l aw gnre augmente alors le
stress impos aux microorganismes.
Les sels inorganiques, les acides et bases qui servent ajuster le pH et la viscosit
diminuent l aw. Les hydrocollodes (gomme de xanthane, gomme de guar, etc) utiliss
pour augmenter la viscosit permettent d abaisser la valeur de l aw [47,51]. En effet, ces
agents texturants forment un rseau tridimensionnel qui limite la mobilit des
molcules d eau dans le milieu.
Les facteurs suivants peuvent galement influencer l aw:
l ordre dans lequel les matires premires sont ajoutes,
la mthode et le temps d agitation,
l intervalle de temps entre chaque ajout d ingrdient,
la temprature de chaque ingrdient,
la prsence ou l absence d agents de surface [46,49].
Ces diffrents points permettent une interaction plus ou moins bonne entre les
molcules d eau et les ingrdients susceptibles d interagir.
3.1.1.3.1 Le pH
Tout microorganisme possde un pH de croissance optimum (Tableau 5). Les pH de

croissance se situent gnralement entre 5 et 8 [52]. D une manire gnrale, les
bactries se dveloppent mieux dans des milieux proches de la neutralit alors que les
levures et moisissures sont gnralement acido-rsistantes avec un pH de croissance
optimum se situant entre 4 et 6 mais avec des valeurs extrmes de 2 9 pour les levures
et de 2 11 pour les moisissures.
Le fonctionnement cellulaire microbien dpend du maintien du pH intracellulaire
appropri (pHi . Ainsi, plus le p( du milieu dans lequel se trouvent les cellules s loigne
du pHi, plus les microorganismes se trouvent dans des conditions de stress dfavorables
33
tout dveloppement. Il faut cependant noter que les bactries sont capables de
maintenir un pHi plutt constant, mme si le pH extracellulaire fluctue. En effet, les
membranes cellulaires ont une permabilit slective, permettant ainsi le passage d ions
et de composs spcifiques entre l intrieur et l extrieur de la cellule, ce qui assure un
maintien du pH intracellulaire qui peut tre trs diffrent du pH externe (jusqu 2
units de pH). Cependant, cette rgulation est limite dans le temps [53,54].
Tableau 5 : domaines de pH de croissance des microorganismes
Microorganismes pH de croissance
Bactries 4,0 9,0
Levures 1,5 8,0
Moisissures 5,0 - 11
Le formulateur possde un large choix d acides pour quilibrer le p( de ses formules. Il

faut noter que les acides forts (ex : acide chlorhydrique) ne jouent un rle que sur le pH
externe des cellules microbiennes alors que les acides faibles, plus lipophiles, sont
capables de traverser la membrane cellulaire et d agir sur le p( cytoplasmique (cf.
2.4.1). [46,16,17].
Cependant, la majorit des produits cosmtiques ont un pH qui se situe entre 5 et 8. En
dehors de certaines exceptions, il est donc difficile d utiliser ce paramtre pour limiter la
croissance microbienne au sein du produit fini
3.1.1.3.2 Matires premires
Tensioactifs
Les tensioactifs sont des molcules amphiphiles trs utilises par l industrie cosmtique,
tout particulirement pour leur capacit abaisser la tension interfaciale entre deux
milieux immiscibles tels qu une phase aqueuse et une phase huileuse par exemple. )ls
sont donc majoritairement employs en tant qu agents dtergents, moussants,
mouillants, solubilisants ou dispersants [55,56]. Les tensioactifs sont composs d une
chane apolaire (hydrophobe) qui porte son extrmit une fonction polaire
(hydrophile). Ils sont classs en fonction de la nature de leur tte polaire. Sont ainsi
distingus les tensioactifs anioniques, cationiques, non-ioniques et amphotres ou
zwitterioniques [57]. Parmi ces classes de tensioactifs, certaines sont connues pour
prsenter un spectre d activit antimicrobien plus ou moins important. Les interactions
entre les tensioactifs antimicrobiens et leurs cellules cibles sont pour la plupart trs
complexes car elles peuvent dcouler d interactions lectrostatiques, d effets
hydrophobes ou de la formation de structures secondaires [46,58,59,60].
L activit bactricide des tensioactifs cationiques, en particulier les sels d ammonium
34
quaternaire, a t trs tudie. Cette famille de molcules altre la permabilit des

cellules membranaires bactriennes, diminuant l activit et menant la mort des
bactries cibles. De plus, ces tensioactifs prsentent un large spectre d activit sur
l chelle de p( communment rencontre en cosmtique, une faible toxicit aux
concentrations usuelles, une solubilit leve dans l eau et sont bien tolrs par la peau.
Il faut nanmoins noter leur inactivation par des tensioactifs anioniques (dont les sels
d acides gras), les fibres du coton et certaines protines.
Les tensioactifs amphotres ont des proprits bactricides notables mais infrieures
celles des sels d ammonium quaternaire.
Les sels d acides gras appartiennent la classe des tensioactifs anioniques. )ls possdent
une activit antimicrobienne qui dpend de la basicit et de l activit de l eau du milieu.
Lorsqu ils sont incorpors en concentration suprieure leur CMC (concentration
micellaire critique), ils ont un effet chaotropique sur les cellules membranaires
microbiennes (par exemple le sodium dodecyl sulfate ou SDS . Plus prcisment, l action
chaotropique entraine la destruction de la structure spatiale des macromolcules
biologiques en interfrant avec les liaisons faibles intramolculaires de type liaisons
hydrogne, forces hydrophobes et de Van der Waals [61,62]. De manire gnrale, les
tensioactifs anioniques sont plus efficaces contre les bactries Gram positif que celles
Gram ngatif. Les autres familles de tensioactifs anioniques ont une activit
antimicrobienne faiblement marque.
Les tensioactifs non-ioniques sont gnralement utiliss en tant qu agents solubilisants.
Leur potentiel antimicrobien dpend souvent de leur concentration. En effet, en de de
leur CMC, ils peuvent exercer une activit contre les microorganismes, alors qu au-del
de cette valeur, ils risquent d inhiber l activit biocide, les agents antimicrobiens se
retrouvant en partie encapsuls dans les micelles de tensioactifs [,63,64,65. Cet
antagonisme peut toutefois tre empch en vitant la co-micellisation [66].
Le Tableau 6 donne un aperu des familles de molcules dont plusieurs drivs ont
montr une activit antibactrienne et/ou antifongique significative. Il faut cependant
toujours garder l esprit que les interactions entre les tensioactifs et les nombreuses
molcules prsentes au sein des formules cosmtiques peuvent avoir un fort impact sur
cette activit [46].
Acides gras et leurs esters
Les premires tudes axes sur l activit germicide des acides gras se sont droules au
cours des annes 1920 1940, puis plus tard avec John J. Kabara dans les annes 1970
[67,68].
Des tests d activit antimicrobienne ont t effectus sur des acides gras saturs de
chanes carbones C6 C20. Puis l effet des insaturations, de l isomrie et de
l estrification sur l activit a t valu.
35
Tableau 6 : famille de molcules tensioactives dont plusieurs drivs ont montr une activit
antibactrienne et/ou antifongique significative
Classification des
Famille de tensioactifs
tensioactifs
ANIONIQUES Sels d acides gras
Sels d ammonium quaternaire

CATIONIQUES Aminimides
Alkyles btanes
Alkyles amidopropylbtanes
AMPHOTRES Alkyles aminopropionates et Alkyles iminodipropionates
Alkyles imidazolines
Drivs d acides amins
Monoesters d acides gras

Monoesters d acides alkyldihydroxybenzoque
Polythylne glycol
Alkanolamides
NON IONIQUES Drivs polyoxythylniques
Esters de sucres
Alkyles glycosides ou Alkyl glycopyranosides
Oligosaccharides contenant un groupe amino
Dithanolamides de N-Lauroyl dipeptides
Les acides gras :

Les acides gras sont gnralement plus efficaces contre les bactries Gram
positif que celles Gram ngatif. L acide laurique C12 est l acide gras le plus actif contre
la plupart des bactries alors que les acides gras de chanes C8 et C18 sont gnralement
plus actifs contre les levures et moisissures.
Les acides gras mono et polyinsaturs :
Les acides gras monoinsaturs sont gnralement plus actifs que les acides gras
saturs. L activit optimale a t montre pour l acide palmitolique C16:1). La prsence
d une double liaison augmente l activit antimicrobienne sans que la position de la
liaison sur la chane n ait d impact. De plus il faut noter que les isomres Z) prsentent
systmatiquement une inhibition plus importante que les composs (E). Enfin, les
drivs actylniques sont plus actifs contre les champignons que les drivs
thylniques (Tableau 7) [67].
Les acides gras estrifis :

L utilisation des esters mthyliques et thyliques de ces mmes acides gras rduit
l activit antimicrobienne. Par contre, les esters d alcool polyhydrique montrent une
bonne activit. Les esters de polyglycrol montrent en particulier d excellentes
proprits antimicrobiennes, les plus actifs tant les esters de caprate et laurate de
polyglycryle. Parmi les esters de monoglycrol, les caprate et laurate sont galement
les plus actifs [68]. Enfin, les essais raliss sur les sucroesters montrent qu l exception
36
du sucrose laurate, ils sont plus actifs que leurs acides gras correspondants.
Tableau 7 : Concentrations Minimales )nhibitrices CM) en mM dacides gras saturs et insaturs
[67]
Staphylococcus
Acides gras Candida albicans
aureus
Caproic (6 :0) _a) _
_ _
Caprylic (8 :0)
Capric (10 :0) 2,90 2,90
Lauric (12 :0) 2,49 2,49
Myristic (14 :0) 4,37 4,37
Myristoleic (14 :1) 0,44 0,55
Palmitic (16 :0) _ _
Palmitoleic (16 :1) 0,98 0,49
Stearic (18 :0) _ _
Oleic (18 :1) _ _
Elaidic (18 :1) _ _
Linoleic (18 :2) _ 0,46
Linolenic (18 :3) 1,79 _
Linolelaidic (18 :2) _ _
Arachidonic (20 :4) _ _
a Absence dinhibition aux concentrations testes , mg/ml ou -60 mmol/L).
De manire gnrale, il existe une relation structure/activit. Les acides gras utiliss
pour estrifier le glycrol dterminent le potentiel biocide de l ester rsultant,
l exemple de l ester de monoglycrol laurate. En effet, leur structure spcifique
(longueur de chane) leur permet de pntrer et dstabiliser la cellule membranaire des
microbes, entrainant la destruction du microorganisme. Enfin, l activit antimicrobienne
de ces molcules peut tre amliore par la diminution du p(, la prsence d un agent
chlatant et/ou antioxydant [67,69,70,71].
Ainsi, le march de la cosmtique se voit proposer depuis quelques annes de
nombreuses matires premires composes d esters de monoglycryl purs ou en
mlange, dont les fonctions premires sont les proprits mulsifiantes et hydratantes
37
mais dont l activit antimicrobienne est largement tudie (ex : glyceryl caprate, glyceryl
caprylate, glyceryl laurate). Ces matires premires ne sont donc pas dclares en
conservateurs. Leur grand avantage est qu elles prsentent une activit optimum sur
une chelle de pH allant de 4,5 7, ce qui est largement compatible avec les contraintes
cosmtiques. Leur activit tant gnralement meilleure contre les bactries et levures
que contre les moisissures, il peut tre avantageux de les combiner un acide organique
[46,16].
Agents chlatants
Les agents chlatants ou squestrants sont des molcules qui permettent entre autres de
maintenir la transparence d une formule, de protger les parfums, de stabiliser les
agents paississants, de prvenir le rancissement et de stabiliser les colorants.
Ils ont galement la capacit d augmenter l efficacit antimicrobienne contre les
bactries Gram ngatif, les levures et moisissures. Ils sont particulirement efficaces
contre Pseudomonas fluorescens et Pseudomonas aeruginosa (bactries Gram ngatif).
Les agents chlatants que l industrie cosmtique utilise sont, par exemple, l EDTA acide
thylne diamine ttra actique , le calcium disodium EDTA, l acide citrique, le citrate de
sodium, le citrate de potassium, le trisodium phosphate.
La contribution de l EDTA l activit antimicrobienne a t trs tudie. Cette molcule
provoque la dissolution des couches externes des membranes des bactries Gram
ngatif. Ceci a pour consquence la libration de soluts intracellulaires ainsi qu une
solubilisation partielle de l enveloppe cellulaire des bactries. Grce cette action, la
permabilit des cellules bactriennes est augmente, ce qui les rend plus vulnrables
l action d autres agents de conservation. En effet, la complexit de la structure des
membranes cellulaires des bactries Gram ngatif les rend plus rsistantes que celles
Gram positif et souvent difficiles combattre. Nanmoins, bien que trs efficace contre
P. aeruginosa, l action de l EDTA contre cette bactrie n est pas complte s il est utilis
comme seul agent antibactrien. Diffrents travaux ont montr une synergie trs
importante entre l EDTA et de nombreux conservateurs usuels en cosmtique contre P.
aeruginosa. Des tudes ont galement montr le potentiel de l EDTA pour avoir un effet
synergique avec des conservateurs naturels tels que des huiles essentielles ou des
extraits vgtaux [72,73,74,75,76,77]. Nanmoins, l utilisation de cet agent chlatant est
controverse. )l se rvle en effet cytoxique et lgrement gnotoxique sur l animal. Le
principal inconvnient rside nanmoins dans sa persistance dans l environnement et
dans les eaux traites. La recherche d alternatives cet agent efficace est donc
d actualit [78].
Alcools
Les alcools aliphatiques les plus frquents dans l industrie cosmtique sont l thanol,
l alcool n-propylique et l alcool isopropylique. Plus la masse molculaire et la longueur
de chane augmentent et plus l efficacit antimicrobienne est accrue. Lorsqu un produit
38
fini contient une concentration en alcool suprieure 20 % en masse volumique, il est

auto-conserv et ne ncessite pas d essais microbiologiques (Tableau 8). En effet, l alcool
(agent chaotropique) dstabilise les cellules membranaires, dnature les protines et
tue les microorganismes lorsqu il est introduit en quantit suffisante.
En concentration infrieure 20 %, l alcool contribue la conservation, ce qui permet de
diminuer la quantit de conservateur introduire, ou il faut alors combiner son effet
d autres facteurs physicochimiques tels que le p( NF EN )SO [47,62].
Tableau 8 : concentrations minimales dthanol permettant linhibition des microorganismes
Concentration dEthanol
Microorganismes
(en volume)
Bactries 8-11 %
Levures 8-11 %
Moisissures 15-18 %
Cependant, il ne faut pas oublier que l alcool est asschant et irritant pour les peaux
sensibles, ce qui peut limiter son utilisation des concentrations trop leves [46].
3.1.1.3.3 L eau
L eau est une matire premire utilise en trs grande quantit dans une grande partie
des produits cosmtiques. Plusieurs types d eaux sont utiliss : l eau adoucie, l eau
dminralise et l eau strile.
L eau strile est la fois dminralise et dbarrasse de tous les microorganismes. Pour
cela, on peut utiliser deux grands procds :
La distillation (eau distille),
La filtration sur des membranes de cellulose spciales de trs faible porosit
(0,22 m).
La distillation est un procd qui consomme beaucoup d nergie, c est donc le procd
de filtration strilisante qui est gnralement prfr.
L eau tant le milieu de croissance des microorganismes, plus le produit cosmtique en
contient, et plus les microorganismes pourront prolifrer. Or l absence de
microorganismes dans cette matire premire, souvent prdominante en cosmtique,
est un facteur cl pour la propret microbiologique du produit fini. L utilisation d une
eau strilise est donc une alternative qui permet de diminuer la quantit de
conservateur incorporer. En effet, si l eau contient un certain nombre de
microorganismes au moment du procd de fabrication, le rle premier du conservateur
sera de les liminer ou de lutter contre leur prolifration avant mme que le
consommateur n ouvre son produit, alors que l utilisation d une eau strile vite cette
consommation prmature [46].
39
3.1.1.3.4 Temprature
Comme pour le pH, il existe une plage de temprature optimale la survie et la

croissance microbienne. Ainsi, basse temprature, la croissance se trouvera nettement
ralentie et au-del de la temprature optimale, les microorganismes sont tus. En
fonction de la sensibilit des produits formuls, le facteur temprature peut donc
permettre le contrle des microorganismes, par exemple en maintenant le produit
pendant un intervalle de temps prolong une temprature suprieure la temprature
optimale (au moins 10 min). Les rouges lvres ou fards joues conditionns des
tempratures 65,0 C remplissent ce dernier critre (NF EN ISO 29621) [46].
3.1.1.4 Autres systmes de conservation
3.1.1.4.1 Enzyme
Une alternative la conservation par voie chimique est l utilisation de systmes

enzymatiques. Les enzymes sont des catalyseurs biologiques. Celles qui luttent contre
les mcanismes de dfense des organismes vivants sont typiquement des enzymes
lytiques ou des enzymes oxydorductases. La conservation enzymatique est dj trs
utilise par l industrie laitire pour les produits de premption rapide. Des tudes sont
menes afin d optimiser leur potentiel antimicrobien dans le cas de l industrie
cosmtique. Un systme conservateur enzymatique brevet base de lactoperoxydase,
de glucose oxydase, de glucose, d iodure de potassium ainsi que de thiocyanate de
potassium existe dj sous le nom de Biovert (Arch Personal Care, L.P.) [79,80].
Les avantages du systme enzymatique sont les suivants :
l enzyme n est pas consomme aprs avoir agi contre la cellule cible. Une
enzyme reste active tant qu elle se trouve en prsence de son substrat,
le principe est bas sur les systmes de dfenses immunitaires naturelles.
Ses inconvnients sont le prix environ fois plus cher qu un systme conservateur de
synthse classique), la difficult de production grande chelle et une sensibilit la
chaleur. Les produits conservs via un complexe enzymatique ne doivent pas tre
exposs des tempratures au-del de 35 C pendant une dure prolonge au cours de
la production ou pendant le stockage [46,81].
3.1.1.4.2 Procds de strilisation
UHT
Le principe de la strilisation Ultra Haute Temprature est une technique brevete par
les laboratoires Dermatherm [82]. Dj trs utilise en agroalimentaire, notamment
pour le lait, la strilisation se fait par un passage rapide haute temprature (135 C
pendant secondes suivi d un refroidissement immdiat. La quasi-totalit des
microorganismes est ainsi limine. Le procd de strilisation est effectu directement
aprs production sur les produits non conditionns (vracs) dans des packagings de type
40
airless munis en plus d un bouchon antimicrobien, avant d tre conditionns en bloc

strile [46]. Le packaging airless protge de la lumire et de l air. Le bouchon
antimicrobien est garni d une mousse antimicrobienne qui nettoie et protge la valve
chaque repositionnement du bouchon. Ce procd n est bien sr pas applicable tous
les produits cosmtiques. En particulier, il est rserv aux cosmtiques fluides.
Rayons
Comme dcrit ci-aprs (cf 3.1.2), il existe des procds de strilisation aux rayons
gamma, bta ou au gaz d oxyde d thylne qui strilisent le produit cosmtique fini,
avant ou aprs conditionnement.
CO2 supercritique
Une technique de strilisation plus rcente est l utilisation du CO2 supercritique. En effet,
pression atmosphrique, le CO2 inhibe la croissance microbienne, mais le phnomne
est rversible. Par contre, lorsque la pression augmente, l effet du CO2 sur les
microorganismes augmente et devient irrversible. L effet du CO2 supercritique sur les
microorganismes dpend de plusieurs paramtres tels que la nature des
microorganismes, l activit de l eau du milieu, le p(, la temprature. Le mode d action du
CO2 n est pas encore clairement dfini. )l a t montr que lors d un traitement au CO 2
supercritique, la mort cellulaire a lieu pendant la dpressurisation. En effet, le CO2
supercritique a la capacit de diffuser dans les cellules microbiennes [83]. Ainsi,
plusieurs hypothses ont t mises sur son mode d action:
La nature lipophile du CO2 supercritique solubilise les bicouches de

phospholipides de la membrane cellulaire, augmentant fortement la permabilit
de celle-ci,
Rupture de la cellule cause de la pression interne,
)nactivation d enzymes ncessaire la mtabolisation des cellules,
Diminution du pH cytoplasmique par accumulation du CO2 dans le
cytoplasme interne des cellules, formation de protons en grande quantit et
incapacit des cellules tout expulser pour rguler le pH,
Conversion du bicarbonate form en carbonate, entranant une
prcipitation intracellulaire de sels.
Ainsi, un certain nombre de points reste lucider sur la mthode de strilisation au CO2
supercritique. Nanmoins, ses excellentes proprits microbicides ainsi que le respect
environnemental de la technique laissent prsager un intrt croissant pour cette
alternative [84,85,86,87,88].
41
3.1.2 De la fabrication au packaging
3.1.2.1 BPF
L hygine des locaux est primordiale et facilite par des surfaces lisses et non
absorbantes. Il faut particulirement veiller aux tuyauteries apparentes et difficiles
atteindre, aux courants d air, au taux d humidit ainsi qu aux eaux stagnantes qui
peuvent devenir des sources de contamination. Il est ncessaire de privilgier des
matriaux de fabrication en acier inoxydable. Un choix judicieux des tuyauteries et
robinetteries, nombre limit de coudes par exemple, limitera les risques. Afin
d optimiser les dcontaminations, les nettoyages l aide de dtergents germicides
(bactricides et fongicides) sont privilgier [89].
Le personnel oprant doit galement porter une tenue adapte et rpondre des
normes d hygine strictes afin de vhiculer un minimum d agents contaminants [14].
Les matires premires utilises dans la fabrication des produits peuvent contenir des
microorganismes et contaminer le produit in situ. L eau est ainsi la source premire de
contamination et sa propret microbiologique doit tre scrupuleusement vrifie. De
plus, des produits d origine vgtale tels que les poudres vgtales, les extraits, les
gommes, les alginates, ou encore d origine tellurique telles que les argiles, mais
galement certains colorants, agents de surface, peuvent tre porteurs de germes et
contaminer le produit fini. Il est donc ncessaire que les tests de contrle de la qualit
microbiologique de ces ingrdients soient rigoureusement appliqus [14]
3.1.2.2 Packaging
Le choix du packaging est d une importance cruciale lorsque le souhait du fabriquant est
d optimiser la conservation du produit fini. En effet, une fois fabriqu et conditionn, les
sources de contaminations majeures d un produit sont les contacts rpts entre le
produit et le doigt du consommateur, l air et l eau. De mme, une temprature de
conservation leve (par exemple dans les salles de bains) pourra favoriser la
multiplication des germes. La contamination peut avoir lieu alors que le consommateur
prlve le produit dans le tube ou le pot, packaging ncessitant un contact direct du
produit avec l air et avec le doigt de l utilisateur, charg de microorganismes.
Ainsi, des packagings spcifiques ont t labors afin de limiter au maximum la
pntration des microorganismes dans le contenant.
De nombreux packaging permettent de protger, avec plus ou moins d efficacit, le
produit fini de la contamination microbienne avant et aprs ouverture. Les pompes
airless ou encore certains dispositifs de fermeture spcifique dvelopps par des
laboratoires dermatologiques comme Avne, sont des solutions proposes aux
industriels et qui ont pour but de limiter, voire d empcher, tout contact entre le produit
et le consommateur, et entre le produit et l environnement extrieur au packaging.
L objectif est galement de bloquer l entre d eau et d oxygne l intrieur du packaging
[46,90,51,17,91].
42
Les packagings mono-doses sont une autre solution. En effet, dans le cadre de
l utilisation unique, il n y a pas de contamination extrieure du produit. Ainsi, le
formulateur peut diminuer, voire supprimer, la quantit de conservateur incorporer
dans le produit. Des fabricants de contenants mono-doses proposent par exemple des
packagings ayant subi une tape de strilisation. Diffrents processus de strilisation
sont envisageables.
Strilisation ETO : oxyde d thylne (gaz) aux proprits bactricides,
fongicides, sporicides et virucides. )l est mlang de l azote ou du dioxyde de
carbone. )l s infiltre dans l emballage et au cur du produit, dtruisant ainsi les
microorganismes
Strilisation aux rayons gamma
Strilisation aux rayons bta
Bien que l option de la mono-dose strile soit sduisante pour qui souhaite liminer
compltement les conservateurs, l un des inconvnients majeurs est la quantit de
packagings, qui se trouve dcuple pour un volume de produit donn par rapport aux
multi-doses. Or dans une socit o les contraintes de dveloppement durable sont de
plus en plus exigeantes, l usage unique semble sortir de ces considrations [46].
3.1.2.3 Matriaux
Les matriaux constituant le packaging ont un rle primordial dans l optimisation de la

conservation d un produit cosmtique. En effet, certains conservateurs sont par exemple
sensibles la lumire oxydation . C est le cas de l alcool benzylique, du sorbate de
potassium, ou encore de l acide sorbique. Les formules contenant ce type de
conservateurs devront tre conditionnes dans des packagings tenant compte de ce
facteur.
Certains plastifiants tels que les phtalates d alkyles prsents en grande quantit dans le
Chlorure de PolyVinyle souple (PVC) sont connus pour migrer lentement du packaging
dans la formule. )ls sont alors capables d inactiver les conservateurs phnoliques. Les
polyurthanes peuvent, quant eux, diminuer l activit des conservateurs phnoliques
et des ammoniums quaternaires. )l est galement connu que l alcool benzylique interagit
avec le polythylne (PE) et le polystyrne (PS). Les acides sorbique et dhydroactique
sont instables dans des contenants en verre brun, en PVC et en polypropylne (PP) [92].
Alors que la tendance actuelle dans la conception des packagings est d avoir recours
des matriaux d origine naturelle et biodgradables ou recyclables, leur impact sur la
conservation demeure proccupant. En effet, les matriaux drivs de fibres organiques
ou les polymres d origine naturelle constituant certains de ces contenants, peuvent
avoir un impact important sur les interactions packaging/produit et entraner
l inactivation d une partie du systme conservateur.
43
Il est donc ncessaire que le fabricant prenne en compte la nature des conservateurs et
du packaging lors de l optimisation de la conservation de produit fini [46,90,93].
4 LES ANTIOXYDANTS
Pour la cosmtique, les antioxydants sont des rducteurs ayant la capacit
d interrompre la raction de peroxydation et ainsi d empcher la formation
d hydroperoxydes et de peroxydes, courante pour les huiles insatures. )ls sont utiliss
dans toutes les formules contenant des corps gras insaturs, mais peuvent galement
tre incorpors des phases aqueuses contenant des extraits vgtaux riches en
oxydases, enzymes catalysant la rduction de l oxygne en eau ou en peroxyde
d hydrogne (2O2.
Leur concentration dans les produits cosmtiques est gnralement comprise entre 0,02
et 0,05 % [94].
L oxydation gnrant bien souvent un phnomne de rancissement proscrire en

cosmtique, il est donc important de connatre la sensibilit des matires premires et
produits finis cosmtiques ce phnomne ainsi que les facteurs qui en sont
responsables.
INITIATION LH L + H Formation dun radical lipidique
L + O2 LOO Formation dun radical peroxyle
PROPAGATION LOO + L ( LOOH + L Formation dhydroperoxyde
TERMINAISON L + L L L
LOO + LOO LOOL + O2
LOO + L LOOL
L = Lipide
Figure 1 : schma gnral du mcanisme dauto-oxydation
Les phnomnes d oxydation apparaissent selon plusieurs mcanismes dans les

produits cosmtiques :
L autooxydation qui peut tre catalyse par la temprature, les ions
mtalliques ou les radicaux libres) (Figure 1) ;
La photooxydation (initie par la lumire en prsence de
photosensibilisants) (Figure 2).
44
R2 R1
O2 O2
R2 R1 R2 R1
O O H H O O
HOO OOH
R2 R1 R2 R1
Figure 2 : formation dhydroperoxydes par photo-oxydation des acides gras insaturs
Les tocophrols, naturellement prsents dans les huiles vgtales, notamment l -

tocophrol, sont frquemment formuls en cosmtique, tout comme les antioxydants
phnoliques trs prsents dans les extraits vgtaux [95].
On peut galement recourir aux antioxydants sous forme de complexe ou en association
avec un chlateur de mtaux. Un phnomne de synergie peut tre observ lorsqu un
des accepteurs de radicaux libres possde une efficacit suprieure un autre issu du
mme complexe. Cette synergie permet au complexe antioxydant d avoir une ractivit
suprieure celle d un compos utilis seul. L acide ascorbique, hydrosoluble, et son
driv lipophile, le palmitate d ascorbyle, sont souvent employs comme antioxydants
synergistes. L acide citrique ou l EDTA sont utiliss comme chlateurs de mtaux [96].
L association de l acide citrique avec du tocophrol, ou encore du -carotne et de l -
tocophrol, sont de bons exemples de complexes antioxydants synergiques ayant
montr leur efficacit [96,97].
L efficacit des antioxydants dans les systmes lipidiques dpend de trois paramtres :
leur solubilit, leur volatilit et leur stabilit. En effet, les antioxydants doivent tre
liposolubles afin de pouvoir ragir avec les radicaux libres issus de l oxydation des
huiles. Par ailleurs, ils ne doivent pas tre trop volatils au risque d tre perdus lors du
processus de fabrication du produit fini. Ils doivent galement tre stables la
temprature mise en uvre lors de la production. )l est ncessaire que les antioxydants
soient ajouts avant que les ractions d oxydation n interviennent car, s ils prviennent
ce phnomne, ils n ont aucune action sur les produits de l oxydation.
45
5 MICROBIOLOGIE
Comme le rappel la Figure 3, le contrle et la matrise de la microbiologie des produits
cosmtiques sont ncessaires et par ailleurs imposs par la rglementation.
Figure 3 : encart rappelant la ncessit des contrles microbiologiques des produits cosmtiques
[46].
Le dveloppement d un nouveau conservateur ncessite plusieurs tapes d valuation et

de validation microbiologique. Le secteur d application et sa rglementation orientent le
choix des microorganismes utiliser pour raliser les essais.
Tests d activit antimicrobienne et challenge test
L annexe ) du rglement CE du parlement europen pour la cosmtique

prcise que le rapport de scurit du produit doit comporter les spcifications
microbiologiques dudit produit ainsi que les rsultats du challenge test pour la
conservation. Le challenge test est un test rglement permettant d valuer l efficacit
du systme conservateur.
Analyse microbiologique du produit
Afin de dterminer quels sont les produits ncessitant une analyse microbiologique en
vue d une dtection de microorganismes spcifis et non spcifis, il est conseill aux
industriels d effectuer une analyse du risque microbiologique selon la norme NF EN )SO
29621 de juin 2011. En effet, les produits prsentant un faible risque microbiologique ne
ncessitent pas la mise en uvre des normes internationales de microbiologie relatives
aux cosmtiques. On peut citer par exemple les produits dfrisants qui prsentent un
pH 10,0 ou encore les vernis ongles base de solvants.
Une attention particulire doit tre accorde aux produits cosmtiques utiliss sur le
46
contour des yeux, sur les muqueuses en gnral, sur une peau lse, chez les enfants de
moins de trois ans, chez les personnes ges et chez les personnes au systme
immunitaire fragilis. Ces produits sont dits de catgorie 1, les autres tant dits de
catgorie 2. Ces produits doivent rpondre aux contraintes suivantes (en Europe) :
Catgorie 1 : le nombre total de microorganismes msophiles arobies
(microorganismes pouvant se dvelopper des tempratures entre 20 et 45 C, en
prsence d oxygne atmosphrique [98]) acceptable ne doit pas excder 102 CFU/g
(Unit Formant Colonie) ou 102 CFU/mL dans 0,5 g ou 0,5 mL de produit (limite
maximale acceptable 5.102 CFU/mL).
Catgorie 2 : le nombre total de microorganismes msophiles arobies
acceptable ne doit pas excder 103 CFU/g ou 103 CFU/mL dans 0,1 g ou 0,1 mL de
produit (limite maximale acceptable 5.103 CFU/mL) [99].
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus et Candida albicans sont les souches
pathognes risque dans les produits topiques car elles peuvent engendrer des
infections cutanes ou ophtalmologiques. Elles ne doivent donc pas tre dtectes dans
0,5 g ou mL de produits de catgorie 1, ni dans 0,1 g ou mL de produits de catgorie 2. La
dtection d autres sortes de microorganismes par exemple des indications de
contamination fcale tels qu Escherichia coli peut aussi s avrer ncessaire car leur
prsence laisse penser une dfaillance de l hygine au cours du processus de
fabrication.
Ainsi, la qualit microbiologique des produits fabriqus doit tre value tout au long de
la chane de fabrication, de la matire premire au produit fini, en passant par
l environnement de production.
Afin d effectuer ces examens microbiologiques au sein du laboratoire, certaines
contraintes sont respecter pour la viabilit du test :
Toute contamination de l chantillon tester doit tre vite, celle-ci
pouvant avoir lieu lors du transport, de la rception, du stockage ou de la manipulation
de l chantillon ;
L inhibition potentielle de la croissance microbienne par l chantillon doit
tre neutralise avant le dbut du test de recherche ou du dnombrement des
microorganismes viables dans le produit [100].
Les laboratoires de contrle de la propret microbiologique de produits cosmtiques
doivent tre en possession d un quipement de strilisation adquat pour le matriel, les
milieux de culture et les ractifs (strilisation par chaleur sche, humide et filtration) et
de hottes microbiologiques (hotte flux laminaire ou de scurit) afin de pouvoir
manipuler dans des conditions de sret et de rigueur optimales [101].
Le laboratoire effectuant les tests possde une certaine libert quant au choix de la
prparation des chantillons, plus particulirement la prparation des milieux de
culture. Il est possible de prparer entirement les milieux selon des compositions
dcrites dans les normes AFNOR pour le contrle microbiologique des cosmtiques. Il
47
est galement possible d utiliser des milieux de culture dshydrats conformment aux
instructions du fabricant ou encore des milieux prts l emploi.
Challenge Test
Diffrentes normes dfinissent un test d efficacit de la conservation antimicrobienne ou
challenge test :
NF T 75 611:2007 : Cosmtiques Microbiologie valuation de la
protection antimicrobienne d'un produit cosmtique (Tableau 9) ;
Pharmacope Europenne 7.0 EP 5.1.3 : Efficacit de la conservation
antimicrobienne ;
Pharmacope US - USP 51: Preservative Efficacy Testing and Preservative
Challenge Testing by Antimicrobial Test.
Le challenge test permet de tester le comportement d une formulation cosmtique face
une contamination volontaire et artificielle par des microorganismes de rfrence afin
que les produits mis disposition du consommateur ne prsentent pas de risque
particulier. Les microorganismes de test sont inoculs en quantit dtermine puis
l volution de la population viable est suivie par dnombrement des germes dans des
chantillons prlevs intervalles de temps donns (en gnral J2, J7, J14 et J28). La
temprature et la dure des essais sont contrles.
Cet essai d efficacit de conservation doit tre effectu :
la conception du produit pour slectionner le systme le plus efficace,
Lors de l tude de stabilit, afin de s assurer de son efficacit la date de
premption du produit,
chaque changement d un lment de la formulation ou du
conditionnement.
Les essais doivent tre mens en utilisant comme organismes de test les souches
suivantes :
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (souches quivalentes : CIP 82.118,
NCIMB 8626, NBRC 13275, KCTC 2513) ;
Staphylococcus aureus ATCC 6538 (souches quivalentes : CIP 4.83, NCTC
10788, NCIMN 9518, NBRC 13276, KCTC 1916) ;
Escherichia coli ATCC 8739 (souches quivalentes : CIP 53.126, NCIMB
8545, NBRC 3972, KCTC 2571, NCTC 8545) ;
Candida albicans ATCC 10231 (souches quivalentes : IP 48.72, NCPF
3179, NBRC 1594, KCTC 17205) ;
Aspergillus niger / brasiliensis ATCC 16404 (souches quivalentes : IP
1431.83, IMI 149007, NBRC 9455, KCTC 6317) ;
La Pharmacope europenne 5.1.3 (01/2011 : 50103) recommande de tester
Escherichia coli pour les prparations orales.
48
Avant tout challenge test, la qualit microbiologique du produit doit tre dtermine car
une flore initialement prsente dans le produit interfrera avec les rsultats de l essai.
Selon les rsultats du test, deux profils de produits sont dfinis selon le Tableau 9
(inspir de la norme NF T 75 611:2007). Un produit de profil A satisfait aux exigences de
protection antimicrobienne. S il rpond aux critres du profil B, des lments de
l analyse de risques doivent justifier un niveau de matrise du risque microbiologique
conforme conditionnement, p(, activit de l eau aw . Si la formule ne correspond pas
aux profils A ou B, le responsable de la mise sur le march du produit devra apporter les
arguments de matrise renforce du risque microbiologique du produit.
Il est noter qu en fonction de la norme applique AFNOR NF T :2007,
Pharmacope europenne 7.0 01/2011 :50103 ou USP32-NF27), certaines variantes
sont observes dans les critres d acceptation [96].
Tableau 9 : critres dvaluation de lefficacit antimicrobienne dun produit cosmtique
Bactries Levures Moisissures

T7j T 14j T 28 j T7j T 14 j T 28 j T 14 j T 28 j
Profil A logd) PA a) (PA) c) log PA (PA) PA PA
Profil B b) log PA b) log PA PA PA
a) Pas daugmentation de la population microbienne par rapport au temps prcdent
b) Cases comportant un critre correspondant des dterminations facultatives
c) Les critres entre parenthses sont considrer comme informatifs
d) Rduction du nombre de microorganismes viables
6 CONCLUSION
Dans le cadre du dveloppement d un produit cosmtique, il est primordial de dfinir au
pralable quel mode de conservation sera privilgi. Ds le dpart, il est ncessaire de
prvoir la mise l chelle, les conditions de fabrication, le packaging. Suivant ces
critres, plus ou moins de solutions seront envisageables. Les solutions les plus simples
et les moins contraignantes sont l utilisation des conservateurs de synthses prsents
dans l annexe V de la rglementation cosmtique. Mais de plus en plus d industriels
privilgient aujourd hui les alternatives en utilisant notamment des matires premires
aux proprits antimicrobiennes notoires. Encore peu de solutions naturelles et
efficaces sur les 5 souches microbiennes testes lors du challenge test sont disponibles
sur le march. Alors que les huiles essentielles sont trs tudies pour ce potentiel
d activit, les extraits aux solvants restent peu valoriss.
De plus, bien que de nombreux facteurs soient connus pour influencer l activit de l eau
et ainsi affecter les dveloppements microbiens, le nombre de donnes prcises
permettant au formulateur de dvelopper un produit matris par ce facteur
d autoconservation est extrmement limit.
49
PARTIE II : ENCAPSULATION
L encapsulation est une technique qui consiste piger ou enrober une substance ou un
mlange de substances spcifiques l aide de matriaux adapts [107]. Les substances
encapsuler peuvent tre liquides, solides ou gazeuses [102,103]. Ce sont souvent des
principes actifs sensibles ou instables certains facteurs environnementaux ayant une
action cible (vectorisation), ou bien des substances dont on souhaite modifier l tat
transformation d un liquide en solide par exemple [104].
Les matriaux enrobants, quant eux, sont essentiellement des polymres d origine
naturelle ou synthtique, ou des lipides, mais parfois galement d autres molcules. Les
particules obtenues prsentent deux types de morphologie :
Soit une capsule, c est--dire une particule rservoir constitue d un cur de
matire active liquide plus ou moins visqueux ou solide, entour d une paroi
solide continue de matriau enrobant ;
Soit une sphre, c est--dire une particule constitue d un rseau polymrique
ou lipidique continu formant une matrice dans laquelle se trouve finement
disperse la matire active l tat de molcules, de fines particules solides, ou
encore de gouttelettes de solution [105].
C est dans les annes qu ont t dvelopps les premiers produits encapsuls, avec la
fabrication du papier copie sans carbone, sur lequel tait fix des microcapsules
contenant de l encre. Sous l effet d une pression, les capsules s ouvraient, librant ainsi
les actifs protgs [106,107,108].
Aujourd hui, les applications de l encapsulation sont nombreuses et touchent des
domaines tels que les industries chimiques, agro-alimentaires, pharmaceutiques,
cosmtiques, nutraceutiques, l agriculture, les textiles ou encore la peinture
[107,109,113,123]. Suivant les cas, l encapsulation a pour objectif d assurer la
protection, la compatibilit et la stabilisation d une matire active dans une formulation.
Elle permet de raliser une mise en forme adapte, d amliorer la prsentation d un
produit ou encore de masquer un got ou une odeur. Enfin, l encapsulation peut
modifier et matriser le profil de libration d une matire active pour obtenir, par
exemple, un effet prolong ou dclench (Tableau 10).
Le choix d un procd d encapsulation particulier et du type de formulation aura des
consquences directes sur la morphologie, la taille, la structure des microparticules, ou
encore sur la teneur en matire active, la stabilit et sur le profil de libration de l actif
[105,113].
Typiquement, la matire active protger est une molcule unique. Chaque molcule
encapsuler exige un dveloppement nouveau et spcifique. En effet, il n existe pas de
systme universel permettant d encapsuler toutes sortes d actifs. Dans le cas o la
matire active protger est un complexe de molcules, tels que le sont les extraits
naturels, les contraintes et difficults de dveloppements se trouvent accrues. La nature
50
trs varie des diffrents composs (hydrophilie/hydrophobicit, diffrences de masse

molculaires, fonctions chimiques diverses cre des diffrences d interaction avec le
ou les matriaux de recouvrement, gnrant par exemple des rendements
d encapsulation ou des cintiques de fuites htrognes.
Un aperu gnral de l encapsulation spcifique la cosmtique ainsi qu un descriptif

des techniques d encapsulation les plus connues, de leurs principes et caractristiques
permettront de comprendre le choix ralis (Tableau 13).
51
Tableau 10 : exemples dapplication de lencapsulation
Domaine dapplication Objectifs Exemples Rfrences
- Visuel et marketing avec une libration de l actif

l utilisation millicapsules
- Libration retarde et activit optimise de l actif encapsul
Cosmtique (microcapsules) Encapsulation de vitamines sensibles [110,111,112]
- Optimisation de la solubilit des actifs l oxydation
- Protection d actifs sensibles temprature, air,
incompatibilit avec d autres actifs
Encapsulation de la morphine pour
- Libration contrle et cible des principes actifs rduire sa concentration locale et
prolonger son action
Pharmaceutique - Protection des principes actifs instables et libration cible [113,114,115]
Encapsulation de l aspirine pour
- Amlioration de la biodisponibilit masquer le got et librer l actif dans
l environnement intestinal.
- Amlioration des proprits des peintures (proprits Encapsulation de biocides pour
[116,117,118,
Peinture adhsives, luminescence des pigments) prolonger la dure de vie des
119]
- Augmentation de la dure de vie des peintures peintures
Encapsulation d armes dans les

- Encapsulation d ingrdients se librant au cours de la
Agroalimentaire chewing-gums, protection du sel et du [113,120,121]
consommation
sucre contre l humidit
- Encapsulation d actifs se librant lors des frottements entre Encapsulation de rpulsifs contre les
Textile [123,122]
le vtement et la peau insectes, d actifs amincissants
- Amlioration du dpt et/ou de la pntration des actifs

Encapsulation de pesticides et
Agrochimie sur les lments cibles [123,124]
insecticides
- Protection des actifs contre une dgradation prmature
52
1. LENCAPSULATION EN COSMETIQUE
L encapsulation prsente plusieurs intrts pour l industrie cosmtique. L objectif peut
tre de protger les proprits de certains actifs tout au long de la dure de conservation
du produit fini. Ces systmes peuvent par exemple faire office de barrire physico-
chimique contre les lments pro-oxydants tels que les radicaux libres, l oxygne ou
encore les rayons UV [125]. Des actifs qui y sont sensibles sont alors protgs via
l encapsulation. L intrt peut galement tre d optimiser la libration et donc
l activit du principe actif par une action cible et/ou retarde. Dans une optique de
rduction des cots pour l industriel, l encapsulation de parfum ou d actifs coteux
permet de diminuer les concentrations introduites sans affecter l efficacit du produit
fini. Enfin, la mise sur le march de nouveaux concepts renforce l image de l innovation
[115].
La teneur en matire active (ou taux d encapsulation) peut tre trs leve dans les
microcapsules, de l ordre de % (masse de matire active/masse de
microparticules). Au contraire, les teneurs habituellement rencontres dans les
microsphres sont plus faibles, de l ordre de %, mme si, dans certains cas, on
peut atteindre des teneurs de 50 %. En terme de contenance, le systme microcapsule
est bien sr beaucoup plus intressant que la microsphre [126].
2. PROCEDES CLASSIQUES DENCAPSULATION

L tendue des domaines d application de l encapsulation tant large et diversifie,
nombreuses sont les techniques dcrites dans la littrature. Chaque technique
d encapsulation rpond des critres bien dfinis. Ainsi le choix d une technique se fera
en fonction de la nature de l actif encapsuler, de la taille de particule souhaite, de
l application envisage cosmtique, pharmaceutique, agroalimentaire, peinture , de la
vitesse et des conditions de libration prvues, des rendements d encapsulation
ncessaires, mais galement des contraintes de fabrication et de cot.
2.1. Procds chimiques

2.1.1. La polymrisation
Deux monomres ractifs sont dissous sparment dans des solvants immiscibles et
mlangs afin de former une mulsion H/E (huile dans eau) ou E/H (eau dans huile). Les
momomres peuvent alors ragir l interface huile/eau formant une membrane
polymrique [130,127].
Cette technique d encapsulation prsente un certain nombre de contraintes et limites.

L encapsulation de protines est problmatique car ce type d actif peut participer la
raction de polymrisation, modifiant ainsi leur activit biologique. Ensuite, il est
53
souvent difficile de contrler la raction de polymrisation : le rendement et la qualit

de la membrane obtenue par polymrisation interfaciale dpendent de nombreux
facteurs comme la nature des monomres ractifs, les conditions de raction, les
concentrations en monomres, la temprature, la qualit du mlange [130,128]. De plus,
les tapes de lavage requises pour liminer les monomres, solvants organiques,
tensioactifs et produits secondaires en excs sont trs coteuses. Ces lavages rpts
peuvent provoquer une perte en actifs hydrosolubles encapsuls. Enfin, les changements
de p( engendrs par la formation d acide chlorhydrique, sous-produit de la raction du
chlorure d acide et de l amine, peuvent dgrader le principe actif [130,129]
2.2. Procds mcaniques

2.2.1. Le spray drying ou schage par atomisation
Le spray drying est largement utilis dans l industrie agro-alimentaire et

pharmaceutique. Cette technique permet, par exemple, de protger des actifs de
l oxydation et de transformer des liquides en poudres [130,104].
Le principe rside dans le schage rapide sous air chaud d un liquide contenant un
certain taux de matire sche) pulvris sous forme de fines gouttelettes afin de gnrer
une poudre. Un polymre hydrophile ou hydrophobe est tout d abord dissous dans un
solvant appropri. Le solvant doit tre volatil : c est en gnral l eau avec ventuellement
un co-solvant et parfois un solvant organique, mais cela demande une conception
particulire de l appareillage. L actif, solide ou liquide, est ensuite dissous, suspendu ou
mulsifi dans ce solvant. Des ingrdients tels que des tensioactifs, sels, ajusteurs de pH
peuvent galement tre ajouts afin de faciliter la solubilisation/dispersion des produits
ou encore pour agir sur le mcanisme de libration du produit fini. Puis le mlange
obtenu est pulvris l aide d une buse, d un disque rotatif ou d une turbine conduisant
l obtention de microsphres solides prcipites [130,131]. Parfois, le procd inclut
l utilisation de plastifiants pour former des microcapsules sphriques rgulires et de
surface lisse, en rduisant la rigidit des chaines de polymre [130,132].
Le schage des gouttelettes permet la formation de particules de taille de 10 100 m,

avec un taux d actif allant jusque -50 %. Les matriaux matriciels sont souvent des
solutions de polysaccharide tel que la gomme d acacia qui est la plus utilise
slectionns pour leur bonne solubilit associe une faible viscosit [107,133, 134].
2.2.2. Le spray cooling ou prilling (glification/conglation de gouttes)
La technologie du spray cooling rside sur le mme principe que le spray drying, ceci
prs qu il ne s agit pas de schage sous air chaud mais de refroidissement rapide de
gouttelettes constitues d une cire haut point de fusion. Le principe est donc bas sur
la solidification des cires [109]. La matrice d encapsulation doit avoir un point de fusion
trs suprieur la temprature de l air de refroidissement ainsi qu un pic de
solidification le plus fin possible. L actif peut tre solide ou liquide, hydrophobe ou
54
hydrophile. L ajout d additif peut faciliter la solubilisation/dispersion des produits, mais

galement amliorer la solidification, agir sur le mcanisme de libration du produit fini
ou encore amliorer la stabilit de la matrice d encapsulation (ajout d antioxydant par
exemple).
Dans le cas d un actif hydrophile, la ralisation d une mulsion chaud est ncessaire
[135,136]. Les huiles choisies sont souvent raffines et hydrognes car elles possdent
des points de fusion levs ainsi que des profils de solidification plus fins. De plus,
l hydrognation offre une rsistance non ngligeable l oxydation.
Les microsphres obtenues ont une granulomtrie qui varie de 100 400 m, avec un
taux d actif pouvant atteindre 40 60 %.
2.2.3. Le lit dair fluidis
Le procd d enrobage en lit fluidis est une technologie trs efficace pour l enrobage en
couche uniforme de particules solides (granuls, cristaux) [104]. Il est galement
possible d enrober des matires actives liquides aprs absorption par des supports
particulaires poreux ou en de de leur temprature de solidification.
Ce procd d encapsulation se dcompose en trois temps :
Fluidisation de la poudre de particules ;
Pulvrisation du matriau d enrobage sur les particules ;
Schage de l enrobage.
La fluidisation consiste placer une colonne de particules dans un courant d air
ascendant, jusqu obtenir une suspension fluide, sans transport significatif des
particules. Ces trois oprations se droulent dans la chambre cylindrique verticale d un
lit fluidis [107, 105].
Cette technique est avantageuse car une trs grande varit de matriaux de
recouvrement sont utilisables tels que des polysaccharides, des protines, des
mulsifiants, des matires grasses, des formulations complexes, des enrobages poudres,
etc. Cependant, les possibilits de libration sont plus difficilement contrlables qu avec
d autres technologies et les chocs entre les particules en cours de procd peuvent
provoquer une agglomration [104]. Les particules obtenues ont une taille pouvant
varier de 0,3 10 mm [107,137].
2.2.4. Lextrusion
L encapsulation par extrusion est utilise quasi exclusivement pour des substances
volatiles et instables telles que des armes dans des matrices d hydrate de carbone
l tat vitreux [104, 107]. Une mthode classique consiste mlanger la matire active
avec des poudres de polymre thermoplastique. L ensemble est fondu et extrud afin de
former des tubes filamenteux qui sont refroidis et dcoups en cylindres de petite taille
(0,5-1,5 mm puis rods de manire mcanique afin d obtenir des objets de formes
55
sphriques [138]. Cette mthode implique donc que le principe actif soit stable
thermiquement la temprature d extrusion qui se situe gnralement entre et
150 C. Il est galement possible d adapter la mthode basse temprature afin
d encapsuler des microorganismes et des enzymes dans des matrices spcifiques.
L un des inconvnients de la mthode est la taille des particules qui demeure assez large
(de 200 1000 m , ce qui limite les applications [104, 105].
2.2.5. Rapid Expansion of Supercritical Solutions (RESS) et Aerosol Solvent

Extraction System (ASES)
A l tat supercritique, un fluide possde des proprits intermdiaires entre celles d un

gaz et celles d un liquide. )l prsente une viscosit et une densit faible ainsi qu un
pouvoir de solvatation, une diffusivit et un taux de transfert de masse levs [104]. Les
fluides supercritiques (FC), en particulier le dioxyde de carbone, sont utiliss depuis
quelques annes pour l encapsulation de matriaux sensibles la chaleur, selon un
procd trs similaire au spray drying. L un des grands avantages de cette mthode est
qu elle permet de s affranchir de la toxicit des solvants organiques utiliss dans des
procds classiques.
Diffrents procds utilisant les FC sont dvelopps :
Le procd d expansion rapide de solutions supercritiques RESS
(Rapid Expansion of Supercritical Solutions) ;
Le procd d extraction de solvant d arosols ASES Aerosol
Solvent Extraction System) ;
Le procd d enrobage par sparation de phases.
2.2.6. Rapid Expansion of Supercritical Solutions (RESS)
L actif ainsi qu un polymre sont dissous dans le FC haute pression puis prcipits par
rduction de la densit du solvant suite une dcompression rapide [130, 139]. La
dpression brutale provoque une expansion du FC ce qui entraine la prcipitation du
matriau encapsulant et de l actif sous forme de microsphres [104, 105]. L un des
grands avantages de la mthode est qu aprs expansion, le FC est l tat gaz ; le solide
form est donc pur de tout solvant [130]. De plus l utilisation de tensioactifs n est pas
requise.
Les limites de la technique sont que le dioxyde de carbone n a pas de moment dipolaire
et prsente une faible polarisabilit, ce qui signifie que seuls des matriaux de
recouvrement hydrophobes peuvent tre dissous dans le dioxyde de carbone.
Nanmoins, certains polymres hydrophiles tels que des protines (glatine, protines
de bl, etc) et des polysaccharides (celluloses, HPMC1, CMC2, etc) peuvent gonfler dans le
dioxyde de carbone supercritique et donc tre utiliss comme matriaux
1 HPMC : Hydroxypropylmethylcellulose
2 CMC : Carboxymethylcellulose
56
d encapsulation [104]. La mthode reste nanmoins rserve l utilisation de polymres

de faible poids molculaire.
2.2.7. Aerosol Solvent Extraction System (ASES)
La mthode est galement appele SAS (Supercritical Antisolvent Crystallization) ou

PCA Precipitation with a Compressed fluid Antisolvent . Tout d abord, le matriau
d enrobage est dissous dans un solvant organique adquat. En effet, ce solvant devra
tre soluble dans le fluide l tat supercritique. Ensuite, le principe actif est dissous ou
dispers dans cette solution. Puis cette prparation est atomise dans une colonne dans
laquelle circule le FC. Le solvant organique est rapidement extrait par le FC, ce qui
provoque la prcipitation du matriau d enrobage ainsi que l encapsulation de l actif
[105, 130].
Cette technique est plus flexible que la RESS concernant le choix des solvants. De plus, ce
procd autorise l utilisation de solutions de polymres plus concentres qu en RESS
ainsi que la mise en suspension de l actif. Les inconvnients de l ASES sont la
plastification du polymre par le CO2 ainsi que l agglomration des polymres de faible
temprature de transition vitreuse [104,130].
2.3. Procds physico-chimiques

2.3.1. Evaporation/extraction de solvant
Cette mthode est trs utilise pour prparer des microsphres charges d actifs varis
et est base sur l emploi d mulsion simple ou double selon le caractre hydrophile ou
hydrophobe du principe actif [130]
2.3.1.1. Emulsion simple (H/H ou H/E))
Le principe actif est dissous dans la phase disperse constitue le plus souvent d une
solution de polymre dans un solvant organique tel que du dichloromthane ou de
l actate d thyle. Les polymres synthtiques biodgradables les plus utiliss sont les
acides polylactique (PLA) et poly(lactique-co-glycolique). Selon leur poids molculaire
et/ou le ratio copolymrique des polymres, la cintique de relargage de l actif sera
affecte. Cette solution organique est alors ajoute la phase continue qui peut tre une
huile minrale (huile/huile), ou une solution aqueuse (huile/rau) contenant un
mulsifiant. L ensemble est mulsifi par agitation, homognisation ou sonication.
Enfin, le solvant organique est limin par vaporation ou extraction.
Dans le cas de l vaporation, le solvant organique volatile pntre lentement la phase
continue puis s vapore de cette phase pression atmosphrique, provoquant ainsi un
durcissement de l mulsion forme par prcipitation du polymre. Il est possible
d acclrer l vaporation en faisant le vide ou en augmentant lgrement la temprature.
57
L extraction du solvant organique plus rapide que l vaporation ncessite, quant lui,
le transfert de l mulsion dans de l eau ou un autre milieu. Les microsphres obtenues
par extraction sont plus poreuses que celles rcupres par vaporation. La porosit
accrue implique une libration plus rapide du principe actif. Les microsphres sont
rcupres par centrifugation ou filtration puis lyophilises [130,140,141].
2.3.1.2. Emulsion double (E/H/E)
Une solution aqueuse du principe actif est tout d abord mulsifie dans une solution de
polymre dissous dans un solvant organique. Cette mulsion eau/huile est ensuite
ajoute dans une phase aqueuse contenant un mulsifiant afin de former l mulsion
eau/huile/eau. Enfin, le solvant organique est limin par extraction dans la phase
aqueuse externe puis vapor [130].
L encapsulation par vaporation/extraction de solvant permet d obtenir des particules
de taille contrle allant du nano au micromtre. Les rendements sont trs variables en
fonction de la nature des actifs, des polymres utiliss et du protocole appliqu
[140,141].
2.3.2. La glation ionotropique
La glation ionotropique est base sur la capacit de rticulation de polylectrolytes en

prsence de certains ions pour former des hydrogels. La glation de l alginate en
prsence de calcium est le cas le plus connu. L alginate est le polyanion le plus utilis
dans le domaine de l encapsulation. )l est compos d un enchanement d units d acides
-D-mannuronique et -D-guluronique lies en 14. Les cations divalents et trivalents
induisent une glation par liaison des blocs d units guluroniques de l alginate. Les
micro- ou macro-sphres sont formes par ajout, goutte goutte, d une solution
d alginate et du principe actif dans une solution de chlorure de calcium. Les ions calcium
diffusent l intrieur des gouttes d alginate, formant ainsi un rseau tridimensionnel du
polylectrolyte ioniquement rticul. Il est possible de renforcer la membrane des
capsules d alginate par ajout d un polylectrolyte de charge oppose. Par exemple, le
chitosane et le poly-L-lysine sont utiliss cet effet [130,142]. Lorsque le chitosane est
utilis comme polymre glifiant, la solution aqueuse de rception des microgouttelettes
est une solution alcaline qui insolubilise le chitosane [105].
Ce procd conduit des microparticules de distribution granulomtrique trs troite,
dans une gamme de diamtre compris entre 200 m et 800 m. Ces diamtres peuvent
tre diminus (1-500 m) en utilisant un systme de pulvrisation ou encore en passant
par un procd d mulsion puis de rticulation de la solution d alginate [130,143,144].
Le taux d encapsulation reste gnralement faible (entre 10 % et 30 % en poids) [105] ;
58
2.3.3. La coacervation
La coacervation est base sur un procd de sparation de phase d un ou de plusieurs

hydrocollodes d une solution initiale, suivi du dpt des coacervats ainsi forms autour
de l ingrdient actif en suspension ou mulsifi dans ce mme milieu ractionnel. Le
coacervat form peut encapsuler la matire active si les conditions d talement des
phases en prsence sont respectes.
L enveloppe hydrocollodale peut ventuellement tre renforce par l ajout d un agent
rticulant de nature chimique ou enzymatique appropri. Les plus utiliss sont le
formaldhyde et le glutaraldhyde [104].
Cette technique produit gnralement des capsules de 20 800 m de diamtre qui
contiennent 80-90 % de principe actif. Mais il est galement possible d envisager des
capsules de taille plus importante [145].
En fonction de la technique de sparation de phase envisage, on parle de coacervation
simple ou complexe.
2.3.3.1. La coacervation simple
La phase continue est compose d un polymre. La coacervation est provoque par

l addition d un non solvant [105,146,147], le changement de temprature [148,149]
et/ou l ajout d une solution d lectrolytes [150,151] ou de polymre incompatible [130].
Ce phnomne peut se drouler en milieu aqueux ou organique. Dans le premier cas,
c est un polymre hydrophile qui formera le coacervat, par exemple la glatine qui peut
tre dsolvate par addition de sulfate de sodium. Dans le deuxime cas, c est un
polymre hydrophobe qui sera dsolvat, par exemple l thylcellulose. Les particules
obtenues sont gnralement des microcapsules. Toutefois, dans certains cas, le procd
par coacervation simple permet d obtenir des microsphres. C est le cas lorsque la
proportion de substance active est faible par rapport au volume du coacervat [105].
Les procds par coacervation simple ncessitent beaucoup de savoir-faire. Toutefois,
lorsqu une mthode est bien matrise sur le plan de la formulation, elle peut tre
transpose assez aisment l chelle industrielle avec des rendements de production et
d encapsulation levs [105].
2.3.3.2. La coacervation complexe
La coacervation complexe rsulte de l interaction entre deux polylectrolytes de charges

opposes. La raction est provoque par une modification du pH. Les polylectrolytes
doivent tre suffisamment chargs pour induire des interactions lectrostatiques
suffisantes mais pas trop pour ne pas provoquer une prcipitation [152,153]. Dans un
premier temps, l actif encapsuler est dispers dans une solution aqueuse contenant les
deux polymres. Dans un second temps, la coacervation est induite par un ajustement du
pH de la solution, de faon ce que les charges positives du premier polymre
59
quilibrent les charges ngatives du second. L attraction lectrostatique des deux

polylectrolytes provoque l apparition d un coacervat mixte. Dans un troisime temps,
les gouttelettes de coacervats ainsi formes viennent s adsorber la surface de la
matire active et former un enrobage continu. Finalement, cet enrobage peut tre
consolid par rticulation des macromolcules constitutive du coacervat [108].
Les particules obtenues sont des microcapsules. Leur taille varie de quelques
micromtres quelques centaines de micromtres. Elle dpend essentiellement de la
taille initiale des cristaux ou des gouttes disperss de matire active. Dans ce deuxime
cas, la taille des capsules pourra tre ajuste en jouant sur la vitesse d agitation de
l mulsion initiale [154]. Seules les matires actives lipophiles peuvent tre encapsules
selon ce procd : huiles vgtales ou minrales, huiles essentielles Les taux
d encapsulation peuvent tre trs levs, de l ordre de % [155,156,157,158]. Une
variante cette mthode peut tre apporte pour encapsuler des matires actives
hydrosolubles. Elle consiste formuler une mulsion inverse eau/huile (E/H) puis
disperser cette mulsion dans la solution aqueuse contenant les polymres. Le coacervat
form par changement du pH vient alors se dposer sur les gouttelettes huileuses. La
difficult de cette approche rside dans la formulation d une mulsion double
eau/huile/eau (E/H/E) stable, condition indispensable une bonne encapsulation
[125,129,159].
2.3.4. Les mulsions
Figure 4 : reprsentation schmatique dmulsions simples et doubles
Une mulsion est une dispersion collodale3 de deux liquides non ou peu miscibles tels
que l eau et l huile (Figure 4), laquelle on ajoute gnralement un agent de surface
(tensioactif) [160,161]. La dispersion est ralise par cisaillement de l une des phases
dans l autre de manire former des gouttelettes dont la taille peut varier de nm
10 m. Les mulsions prsentent l intrt de solubiliser des actifs tant hydrophiles
qu hydrophobes, tout en tant biocompatibles et suffisamment stables pour les
dveloppements tudis [161].
3Dispersion de particules dans une phase continue (liquide dans liquide, solide dans liquide, liquide dans
gaz
60
Les mulsions doubles constituent des rservoirs d intrt pour une libration retarde
d actifs. Elles consistent en une phase interne mulsifie dans une seconde phase, elle-
mme mulsifie dans une phase externe qui peut tre identique ou non la phase
interne. Suivant la nature des phases, on parle d mulsion de type huile/eau/huile
(H/E/H) ou eau/huile/eau (E/H/E) [161].
Plusieurs techniques permettent l obtention d mulsions multiples. Parmi elles, les
procds directs, par tapes, par inversion de phases, ou encore par ionisation inverse.
Le choix d une technique plutt qu une autre dpendra entre autre de la nature des
phases et des agents de surface utiliss.
La rupture des mulsions multiples et la libration du ou des actifs dpendent de
plusieurs paramtres :
La substance active : taille des gouttes disperses, coefficient de partage
eau/huile, pression de vapeur ;
Les caractristiques des mulsions : pH, force ionique, viscosit, nature et
ramification des agents de surface, taille des gouttes.
La libration se fait donc soit par diffusion travers la membrane intermdiaire, soit par
rupture de celle-ci [162].
L un des grands avantages de l encapsulation par les mulsions est la facilit de mise en
uvre l chelle industrielle [161].
2.3.5. Les systmes vsiculaires
Les vsicules sont des microstructures composes d une ou plusieurs bicouches de

tensio-actifs. On distingue vsicules uni- ou multilamellaires, leur taille pouvant varier
de 30 nm quelques microns.
2.3.5.1. Les liposomes
2.3.5.1.1. Dfinition et classification
C est dans le milieu des annes que Bangham construit les premiers modles de
liposomes, alors dfinis comme de petites vsicules de phospholipides et utiliss comme
modles des membranes cellulaires [163,164]. Ils sont composs de phospholipides,
molcules amphiphiles constitues d une tte polaire et de deux chaines
hydrocarbones saturs ou non. Ces molcules peuvent s organiser en bicouches
lamellaires (Figure 5) et former des vsicules collodales uni ou multi-lamellaires
encapsulant une fraction de phase aqueuse [165]. Les liposomes sont majoritairement
composs de glycrophospholipides d origine naturelle ou synthtique, satur ou
insatur, ou de sphingolipides. Du cholestrol peut galement tre ajout afin
d amliorer la stabilit des structures. )l est aussi possible d incorporer des composs
lipidiques chargs afin de diminuer l agrgation des vsicules entre elles.
61
Figure 5 : reprsentation schmatique dun liposome unilamellaire et de lorganisation de la

bicouche lipidique
Comme dcrit dans le Tableau 11, les liposomes sont classs en quatre catgories, selon
leur mode d obtention, leur taille ainsi que le nombre de bicouches lipidiques.
Tableau 11 : classification des liposomes [166,167]
Le type d application des liposomes va donc varier en fonction des proprits physico-
chimiques que sont la taille, la composition lipidique, la charge de surface et le nombre
et la fluidit des bicouches de phospholipides [166]. La premire application des
liposomes en cosmtique date de par Louis Vuitton Moet (ennessy et L Oral
[168].
2.3.5.1.2. Intrt des liposomes en cosmtiques
Les liposomes multi-lamellaires sont les plus intressants pour des applications en
cosmtique car ils ont une activit propre sur l piderme. Leur structure multi-couche
permet de reconstituer les feuillets lipidiques intercellulaires aprs dlipidation (perte
de lipides) de la peau. Ainsi, on peut prvenir des phnomnes de peau sche et leur
utilisation est recommande dans le traitement du vieillissement cutan [169]. Cette
approche est bien sre exploite en cosmtique. Les liposomes ont d autant plus
62
d intrt qu ils peuvent vhiculer des substances effet hydratant, anti-oxydant et

autres Les effets en sont augments par rapport aux vhicules plus traditionnels
comme les mulsions, grce aux possibilits de stockage dans la couche corne [170].
Nous allons donc dans ce qui suit nous focaliser sur les MLV.
2.3.5.1.3. Mode d obtention
La mthode d obtention de MLV la plus rpandue est la mthode de Bangham [171] dite
d hydratation du film lipidique . Selon ce procd, les phospholipides sont solubiliss
dans un solvant organique (ou mlange de solvants) tel que du chloroforme par
exemple. Ce solvant est ensuite vapor, menant la formation d un film
phospholipidique. Puis ce film est hydrat par ajout d une solution aqueuse sous
agitation afin de former les liposomes. Les actifs hydrophiles sont ajouts la phase
aqueuse, tandis que les actifs hydrophobes sont incorpors dans le solvant organique
[172].
Cette mthode simple prsente nanmoins l inconvnient d utiliser des solvants
organiques. De plus, la formation des liposomes se fait en prsence d un excs de phase
aqueuse, ce qui conduit des rendements d encapsulation faibles dans le cas des
composs hydrophiles.
2.3.5.2. Les vsicules multilamellaires types oignons
2.3.5.2.1. Dfinition et mode d obtention
La technologie des oignons encore appels sphrulites est ne de l tude des phases
lamellaires tensioactives sous cisaillement contrl. Une phase lamellaire est compose
d un empilement rgulier de bicouches de tensioactifs spares par des couches d eau :
c est une phase cristal liquide smectique A . Parfois, un compos supplmentaire, telle
qu une huile, gonfle la bicouche de tensioactifs. Une bicouche est un assemblage
organique constitu de deux monocouches o les molcules organiques sont alignes
cte cte. Les ttes hydrophiles sont toutes du mme ct et les queues hydrophobes
de l autre. Dans une bicouche, les parties hydrophobes des deux couches se font face
tandis que les parties constitues des ttes hydrophiles sont au contact de la phase
aqueuse. La distance entre les bicouches est appele pas lamellaire [173]. Suivant le
ratio tensioactif/phase aqueuse, le pas lamellaire varie. Lorsque la quantit de phase
aqueuse augmente, le pas lamellaire s accroit, gnrant un gonflement des bicouches
lamellaires. A partir d une certaine composition, le pas lamellaire atteint un maximum :
la limite de gonflement des bicouches. Toute phase aqueuse ajoute en plus sera en
excs, gnrant l apparition d un systme diphasique phase lamellaire et phase aqueuse
en excs) [174,178].
Lorsqu elle est soumise un cisaillement, la phase lamellaire monophasique c est dire
sans excs aqueux ou encore en limite de gonflement) subit une succession de
transformations d intrt. En particulier, une certaine vitesse de cisaillement, les
membranes sont rompues et la phase s organise spontanment en vsicules
63
multilamellaires de la mme taille [113,174]. Aprs cette tape de cisaillement, les

oignons sont au contact les uns des autres, formant une phase compacte. Ils se
diffrencient des MLV classiques par leur mode de prparation mais aussi par leur
structure ; une succession de bicouches jusqu au cur de la vsicule. )ls peuvent alors
tre disperss par ajout d un excs d eau afin de donner une dispersion collodale
(Figure 6). En fonction de la formulation (ex : type de tensioactif), et de la vitesse de
cisaillement, la taille des vsicules varie entre 0,1 et plus de 50 m. Les oignons sont
capables d encapsuler une grande quantit de composs hydrophobes au sein des
bicouches, ou hydrophiles entre les bicouches lamellaires. Le temps de libration de
l actif dpend en particulier de la taille de la molcule [174].
Figure 6 : reprsentation schmatique de lorganisation compacte des oignons puis de leur

dispersion dans leau
La microscopie lectronique transmission (MET), et notamment la cryo-MET (MET

quip d un systme de prparation d chantillon par conglation-lyophilisation),
permet d observer ces structures bien spcifiques, comme le montrent les photos Figure
7.
Figure 7 : observations au Cryo-MET de lorganisation concentrique lamellaire doignons.
L obtention d oignons de taille homogne n est possible que si la phase lamellaire est
soumise un cisaillement constant homogne dans l espace [175]. L un des dispositifs
qui runit ces conditions est la cellule dite de Couette, constitue de deux cylindres
concentriques en rotation constante l un par rapport l autre, o le cisaillement est
dfini par le rapport de la vitesse de dplacement relative divise par la distance entre
64
les cylindres (Figure 8). Un autre type de dispositif est la cellule de type plan/cne, o
un cne dont la pointe est dirige vers un plan, et dont l axe est perpendiculaire ce
plan, tourne une vitesse angulaire constante distance du plan [175].
Figure 8 : reprsentation schmatique dune cellule de couette. Lchantillon est cisaill entre les
parois de deux cylindres coaxiaux. Le cylindre intrieur est fixe alors que le cylindre extrieur
tourne vitesse constante.
Les vsicules multilamellaires de tensioactifs, en particulier les vsicules structure en

oignon, sont des systmes qui peuvent encapsuler des actifs, en crant un milieu
intrieur diffrent du milieu extrieur, au sein duquel sont retenus les principes actifs.
La rtention de l actif l intrieur de la vsicule a deux origines :
Thermodynamique : la diffrence d affinit de l actif entre le milieu extrieur
et le milieu intrieur entraine son partage entre les deux milieux.
Cintique : Chaque membrane base de tensioactifs forme une barrire de

diffusion qui ralentit le passage et donc la fuite vers l extrieur de l actif. Ce
mcanisme est d autant plus efficace que la masse molaire de l actif augmente,
car le coefficient de diffusion sera faible (M > 1000 g/mol)
Le moyen le plus efficace de ralentir la libration de l actif dans le temps et de jouer sur
la cintique de fuite.
2.3.5.2.2. Intrt des oignons
Prsentant une structure proche des MLV, les oignons possdent leurs propres
caractristiques :
Une mthode de prparation ne ncessitant pas de solvant organique ;
Un taux d encapsulation lev ;
Un arrangement lamellaire concentrique dans laquelle les bicouches de
tensioactifs sont spares par une distance bien prcise ;
La capacit encapsuler des molcules hydrophiles et hydrophobes.
Les inconvnients de ces structures sont notamment leur instabilit thermodynamique
en dispersion et leur incompatibilit avec certains tensioactifs.
65
2.3.5.2.3. Actifs encapsuls dans les oignons
De nombreux actifs ont dj t encapsuls dans ces structures multilamellaires. Le

Tableau 12 en prsente quelques exemples.
Tableau 12 : exemples dactifs encapsuls dans les onions
Rendements
Principes actifs Rfrences
dencapsulation
Trametes versicolor laccase 54-65 % [176]
Enzymes Glucose oxydase Environ 80 % [177,178]
Phosphatase alcaline 75-90 % [113]
Oxyde de fer Jusque 75 % [179]
-Fe2O3 75 5 % [180]
Cu2+ (Cu2O) 80 % [174]
Nanoparticules
Nitrate d indium et chlorure
- [181]
d tain
KAuCl4 - [182]
Sumatriptan succinate
Environ 90 % [183]
(antimigraineux)
Oligonuclotides Jusque 80 % [184]
Ligands Arg-Gly-Asp - [185]
ADN - [186,187]
Principes actifs
Albumine 30-61 % [188,189]
pharmaceutiques
Calcine 13-66 % [188]
Rouge de mthyle, rouge de
- [190]
chorophnole, ibuprofen
B-sous unit de la toxine Shiga - [191]
Antignes protiques > 50 % [192]
Plusieurs acides, de l acide
Acides - [193]
actique l acide dodcanoque
Ions Cl-, H+ - [194]
Colorant Amaranth 20-85 % [195]
3. CONCLUSION
Sans tre exhaustif, cet aperu des grandes techniques d encapsulation rsum dans le
Tableau 13 montre que les possibilits sont nombreuses mais que chaque procd
gnre des profils de capsules qui lui sont propres. Les proprits physico chimiques du
ou des principes actifs encapsuler sont dterminantes dans le choix de la technique
d encapsulation privilgier. Les contraintes d quipement associes certains
procds mcaniques notamment peuvent aussi influencer les choix. Enfin, l objectif
66
de l encapsulation ainsi que le type de relargage souhait terminent d orienter la

slection des procds adquats.
67
Tableau 13 : rcapitulatif des diffrentes techniques dencapsulation courantes avec leurs avantages, inconvnients et spcificits.
Rendements Nature des actifs

Procds Technique Avantages Inconvnients Rfrences
dencapsulation encapsuls
Perte de matriel importante par
adhrence aux parois de la
Simple, rapide, conomique, chambre de schage Hydrophile ou
Schage par atomisation [104,130,
facilement transposable et sans Non applicable aux systmes de Jusque 40-50 % hydrophobe,
(spray drying) 196]
ractions chimiques viscosit trop leve liquide ou solide
Consommation d nergie leve
cause de l vaporation de l eau
Particules denses et non poreuses Tempratures de procds pouvant Hydrophile ou
Glification/conglation affecter les actifs [109,135,13
Absence de solvant Jusque 40-60 % hydrophobe,
de gouttes (spray cooling) 6]
Temps de procds courts Agglomration liquide ou solide
Granulomtrie au niveau industriel

leve
Absence de raction chimique Agglomration
Mcaniques Enrobage en lit dair [104,105,10
Cots de procd et de maintenance Epaisseur de membrane souvent Variable Solide
fluidis 7,137]
faibles faible
Consommation d nergie leve
(vaporation eau)
Taille de particules importante :
Contrle prcis de la forme et de la 200-1000 m
taille des capsules Hydrophobe [104,105,10
Extrusion Non applicable aux actifs trop Jusque 40 %
Haut degr de stabilit des capsules essentiellement 7,115]
en milieu formul sensibles, notamment sensibles
l oxydation.
Absence de solvants organiques et de Limit aux polymres de faibles
RESS Variable Hydrophobes [104,130]
tensioactifs poids molculaires
Absence de solvants organiques et de Agglomration des polymres de Variable (5- Hydrophobe, [104,130,
ASES
tensioactifs faible transition vitreuse 80 %) solide 197,198]
Interaction de certains actifs dans
Contrle de la porosit et de la raction de polymrisation Liquide,
Polymrisation Variable (15- [127,128,13
Chimiques l paisseur de la paroi en fonction des Nombreux lavages ncessaires hydrophile ou
interfaciale 100 %) 0]
polymres Sous produits interagissant avec les hydrophobe
actifs

Encapsulation de petites molcules
Possibilit de contrle de la cintique Utilisation de solvants organiques Hydrophiles ou
Evaporation/extraction [130,140,14
de relargage grce au PLGA toxique Variable hydrophobes,
de solvant 1]
Utilisation de polymres Prsence de solvants rsiduels solides ou liquides
biodgradables et biocompatibles
Mise l chelle industrielle Hydrophiles ou
complique hydrophobes, [104,105,13
Glation ionotropique Mise l chelle du laboratoire aise 10-30 %
Porosit leve d o une fuite Solides, visqueux 0]
rapide des actifs ou liquides
Distribution de taille troite
Agglomration, utilisation de
Pour l ajout de non-solvant : absence Variable (6- Majoritairement [104,105,14
Coacervation simple solvant dans certains cas
de contact entre la phase continue et 99 %) hydrophobes 5,199]
l actif
Distribution de taille troite
Physico- Agents rticulant classiques Majoritairement
chimiques (auts rendements d encapsulation toxiques: glutaraldhyde ou
Coacervation simple ou hydrophobes,
Conditions douces (absence de formaldhyde Environ 80 % [104,105]
complexe possibilit
solvants organique et temprature Gamme de pH limite hydrophiles
ambiante)
Risque de dgradation des actifs
Absence de solvants organiques
sensibles la chaleur car ncessit
Emulsions Possibilit d encapsuler des actifs Hydrophiles ou
de chauffer les phases Variables
doubles/multiples hydrophiles et hydrophobes en hydrophobes
mulsionner (dans la plupart des
simultan
cas)
Encapsulation simultane d actifs
Utilisation de solvants organiques
hydrophiles et hydrophobes Hydrophiles : 5-
Faible rendements d encapsulation
Augmente l efficacit des principes 15 % pour les Hydrophiles et
Liposomes des actifs hydrophiles [200]
actifs SUV, jusque 60 % hydrophobes
Incompatibilit avec certains pour les MLV
Utilisation de molcules
tensioactifs.
constituantes de la structure cutane

hydrophiles et hydrophobes
Instabilit thermodynamique en
Augmente l efficacit des principes
Vsicules multilamellaires phase aqueuse Hydrophiles et
actifs Variables [223]
type oignons Incompatibilit avec certains hydrophobes
Utilisation de molcules
tensioactifs.
constituantes de la structure cutane
(auts rendements d encapsulation
CONCLUSION
CONCLUSION
Quantits d tudes ont dmontr l activit antimicrobienne et antifongique de certaines

familles de molcules que l on retrouve en particulier dans les huiles essentielles, soit
des molcules volatiles. Nanmoins, leur utilisation en tant que conservateur d un
produit cosmtique peut se montrer problmatique. En effet, leur odeur marque est
parfois rdhibitoire pour une utilisation cosmtique, et la prsence d allergnes, sources
de ractions cutanes, voire d allergies de contact, souvent limitante. Aussi nous a-t-il
sembl judicieux de concentrer nos travaux de recherche sur le potentiel antimicrobien
d extraits vgtaux dont les familles de molcules non volatiles responsables de l activit
antimicrobiennes auront t tablies au pralable et de travailler la formulation de ces
extraits en tant que conservateur cosmtique. En effet, peu d tude portant sur l activit
antimicrobienne d extrait vgtaux sont suffisamment compltes pour proposer un
produit fini conservateur efficace.
Les faits montrent galement que les conservateurs rfrencs cosmo-standard
prsentent bien souvent une activit moins importante que leurs rfrants synthtiques
tels que les parabnes par exemple. Enfin, les extraits conservateurs, mlanges de
nombreuses molcules doivent tre incorpors en concentration importante pour
esprer atteindre une efficacit comparable aux molcules pures. Afin de palier cet
inconvnient prvisible, plusieurs voies ont t tudies et combines. Dans un premier
temps, la recherche bibliographique a montr que de nombreux facteurs de formulation
peuvent impacter le potentiel microbiostatique, voire microbicide du produit fini, mais
sans donner de solution claire au formulateur pour orienter le dveloppement de son
produit, ni donner d indication sur les paramtres les plus impactant suivant la nature
du produit. Aprs tude de ces diffrents paramtres, nous en avons choisi trois qui
nous ont paru d intrt majeur pour nos travaux.
)l apparat galement ncessaire d valuer la solubilit des extraits vgtaux aux
proprits antimicrobiennes dans l objectif de les formuler dans des matrices
cosmtiques.
La date limite d utilisation aprs ouverture des cosmtiques naturels ou biologiques est
bien souvent infrieure celle des produits classiques contenant des parabnes par
exemple. Cela dmontre que les conservateurs autoriss par COSMOS-standard ou que
les extraits naturels ou matires premires aux proprits antimicrobiennes utiliss ont
une efficacit rduite et trs limite. Afin de potentialiser l effet antimicrobien d un
extrait vgtal aux proprits antimicrobiennes, il apparat alors d intrt de dvelopper
un systme de vectorisation afin de retarder partiellement la libration des molcules
antimicrobiennes et de conserver ainsi leur biodisponibilit sur une dure prolonge et
optimise.
71
CHAPITRE II
RESULTATS ET DISCUSSION
FORMULATION COSMETIQUE
CHAPITRE II : RESULTATS ET DISCUSSION
PARTIE I : FORMULATION COSMETIQUE
INTRODUCTION
Dans le cadre de notre tude, 5 formules cosmtiques ont t slectionnes pour raliser
les essais. Le choix s est port vers des formulations varies : une lotion, un gel aqueux,
des laits et une crme. Elles prsentent la particularit d tre difficiles conserver. En
effet, elles comportent un fort pourcentage en eau (suprieur 84 % sauf pour la crme
qui en comporte 59 %). De plus, elles ne contiennent pas ou peu de matires premires
susceptibles de lutter contre ou limiter la croissance microbienne en dehors des
conservateurs ajouts.
Une premire partie de l tude a donc consist en l optimisation de ces formules tmoins
quant leur capacit limiter la croissance microbienne par diminution de l activit de
l eau aw. La deuxime partie est consacre l tude de la substitution des conservateurs
de synthse par des extraits vgtaux slectionns pour leur potentiel antimicrobien
d intrt dans des formules tmoins et des formules optimises suivant le facteur aw.
PARTIE I : OPTIMISATION DE FORMULATIONS PAR DIMINUTION DE

LACTIVITE DE LEAU
L objectif de cette premire tude a t d optimiser les formulations tmoins choisies en

diminuant leur activit de l eau. Au regard des lments bibliographiques, nous avons
choisi de suivre l impact de la concentration en glycrine et de certains glycols sur cette
valeur, puis avons valu l influence du protocole de formulation. Par la suite, nous
avons largi l tude au rle que peuvent jouer certains agents rhologiques et ajusteurs
de p( sur l aw.
1. FORMULES TEMOINS
Les cinq formules choisies sont des classiques de la cosmtique et prsentent des
caractristiques de formulation varies. Les diffrences sont notamment les
tempratures de prparation froid ou chaud , la prsence ou l absence d agent
rhologique, ou encore la prsence ou l absence d une phase grasse plus ou moins
complexe. Les proprits physico-chimiques sont alors bien diffrentes d un produit
l autre.
Les 5 formulations tmoins sont :
Une lotion tonique (Tableau 14) ;
Un lait mulsionn froid (Tableau 15) ;
Un lait mulsionn chaud (Tableau 16) ;
Un gel (Tableau 17) ;
Une crme hydratante (Tableau 18).
73
Tableau 14 : protocole de formulation de la lotion tonique tmoin
Matires premires (INCI) % Protocole opratoire

Aqua 91,51
Butylene glycol 4,00
Panthenol, propylene Glycol 0,05
A
Aqua, propylene glycol, chamomilla recutita
1,00 Incorporer B dans A
extract
sous agitation
Arnica montana extract, propylene glycol 0,50
Methylparaben, ethylparaben, propylparaben
0,60
B butylparaben, phenoxyethanol
Imidazolidinyl urea 0,25
C Aqua, rosa damascena extract 2,00 Ajouter C
Ajuster la coloration
CI 16035 (solution 0,2%) 0,03
D en versant D
Parfum 0,03 Ajouter E aprs avoir
E mlang le parfum et
PPG-1-PEG-9 lauryl glycol ether 0,60 le solubilisant
Tableau 15 : protocole de formulation du lait mulsionn froid tmoin

Aqua 87,90
A Ajouter B dans A sous
Glycerin 2,00
agitation
B Parrafinum liquidum 8,00
Sodium acrylates copolymer, parraffinum Ajouter C en fin filet
C 1,25
liquidum, PPG-1 trideceth-6 sous agitation
Methylparaben, ethylparaben, propylparaben,
0,60
D butylparaben, phenoxyethanol Conserver avec D
Tableau 16 : protocole de formulation du lait mulsionn chaud tmoin

Aqua 83,75
A Glycerin 2,00 Chauffer A 75 C
Disodium EDTA 0,10
Cetyl palmitate 1,45
Glyceryl stearate 3,45
Chauffer B 75 C puis
Ceteareth-12 1,50 mulsionner en
B
Ceteareth-20 1,50 incorporant B dans A
sous agitation
Cetyl alcohol 2,45
Parrafinum liquidum 2,00
74

0,60
C butylparaben, phenoxyethanol A 30 C, incorporer C
Incorporer D sous
D Biosaccharide gum-1 0,20
agitation
Ajuster la viscosit en
E Polyacrylamide, C13-14 isoparaffin, laureth-7 0,75 incorporant en fin filet
E sous agitation
Tableau 17 : protocole de formulation du gel tmoin

Aqua 93,84
A Chauffer A 55 C
Glycerin 4,00
Disperser B dans A
B Carbomer 0,53
sous agitation
C Triethanolamine 0,60 Ajouter C
0,60
D butylparaben, phenoxyethanol Conserver avec D
Ajuster si ncessaire le
E Triethanolamine 0,18
pH avec E
Tableau 18 : protocole de formulation de la crme hydratante tmoin

Aqua 58,92
A Chauffer A 55 C
Glycerin 4,00
Saupoudrer B en fine
B Acrylates/C10-30 alkyl acrylate crosspolymer 0,15 pluie. Bien laisser le
gel s hydrater
Polyoxyethylene (2), stearyl ether 2,00
Steareth-21, polyethoxylated alcohol 2,00
Stearyl alcohol 1,50
Glyceryl stearate 3,00
Chauffer C 75 C,
Octyldodecanol 3,00 chauffer A+ B 75 C
C
Squalane 2,50 et mulsionner C dans
A+B 75 C
Isohexadecane 3,00
Simmondsia chinensis (jojoba) seed oil 1,50
Triticum vulgare (weat) germ oil 1,50
Butylhydroxytoluene 0,05
75

Butyrospermum parkii butter 2,00
Dimethicone 1,50
Butyl methoxydibenzoyl-methane 1,00
Ethylhexyl methoxycinnamate 1,50
Dimethicone 2,00
D Triethanolamine 0,11
Verser D et E 60 C
E Isononyl isononanoate, titanium dioxide 1,25
Panthenol, propylene glycol 0,20
F
Tocopheryl 0,50
G Sodium hyaluronate 5,85
Incorporer F, G, H et I
H Parfum 0,10 30 C
0,60
I butylparaben, phenoxyethanol
Pour la ralisation de ces essais, toutes les formulations ont t conserves avec 0,6 %
de Phenochem (mlange de 4 parabnes et de phnoxythanol) ainsi que 0,25 % de
Sepicide CI (imidazolidinyl ure).
Pour chacune de ces formules ont t mesures les valeurs d aw dfinies comme valeurs
tmoins. Ces valeurs sont exposes dans le Tableau 19. A J+1, nous notons que les laits et
le gel ont une aw suprieure , une temprature d environ C l appareillage
utilis ne permet pas de fixer la temprature de mesure . D aprs les donnes
bibliographiques, les 5 microorganismes (P. aeruginosa, E. coli, S. aureus, A. niger et C.
albicans) contre lesquels les produits cosmtiques doivent tre protgs peuvent tous se
dvelopper pour une aw suprieure 0,97 25 C (Tableau 4) [46]. Ces premires
mesurent paraissent donc confirmer que ces produits sont propices aux
dveloppements microbiens. La lotion et la crme prsentent une aw trs lgrement
infrieure 0,97 26 C. Or l aw minimale de croissance de P. aeruginosa 25 C est de
0,97. Ces produits devraient donc tre moins sujets aux dveloppements de cette
bactrie.
Nous notons ensuite qu semaines, les valeurs mesures sur les produits conservs
temprature ambiante (20-25 C) varient lgrement. Une diminution systmatique de
l activit de l eau est observe. Nous pouvons penser une lgre vaporation de l eau
des produits pouvant expliquer cette baisse. De plus, nous constatons que les
tempratures de mesures sont plus basses, de l ordre de -24 C. Or l activit de l eau
dpend de la temprature car la pression de vapeur d eau d une solution dpend de la
temprature [201]. )l nous semble donc raisonnable de conclure qu C, la lotion et la
crme prsentent effectivement une aw infrieure 0,97, limitant ainsi la croissance de
P. aeruginosa, mais pas des 4 autres microorganismes. Les mesures ne permettent pas
76
de conclure sur le comportement des autres formulations vis vis de cette bactrie
Gram (-).
Tableau 19 : valeurs daw des formulations tmoins J+ ainsi qu S+ , Tamb
Mesures J+1 Mesures S+6 (6 semaines)

Formules
aw Ecart type T (C) aw Ecart type T (C)
Lotion 0,970 0,001 26,0 0,955 0,001 24,1
Lait Froid 0,973 0,001 26,5 0,952 0,004 23,5
Lait chaud 0,971 0,000 26,3 0,950 0,001 23,2
Gel 0,971 0,001 26,5 0,953 0,000 23,8
Crme 0,961 0,001 26,2 0,940 0,004 24,0
A partir de ces mesures et observations, l objectif a t de dfinir des solutions pour

abaisser l activit de l eau pour chacune des formulations afin de lutter contre la
croissance d un maximum de microorganismes.
2. IMPACT DE LA GLYCERINE ET DE GLYCOLS SUR LAW

Les glycols ont la capacit d abaisser l activit de l eau. En effet, ces molcules peuvent
former des liaisons hydrognes avec les molcules d eau [202], liant ainsi l eau prsente
dans un produit. Nous avons donc choisi de comparer l impact de la glycrine glycrol ,
du propylne glycol (propane-1,2-diol), du Zma (propane-1,3-diol), du butylne glycol
(butane-1,3-diol et de l isopentyldiol -methyl-1,3-butanediol) dont les structures
chimiques sont reprsentes dans le Tableau 20.
Tableau 20 : structures de la glycrine et des glycols tudis
Propan-1,3- Propan- Butylne

Noms Glycrine Isopentyldiol
diol 1,2-diol glycol
Structures
Dans un premier temps, nous avons test l impact de chacune des matires premires
dans l eau, diffrentes concentrations. Le protocole appliqu nomm protocole dans
le Tableau 24) pour cette premire tape a t le mme que celui des formulations
tmoins. La glycrine ou le glycol ont t pess avec l eau et homogniss avant de
mesurer l aw.
Les rsultats obtenus pour la glycrine (Figure 9 montrent qu partir de % en
glycrine, l activit de l eau est infrieure , , valeur minimale de croissance de P.
aeruginosa. A 16 % en glycrine, l aw est infrieure 0,95, valeur minimale de croissance
de E. coli. Enfin, une concentration suprieure 32 % en glycrine est ncessaire pour
rduire le dveloppement des autres microorganismes, concentration rdhibitoire pour
77
la formulation de produits cosmtiques en gnral cause des rpercussions

sensorielles, telle que l obtention de produits collants.
Figure 9 : Evolution de lactivit de leau aw en fonction du pourcentage massique en glycrine et

comparaison avec 2 glycrines biologiques 16 %. Les barres derreurs sont incluses dans les
symboles.
Nous avons ensuite compar la valeur obtenue 16 % en glycrine avec deux glycrines
biologiques commerciales prpares dans les mmes conditions. D importantes
diffrences ont t notes. En effet, alors que la glycrine tmoin prsente une aw de
0,947 , , l aw de la glycrine bio 1 est de 0,913 0,011 et celle de la glycrine bio 2
de 0,866 0,010. Cette dernire valeur est des plus intressantes car infrieure la
valeur minimale de croissance de C. albicans (0,87). Ces diffrences pourraient tre
expliques par l origine et la puret des glycrines. Par exemple, alors que la glycrine
tmoin est pure 99,5 % le reste tant de l eau [203]), la glycrine bio 2 obtenue par
fractionnement d huiles de mas et de soja est pure %. Nous pouvons donc penser
que des rsidus issus du fractionnement des huiles peuvent tre prsents dans les 2 %
restant, expliquant peut tre les diffrences de rsultats observs. Cependant, nous
n avons pas obtenu d information sur la nature de ces composs rsiduels.
Les rsultats obtenus pour les propane-diols (Figure 10) sont similaires aux
concentrations extrmes 5 % et 65 %). Entre 5 et 65 %, le propane-1,2-diol s avre
plus intressant, car les aw mesures sont infrieures celle obtenues pour le propane-
1,3-diol. Nous pouvons en dduire que la position des groupements hydroxyles sur la
chaine carbone joue un rle important pour lier les molcules d eau et que le propan-
1,2-diol est mieux stabilis dans l eau que le propan-1,3-diol.
Afin de confirmer cette observation, nous avons modlis ces molcules et compar leur
nergie de solvatation Esolv dans l eau. Pour ce faire, nous avons optimis la gomtrie
des molcules en minimisant les forces sur les atomes suivant leur environnement. En
effet, le milieu dans lequel se trouve la molcule (solubilise ou disperse) influence sa
polarisabilit et donc sa gomtrie.
78
Figure 10 : volution de lactivit de leau aw en fonction du pourcentage massique en propane-1,2-

diol et propane-1,3-diol
Dans une premire tape, nous avons donc modlis les gomtries des propan-1,2-diol
(P12D) et propan-1,3-diol P D dans un solvant l eau Figure 11). Nous avons
ensuite calcul la diffrence d nergie entre les deux molcules dans ce solvant, la
molcule la plus stable ayant l nergie la plus basse. Cette comparaison est possible car
les deux molcules ont le mme nombre d atomes. Les rsultats sont exposs dans le
Tableau 21. La diffrence d nergie calcule, -0,00400780 Ha quivaut -2,51493301
kcal/mol. Dans la classification des liaisons hydrognes, cette valeur correspond des
interactions lectrostatiques faibles (0-4 kcal/mol) [204]. Dans notre tude, nous
pouvons estimer que ce rsultat est suffisant pour conclure que le propan-1,2-diol est
mieux stabilis dans l eau que le propan-1,3-diol, confirmant ainsi nos mesures d aw.
Tableau 21 : nergies et diffrence dnergie des propane-diols dans leau, exprimes en (artree
(Ha) puis en Kcal/mol
EP12D EP13D
E(eau) (Ha) EP12D EP13D (Ha)
(Kcal/mol)
Propan-1,2-diol -269,61592327
-0,00400780 -2,51493301
Propan-1,3-diol -269,61191547
Dans une deuxime tape, nous avons calcul l nergie de solvatation des deux diols en
modlisant les gomtries des propan-1,2-diol (P12D) et propan-1,3-diol (P13D) dans le
vide. La diffrence d nergie des molcules dans chaque milieu donne l nergie de
solvatation Esolv des molcules selon l quation :
Esolv = Em1(solvant) Em1(vide)

O Em1(solvant) correspond l nergie de la molcule dans l eau et Em1(vide) l nergie de
la molcule 1 dans le vide.
79
Plus l nergie de solvatation est faible, plus la molcule est stabilise par le solvant. Le
Tableau 22 expose les nergies des propane-diols dans l eau et dans le vide ainsi que
leurs nergies de solvatation.
Tableau 22 : nergies des propane-diols de gomtries optimises dans leau et le vide, exprimes
en Hartree (Ha) puis en Kcal/mol
Esolv
E(eau) (Ha) E(vide) (Ha) Esolv (Ha)
(Kcal/mol)
Propan-1,2-diol -269,61592327 -269,59953129 -0,01639198 -10,28612494
Propan-1,3-diol -269,61191547 -269,59098870 -0,02092677 -13,13174924
Nous pouvons alors calculer Esolv comme suit :
Esolv = Esolv(P12D) Esolv(P13D) = 0,00453479 Ha = 2,8456243 Kcal/mol
Cette valeur positive semble indiquer que le propan-1,3-diol serait mieux stabilis dans
l eau que le propan-1,2-diol, ce qui est contraire aux rsultats prcdents.
Nanmoins, nous avons remarqu, lors de l optimisation, que la gomtrie du propan-
1,2-diol dans le vide tait diffrente de celle obtenue dans l eau, alors que le propan-1,3-
diol conserve la mme gomtrie quelque soit le milieu (Figure 11). En effet, dans le gaz,
nous observons la cration d une liaison hydrogne entre l hydrogne de l hydroxyle en
position C1 et l oxygne de l hydroxyle en position C2, liaison qui n existe pas lorsque la
molcule est dans l eau. La cration de cette liaison tend alors stabiliser la molcule
dans le vide, abaissant par ailleurs son nergie dans ce milieu. Nous avons alors re-
calcul l nergie de la molcule dans le vide en conservant la gomtrie obtenue dans
l eau afin de comparer rellement son comportement par rapport au propan-1,3-diol.
Bien que la gomtrie de ce dernier ne change pas du vide l eau, nous avons recalcul
l nergie de la molcule dans le vide en conservant les paramtres d optimisation dans
l eau, ceci afin de comparer rigoureusement les deux molcules dans des conditions
similaires. Les calculs obtenus ainsi sont exposs dans le Tableau 23.
Tableau 23 : nergies du propan-1,2-diol dans leau et le vide en conservant la gomtrie

optimise dans leau, exprimes en (artree (a puis en Kcal/mol
Esolv
E(eau) (Ha) E(vide) (Ha) Esolv (Ha)
(Kcal/mol)
Propan-1,2-diol -269,61592327 -269,5923041 -0,02361918 -14,82126238
Propan-1,3-diol -269,61191547 -269,5903711 -0,02154438 -13,51930545
Nous notons alors que l nergie de solvatation du propan-1,2-diol est bien plus basse
que la prcdente. Nous remarquons galement que, bien que la gomtrie du propan-
1,3-diol ne varie pas de l eau au vide, l nergie de la molcule optimise dans le vide,
80
avec les contraintes dfinies dans l eau ou non, varie. Nous pouvons alors recalculer
Esolv :
Esolv = Esolv(P12D) Esolv(P13D) = , Ha = , Kcal/mol
Ce nouveau rsultat confirme cette fois la plus grande stabilit du propan-1,2-diol dans
l eau que le propan-1,3-diol. Ce rsultat vient appuyer les premiers calculs ainsi que les
mesures d aw effectues.
Propan-1,2-diol Propan-1,3-diol
Dans leau
Dans le vide
Figure 11 : optimisation gomtrique des ( gauche) propan-1,2-diol et ( droite) propan-1,3-diol

dans en haut leau et en bas dans le vide.
Les mesures d aw ayant t effectues une temprature de 23 C, nous pouvons

considrer que le propane-1,3-diol permet de limiter la croissance de P. aeruginosa et E.
coli partir de 16 % et au del de 32 % pour les autres microorganismes, alors que le
propane-1,2-diol s avre d intrt ds % avec une aw de 0,882 0,005.
Par comparaison avec la glycrine tmoin, nous observons que les deux propane-diols
donnent de meilleurs rsultats 16 %, alors qu %, c est la glycrine qui donne la
valeur d aw la plus basse.
Les mesures effectues ( 23 C partir du butylne glycol et de l isopentyldiol Figure
12) indiquent que ce dernier se montre plus efficace pour abaisser l aw, sauf la
concentration la plus leve teste, savoir 80 %. Il est possible que la prsence des
groupements mthyles influence la stabilit des interactions avec les molcules d eau
(effet iceberg) [205]. Nous remarquons qu aux concentrations suprieures %, ces
deux glycols se montrent systmatiquement moins intressants que la glycrine et les
propanediols. Par contre, l isopentyldiol se montre particulirement efficace et %
avec des valeurs d aw de 0,867 0,028 et 0,847 0,010 respectivement. A 16 %,
81
l isopentyldiol serait donc efficace pour lutter contre la croissance de tous les
microorganismes l exception d A. niger (Tableau 4).
Figure 12 : volution de lactivit de leau aw en fonction du pourcentage en butylne glycol et en

isopentyldiol
Ainsi, nous observons que pour obtenir une activit de l eau suffisamment basse pour
ralentir la croissance des cinq microorganismes d intrt, les concentrations en
glycrine ou en glycol incorporer sont trop importantes pour des formulations
cosmtiques classiques. Nous avons not des diffrences entre des matires premires
prsentant une mme structure chimique mais d origine et de puret diffrentes
(glycrine). Des diffrences sont notables entre deux molcules de mme formule brute,
mais de formules dveloppes diffrentes (propane-diols), et enfin la prsence du
mthyl supplmentaire en position C3 du 3-methyl-1,3-butanediol amliore le potentiel
de la molcule abaisser l aw par comparaison avec le butane-1,3-diol, sauf trs haute
concentration.
80 %, concentration la plus leve teste, c est la glycrine qui prsente le plus fort
potentiel pour abaisser l aw. 8 et 16 %, c est l isopentyldiol qui est le plus prometteur.
2.1 Influence du protocole de formulation

L tape suivante a consist valuer l impact du protocole de formulation sur l aw. Les
essais ont tout d abord t raliss partir de la glycrine tmoin % dans l eau. Le
Tableau 24 prsente les cinq protocoles tests.
La Figure 13 prsente les valeurs d aw de la solution 16 % en glycrine en fonction des
protocoles tests. Les rsultats montrent des diffrences significatives, notamment entre
le protocole 1 (protocole tmoin) et les protocoles 4 et 5. En comparaison avec le
protocole tmoin, les valeurs d aw sont abaisses de 7,5 % et 6,5 % avec les protocoles 4
et respectivement. Ces deux protocoles d intrts sont ceux pour lesquels la glycrine
est incorpore doucement dans l eau sous agitation. Nous pouvons en dduire que cette
mthode de formulation permet aux molcules de glycrol de se lier l eau au fur et
82
mesure de leur incorporation de manire plus efficace qu avec les autres protocoles. Le
protocole 4 est donc slectionn comme protocole optimis, avec une aw de
0,876 0,090 24 C pour la solution teste.
Tableau 24 : description des 5 protocoles appliqus une solution contenant 16 % de glycrine

dans leau avant mesure des aw
Protocoles appliqus une solution contenant 16 % de glycrine

Peser l eau et la glycrine
Protocole 1
Homogniser sous agitation magntique
Peser la glycrine
Protocole 2 Mettre sous agitation l aide d une hlice dfloculeuse
Ajouter l eau goutte goutte
Peser l eau et la glycrine
(omogniser l aide d une hlice dfloculeuse
Protocole 3
Monter la temprature 75 C au bain-marie
Agiter l hlice dfloculeuse pendant min
Peser l eau
Mettre sous agitation l aide d une hlice dfloculeuse
Protocole 4
Ajouter la glycrine goutte goutte
Poursuivre l agitation pendant min
Peser l eau
Mettre sous agitation l aide d une hlice dfloculeuse
Protocole 5
Ajouter la glycrine goutte goutte
Poursuivre l agitation pendant min
Ce protocole optimis est ensuite appliqu d autres matires premires, une

concentration de 4 % pour vrifier la gnralisation des rsultats observs. La
concentration de 4 % est slectionne car elle correspond au pourcentage en glycrine
ou butylne glycol dans la crme, le gel et la lotion tmoin. Etant donn que les formules
tmoins contiennent soit de la glycrine, soit du butylne glycol, nous avons appliqu ce
nouveau protocole la glycrine tmoin et son rfrent biologique ainsi qu au
butylne glycol et un rfrent biologique. En effet, ce stade de l tude, il nous a sembl
intressant, lorsque cela tait possible, d introduire des matires premires d origines
diffrentes (biologiques notamment) la vue des rsultats prcdemment obtenus avec
les glycrines.
83
Figure 13 : activit de leau dune solution de glycrine % dans leau en fonction du protocole
de formulation
Les rsultats prsents Figure 14 confirment que le protocole 4 rduit

systmatiquement l aw.
Figure 14 : application du protocole en comparaison avec le protocole tmoin dautres

matires premires, 4 %, 24C
2.2 Application aux formules

Le protocole 4 a t appliqu aux formulations de la lotion tonique, du gel et du lait
mulsionn froid, sans modification de la composition des formules (Figure 15). Ce
nouveau protocole permet effectivement d abaisser l aw des trois formulations
concernes. Les nouvelles valeurs obtenues ( 24 C) offrent aux formulations une
meilleure protection contre les dveloppements de P. aeruginosa et E. coli. Par la suite,
les formulations ont t prpares avec ce nouveau protocole en augmentant la
concentration en glycrine (lait froid et gel) ou butylne glycol (lotion tonique) de 4 %
10 % (Figure 15 . Une diminution de l aw est de nouveau observe par rapport aux
84
formules 4 %, amliorant ainsi la protection contre P. aeruginosa et E. coli. Mais les

valeurs obtenues ne permettent pas de limiter la croissance des autres microorganismes
d intrt.
Figure 15 : impact du protocole par rapport au protocole tmoin sur la w de la lotion, du gel et
du lait mulsionn froid puis impact du protocole 4 avec modification de la concentration en
glycrine ou butylne glycol 10 % au lieu de 4 %
Figure 16 : application du protocole 4 et de la modification de la concentration en glycrine (de 4

10 % au lait mulsionn chaud ainsi qu la crme hydratante. Comparaison des aw obtenues
avec les formulations tmoins.
Le protocole 4 avec 10 % de la matire premire tudie a ensuite t appliqu la

crme hydratante ainsi qu au lait mulsionn chaud Figure 16). Une importante
diminution de l aw a galement t mesure, avec 4,3 % de rduction sur le lait chaud
et 6,6 % pour la crme en comparaison des tmoins. Pour la premire fois, nous avons
obtenu une formulation prsentant une aw infrieure 0,90. La crme contenant 10 %
de glycrine, formule avec le protocole 4 donne en effet une aw de 0,898 0,009 25C.
Cette valeur permet d envisager un ralentissement encore plus marqu de la croissance
de P. aeruginosa et E. coli. Cependant, cette valeur n offre toujours pas de protection
contre S. aureus, ni contre les levures et moisissures considres.
85
Figure 17 : remplacement du butylne glycol classique avec le butylne glycol biologique.

Comparaison des aw du tmoin avec la lotion contenant 4% puis 10 % du produit biologique.
Ayant dmontr que certaines matires premires biologiques abaissaient plus

fortement l aw que leurs rfrents synthtiques, nous avons souhait en valuer l impact
sur deux formulations, la lotion tonique (Figure 17) et la crme hydratante (Figure 18).
Nous avons compar le tmoin de la lotion avec la formule contenant 4 % de butylne
glycol biologique formul avec le protocole 4. Puis, avec ce mme protocole, nous avons
prpar la lotion avec 10 % de butylne glycol biologique. Nous remarquons avec intrt
que la valeur d aw obtenue avec 4 % de butylne glycol biologique (0,916 0,019) est
dj infrieure celle obtenue avec 10 % de butylne glycol classique (0,933 0,001,
Figure 15) dans les mmes conditions de prparation. De plus, la formule prpare avec
10 % du butylne glycol biologique prsente une aw de 0,848 0,043, valeur la plus
faible obtenue jusqu alors. Cette valeur doit permettre de limiter la croissance de C.
albicans (aw minimale de croissance = 0,87 25C) ainsi que S. aureus (aw minimale de
croissance = 0,86 25C). La lotion formule dans ces conditions offre donc une
protection thorique contre 4 des 5 microorganismes tudis. De plus, aucune
modification sensorielle de cette formule optimise n a t observe, ce qui rend le
nouveau produit d autant plus intressant. La crme hydratante a t formule
directement avec 10 % de glycrine biologique. Par comparaison avec la glycrine
classique mme concentration, nous ne notons pas de diffrence notable d aw (Figure
18).
Jusqu prsent, nous avons ainsi dmontr que la concentration en glycols influence
l activit de l eau en fonction de la nature de ce dernier et que l ordre et la vitesse
d incorporation de ces matires premires dans l eau influence la valeur finale de l aw
dans un produit fini.
Des valeurs d intrts ont t obtenues pour diffrentes formulations. Nous avons alors
envisag de tester l une de ces formules optimise en challenge test.
86
Figure 18 : remplacement de la glycrine classique avec la glycrine biologique. Comparaison des

aw du tmoin avec la crme contenant 10 % de glycrine classique puis 10 % de produit
biologique.
3. CHALLENGE TEST
Un challenge test a t effectu sur la crme contenant 10 % de glycrine biologique,
formule suivant le protocole 4. Les rsultats ont t compars avec la formulation de la
crme tmoin et sont exposs Tableau 25. Si nous comparons les rsultats obtenus 14
jours, nous observons alors que la crme optimise en aw se montre systmatiquement
meilleure que le tmoin. L activit antibactrienne est notamment trs intressante.
Nous notons que pendant 14 jours, les rductions logarithmiques de P. aeruginosa et S.
aureus sont conformes au critre B de la Pharmacope Europenne. L activit est un peu
moins marque contre E. coli puisque la rduction n est pas suffisante jours pour
respecter le critre B. Les mesures concernant C. albicans et A. brasiliensis montrent que
les produits ne permettent pas une rduction suffisamment importante des micro-
organismes pour tre conforme la rglementation. Nanmoins, les rsultats obtenus
sont meilleurs que le tmoin puisque ce dernier inhibe la croissance de C. albicans sans
pour autant dtruire le microorganisme alors que la formule optimise permet une
rduction de 0,2 log. De plus, nous observons une croissance d A. brasiliensis dans la
crme tmoin alors qu une lgre inhibition est mesure dans le produit optimis. Ainsi,
bien que le produit optimis ne soit pas conforme la Pharmacope europenne pour 3
souches 14 jours, il se montre plus performant que le tmoin.
Deux explications peuvent tre donnes pour interprter ces rsultats. En premier lieu,
nous pouvons penser que la rduction de l activit de l eau joue un rle, notamment
contre P. aeruginosa dont l activit minimale de croissance est de , . De mme, nous
pourrions interprter les rductions logarithmiques plus importantes sur les deux
autres bactries (E. coli et S. aureus grce la rduction de la quantit d eau libre dans
le milieu. Mais il faut galement penser l impact de la concentration en glycrine dans
le milieu qui peut augmenter les proprits antimicrobiennes. En effet, les
concentrations minimales d inhibition CM) de la glycrine sont de % pour E. coli,
5 % pour P. aeruginosa, 20 % pour S. aureus et 30 % pour C. albicans et A. brasiliensis.
87
Notre produit contenant 10 % de glycrine, Nous pouvons en conclure que l impact de

cette concentration peut tre consquent.
Malheureusement, ces essais ne nous permettent pas de distinguer l apport de chaque
facteur concentration en glycrine et rduction de l eau libre) dans le milieu. Pour ce
faire, il aurait t intressant de tester les formulations en substituant la glycrine par
d autres matires premires abaissant l aw, de manire comparer l activit
antimicrobienne aw quivalente, mais pour diffrentes compositions. Ici, nous pouvons
simplement conclure une amlioration intressante du potentiel antimicrobien de la
crme, et notamment antibactrien. Les tests sur ces produits ont t interrompus au
bout de 14 jours.
88
Tableau 25 : rsultats des challenges tests de la crme tmoin et de la crme contenant 10 % de glycrine bio formule selon le protocole optimis.
Conformit avec les critres Pharmacope Europenne (rductions logarithmiques et interprtation). Les rsultats marqus en vert montrent une
performance significativement amliore de la crme optimise par rapport au tmoin.
Souches P. aeruginosa S. aureus E. coli C albicans A. brasiliensis

Jours J2 J7 J14 J28 J2 J7 J14 J28 J2 J7 J14 J28 J2 J7 J14 J28 J2 J7 J14 J28
Critre A - NI* - NI - NI / / NI / / NI
Critre B - - NI - - NI - - NI / / NI / / NI
Tmoin 1,3 >3 1,1 0,2 0,0 -0,2 0,5 0,7 0,0 / / 0,0 / / -0,1
Interprtation B B NC B B NC B B NC NC NC
Crme aw 0,9 >3 >3 1,1 2,0 >3 0,9 0,9 1,1 / / 0,2 / / 0,1
Interprtation B B B B B B B B NC NC NC
*NI : No )ncrease, cest dire pas daugmentation de la population microbienne dnombre la lecture prcdente.
NC: Non-conforme, cest dire non-conforme aux critres dfinis par la pharmacope europenne.
89
4. IMPACT DAGENTS RHEOLOGIQUES SUR LAW

Les donnes bibliographiques spcifiant que les hydrocollodes telles que par exemple
les gommes de xanthane et les gommes de guar peuvent influencer l aw [47,51], nous
avons slectionn quelques agents rhologiques afin d en valuer l impact rel. Les
matires premires slectionnes sont :
Une gomme de xanthane
Une gomme de guar
Une combinaison de deux carraghnanes (proportions 1 :1 m/m)
Les agents rhologiques sont tests diffrentes concentrations dans la formulation du
gel. Deux protocoles sont tests (Tableau 26).
Tableau 26 : description des 2 protocoles appliqus pour la prparation des solutions contenant
les agents rhologiques avant mesure de law (solutions contenant 10 % de glycrine)
Protocoles appliqus pour la formulation des agents rhologiques

Protocole Prparer le gel en appliquant le protocole 4, avec 10 % de
tmoin glycrine
Peser la glycrine (10 %)
Ajouter l agent rhologique sous agitation
Protocole Peser l eau et y ajouter la pte glycrine + agent
avec rhologique sous agitation
emptage Laisser sous agitation jusqu ce que l hydratation soit
complte (dissolution des poudres polymriques)
Terminer la formulation suivant le protocole tmoin
Les essais raliss avec les diffrents agents rhologiques ne montrent aucune volution
de l aw en fonction de la concentration (voir Figure 19 Figure 21). Les valeurs restent
similaires aux concentrations testes. Il semble donc difficile de jouer sur ce facteur pour
abaisser l aw avec les matires premires slectionnes et dans les gammes de
concentration testes.
Le protocole par emptage donne des rsultats spcifiques chaque agent rhologique.
Dans le cas de la gomme de xanthane (Figure 19 , l aw mesure (0,944 0,002) est
suprieure celle obtenue par le protocole classique (0,930 0,005). Pour le mlange de
carraghnanes (Figure 20), le phnomne inverse est observ avec une aw de
0,938 , dans le cas de l emptage et , 0,010 sinon. Enfin, concernant la
gomme de guar (Figure 21 , aucune diffrence n est observe entre les deux protocoles.
Nanmoins, nous remarquons qu en comparaison avec l aw du gel tmoin
(0,971 0,001) les valeurs obtenues avec les glifiants sont toutes infrieures, les
valeurs les plus basses tant obtenues avec la gomme de xanthane. Bien que ce rsultat
soit intressant, la substitution de l agent rhologique n est cependant pas applicable
dans le cas de cette formulation qui doit rpondre des critres organoleptiques
spcifiques que seul le carbomer de la formule tmoin confre (transparence et
90
proprits glifiantes . Ce rsultat peut cependant tre utilis pour d autres

formulations telles que des mulsions par exemple.
Aw du gel en fonction de la concentration en gomme Aw du gel en fonction de la concentration en

de xanthane et du protocole carraghnane et du protocole
0,99 0,99
0,97 0,97
0,95 0,95
0,93 0,93
aw
aw
0,91 2% avec empatage 0,91

2% avec empatage
0,89 0,89
0,87 0,87
0,85 0,85
0,00% 5,00% 10,00% 15,00% 0,00% 2,00% 4,00% 6,00% 8,00% 10,00%
% en gomme de xanthane % en carraghnane
Figure 19 : volution de law du gel en fonction de la Figure 20 : volution de law du gel en fonction de la
concentration en gomme de xanthane suivant le concentration en carraghnane suivant le protocole 4
protocole 4 et 10 % en glycrine, comparaison 2 % et 10 % en glycrine, comparaison 2 % de polymre
de polymre avec le protocole par emptage (T=25C) avec le protocole par emptage (T=25C)
Aw du gel en fonction de la concentration en

gomme de guar et du protocole
0,99
0,97
0,95
0,93
aw
2% avec empatage
0,91
0,89
0,87
0,85
0,00% 1,00% 2,00% 3,00% 4,00% 5,00% 6,00%
% en gomme de guar
Figure 21 : volution de law du gel en fonction de la

concentration en gomme de guar suivant le protocole 4 et
10 % en glycrine, comparaison 2 % de polymre avec le
protocole par emptage (T=25C)
Ainsi, aux concentrations testes, les agents rhologiques valus n impactent pas l aw.
Cependant, les valeurs obtenues, comprises entre , et , , peuvent tre d intrt
pour abaisser l aw de certaines formulations compatibles avec ces hydrocollodes.
5. IMPACT DU PH SUR LAW

Pour terminer cette tude, nous avons souhait mesurer l aw des formulations en
fonction du pH. Les essais ont t effectus pour la lotion, le lait mulsionn chaud
ainsi que la crme hydratante.
91
Le choix des ajusteurs de p( s est port vers l acide citrique pour acidifier et l hydroxyde
de sodium pour basifier. L acide citrique nous a paru particulirement intressant car il
peut jouer un rle de chlatant dans la formulation.
Les essais raliss, sur une gamme de pH allant de 4 7, ne montrent pas de rel impact
sur l activit de l eau mesure pour la lotion et le lait mulsionn chaud Figure 22,
Figure 23 . Les mesures sur les crmes sont fluctuantes, sans qu il semble possible
d apporter une interprtation aux rsultats obtenus Figure 24).
Figure 22 : aw mesures sur la lotion (protocole Figure 23 : aw mesures sur le lait mulsionn
optimis, 10 % en butylne glycol) en fonction chaud (protocole optimis, 10 % en butylne
du pH. La valeur tmoin est rfre en rose, les glycol) en fonction du pH. La valeur tmoin est
valeurs modifies en orange. rfre en rose, les valeurs modifies en
orange.
Figure 24 : aw mesures sur la crme (protocole

optimis, 10 % en butylne glycol) en fonction
du pH. La valeur tmoin est rfre en rose, les
valeurs modifies en orange.
Ces mesures ne permettent pas de conclure quant l impact du p( sur l aw dans la

gamme teste.
92
PARTIE II : EVALUATION DE LACTIVITE ANTIMICROBIENNE DES

EXTRAITS DE PLANTES SELECTIONNEES DANS LE CADRE DU PROJET
Selon la rglementation cosmtique en vigueur, seules les substances cites dans

l annexe V sont considres comme conservateur. Toute autre matire premire
cosmtique prsentant des proprits antimicrobiennes plus ou moins marques, mais
n apparaissant pas dans la liste positive, ne sont pas dclarer comme conservateur.
L tude des proprits antimicrobiennes d extraits de plantes et leur utilisation en tant
que conservateur dans les produits cosmtiques prsentent donc l intrt de pouvoir
revendiquer un produit sans conservateur, mais galement la prsence de produit
naturel, issu du rgne vgtal, suivant ainsi la tendance du march actuel. De plus, les
extraits vgtaux possdant pour la plupart une ou des activit(s) biologique(s)
spcifique s , il est alors avantageux de mettre en avant la prsence de l extrait dans la
formule pour ce potentiel dmontr.
D autre part, les extraits aux solvants organiques ne prsentent pas les inconvnients
inhrents aux huiles essentielles tels qu une odeur marque et parfois rdhibitoire ou
encore la prsence en grandes quantits d allergnes cutans (Figure 25) limitant
fortement les concentrations d utilisations. En effet, bien que les extraits vgtaux
puissent contenir des traces d allergnes, ils y sont prsents en quantit plus faible que
dans les huiles essentielles. En effet, ces molcules volatiles sont plus dilues dans les
extraits aux solvants organiques qui contiennent des composs non volatils absents
dans les huiles essentielles.
Figure 25 : rappels sur les allergnes en cosmtique [46,206,207]
Dans le cadre du projet NATUBAVAL, plusieurs dizaines de plantes ont t testes pour
valuer leur potentiel antimicrobien. Parmi celles-ci, une dizaine ont montr un
potentiel d intrt et trois se sont particulirement dmarques. Pour des raisons de
confidentialit (dpt du brevet BEP140143EP), ces trois plantes seront par la suite
nommes plantes A, B et C. Les plantes A et B sont issues du bassin mditerrranen et la
plante C est un arbre d origine tropicale [208].
93
Dans le cadre de notre tude, nous avons utilis des extraits de ces trois plantes
slectionnes pour leur potentiel antimicrobien et dont les profils phytochimiques ont
t pralablement tudis. L tude approfondie de la plante A a permis d isoler et
lucider l un des principaux actifs responsable de l activit antimicrobienne. Des tests
ont galement mis en valeur l activit antioxydante et chlatante de cet extrait.
1. ACTIVITE ANTIMICROBIENNE DES EXTRAITS VEGETAUX

Dans cette premire phase, les extraits de plantes A et B sont obtenus par macration
dans un mlange eau/thanol 25 : 75 v/v. Les extraits de plantes C sont des rsinodes
obtenus par extraction l thanol. Les plantes C et C diffrent par leur varit. Les
profils HPLC-UV des quatre extraits de plantes sont reprsents Figure 26. L actif
principalement responsable de l activit antimicrobienne de la plante A est clairement
identifi sur le profil correspondant.
Figure 26 : profils HPLC-UV des plantes A, B, C , C . )dentification de lactif principalement

responsable de lactivit antimicrobienne de la plante A
1.1 Activit antimicrobienne des extraits bruts

Dans une premire tape, les extraits ont t tests deux concentrations 0,4 % et
0,04 % (concentrations massique en extrait brut) sur les quatre souches microbiennes
contre lesquelles les produits cosmtiques doivent obligatoirement lutter,
conformment la rglementation. Les rsultats expriment l efficacit inhibitrice de
l extrait sur chaque souche temps de lecture : 24 et 48 h pour les champignons et
levures (C. albicans et S. aureus) et 48 et 72 h pour les bactries (A. niger et P.
aeruginosa). Les essais ont systmatiquement t raliss sur plusieurs extraits de
94
plantes rcoltes diffrentes priodes de l anne sur ans. Les rsultats expriment
l activit moyenne pour chaque extrait. Ils sont exprims comme suit :
)nhibition 90 % : +++
)nhibition 80 % et au moins 70 %* (* si diminution au cours du temps) :
++ ou ++*
)nhibition 60 % : +
)nhibition % mais perdue au cours du temps : ~
Inhibition < 60 % : -
Tableau 27 : rsultats de lactivit antimicrobiennes des extraits des plantes , % et 0,04 %) sur
A. niger, C. albicans, P. aeruginosa et S. aureus.
Souches
A. niger C. albicans P. aeruginosa S. aureus
microbiennes
Concentrations 0,4 % 0,04 % 0,4 % 0,04 % 0,4 % 0,04 % 0,4 % 0,04 %
Plante A +++ - +++ - - - +++ -
Plante B ++ - - - ++ - +++ -
Plante C1 +++ ~ ++ - ++* - ++ -
Plante C2 +++ - ++ - ~ - - -
Tmoin
commercial : ++ + - + +++ +++ +++ +++
Totarol
Dans le Tableau 27, nous notons une excellente activit de la plante A 0,4 % contre
toutes les souches l exception de P. aeruginosa. Par contre, les plantes B et C1
possdent une bonne activit contre cette bactrie. Etant donn qu aucune plante ne
prsente un spectre d activit optimal contre les souches, il nous a paru adquat de
combiner leur activit. En effet, certains mlanges d extraits peuvent parfois gnrer une
activit intensifie par effet de synergie ou tout simplement une activit cumule.
Tableau 28 : rsultats de lactivit antimicrobienne des associations de plantes , % et 0,04 %)

sur A. niger, C. albicans, P. aeruginosa et S. aureus.
Souches
microbiennes
Concentrations 0,4 % 0,04 % 0,4 % 0,04 % 0,4 % 0,04 % 0,4 % 0,04 %
PA+PB+PC1a)
0,375 : 0,375 : 0,25
+++ - ~ - - - - -
PA+PB+PC2
~ - + - - - ~ -
0,33 : 0,33 : 0,33
PA+PC1
+++ - +++ - + - +++ -
0,5 : 0,5
PA+PC1
+++ - +++ - - - ~ -
0,25 : 0,75
95
Souches
microbiennes
Concentrations 0,4 % 0,04 % 0,4 % 0,04 % 0,4 % 0,04 % 0,4 % 0,04 %
PA+PC2 -
++ - ++ - + - ++
0,5 : 0,5
PB+PC1
+++ - +++ - +++ - + -
0,25 : 0,75
PA+PB
+ - +++ - ++ - +++ -
0,5 : 0,5
a) PA : Plante A, PB : Plante B, PC1 : Plante C varit 1, PC2 : Plante C varit 2
Les rsultats obtenus avec les associations de plantes sont trs htrognes. En premier,
lieu, les associations de plantes ne montrent pas d activit d intrt. Ce rsultat est trs
certainement d aux concentrations utilises. En effet, nous avons souhait que la
concentration totale en extrait test soit constante (0,4 % et 0,04 %). Lorsque nous
avons ralis des mlanges, les concentrations reprsentatives de chaque extrait de
plante taient donc environ trois quatre fois plus faibles comme expos dans le
Tableau 28. La faible activit des mlanges peut donc rsulter d un manque d activit
ces concentrations et/ou d une absence de synergie.
Les associations des plantes A et C1 et plantes B et C1 donnent les meilleures activits.
Ces mlanges sont trs actifs 0,4 % contre les 4 souches microbiennes. Nous notons
qu en faisant varier le ratio PA : PC1 de 0,5 : 0,5 0,25 : , , nous perdons l activit
contre P. aeruginosa et S. aureus sans affecter l excellente activit contre les autres
souches. Le mlange de ces deux plantes parat donc d intrt pour la suite des travaux.
Par comparaison, la substitution de la plante C1 avec la C2 ne prsente pas autant
d intrt bien que nous constations une activit sur les quatre souches galement.
La plante B associe la plante C1 (ratio 0,25 : 0,75) prsente galement un fort intrt
avec une excellente activit sur 3 souches et une activit notable sur S. aureus. Ce
mlange est aussi retenir pour la suite des expriences.
Enfin, la plante B ajoute la plante A donne de trs bons rsultats avec une activit sur
toutes les souches. Ce rsultat est retenir pour la suite.
. Optimisation de lextrait de plante A : support solide et

dcoloration
En raison de la nature du mlange de solvants utiliss (thanol/eau 75 : 25), les extraits
sont de polarit trs large. Ils prsentent donc souvent des problmes de solubilit dans
les matires premires cosmtiques usuelles. La connaissance des familles de molcules
actives en fonction des revendications souhaites et l optimisation du procd
d extraction permettent gnralement de trouver des alternatives pour que le produit
final soit plus aisment manipulable par le formulateur. L ajout d un support solide ou
liquide au court du procd d extraction constitue l une de ces solutions.
96
De plus, la dcoloration est une tape importante de l optimisation d un extrait de plante

pour une utilisation cosmtique. Les solvants organiques utiliss extraient les molcules
responsables de la coloration des plantes. Ce procd d extraction produit alors un
extrait brut fortement color, qui, mme incorpor faibles concentrations dans un
produit cosmtique, le colore. Ces extraits ne sont par exemple pas utilisables en
cosmtique blanche , fortement prsente sur le march.
Dans une premire partie de l tude, nous avons donc choisi de prparer l extrait de
plante A sur support solide. De la maltodextrine a t utilise cet effet. Aucun test
d activit microbiologique n a t ralis sur ces essais (extrait de plante A sur
maltodextrine non dcolor). En effet, la dcoloration a t engage en simultan et les
tests d activit raliss sur l extrait de plante A dcolor sur support maltodextrine.
Figure 27 : photos de a) deux extraits sur maltodextrine dcolors sur charbon actif, ( gauche)
avec 3 % de charbon actif, ( droite) avec 3,6 % de charbon actif, b) ( gauche) un extrait sur
maltodextrine dcolor avec 3,6 % de charbon actif et ( droite) un extrait brut non dcolor, sans
maltodextrine et c) (en bas) un extrait sur maltodextrine dcolor avec 3,6 % de charbon actif et
(en haut) un extrait brut non dcolor, sans maltodextrine.
L extrait brut de plante A est fortement color Figure 27, b et c), dans les tons brun-
vert. L impact sur la coloration des cosmtiques n est pas acceptable. Les produits
formuls avec 0,5 2 % de cet extrait brut prsentent une couleur verte non convenable
(Figure 28).
Figure 28 : photos de crmes contenant ( gauche) 0,5 % dextrait brut de plante A non dcolor et
( droite) 2 % dextrait brut de plante A non dcolor.
Deux techniques de dcoloration ont donc t envisages :

Dcoloration sur charbon actif ;
Dcoloration par distillation molculaire.
97
1.2.1 Dcoloration sur charbon actif
En premier lieu, nous avons test la dcoloration sur charbon actif. Trois grades de
charbons actifs ont t compars : Norit SX, Adsorb pure HP150 et Adsorb pak 1000.
Nous avons valu l efficacit de la dcoloration visuellement et avons slectionn le
Norit SX pour son efficacit comme le montre la Figure 29. Dans un premier temps, les
extraits dcolors avec le charbon actif retenu ont tous t prpars avec le support
solide choisi : la maltodextrine. L activit antimicrobienne de l un de ces extraits a alors
t value. Les rsultats sont exposs Tableau 28. Nous observons alors une perte
importante de l activit antimicrobienne de l extrait par comparaison avec les rsultats
prcdemment exposs pour les extraits bruts. L extrait dcolor ne se montre actif que
sur une seule souche, A. niger. Afin de comprendre ces rsultats, un dosage de l actif
dans les extraits a t engag. Nous avons ainsi pu comparer les concentrations avant
puis aprs dcoloration et mise sur support
Figure 29 : photo des essais de dcoloration de lextrait de plante A partir de trois charbons
actifs.
Tableau 29 : rsultats de lactivit antimicrobienne de la plante A dcolore sur support

maltodextrine (0,4 % et 0,04 %) sur A. niger, C. albicans, P. aeruginosa et S. aureus.
Souches
microbiennes
Concentrations 0,4 % 0,04 % 0,4 % 0,04 % 0,4 % 0,04 % 0,4 % 0,04 %
PA dcolore +
+++ - - - - - - -
maltodextrine
Comme le montre la Figure 30, tous les extraits dcolors, l exception de celui rcolt
en mai 2012, prsentent une concentration plus leve en actif que leur quivalent non
dcolor. Nous observons une fluctuation importante de la concentration en actif sur
l anne, de , 1,0 51,2 , mg d actif/g d extrait dans les extraits dcolors.
Malheureusement, le dosage de l actif prsent dans l extrait dcolor test pour son
potentiel antimicrobien n a pas pu tre valid, faute d puisement de la matire. Mais
nous pouvons mettre l hypothse que cet extrait prsentait une faible concentration en
actif car il a t dmontr que l activit antimicrobienne de l extrait dpendait fortement
98
de ce paramtre. Nous pouvons galement penser que la dcoloration supprime d autres

molcules d intrts dans l activit antimicrobienne. En effet, des extraits de plante A ne
contenant pas d actif ont montr une certaine activit, notamment contre S. aureux,
dmontrant ainsi l importance de la participation de l ensemble de l extrait dans
l activit [208].
La dcoloration sur charbon actif apparat comme une technique d enrichissement en

actif trs intressante. Nanmoins, l htrognit des rsultats obtenus lors des essais
nous a encourags explorer d autres techniques de dcoloration.
Figure 30 : concentration en actif dans diffrents extraits EtOH/H2O (75 : 25 v/v) avant
(couleur fonce) et aprs dcoloration et mise sur support solide (couleur claire). Les extraits
ont t obtenus partir de plantes rcoltes entre avril 2012 et janvier 2013. En orange,
plantes rcoltes dans la zone 1 (Z1) et en bleu, plante rcolte dans la zone 2 (Z2).
1.2.2 Solubilisation des extraits
Des essais de solubilisation de cet extrait sur support dcolor ont t effectus afin d en
faciliter l incorporation en formulations cosmtiques. En effet, l extrait de plante A sur
support maltodextrine n est pas soluble dans l eau. )l est donc ncessaire de le
prsolubiliser avant utilisation.
Afin de dfinir un solvant ou mlange de solvants permettant d obtenir une bonne

solubilit de l extrait, nous avons fait un calcul approximatif de la valeur de la constante
dilectrique permittivit relative r du mlange de solvants d extraction et avons
cherch un mlange de matires premires cosmtiques ayant la mme valeur de
permittivit relative. En effet, la constante dilectrique donne une information sur la
polarit du milieu. Cette valeur correspond la rponse d un milieu soumis un champ
lectrique. Au niveau microscopique, elle est donc lie la polarisabilit lectrique des
molcules ou atomes [209]. Les valeurs des constantes dilectriques (constantes
relatives) des solvants purs sont exposes dans le Tableau 30.
99
Tableau 30 : valeurs des constantes dilectriques relatives des liquides purs utiliss pour
solubiliser lextrait de plante A [210]
Constante dilectrique
Solvants
r
Eau 80,1
Ethanol 25,3
Glycrol 46,5
Propan-1,2-diol 27,5
Propan-1,3-diol 35,1
Butan-1,3-diol 28,8
La constante dilectrique des mlanges a ensuite t calcule par l quation :
r = x1r1 + x2r2
o r est la constante dilectrique du mlange de solvants 1 et 2, r1 et r2, les constantes

dilectriques des solvants purs 1 et 2 respectivement et x1 et x2 les fractions volumiques
des solvants 1 et 2 dans le mlange (x1+x2=1) [211].
Selon cette formule, le mlange de solvants d extraction H2O/EtOH 25 : 75 possde une
constante dilectrique r = 39,0.
Le Tableau 31 prsente les fractions volumiques de mlanges binaires permettant
d obtenir une permittivit relative de , partir des composs exposs dans le
Tableau 30.
Tableau 31 : fractions volumiques des mlanges binaires solutions de lquation r = 39,0
Mlange 1 Mlange 2 Mlange 3 Mlange 4 Mlange 5 Mlange 6

Solvants
S1+S3 S1+S4 S1+S5 S2+S3 S2+S4 S2+S5
S1 Eau 0,22 0,09 0,20
S2 Glycrol 0,60 0,34 0,58
Propan-
S3 0,78 0,40
1,2-diol
Propan-
S4 0,91 0,66
1,3-diol
Butan-1,3-
S5 0,80 0,42
diol
Nous avons ensuite solubilis l extrait de plante A sur support maltodextrine dans ces
diffrents mlanges. Le mlange n a pas t test par manque de matire premire
extrait de plante . Nous avons alors choisi de privilgier les mlanges sans eau, l eau
tant la source premire des dveloppements microbiens (Figure 31).
100
Figure 31 : solubilit de lextrait de plante A sur support maltodextrine dans les mlanges binaires
slectionns. En orange fonc apparaissent les pourcentages de solubilit quivalents en extrait
brut (sans maltodextrine) ; les pourcentages totaux (orange fonc+clair) correspondent aux
pourcentages dextrait support par masse de solvant.
Nous observons que deux mlanges de solvants se distinguent :
Le mlange 6 compos de glycrol/butan-1,3-diol 58 : 42 v/v permet de

solubiliser 24 % d extrait support par masse de solvant, soit 14 % d extrait
brut (sans maltodextrine) par masse de solvant.
Le mlange 4 compos de glycrol/propan-1,2-diol 60 : 40 v/v permet de
solubiliser 30 % d extrait support par masse de solvant, soit 17,2 % d extrait
brut par masse de solvant.
A cette tape, nous pouvons alors slectionner le mlange glycrol/propan-1,2-diol (G-

PG comme bon solvant de l extrait de plante A. Nanmoins, nous notons galement que
l tape de solubilisation est lente et fastidieuse. Pour obtenir ce rsultat, il a t
ncessaire d agiter la solution plusieurs heures agitation magntique C) en
alternant avec 30 min d ultrasons chaque ajout d extrait. De plus, partir de % en
extrait dans le milieu, l ensemble devient trs visqueux et difficile homogniser. En
effet, la prsence de la maltodextrine augmente la viscosit de la solution. Ce support ne
semble donc pas tre idal dans le cadre de ces travaux.
1.2.3 Dcoloration par distillation molculaire
La dcoloration au charbon actif n ayant pas donn de rsultats d intrt, nous avons
envisag une autre technique de dcoloration : la distillation molculaire. Cette
technique est une distillation sous vide pousse temprature leve mais avec un
temps de contact trs court (quelques secondes) entre la matire vgtale solubilise et
le matriel de distillation chauff. Cette technique vite la dnaturation des molcules
sensibles la chaleur. Nous avons appliqu la technique en utilisant un support liquide :
un triglycride chaines moyennes.
101
L extrait obtenu est liquide et marron-orange translucide comme le montre la Figure 32.
La couleur obtenue est trs intressante pour une utilisation cosmtique. De plus, le
profil HPLC-UV de cet extrait montre que l actif d intrt y est bien prsent.
Figure 32 : photo de lextrait dcolor obtenu aprs distillation molculaire
Malheureusement, les tests d activit antimicrobiens de cet extrait se sont montrs

dcevants. Comme le montre le Tableau 32, il n est actif sur aucune souche, quelque soit
la concentration.
Figure 33 : profil HPLC-UV de lextrait de plante A dcolor par distillation molculaire. = 310 nm
Tableau 32 : rsultats de lactivit antimicrobienne de la plante A dcolore par distillation

molculaire (0,4 % et 0,04 %) sur A. niger, C. albicans, P. aeruginosa, S. aureus et E. coli.
Souches
A. niger C. albicans P. aeruginosa S. aureus E. Coli
microbiennes
Concentrations 0,4 % 0,04 % 0,4 % 0,04 % 0,4 % 0,04 % 0,4 % 0,04 % 0,4 % 0,04 %
PA distillat
- - - - - - - - - -
DM*
*DM : Distillation Molculaire
Nous noterons que cet essai a t ralis partir de l extrait pilote de plante A
EtOH/H2O qui n tait actif que sur S. aureus. Nous pouvons donc seulement conclure
une perte d activit sur cette souche. )l serait malgr tout intressant de tester cette
technique de dcoloration partir d un extrait plus actif, afin de conclure sur l impact
rel de la dcoloration sur l activit sur les autres souches.
102
1.3 Activit antimicrobienne de lextrait de plante A enrichi en actif

Dans les cas o l on souhaite revendiquer l activit d une molcule ou d un ensemble de
molcules prsente s dans l extrait, il est souvent ncessaire d optimiser la technique
d extraction en vu d augmenter la ou les concentration s finale s en actif s . L objectif
ainsi recherch est de limiter la concentration en extrait total dans le produit fini, tout
en ayant l activit ncessaire.
Comme dj explicit, l actif participant principalement l activit antimicrobienne de la
plante A a t dfini [208] et nous avons donc ralis cette optimisation. Les rsultats
ont montr que l un des meilleur solvant d extraction permettant d obtenir un extrait
enrichi en actif est le mthanol (Figure 34).
Figure 34 : profil HPLC-UV dun extrait de plante A MeO(. = 310 nm
Les tests d activits antimicrobiens raliss sur un extrait de plante A MeOH (extrait
ralis sur quelques dizaines de grammes de plante frache) ainsi que le mme extrait
ralis l chelle pilote montrent une perte d activit lors du changement d chelle
(Tableau 33). En effet, les deux extraits prsentent une excellente activit contre A. niger
et S. aureus alors qu aucun des deux n est actif contre E. coli. Par contre, l extrait ralis
petite chelle prsente une activit notable contre C. albicans, alors que nous observons
une perte de l activit de l extrait pilote contre cette mme souche. Enfin, l extrait ralis
en petite quantit perd l activit initiale contre P. aeruginosa alors que l extrait pilote ne
prsente aucune activit contre cette bactrie. Un dosage de l actif a alors t ralis sur
ces deux extraits. L extrait ralis dans les conditions d optimisation contient
44,3 2,6 mg d actif/g d extrait alors que celui ralis l chelle pilote contient
38,9 0,9 mg d actif/g d extrait. Nous notons que les deux extraits sont riches en actif,
avec des concentrations peu diffrentes. La lgre perte en actif note peut expliquer en
partie la perte d activit antimicrobienne observe. Mais nous pouvons galement
penser que le passage l chelle pilote peut impacter d autres composs participant
l efficacit antimicrobienne.
L extrait pilote a galement t test associ la plante C1 avec un ratio 50 : 50
conformment aux bons rsultats obtenus prcdemment. Malheureusement, nous
103
observons ici que les rsultats sont moins intressants que prvus puisque l ensemble
n est pas actif contre souches A. niger, P. aeruginosa et E. coli . L activit est notable
contre S. aureus et bonne contre C. albicans. Nanmoins, cette association semble moins
intressante que l extrait pilote seul.
Tableau 33 : rsultats de lactivit antimicrobienne de la plante A extraite au mthanol et de

lassociation avec la plante C , % et 0,04 %) sur A. niger, C. albicans, P. aeruginosa, S. aureus et
E. coli.
Souches
microbiennes
Concentrations 0,4 % 0,04 % 0,4 % 0,04 % 0,4 % 0,04 % 0,4 % 0,04 % 0,4 % 0,04 %
PA MeOH
Pilote
+++ - ~ - - - +++ - - -
PA MeOH
Labo
+++ - + - ~ - +++ - - -
PA + PC1
- - ++ - - - + - - -
50 :50
1.4 Activit antimicrobienne de lextrait de plante A sur support

liquide
Dans une troisime phase de l optimisation de l extrait, nous avons choisi d ajouter un
support liquide cosmtique au cours de l tape d extraction de la plante A afin que la
matire premire extraite soit immdiatement formulable sans tape de prparation
pralable. Trois critres de slection nous ont permis d orienter les choix de matires
premires :
Etape 1 : Slection de matires premires possdant des proprits
antifongique et/ou antibactriennes, en privilgiant l activit sur P.
aeruginosa ;
Etape 2 : Suivant les essais raliss avec les matires premires de l tape ,
slection des matires premires solubilisant le mieux l extrait de plante A
(extrait MeOH) ;
Etape 3 : Redirection des choix suivant les contraintes de disponibilit des
matires premires pour la ralisation d une extraction pilote sur support
liquide.
Etape 1
Les matires premires slectionnes sont dcrites dans le Tableau 34. Toutes ont t
slectionnes en fonction de leur potentiel antimicrobien revendiqu et/ou de leur
capacit abaisser l activit de l eau [16,46,212,213,214].
104
Tableau 34 : formules des matires premires slectionnes pour leur activit antimicrobienne
Noms INCI Formules Activit

Structures
brutes antimicrobienne
Activateur des
systmes de
ETHYLHEXYLGLYCERIN C11H24O3 conservations
Efficace notamment sur
les bactries Gram+
Trs bonne activit
contre Gram+ et
levures.
GLYCERYL CAPRATE C13H26O4 Assez bonne activit
contre Gram-
Insuffisant contre
champignons
Large spectre
CAPRYLYL GLYCOL C8H18O2 antimicrobien. Peu actif
contre champignons
Activit contre les

CAPRYLOYL GLYCINE C10H19N03 bactries notamment
Trs bonne activit

contre Gram+, Gram
GLYCERYL CAPRYLATE C11H22O4 et les levures.
Assez bonne activit
contre les champignons
Potentiel antibactrien
GLYCERIN C3H8O3 entre 5 et 20 % et
antifongique ds 30 %
Activit
antibactrienne et
PROPYLENE GLYCOL C3H8O2
antifongique entre 10
et 20 %
Activit
antibactrienne et
BUTYLENE GLYCOL C4H10O2 antifongique entre 5 et
20 %
Activateur des
PROPANEDIOL C3H8O2 systmes de
conservation
Avant que le solvant d extraction de la plante A ne soit optimis MeO( , nous avons pu
tester l activit antimicrobienne de l extrait de dpart (2O/EtOH 25 : 75) associ trois
de ces matires premires : glycryl caprylate, glycryl caprate et caprylyl glycol. Ces
trois matires premires (MP) ont systmatiquement t mlanges avec la plante A
dans des proportions plante A/MP 75 : 25 m/m, suivant les recommandations des
fournisseurs. Les rsultats (Tableau 35 et Tableau 36) montrent une augmentation de
l activit de la plante A par addition de son activit et de celle des MP associes. Nous
n observons nanmoins pas de synergie d activit.
105
Tableau 35 : activit antimicrobienne des glycryl caprylate, glycryl caprate et caprylyl glycol
0,05 et 0,005 %
Souches
microbiennes
Concentrations 0,05% 0,005% 0,05% 0,005% 0,05% 0,005% 0,05% 0,005%
Glycryl
+++ - ++* ~ - - - -
caprylate
Glycryl
+++ - +++ + - - +++ -
caprate
Caprylyl
~ - - - - - - -
glycol
Tableau 36 : activit antimicrobienne de la plante A associe aux glycryl caprylate, glycryl

caprate et caprylyl glycol
Souches
microbiennes
Concentrations 0,4 % 0,04 % 0,4 % 0,04 % 0,4 % 0,04 % 0,4 % 0,04 %
Plante A (PA) +++ - +++ - - - +++ -

PA + glycryl
caprylate +++ - + ~ - - +++ -
87,5 :12,5
PA + glycryl
caprate +++ ~ +++ + - - +++ ~
87,5 :12,5
PA + caprylyl
glycol +++ - +++ - - - +++ ~
87,5 :12,5
Etape 2
L extraction de la plante A extrait MeO( sur les supports (MP) prsents Tableau 34 a
t ralise par ajout de chaque matire premire dans le solvant d extraction avant
vaporation. En effet, le procd d extraction de la plante est une macration dans le
mthanol suivie d une concentration sous vide. Mais dans cette tape d optimisation,
nous avons ajout une matire premire (support) au macrt mthanolique avant de le
concentrer, et ce afin d obtenir un produit final liquide. Nous avons test les MP
prsentes dans le Tableau 34, et avons donc obtenu 9 produits que nous avons
compars suivant un critre d homognit.
Cette tape a permis de classer les solvants en fonction de leur capacit solubiliser
l extrait :
106
ETHYLHEXYLGLYCERINE>GLYCERYL CAPRATE>CAPRYLYL GLYCOL>CAPRYOLOYL GLYCINE> GLYCERYL

CAPRYLATE>GLYCERINE>PROPYLENE GLYCOL>BUTYLENE GLYCOL>PROPANEDIOL
Etape 3
Une extraction pilote de la plante A a t ralise afin de finaliser et valider les essais. 4
chantillons diffrents ont t produits :
Un extrait brut tmoin sans support
Un extrait sur support thylhexylglycerin (meilleur solvant slectionn) :
Support S1
Un extrait sur support thylhexylglycerin/caprylyl glycol non test l tape
2)= Support S2
Un extrait sur support caprylyl glycol (3me meilleur solvant) : Support S3
Le glyceryl caprate (2me meilleur solvant) et le capryloyl glycine (4me meilleur solvant)
n ont pas t considrs car nous n avions pas suffisamment de ces produits au moment
de raliser l extraction pilote. Etant en possession d une matire premire susceptible
d tre un intermdiaire d intrt mlange thylhexylglycerin/caprylyl glycol), nous
avons choisi de l utiliser pour l extraction. Les autres matires premires ont t
limines par manque de solubilit de l extrait dans celles-ci.
Tableau 37 : rsultats de lactivit antimicrobienne des extraits pilotes de la plante A MeOH sans
(extrait brut) et avec supports liquides (S1 S3) tests 0,4 % et 0,04 % sur A. niger, C. albicans, P.
aeruginosa, S. aureus et E. coli.
Souches
microbiennes
Concentrations 0,4 % 0,04 % 0,4 % 0,04 % 0,4 % 0,04 % 0,4 % 0,04 % 0,4 % 0,04 %
PA pilote Brut +++ - ~ - - - +++ - - -
PA pilote S1 +++ + +++ - ~ - +++ - ++ ~
PA pilote S2 +++ ~ ++ - ++ - + - ++ -
PA pilote S3 +++ - +++ - +++ - +++ - +++ -
Les rsultats antimicrobiens raliss sur les 4 extraits pilotes sont trs positifs. Par
rapport l extrait brut dj discut, nous observons que chaque support apporte une
activit supplmentaire.
A 0,4 %, l extrait sur support S prsente une excellente activit contre A.
niger, C. albicans, S. aureus et une trs bonne activit contre E. coli. Seule
l activit contre P. aeruginosa est perdue dans le temps.
A 0,4 %, l extrait sur support S prsente une excellente activit contre A.
niger et une trs bonne activit contre les autres microorganismes.
L extrait sur support S prsente une excellente activit contre tous les
microorganismes 0,4 %.
107
Nous pouvons galement ajouter que le caprylyl glycol doit jouer un rle important dans
l activit contre P. aeruginosa. En effet, l extrait brut ne prsente pas d activit contre
cette souche et l extrait sur support S thylhexylglycrine perd rapidement l activit
note au dpart. Par contre, nous observons une bonne activit avec le support S2 qui
contient le mlange de caprylyl glycol et d thylhexylglycrine et une excellente activit
lorsque le caprylyl glycol est seul. Mme si dans cette srie le caprylyl glycol n a pas t
test seul 0,4 et 0,04 %, nous pouvons nous rfrer aux rsultats obtenus Tableau 35
o il a t test 0,05 et 0,005 %. Nous pouvons alors conclure qu il faut une
concentration strictement suprieure 0,05 % en caprylyl glycol pour pouvoir observer
une activit antimicrobienne, seul ou associ la plante A.
Ainsi, l extrait sur support S3 est le plus actif et il sera des plus intressant de comparer
ces rsultats avec ceux obtenus lors des challenges tests.
. Activit antimicrobienne de lextrait de plante A associ des

agents de chlation
Enfin, dans une dernire srie d essais, nous avons associ les extraits de plante A des
agents de chlation synthtique et naturels, le Na2-EDTA4, l acide phytique et le sodium
gluconate. En effet, l ajout d un agent chlatant est susceptible d amliorer l activit
antimicrobienne de certains agents en agissant sur la permabilit et la fluidit des
membranes plasmique des pathognes.
Les essais ont t raliss sur l extrait de plante A (2O/EtO( et d excellents rsultats ont
t obtenus avec l agent de synthse Na2-EDTA. Seulement, cet agent prsente dj une
excellente activit seule, trs faible concentration (0,004 %) (Tableau 38). Nous
pouvons donc penser que les rsultats obtenus avec la plante A (Tableau 40) sont
majoritairement ds l action du Na2-EDTA.
Tableau 38 : activit antimicrobienne des agents de chlation Na2-EDTA, acide phytique et

gluconate de sodium 0,04 % et 0,004 %
Souches
microbiennes
Concentrations 0,04% 0,004% 0,04% 0,004% 0,04% 0,004% 0,04% 0,004%
Na2EDTA +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
Acide
- - - - - - - -
Phytique
Gluconate de
- - - - - - - -
sodium
Les agents naturels ne prsentent, quant eux, aucune activit lorsqu ils sont tests
seuls 0,004 et 0,04 % (Tableau 38) ou 0,02 et 0,2 % (Tableau 39). L association de la
4 Na2-EDTA : acide thylne diamine ttra actique disodium
108
plante A avec l acide phytique montre que pour un ratio : , l activit observe
correspond celle de la plante A. L acide phytique ne prsente donc pas d intrt dans
ce cas. Pour un ratio 80 : , nous pouvons galement penser que l activit correspond
celle de la plante A sans valeur ajoute de l agent de chlation. En effet, mme si l extrait
de plante n a pas t test , % (concentration quivalente en plante A pour le ratio
80 : , nous pouvons estimer l activit cette concentration proche de celle obtenue
0,4 % (Tableau 27). De manire inexplique, nous observons qu : 10, toute activit
antimicrobienne est perdue.
Tableau 39 : activit antimicrobienne de la plante A et des agents de chlation Na 2-EDTA, acide

phytique et gluconate de sodium 0,2 % et 0,02 %
Souches
microbiennes
Concentrations 0,2% 0,02% 0,2% 0,02% 0,2% 0,02% 0,2% 0,02%
Plante A +++ - - - - - +++ -
Acide
- - - - - - - -
Phytique
Gluconate de
- - - - - - - -
sodium
Enfin, les essais d association avec le sodium gluconate montrent qu associ : 50

avec la plante A, l activit sur A. niger est perdue. L effet de l agent chlatant est donc ici
ngatif. A 80 : , l activit de la plante A semble conserve. De mme qu avec l acide
phytique, nous notons qu : 10, toute activit antimicrobienne est perdue sans que
nous ne puissions expliquer ce phnomne.
Tableau 40 : activit antimicrobienne de la plante A associe aux agents de chlation Na 2-EDTA,

acide phytique et gluconate de sodium 0,4 % et 0,04 %
Souches
microbiennes
Concentrations 0,4% 0,04% 0,4% 0,04% 0,4% 0,04% 0,4% 0,04%
PA + Na2EDTA
+++ +++ +++ ++ +++ +++ +++ +++
90:10
PA + Acide
Phytique - - - - - - - -
90 :10
PA + Acide
Phytique +++ - +++ - - - +++ -
80 :20
PA + Acide
Phytique +++ - - - - - +++ -
50 :50
109
Souches
microbiennes
Concentrations 0,4% 0,04% 0,4% 0,04% 0,4% 0,04% 0,4% 0,04%
PA +
Gluconate de - - - - - - - -
sodium 90 :10
PA +
Gluconate de +++ ~ ++ - - - +++ -
sodium 80 :20
PA +
Gluconate de - - - - - - +++ -
sodium 50 :50
Ainsi, les rsultats obtenus avec les agents de chlation ne nous ont pas paru d intrt
pour la suite des essais.
2. FORMULATION COSMETIQUE ET CHALLENGE TEST

En parallle avec les essais microbiologiques des chantillons issus de l extraction pilote
de la plante A, nous avons test leur incorporation en formulation cosmtique et les
avons soumis des challenges tests.
Dans une premire phase de challenges tests, nous avons choisi de tester l activit des
extraits dans un seul type de formulation : une crme hydratante. La formulation de la
crme est celle dj expose Tableau 18 comme formule tmoin. Les conservateurs de
synthse jusqu alors incorpors dans cette formulation sont dornavant remplacs par
les extraits conservateurs.
Nous avons donc test les trois extraits sur supports deux concentrations dans la
crme comme dcrit Figure 35.
Nous avons galement analys ces extraits 1 % (% matire sche ou extrait brut) dans
la formulation de la crme hydratante d aw optimise. Ensuite, conformment aux
rsultats obtenus lors des essais d associations de plantes p. 95), nous avons test les
extraits de plante A avec la plante C (origine 1) 1 % de matire sche (ratio PA/PC1
35 : . Les essais raliss pour l valuation en challenge test sont rsums Figure 35.
Dans cette premire phase d essais microbiologiques, nous avons choisi de faire un bilan
14 jours afin de pouvoir mettre fin aux essais ne donnant pas les rsultats escompts.
2.1 Analyse des challenges test

2.1.1 Extraits de plante A sur supports dans la crme tmoin
La Figure 35 rsume les essais d incorporation des extraits sur supports S S , et

2 % de matire sche (soit 0,5 et 2 % de support). La crme tmoin a t tudie afin
d valuer l apport des extraits. De plus, pour chaque essai, un tmoin contenant le
110
support seul 0,5 ou 2 % a t test afin d en mesurer l impact sur l activit value.
Comme discut p. 87 le tmoin s avre non conforme la Pharmacope Europenne (Ph.
Eur.) ds 14 jours, ce qui permet donc de mettre en vidence des rsultats positifs par
comparaison.
111
Figure 35 : concentrations en extraits de plantes tests (% matire sche) en vu des challenges tests dans la crme hydratante tmoin et son rfrent
optimis en aw. PAS1= Plante A sur support thylhexylglycerin, PAS2= Plante A sur support thylhexylglycerin/caprylyl glycol, PA S3 = Plante A sur support
caprylyl glycol, PC(1) = Plante C origine 1. Les concentrations indiques correspondent la concentration en extrait brut de plantes ou compos.
Tableau 41 : rsultats des challenges tests par incorporation de lextrait de plante A diffrentes concentration dans la crme tmoin. Conformit avec
les critres Pharmacope Europenne rductions logarithmiques et interprtation . Mise en valeur des rsultats dintrts en vert.

Tmoin 1,3 >3 1,1 0,2 0,0 -0,2 0,5 0,7 0,0 / / 0,0 / / -0,1
Tmoin S1 2 % >3 >3 / >3 >3 >3 / >3 >3 >3 / >3 / / >3 >3 / / 0,0 -0,1
Interprtation A A A A A A A A A A A A A A NC NC
PAS1 2% >3 >3 / >3 >3 >3 / >3 >3 >3 / >3 / / >3 >3 / / 0,1 0,3
Tmoin S2 2 % >3 >3 / >3 >3 >3 / >3 >3 >3 / >3 / / >3 >3 / / 0,1 0,1
PAS2 2% >3 >3 / >3 >3 >3 / >3 >3 >3 / >3 / / >3 >3 / / 0,9 2,0
Interprtation A A A A A A A A A A A A A A B A
Tmoin S3 2 % >3 >3 / >3 >3 >3 / >3 >3 >3 / >3 / / >3 >3 / / 0,4 0,9
PAS3 2% >3 >3 / >3 >3 >3 / >3 >3 >3 / >3 / / > >3 / / 2,5 >3
Interprtation A A A A A A A A A A A A A A A A
Tmoin S1 >3 >3 >3 0,1 0,6 2,8 2,9 >3 >3 / / 1,2 / / 0,0
0,5 %
Interprtation A A A B B B B A A B NC

PAS1 0,5% 0,8 0,1 -0,9 0,0 -1,1 -0,8 0,5 -1,2 -1,0 / / 0,6 / / 0,2
Interprtation B NC NC B NC NC B NC NC NC NC
Tmoin S2 >3 >3 / 0,3 0,7 2,6 >3 >3 / / / 1,1 / / 0,1
0,5 %
Interprtation A A A B B NC A A A B NC
PAS2 0,5% >3 >3 / 0,5 >3 >3 >3 >3 / / / >3 / / 0,1
Interprtation A A A B A A A A A A NC
Tmoin S3 >3 >3 / 0,5 >3 >3 >3 >3 / / / >3 / / 0,0
0,5 %
PAS3 0,5% >3 >3 / 1,1 >3 >3 >3 >3 / / / >3 / / 0,1
(*/ : pas dabattement minimal requis, NI : pas daugmentation, NC : non conforme)
tmoin S1 2 % : crme tmoin contenant 2 % de support S1, PAS1 2 % : crme contenant lextrait de plante A sur support S %.
Les rsultats obtenus avec le support S1 seul montrent que les produits rpondent aux
critres A contre P. aeruginosa et E. coli ds 0,5 % et contre S. aureus et C. albicans 2 %.
De manire surprenante, l ajout de la plante A , % fait disparatre toute activit.
Nous avons donc choisi de stopper le challenge test des essais contenant le support S1 et
l extrait , % au bout de 14 jours. Avec 2 % de plante A, nous observons exactement
les mmes rsultats qu avec le support seul, savoir une activit conforme aux critres
A sur toutes les souches sauf A. brasiliensis. Nanmoins, une lgre diffrence est
observe entre le tmoin et l essai contenant la plante. En effet, une reprise de la
multiplication cellulaire de la levure est observe jours dans l essai tmoin alors
qu une dcroissance est note en prsence de l extrait. Nanmoins, ces carts restent
peu significatifs compte tenu de l erreur sur la mesure , log . La conclusion sur cet
essai est donc la non-conformit du produit cause de l absence d activit contre A.
brasiliensis.
Les rsultats obtenus avec le support S2 seul montrent que, tout comme avec S1, les
produits rpondent aux critres A contre P. aeruginosa et E. coli ds 0,5 % et contre S.
aureus et C. albicans 2 %. L ajout de la plante A , % permet de mettre en vidence
l activit de la plante contre S. aureus. En effet, alors que le tmoin S et l essai contenant
la plante prsentaient tout deux une conformit aux critres B jours, l activit du
tmoin chute et n est plus conforme jours alors que l essai contenant l extrait voit
son activit amliore (conformit au critre A 14 jours). Ces essais mettent galement
en vidence l activit contre C. albicans (passage du critre B avec le support au critre A
avec la plante . Nous n avons pas jug utile de poursuivre les essais , % au del de 14
jours.
A 2 %, les essais mettent en avant l activit de la plante A contre A. brasiliensis. En effet,
alors que l essai tmoin n est pas conforme, une dcroissance significative du nombre de
spores de la levure est observe dans la crme contenant l extrait. Alors que la
dcroissance note 14 jours tait de 0,9 log, elle est de 2 log 28 jours. Nous pouvons
donc conclure une conformit selon les critres B de la pharmacope pour cet essai
tout en retenant que l activit contre A. brasiliensis est seulement plus lente.
Les rsultats obtenus avec le support S3 montrent que les produits rpondent au critre
A contre toutes les souches sauf A. brasiliensis 14 jours ds 0,5 % et de mme 2 %.
L apport de la plante A , % amliore l activit contre S. aureus. A 2 %, l extrait
permet d obtenir une activit conforme aux critres A sur toutes les souches. Cet essai
est donc conforme la Ph. Eur. et rpond nos attentes dans l avance du projet.
Ainsi, dans le cadre de cette premire srie, deux essais se distinguent particulirement,
savoir les crmes contenant 2 % d extraits de plante A sur supports S et S . La crme
tmoin contenant lextrait sur support S % est conforme aux critres A de la
Ph. Eur sur P. aeruginosa, S. aureus, E. coli, et C. albicans et conforme aux critres B
sur A. brasiliensis. La crme contenant lextrait sur support S3 2 % est conforme
aux critres A de la Ph. Eur sur toutes les souches. Enfin, lessai contenant lextrait
sur support S1 2 % est galement intressant car conforme sur toutes les
souches sauf A. brasiliensis.
2.1.2 Extraits de plante A sur supports dans la crme optimise en aw
La deuxime srie d essais est rsume Tableau 42 et runit les rsultats obtenus
partir de la crme optimise en aw (10 % de glycrine selon le protocole optimis, voir
p. 84) dans laquelle ont t incorpors les extraits de plante A sur les trois supports
1 % de matire sche. Comme dj discut, le tmoin optimis en aw prsente dj une
activit intressante contre P. aeruginosa et S. aureus. Il sera donc moins ais de
conclure sur l apport d activit des extraits sur ces souches.
L ajout de l extrait sur support S permet d obtenir des rsultats conformes aux critres
A pour toutes les souches, sauf pour A. brasiliensis contre laquelle le produit rpond au
critre B 14 jours. Sachant qu , %, le support S1 donne des rsultats conformes aux
critres A pour P. aeruginosa et E. coli, nous pouvons certainement attribuer l activit au
support. Ayant observ qu avec % de support S1, nous obtenions des rsultats
conformes aux critres A sans l extrait, nous ne pouvons conclure ici sur l apport du
support et de la plante 1 %. Nous pouvons nanmoins penser que l activit contre A.
brasiliensis est bien procure par l extrait de plante A. Cet essai conserve sa conformit
aux critres B 28 jours contre A. brasiliensis. La conclusion sur cette crme est donc
une conformit globale aux critres B.
L ajout de l extrait sur support S gnre un produit conforme aux critres A pour toutes
les souches, sauf pour A. brasiliensis contre laquelle le produit n est pas conforme
jours. Ayant dj constat que le support S2 apporte une activit correspondante aux
critres A contre P. aeruginosa et E. coli ds 0,5 %, nous ne pouvons conclure sur
l apport de l extrait. De plus, % de support S , l activit contre S. aureus et C. albicans
est conforme aux critres A, aussi ne nous est-il pas possible d valuer la valeur ajoute
de la plante A, notamment sur C. albicans. L activit n tant pas suffisante contre A.
brasiliensis, ce produit n est pas valid.
Enfin, l ajout de l extrait sur support S donne un produit conforme aux critres A pour
toutes les souches, sauf pour A. brasiliensis contre laquelle le produit n est pas conforme
14 jours. Ces rsultats sont les mmes que ceux apports par seulement 0,5 % de
support S . Nous pouvons nanmoins valider l apport de la plante sur A. brasiliensis. En
effet, mme si la rduction logarithmique mesure (0,6) rend le produit non conforme,
ce rsultat reste meilleur que celui mesur avec 2 % de support S3 (0,4). De plus, nous
observons une diminution du nombre de spores de cette levure entre 14 et 28 jours. La
dcroissance logarithmique note jours est d intrt et montre que l activit contre
cette souche est trop lente pour entrer dans les critres de la rglementation mais peut
s avrer d intrt dans l optimisation de produits.
Ainsi, lessai contenant lextrait sur support S se distingue ici en rpondant aux
critres B de la Ph. Eur..
Tableau 42 : rsultats des challenges tests par incorporation de lextrait de plante A % dans la crme optimise en aw. Conformit avec les critres
Pharmacope Europenne (rductions logarithmiques et interprtation)

Critre A - NI - NI - NI / / NI / / NI
Tmoin aw 0,9 >3 >3 1,1 2,0 >3 0,9 0,9 1,1 / / 0,2 / / 0,1
Interprtation B A A B B A B B NC NC NC
PAS1aw 1% >3 >3 / >3 >3 >3 >3 >3 >3 >3 / >3 / / >3 >3 / / 0,8 0,9
Interprtation A A A A A A A A A A A A A A B B
PAS2aw 1% >3 >3 / >3 >3 >3 / >3 >3 >3 / >3 / / >3 >3 / / 0,1 0,3
PAS3aw 1% >3 >3 / >3 >3 >3 / >3 >3 >3 / >3 / / >3 >3 / / 0,6 0,9
Interprtation A A A A A A A A A A A A A A NC B
(*/ : pas dabattement minimal requis, NI : pas daugmentation, NC : non conforme)
tmoin aw : crme optimise en aw, PAS1aw 1 % : crme optimise en aw contenant lextrait de plante A sur support S1 1 %.
2.1.3 Extraits de plante A sur supports et plante C1 dans la crme tmoin
Dans cette troisime srie, les extraits de plante A ont t associs l extrait de plante
C1 selon un ratio 35 : 65. Nous avons test ce complexe de plantes 1 % de matire
sche dans la crme tmoin. Les rsultats sont exposs Tableau 43. Pour chacun de ces
essais, nous avons ralis un tmoin contenant systmatiquement le mlange de
supports de la plante A et de la plante C1 1 %.
L essai tmoin ralis avec le support S montre une conformit aux critres A
jours contre P. aeruginosa et E. coli, aux critres B contre C albicans et une non
conformit pour les deux souches restantes. Ces mmes rsultats (sauf pour S. aureus)
taient observs avec 0,5 % de support S1 seul. Nous pouvons donc peut tre lui
attribuer ces rsultats. L ajout des extraits gnre une reprise de la croissance sur toutes
les bactries, rendant le produit non conforme. Ce rsultat concide avec ce que nous
avions dj observ dans le cas de l extrait de plante A sur support S , %. Nous
notons par contre une amlioration de l activit contre A. brasiliensis (critres B). Ce
rsultat n ayant pas t observ dans le cas de la plante A sur support S 0,5 %, nous
pouvons certainement attribuer l activit la plante C et mettre l hypothse d une
synergie du mlange contre cette souche. Considrant l ensemble de ces rsultats, nous
avons dcid de mettre fin au challenge test au bout de 14 jours.
L essai tmoin ralis avec le support S2 montre une conformit aux critres A 14
jours contre P. aeruginosa et E. coli, aux critres B contre C albicans et une non
conformit pour les deux souches restantes. Ces rsultats sont les mmes que ceux que
nous avions not avec le support S2 seul 0,5 %. Nous pouvons donc peut tre lui
attribuer ces rsultats. L ajout des extraits amliore l activit contre S. aureus (critre A),
E. coli (critre A ds 2 jours contre critre B pour le tmoin) et contre C. albicans (critre
A . Aucune amlioration n est cependant observe contre A. brasiliensis. Ces rsultats
tant les mmes que ceux observs avec l extrait de plante A sur support S seul , %,
il n est pas possible de conclure sur la participation des deux extraits l activit. La
conclusion pour cet essai est que le produit n est pas conforme.
L essai tmoin ralis avec le support S montre une conformit aux critres A
jours contre toutes les souches sauf A. brasiliensis. Ces rsultats sont les mmes que ceux
que nous avions not avec le support S3 seul 0,5 %. Nous pouvons donc peut tre lui
attribuer ces rsultats. L ajout des extraits permet d amliorer l activit contre S. aureus
et E. coli. Nous n avions pas observ cette amlioration avec la plante A sur support S3
seul 0,5 %. Nous pouvons donc penser que ce rsultat dcoule de la prsence de la
plante C1. Nous notons ensuite une volution ngative sur C. albicans. En effet, l essai
tait conforme aux critres A 14 jours mais une reprise de la croissance fongique est
observe 28 jours, rendant le produit non conforme.
Tableau 43 : rsultats des challenges tests par incorporation de lextrait de plante A et plante C % dans la crme tmoin. Conformit avec les critres
Pharmacope Europenne (rductions logarithmiques et interprtation)

Critre A - NI - NI - NI / / NI / / NI
Tmoin 1,3 >3 1,1 0,2 0,0 -0,2 0,5 0,7 0,0 / / 0,0 / / -0,1
Tmoin S1S4 >3 >3 / 0,2 0,2 1,2 1,7 >3 / / / 0,9 / / 0,4
1%
Interprtation A A A B B NC B A A B NC
PAS1PCS4 1% 1,8 -0,6 0,1 1,8 -0,9 -0,7 2,7 -0,9 -0,6 / / 0,7 / / 0,8
Interprtation B NC NC B NC NC B NC NC B B
Tmoin S2S4 >3 >3 / 0,3 0,7 2,7 2,8 >3 >3 / / 1,5 / / 0,1
1%
Interprtation A A A B B NC B A A B NC
PAS2PCS4 1% >3 >3 / >3 2,7 >3 / >3 >3 >3 / >3 / / >3 >3 / / -0,1 0,0
Interprtation A A A A B A A A A A A A A A NC NC
Tmoin S3S4 >3 >3 / 0,3 1,2 >3 2,5 >3 >3 / / >3 / / 0,3
1%
Interprtation A A A B B A B A A A NC
PAS3PCS4 1% >3 >3 / >3 >3 >3 >3 >3 >3 >3 / >3 / / 2,9 1,4 / / 0,4 0,4
Interprtation A A A A A A A A A A A A A NC NC NC
2.1.4 Conclusion
Cette premire srie d essais a permis de mettre en vidence que la souche contre
laquelle les extraits sont les moins actifs est A. brasiliensis. Ce rsultat peut surprendre
car l extrait de plante A s est toujours montr trs actif sur ce champignon. Nous savons
nanmoins que ce champignon, sous forme de spore, est rsistant et qu il est frquent
que les nouveaux conservateurs soient moins actifs contre celui-ci [215]. Les diffrences
observes entre les rsultats obtenus lors des essais antimicrobiens de l extrait de
plante A et les challenge test peuvent tre dues aux diffrences de conditions
opratoires entre les essais.
Trois essais se sont particulirement distingus. Un produit prsente une conformit

aux critres A de la Ph. Eur. sur les cinq souches. )l s agit de la crme tmoin
contenant l extrait de plante A sur support S3. Cet essai met particulirement en
vidence l activit de l extrait sur A. brasiliensis. L essai contenant l extrait de la plante
A sur support S2 est tout fait intressant galement car il s avre conforme aux
critres A sur 4 souches et aux critres B sur A. brasiliensis avec une augmentation de la
dcroissance sur cette levure entre et jours. Enfin, l essai contenant l extrait de
plante A sur support S1 formul dans la crme optimise en aw se montre prometteur
car il prsente une conformit aux critres A sur les 3 bactries et le champignon tout en
tant conforme aux critres B sur A. brasiliensis.
Nous observons globalement que les supports liquides choisis participent de manire
consquente l activit notamment contre les bactries. Ces rsultats ne nous
permettent donc pas d valuer l apport des extraits sur ces micro-organismes. Nous
observons par ailleurs que la souche qui se montre la plus rsistante dans nos essais est
A. brasiliensis. Cette rsistance nous a alors permis de diffrencier les essais et de valider
les trois plus prometteurs pour poursuivre le dveloppement d un ingrdient
antimicrobien pour l industrie cosmtique. Les essais suivants devront alors tre
raliss sur un extrait dcolor, tape ncessaire pour la commercialisation. Enfin, il
restera dfinir les concentrations d utilisation puis largir les essais d autres
formes de produits cosmtiques lotions, gels, gels douches, shampoings, masques .
Enfin, si le support S3 est effectivement conserv il faudra considrer sa toxicit
potentielle lorsqu il est incorpor en concentration suprieure , % en formulations
cosmtiques.
3. DOSAGE DE LACTIF DE LA PLANTE A EN FORMULATION COSMETIQUE

Afin de contrler la consommation de l actif de l extrait de plante A aprs incorporation
en formulation cosmtique, une mthode de dosage a t dveloppe par HPTLC.
3.1 Dveloppement de la mthode

Dans une premire tape, une mthode classique de caractrisation des vgtaux a t
utilise afin de dtecter l actif d intrt. Cette mthode utilise une phase mobile
120
compose de tolune/actate d thyle/acide formique : 30 : 1 (v/v/v) pour le

dveloppement de la plaque suivi d une rvlation l anisaldhyde. )l s agit ici d une
phase mobile classique pour la migration des composs de type flavonodes apolaires. Le
rvlateur est, quant lui, caractristique des terpnodes, saponines, strols et
composs lipophiles [216].
Figure 36 : plaque HPTLC observe en lumire blanche aprs rvlation lanisaldhyde

dchantillons dextrait de plante A de rfrence EtO(/( 20 75 :25 20 mg/mL (dpt 2 L), (2)
pilote MeOH brut 20 mg/mL (dpt 2 L), (3) pilote MeOH sur support S1 20 mg/mL (dpt
2 L), (4) pilote MeOH sur support S2 20 mg/mL (dpt 2 L), (5) pilote MeOH sur support S3
20 mg/mL (dpt 2 L), (6) de rfrence EtOH/H20 75 :25 5 mg/mL (dpt 2 L) et (7) pilote
MeOH sur support S1 5 mg/mL (dpt 2L).
L actif, bien isol, apparat aprs rvlation l anisaldhyde en vert sur la plaque, avec
un rapport frontal (Rf) de 0,65 (Figure 36). Celui-ci a t pralablement identifi par
application de l actif isol selon cette mme mthode isolement de l actif par (PLC
semi-prparative et identification par RMN).
Nous avons alors analys les matrices cosmtiques avec et sans actif suivant cette
mthode. Dans un premier temps, nous avons dpos 20 L des matrices cosmtiques
pour 2 L d chantillons tmoin d extrait Figure 37). En effet, les produits cosmtiques
tests contiennent 2 ou 0,5 % d extrait de plante A mais sont dilus par avant d tre
dposs sur la plaque. Nous avons donc dpos 20 L pour comparer qualitativement la
prsence de l actif dans les produits et l extrait. Seulement, nous remarquons que ces
concentrations sont trop leves car ne permettent pas une bonne sparation ni une
bonne rsolution des composs lus des Rf suprieurs 0,65. Nous observons alors
une co-lution avec l actif recherch.
121
Figure 37 : plaque (PTLC observe en lumire blanche aprs rvlation lanisaldhyde

dchantillons de crme tmoin dilue par dpt L , de crme tmoin dilue par
contenant le support S1 20mg/mL (dpt L , de crme contenant lextrait de plante A sur
support S dilue par dpt L , de lextrait de plante A sur support S mg/mL dpt
2L), (5) de crme tmoin dilue par 10 contenant le support S1 5 mg/mL (dpt 20L), (6) de
crme contenant lextrait de plante A sur support S mg/mL dilue par 10 (dpt 20L) et (7)
dextrait de plante A sur support S mg/mL (dpt 2L).
Nous avons alors abaiss les concentrations des matrices cosmtiques (dpt de 2 L au
lieu de 20 L) pour obtenir une meilleure rsolution (Figure 38). Seulement, bien que
visuellement, nous aurions pu penser que la sparation tait bonne, l analyse des
densitogrammes des diffrents chantillons de la plaque 420 nm (bonne longueur
d onde d absorbance de la couleur verte observe montrent qu il y a une superposition
entre l actif et des composs de la matrice cosmtique , Figure 39). Cette mthode
n est donc pas adapte la quantification de l actif dans les produits cosmtiques. De
plus nous pouvons ajouter que pour raliser un dosage optimal par HPTLC, il est
prfrable que l actif doser ait un Rf situ entre , et , [216]. Nous avons alors
modifi les proportions des solvants de la phase mobile afin d en rduire la force luante
et ainsi isoler l actif des composs gras de la matrice cosmtique.
122
Figure 38 : plaque (PTLC observe en lumire blanche aprs rvlation lanisaldhyde

dchantillons (1) de crme tmoin dilue par 10 (dpt 2 L), (2) de crme tmoin dilue par 10
contenant le support S1 20 mg/mL dpt L , de crme contenant lextrait de plante A sur
support S1 dilue par 10 (dpt 2 L , de lextrait de plante A sur support S1 20 mg/mL
(dpt 2 L), (5) de crme tmoin dilue par 10 contenant le support S1 5 mg/mL (dpt 2 L),
de crme contenant lextrait de plante A sur support S mg/mL dilue par 10 (dpt 2 L) et
dextrait de plante A sur support S1 5 mg/mL (dpt 2 L).
Figure 39 : densitogramme des chantillons de la plaque (Figure 38) 420 nm. Mise en vidence
de la superposition de lactif recherch avec des composs de la matrice cosmtique.
Nous avons donc modifi la composition des solvants de dveloppement

tolune/actate d thyle/acide formique de : 30 : 1 96 : 4 : 1 v/v/v. Cette
modification abaisse la polarit du mlange.
Cette premire modification de la composition des solvants de dveloppement a

effectivement permis de modifier la sparation des diffrents composs. Nous observons
(Figure 40) que le principe actif est plus retenu et que le nouveau rapport frontal est de
0,42. Les composs de la matrice cosmtique luent galement diffremment.
Seulement, le densitogramme ralis 420 nm nous montre que nous avons de nouveau
123
une co-lution avec superposition partielle de l actif et d au moins un compos de la

matrice cosmtique.
Figure 40 : en haut plaque HPTLC reprsentant les mmes chantillons que Figure 38 dveloppe
avec un mlange tolune/actate dthyle/acide formique :4 :1 v/v/v. Rf du principe actif de la
plante A = 0,42. En bas densitogrammes des chantillons de la plaque 420nm. Superposition
partielle de lactif avec au moins un compos de la matrice cosmtique.
Dans une dernire phase d optimisation de la mthode, deux changements ont t

apports. Nous avons modifi les proportions en solvants de dveloppement 98 : 2 : 1
en tolune/acetate d thyle/acide formique et avons ralis le densitogramme du
principe actif sans rvlation l anisaldhyde. En effet, connaissant le profil UV de
l extrait de la plante par (PLC-UV, nous savions qu il prsente une trs bonne
absorbance vers 310 nm et avons donc envisag de rechercher une longueur d onde
laquelle l actif prsenterait une bonne absorbance alors que les composs de la matrice
cosmtique ayant des rapports frontaux proche absorberaient faiblement.
Suivant cette dernire mthode, l actif prsente un rapport frontal de , . Nous avons
donc ralis son profil UV et avons not un maximum d absorbance nm (Figure
41). Le densitogramme de la plaque 315 nm nous a alors permis de mettre en vidence
une trs bonne sparation de l actif et des composs de la matrice cosmtique. Nous
notons l absence de composs absorbant cette longueur d onde dans l chantillon
tmoin de crme , et l apparition de l actif dans la crme contenant l extrait. Cette
mthode est donc spcifique et nous pouvons ds lors envisager le dosage de l actif dans
les produits cosmtiques.
124
Figure 41 : gauche Profils UV de lactif dans un chantillon de crme contenant lextrait et

dextraits de plante A. Lactif prsente un maximum dabsorption nm. A droite Profils
dabsorbance nm en haut dun chantillon tmoin de crme sans plante A pour lequel
aucun signal nest dtect , , Rf de lactif ; au milieu dun chantillon de crme contenant
lextrait de plante A et dans lequel lactif est dtect , ; en bas dun chantillon tmoin
dextrait de plante A pour lequel lactif est bien identifi , .
. Dosage de lactif
Nous avons ralis les courbes d talonnages partir des extraits incorpors et doss
dans les diffrentes crmes formules. Ainsi, la courbe d talonnage de l extrait de plante
A sur support S a permis de doser l actif dans les crmes contenant ce mme extrait et
ainsi avec les 3 supports diffrents.
Nous avons pu doser l volution de la concentration de l actif dans la crme contenant
l extrait sur support S partir des premiers jours de formulation et sur une dure de
mois temprature ambiante et 1 mois 42C.
Le premier dosage a t effectu 9 jours aprs formulation. Dans les crmes contenant
2 % et 0,5 % d extrait sur support S , nous avons alors constat que la totalit de l actif
initialement incorpor tait encore prsente (Figure 42 (a) et (b)).
Des dosages ont ensuite t effectus 4 semaines date correspondant la mi-
parcours des challenges tests (J14) ainsi qu semaines fin des challenges tests et
enfin 8 et 13 semaines. Les rsultats sont rsums Figure 42. A 6 et 8 semaines, les
dosages ont t raliss sur l ensemble des crmes cosmtiques contenant les extraits de
plante A sur les 3 supports.
Dans l ensemble et la vue des erreurs sur les mesures, nous pouvons conclure une
bonne stabilit de l actif aprs mois de conservation temprature ambiante.
Les deux chantillons entreposs l tuve partir de semaines et sur une dure de
semaines montrent une chute de la concentration en actif. En effet, la concentration est
quasiment divise par dans les deux cas. )l se pourrait que l actif soit sensible la
chaleur. )l serait donc ncessaire, dans la suite des essais, de vrifier la stabilit de l actif
125
diffrentes temprature dans l extrait brut ainsi que dans des formules cosmtiques.
Cette tude permettrait de dfinir des conditions de stockage appropries.
Les tapes suivantes sont galement de poursuivre les suivis de stabilit temprature
ambiante, 42 C, mais galement en entreposant les produits dans des enceintes
faisant varier la temprature. Il serait galement intressant de raliser des dosages sur
ces produits tests par un panel de consommateurs dans des conditions classiques
d utilisation.
(a) (b)
(c)
Figure 42 : volution du pourcentage de lactif de plante A dans les crmes par rapport la
quantit thorique incorpore (Tamb). A 49 jours, des chantillons des essais contenant lextrait
sur support S1 0,5 et 2 % sont entreposs ltuve C .
3.3 Conclusion
Ainsi, nous avons pu dvelopper une mthode de dosage d un actif naturel incorpor
dans un produit cosmtique complexe par HPTLC. Cette mthode est rapide et prsente
une bonne solution pour valuer la qualit d un produit ainsi que sa stabilit dans le
temps. Les dosages raliss nous permettent de valider la bonne stabilit de l actif de la
plante A incorpor dans une crme conserve temprature ambiante pendant les trois
mois de suivi. Nous observons nanmoins une dgradation de l actif aprs semaines de
conservation des produits 42 C.
126
PARTIE III : CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
Les rsultats obtenus dans cette premire partie ont montr que l activit de l eau est un
facteur qui permet d augmenter la rsistance des cosmtiques aux dveloppements
microbiens.
Diffrents extraits de plantes ont rvls un potentiel antibactrien et/ou antifongique
lev, dont la plante A particulirement tudie au cours de nos travaux. Les essais de
dcoloration et la recherche d un support idal ont montr qu il relve du challenge que
de trouver l ingrdient universel. Nanmoins, nous avons pu dfinir que les deux
techniques de dcoloration testes permettaient de conserver l actif principalement
responsable de l activit dans l extrait. Alors que la distillation molculaire oblige
utiliser un support hydrophobe pour l extrait final, rduisant alors son utilisation pour la
cosmtique, la dcoloration au charbon actif offre plus de libert. Les tests d activit
antimicrobiens de ces extraits dcolors restent encore valider sur des extraits
mthanoliques.
Les tests antimicrobiens ainsi que les challenges tests raliss sur des crmes huile/eau
ont montr que essais s avraient des plus prometteurs.
L extrait de plante A sur support caprylyl glycol incorpor 2 % dans la crme
hydratante a rpondu aux critres A de la Pharmacope Europenne pour les challenges
tests. L extrait sur support caprylyl glycol/thylhexylglycrine mme concentration a
montr les mmes rsultats sauf sur A. brasiliensis critres B . Enfin, l extrait sur
support thylhexylglycrine s est avr trs prometteur incorpor % dans la crme
optimise, rpondant aux critres A sur toutes les souches, sauf sur A. brasiliensis
(critres B).
Bien qu il reste de nombreuses tapes franchir avant de valider un produit
commercialisable impact de la dcoloration sur l activit, largissement une plus large
gamme de cosmtiques, dfinition des concentrations minimales d inhibition, calcul du
cot de fabrication), ces premiers rsultats sont des plus encourageants.
127
CHAPITRE III
RESULTATS ET DISCUSSION
ENCAPSULATION
128
INTRODUCTION
La conception d un systme d encapsulation et de libration d actif ncessite la

connaissance des proprits physico-chimiques de la matire protger, du systme
d encapsulation et de leurs comportements respectifs et associs en produits finis
cosmtiques. Ces donnes permettront de faire les bons choix et d optimiser le
dveloppement. Parmi les critres dfinir concernant les actifs, nous pouvons citer
leur solubilit, stabilit chimique et physique, forme chimique acide, base, sel , forme
physique (liquide, solide) et caractre hydrophile/hydrophobe [ccxvii].
L objectif final de notre tude est l encapsulation d au moins un extrait de plante aux
proprits antimicrobiennes, voire antioxydantes. Les contraintes concernant ce type
d actifs sont multiples.
Les extraits sont des mlanges complexes de centaines de molcules de tailles et
proprits physico-chimiques diffrentes. Le systme d encapsulation devra donc
permettre l encapsulation simultane de molcules aux proprits varies notamment
lipophiles et hydrophiles).
L objectif de l encapsulation de l extrait est de protger partiellement le ou les actifs
responsable s de l activit biologique recherche, afin d en ralentir la consommation ou
dgradation dans le produit fini. En effet, une libration retarde devrait permettre de
prolonger la conservation du produit fini dans le temps par prservation de la
biodisponibilit de l actif tout en le protgeant d ventuelles interactions avec d autres
lments du milieu formul. Le systme d encapsulation devra donc permettre une fuite
des actifs dans le produit fini par diffusion ou destruction graduelle de la membrane de
protection.
Dans l optique de dvelopper un ingrdient conservateur naturel, le procd
d encapsulation ne doit pas ncessiter l utilisation de polymres de synthse ni de
solvants organiques car l entreprise devant fabriquer le systme par la suite n est pas
quipe pour l vaporation de solvants. De plus, en dveloppant un systme de
conservation naturel, il semble logique que le systme d encapsulation soit naturel.
Enfin, la technologie choisie ne doit pas ncessiter d investissement coteux dans du
matriel de spcialit pour la formation des capsules l chelle industrielle.
A partir des recherches bibliographiques ralises, et tout en tenant compte des
lments prcdemment exposs, nous avons slectionn des procds susceptibles de
rpondre notre problmatique. Comme le montre le Tableau 44, cinq procds se
distinguent :
La glation ionotropique
La coacervation simple/complexe
Les mulsions multiples
Les vsicules multilamellaires type oignons
129
Une pr-tude de ces quatre procds d encapsulation a t mne dans l objectif d en

choisir un susceptible d tre dvelopp et optimis pour nos actifs. C est ce que nous
allons exposer dans la section suivante.
130
Tableau 44 : analyse des diffrentes techniques dencapsulation en fonction de nos objectifs et contraintes dans la ralisation des travaux.
Technique
concevable
Aisment formulable avec des
Schage par atomisation polymres naturels (gommes Ncessite un quipement
spcifique : tour d atomisation Non [115]
(spray drying) d acacia, maltodextrines, agar,
chitosan
Ncessite un quipement
Glification/conglation spcifique
Absence de solvant Non
de gouttes (spray cooling) Tempratures de procds
pouvant affecter les actifs
Enrobage en lit dair Ncessite un quipement

Absence de raction chimique spcifique Non
fluidis
Mcaniques spcifique
Possibilit d utiliser des polymres Utilisation de solvants
Extrusion Non [115]
naturels (alginates) organiques
Haut degr de stabilit des
capsules en milieu formul
Rapid Expansion of Limit aux actifs hydrophobes

Absence de solvants organiques et
Supercritical Solutions Ncessite un quipement Non
de tensioactifs
(RESS) spcifique
Aerosol Solvent extraction spcifique Non
System (ASES)
Monomres ou polymres
Polymrisation/polycond Possibilit de faire varier la porosit synthtiques ou hmi-synthtiques
Chimiques Non [ccxviii]
ensation interfaciale de la membrane polymrique
Encapsulation de petites molcules
Possibilit de contrle de la
Physico- Evaporation/extraction Utilisation de solvants organiques
cintique de relargage Non
chimiques de solvant
Utilisation de polymres
biodgradables et biocompatibles
Technique
concevable
Porosit leve d o une fuite
Glation ionotropique Mise l chelle du laboratoire aise Oui
rapide des actifs
Oui avec des
Utilisation classique de polymre polymres
dorigine animale (glatine) dorigine
Hauts rendements d encapsulation naturelle, sans
Coacervation simple ou Agents rticulant classiques
Conditions douces (absence de agent rticulant
complexe toxiques: glutaraldhyde ou
solvants organiques et temprature toxique et selon
formaldhyde
ambiante) un procd
Formation typique de capsules
gnrant de
visibles
petites capsules
Emulsions Applications limites aux produits
Absence de solvants organiques Oui
doubles/multiples disperss
Encapsulation simultane d actifs Utilisation de solvants organiques
hydrophiles et hydrophobes
Faible rendements d encapsulation
Permabilit du systme et fuite des
Liposomes des actifs Non
actifs par diffusion travers les
membranes ou destruction graduelle Incompatibilit avec certains
des bicouches lipidiques tensioactifs

hydrophiles et hydrophobes avec de
hauts rendements
Vsicules multilamellaires Incompatibilit avec certains
Permabilit du systme et fuite des Oui
type oignons tensioactifs
actifs par diffusion travers les
membranes ou destruction graduelle
des bicouches lipidiques
PARTIE I : DEVELOPPEMENT ET VALIDATION DUN SYSTEME

DENCAPSULATION
1. VALIDATION DUN SYSTEME DENCAPSULATION

Nous avons tudi plus attentivement les quatre systmes pr-slectionns et avons,
pour certains, ralis des pr-tests afin de dfinir le systme qui constituerait la base de
notre tude.
1.1 Emulsions multiples

Les mulsions multiples sont une voie de choix, permettant l encapsulation d actifs
hydrophiles et hydrophobes par partage dans les phases aqueuses et huileuses
mulsionnes. La difficult de l encapsulation par les mulsions multiples ex : E1/H/E2)
rside principalement dans la matrise des paramtres influenant leur stabilit :
Les effets osmotique et de Laplace (diffrence de pression) entre les
gouttelettes d eau de la phase E1/H et les deux phases aqueuses E1 et E2 ;
Les interactions entre les mulsifiants de faibles et hautes (LB l interface
H/E2 ;
L influence des interactions entre le viscosifiant introduit dans la phase
aqueuse externe E2 et l mulsifiant hydrophile.
Dans le cadre de notre tude, une contrainte supplmentaire est la ncessit d un
systme d encapsulation naturel. Or, les mulsions multiples sont majoritairement
fabriques partir de tensioactifs de synthse, et/ou d huiles minrales ou de paraffine
et/ou de polymres de synthse [219].
Etant donnes ces contraintes ainsi que celle lie au temps, nous n avons pas slectionn
cette technique. Celle-ci demeure nanmoins un procd de choix qui nous parait
appropri nos exigences et demeure donc prometteuse.
1.2 Glation ionotropique

Des essais prliminaires ont t raliss par glation ionotropique afin de mieux valuer
les problmatiques en jeu pour l optimisation d un systme d encapsulation rpondant
nos objectifs.
1.2.1 Dmarche 1
La premire srie d essais a t ralise par rticulation directe d une solution d alginate
dans un bain de chlorure de sodium CaCl2 (1 % massique). Dans cette tape de
faisabilit, nous n avons pas tenu compte de la taille des capsules et avons formul des
millicapsules de diamtre moyen 2,1 0,1 mm. Deux grades d alginate fort potentiel
rticulant, se distinguant par leur potentiel viscosifiant ont t compars 1 %
massique dans l eau. Un extrait vgtal commercial hydro-alcoolique d Hypericum
133
perforatum L. (Millepertuis commun, Naturex) a t incorpor 0,5 % (massique) dans

ces solutions pour encapsulation.
Nous observons alors un relargage de l extrait dans les minutes qui suivent la formation
des capsules. La porosit est donc trop importante. De plus, nous notons un phnomne
de rticulation trop prononc car les billes formes sont dures et ne se dtruisent pas
facilement. Ce phnomne est d la diffusion des ions calcium Ca2+ l intrieur des
sphres.
Les capsules ayant t conserves quelques jours, nous avons observ que les billes
formes devaient tre maintenues en milieu humide afin d empcher leur desschement.
Pour remdier ces problmes, des solutions ont t testes dans le cadre d une
deuxime dmarche.
1.2.2 Dmarche 2
Afin de remdier au problme de la porosit, il est possible d ajouter au systme un

agent rticulant tel que du chitosan ou une gomme de xanthane.
Pour palier au problme de la rticulation, nous avons choisi de faire varier les
concentrations en alginate (0,5 2 % massique), en CaCl2 (1 10 % massique) et avons
procd par rticulation indirecte (incorporation de gouttes de CaCl2 dans un bain
d alginate et non l inverse .
Les essais ont montr que les solutions salines ne prsentaient pas une densit
suffisante pour tre incorpores simplement dans le bain d alginate et former les billes.
Nous avons alors ajout une gomme de xanthane (0,3 - 0,5 % massique) dans la solution
de CaCl2 afin d en augmenter la densit.
Avec 0,5 % (massique) de gomme de xanthane dans du CaCl2 (10 % massique), nous
avons pu former des billes dans le bain d alginate. En retirant rapidement les billes du
bain, nous avons pu obtenir des billes constitues d une paroi fine et d un cur liquide,
s ouvrant facilement sous la simple pression du doigt contre la peau.
1.2.3 Conclusion et perspectives
Cette technique n a pas t retenue pour une tude plus pousse car d autres tudes plus
prometteuses ont t dveloppes en parallle (voir ci-dessous). Toutefois, dans
l optique d une tude plus pousse, il aurait fallu travailler sur l ajout d un agent
rticulant pour limiter la porosit, et donc la fuite des extraits, ainsi que sur la rduction
de la taille des billes par modification du procd. On pourrait envisager, par exemple,
l mulsification de l une des phases aqueuses alginate ou CaCl2) dans une phase grasse
et ajout de la phase aqueuse complmentaire pour la formation de microgouttelettes
rticules. Nanmoins, les donnes bibliographiques montrent que ces techniques
d mulsification gnrent des capsules d une granulomtrie de plusieurs dizaines ou
centaines de micromtres, taille qui est trop importante pour notre projet [144,220].
134
1.3 Coarcervation complexe : Gomme arabique/lcithines

Bien que les capsules formes par coacervation complexe soient classiquement formes
par l association de la glatine polycation et d un collode charg ngativement, telle
que de la gomme arabique rticule avec du formaldhyde ou du glutaraldhyde, nous
avons souhait faire des essais de faisabilit sur des systmes ne comportant ni de
glatine produit d origine animale dont l utilisation en cosmtique tend disparatre),
ni d agents rticulants synthtiques d utilisation controverse en cosmtique. Nous
avons donc test l association d une gomme arabique et de lcithines pour la formation
de la paroi des capsules [158]. Le protocole dtaill est dcrit chapitre IV, p. 203.
Brivement, 50 mL d une solution aqueuse de gomme arabique (7,5 % m/m) ont t
ajoute 40 mL d une solution de lcithine , % m/m) ajuste pH 8 (hydroxyde de
sodium) contenant 1,25 2,50 % m/m d actif hydrophobe mulsionn l aide d un
moteur quip d une hlice dfloculeuse huile de noyau d abricot ou huile essentielle de
cannelle . L ensemble a ensuite t acidifi p( avec de l acide citrique, la raction de
coacervation tant poursuivie 30 min C. Alors que tous les essais raliss l aide
d une lcithine de soja non purifie ont conduit des observations macroscopiques et
microscopiques d agrgats ou d amas informes nous paraissant inintressants, le
systme formul avec une lcithine purifie en phosphatidylcholine (Emulmetik 930)
encapsulant une huile essentielle de cannelle a permis la formation de capsules de tailles
htrognes et agrges mais prometteuses (Figure 43). La dispersion des capsules
prcipites et agglomres dans de l huile de vaseline permet d observer de belles
capsules sphriques, les plus petites tant agrges en surface des plus grosses.
a) b)
200 m 170m
Figure 43 : photos au microscope optique des capsules formes par coacervation complexe base
de gomme arabique, de lcithine purifie et dhuile essentielle de cannelle a X observation du
concentr prcipit et b) X40 dispersion du concentr 10 % dans de lhuile de vaseline.
Ainsi, ces premiers essais de formulation de capsules par coacervation complexe sont
positifs quant cette premire caractrisation au microscope optique. Cette voie
pourrait donc tre retenue pour nos travaux, tout en gardant l esprit que notre
problmatique visant encapsuler des actifs hydrophiles et hydrophobes oblige une
135
adaptation du systme. En effet, les polymres encapsulent ici une huile essentielle
(hydrophobe). Pour remdier cela, il faudrait donc penser une tape d mulsification
des actifs polaires dans une matrice apolaire encapsuler.
1.4 Vsicules multilamellaires : oignons

Les vsicules multilamellaires de type oignon, base de phospholipides, tant
fabriques sans solvant organique et permettant l encapsulation d actifs hydrophiles et
hydrophobes avec de hauts rendements d encapsulation, nous ont paru un systme de
choix, remplissant nos objectifs [175,221,222,223]. Nous avons ralis des essais de
faisabilit partir de deux grades de lcithines riches en phosphatidylcholine et
contenant un minimum de lysophosphatidylcholine, conditions ncessaires pour la
formation des oignons (Tableau 45).
Tableau 45 : composition des phospholipides slectionns
Phospholipides Phospholipon 85G Emulmetik 930

Cosmetochem Unipex (Lucas
Fournisseurs
(Lipoid) Meyer)
% Phosphatidylcholine (PC) 89,5 95,4
% Lysophosphatidylcholine
2,7 <1
(LysoPC)
La structure des phosphatidylcholines est reprsente Figure 44.
Figure 44 : structure des phosphatidylcholines. R1 et R2 : chanes aliphatiques insatures.
En se basant sur des travaux prcdents [176,180,182,224], nous avons formul un

systme contenant 55 % (en masse) de phospholipides et 45 % de phase aqueuse. Pour
ces essais, nous avons simplement utilis de l eau pour la phase aqueuse. La formation
des oignons est ralise grce plusieurs tapes de cisaillement du mlange alternes
par des phases de centrifugation. Le systme obtenu est un concentr de vsicules, qui
une fois disperses dans l eau, forment les vsicules multilamellaires concentriques
souhaites : les oignons.
136
Phospholipon 85G Emulmetik 930
Figure 45 : observation au microscope optique, grossissement X , des dispersions doignons

contenant 55 % massique de phospholipides et 45 % massique deau. A gauche : formulation
base de Phospholipon 85G. A droite : formulation base dEmulmetik . Les flches indiquent de
petites vsicules sombres, contenant donc de nombreuses bicouches, signature des oignons.
Comme le montrent les observations au microscope optique des dispersions de

vsicules obtenues partir des deux grades de phospholipides, le phospholipon 85G
permet la formation de vsicules plus petites, homognes et concentriques (plus les
vsicules observes sont sombres, plus le nombre de bicouches est important) que
l Emulmetik . Ce dernier gnre la formation de vsicules htrognes, avec
notamment de grosses vsicules multilamellaires, dmontrant par l que la composition
du systme n est pas optimale. En effet, ce phnomne est synonyme d un gonflement
des bicouches lors de la ralisation de la dispersion des oignons dans l eau. Ceci peut
s expliquer par un manque d eau dans les bicouches lamellaires %) pour atteindre
leur gonflement maximal.
La formation de capsules de petite taille, homognes et trs majoritairement structures
en oignons, partir du phospholipon 85G nous a sembl un excellent choix pour
poursuivre nos essais. La possibilit d encapsuler tout autant une phase hydrophile
qu hydrophobe l aide de ce systme entre en parfaite adquation avec notre
problmatique. De plus, le procd de formulation des capsules est simple et rapide
mettre en uvre. Enfin, l utilisation des phospholipides de soja, produits naturels,
s accorde avec le projet d encapsuler et vectoriser un extrait naturel.
1.5 Conclusion
Au regard de ces essais de faisabilit, les contraintes observes et rsultats
obtenus nous ont incit choisir de dvelopper lencapsulation dextraits
vgtaux dans le systme lipidique multilamellaire que sont les oignons.
137
2. DEVELOPPEMENT DU SYSTEME DENCAPSULATION RETENU :

VESICULES MULTILAMELLAIRES TYPE OIGNONS
Les extraits vgtaux sont des mlanges de centaines de molcules de proprits

physico-chimiques diffrentes. Or, lors du dveloppement et de l optimisation d un
systme d encapsulation, il est ncessaire de connatre une ou plusieurs molcules
d intrt s de l extrait et d tre capable de les doser afin de pouvoir valuer l efficacit
du systme les retenir. Ainsi, nous avons fait le choix de dmarrer l optimisation du
systme d encapsulation partir d analytes modles
2.1 Choix des analytes

Les analytes choisis pour dvelopper le modle sont la rutine et la naringnine. Ils nous
ont paru adquats car ce sont deux flavonodes trs prsents dans le monde vgtal et
connus pour leurs proprits antimicrobiennes et antioxydantes [225,226,227,228].
De plus, ce choix nous a permis d valuer le systme sur deux molcules de proprit,
taille, structure et polarit diffrentes (Tableau 46).
Ces actifs sont aisment spars et doss par HPLC-UV 258 nm pour la Rutine et
290 nm pour la Naringnine (Figure 46). Nous observons sur le profil 290 nm que la
Rutine y absorbe fortement, mais pas autant qu nm.
Tableau 46 : caractristiques de la rutine et la naringnine
Solubilit dans
Composs Structure M (g/mol) Rf
leau mg/L
Rutine 610,52 45 [229]
Naringnine 272,25 0,35.10-3 [230]
Afin d tudier l encapsulation des actifs choisis dans les oignons, plusieurs tapes ont t
tablies et suivies systmatiquement.
La formation des oignons a tout d abord t valide par microscopie optique. Le
diamtre moyen des particules ainsi que le profil de rpartition des tailles
(polydispersit) ont ensuite t mesurs par diffraction laser. Puis une mthode de
dosage des actifs non encapsuls a t optimise par HPLC-UV-DAD. Enfin, plusieurs
mthodes de sparation des capsules de leur milieu de dispersion ont t testes :
138
La chromatographie d exclusion SEC

l ultracentrifugation
Figure 46 : profils HPLC-UV de la rutine et de la naringnine.
PARTIE II : DEVELOPPEMENT ET OPTIMISATION DES OIGNONS EN

FONCTION DES PHOSPHOLIPIDES
1. MATIERES PREMIERES
Comme dfini prcdemment (p. 137), nous avons choisi de formuler les oignons avec
pour base de phospholipides, le Phospholipon 85G. La premire tape du
dveloppement a t la modification de la nature de la phase aqueuse. Alors que le
systme est habituellement formul avec de l eau comme phase hydrophile, nous avons
substitue celle ci par un mlange glycrine/propylne glycol 60 : 40 v/v (nomm
mlange G-PG). Ce mlange a t dfini en adquation avec les rsultats de solubilit
obtenus dans le chapitre )) avec l extrait de plante A p. .
Les essais de substitution de l eau par le mlange G-PG ont t raliss sur une
composition de lipides/phase hydrophile 55 : 45 (m:m), la phase hydrophile tant
constitue de G-PG pur ou contenant de la rutine et de la naringnine 30 et 8 mg/mL
respectivement.
1.1 Microscopie
L observation au microscope optique Figure 47) des dispersions de capsules formules
avec le mlange G-PG (sans puis avec actifs) montre la formation de vsicules
multilamellaires, nombreuses et homognes en forme et en taille. Aucune influence
notable de l ajout des actifs dans le G-PG n est visualise par microscopie.
139
Figure 47 : photo au microscope optique X dune dispersion de capsules de ratio lipide / G-PG
55 : 45, ( gauche) sans actif, ( droite) avec la rutine et la naringnine solubilises 30 et
8 mg/mL respectivement dans la phase G-PG.
1.2 Granulomtrie
Figure 48 : distribution volumique de la taille des vsicules formules avec le phospholipon

85G, suivant un ratio lipides/phase aqueuse 55 : 45 (m :m), en fonction de la nature de la
phase aqueuse : eau, GPG et GPG + rutine/naringnine 30 et 8 mg/mL.
Les mesures des tailles des vsicules sont ralises par diffraction laser. Suivant cette
mthode, la distribution granulomtrique d un mlange est dduite de l interaction
entre le mlange de particules et le faisceau laser incident par l analyse de la tache de
diffraction du faisceau. Plus particulirement, les particules analyses diffractent la
lumire incidente du laser selon un angle inversement proportionnel leur taille. Ainsi,
les petites particules diffractent aux grands angles avec une faible intensit alors que les
plus grandes diffractent aux petits angles avec une forte intensit. L appareil mesure
140
alors l intensit diffracte l aide de dtecteurs photosensibles. La technique s applique

aux particules sphriques, dont l indice de rfraction est connu.
La distribution granulomtrique des capsules en fonction de la nature de la phase
hydrophile (eau, G-PG et G-PG+actifs) a t mesure (Figure 48). Nous notons alors que
la substitution de l eau par le G-PG gnre une nette modification de la distribution
volumique des capsules. Lorsque la phase hydrophile est de l eau, nous observons une
premire distribution de taille allant de 40 nm 1,445 m avec un pic 240 nm et une
deuxime distribution allant de 1,660 m 91,201m avec un pic 6,607 m.
La distribution de taille lorsque l eau est substitue par le G-PG est plus fine. Nous
n observons pas d influence notable lorsque les actifs sont ajouts. Les oignons
contenant les actifs prsentent une distribution de taille de particules allant de 120 nm
4,365 m avec un pic 417 nm.
Ces mesures confirment les observations microscopiques.
1.3 Nanoparticules et rglementation

Les mesures granulomtriques nous ont conduits nous interroger sur l utilisation de
ces vsicules dont certaines prsentent des tailles infrieures 100 nm, alors dfinies
comme des nano-objets.
Depuis le 11 janvier 2013, les nanomatriaux contenus dans les produits cosmtiques
doivent tre notifis la Commission europenne. En effet, les substances l tat
nanoparticulaire sont trs utilises par diffrents secteurs (alimentation, aronautique,
cosmtique, nergies alternatives, pneumatique, sant pour leurs proprits
particulires et spcifiques. Or, comme l a soulign le communiqu de la Commission
europenne du 3 octobre 2012, une substance peut prsenter des profils de danger
diffrents selon qu elle soit l tat nanoparticulaire ou non [231]. En effet, lorsque la
taille d une particule diminue, sa ractivit augmente et on peut alors observer une
modification des proprits physiques, biologiques et chimiques. La taille peut donc
avoir une incidence sur la scurit des matriaux [232].
Les nanomatriaux tant encore peu connus, notamment en ce qui concerne les risques
qu ils peuvent prsenter, la Commission europenne a voulu tablir une dfinition claire
CE n / /UE pour s assurer que des rgles de scurit chimique appropries
sont appliques :
1 On entend par nanomatriau un matriau naturel, form accidentellement
ou manufactur contenant des particules libres, sous forme dagrgat ou sous forme
dagglomrat, dont au moins 5 % des particules, dans la rpartition numrique par taille,
prsentent une ou plusieurs dimensions externes se situant entre 1 nm et 100 nm.
2 Dans des cas spcifiques, lorsque cela se justifie pour des raisons tenant la
protection de lenvironnement, la sant publique, la scurit ou la comptitivit, le
seuil de 50 % fix pour la rpartition numrique par taille peut tre remplac par un seuil
141
compris entre 1 % et 50 %.
3 Par drogation au point 2, les fullernes, les flocons de graphne et les

nanotubes de carbone paroi simple prsentant une ou plusieurs dimensions externes
infrieures 1 nm sont considrer comme des nanomatriaux.
Il est considrer que cette dfinition sera revue en 2014 la lumire des progrs
techniques et scientifiques [233,234].
La rglementation cosmtique dfinit quant elle le nanomatriau comme un matriau
insoluble ou bio-persistant, fabriqu intentionnellement et se caractrisant par une ou
plusieurs dimensions externes, ou une structure interne, sur une chelle de 1 100 nm.
Au vu de ces dfinitions, les matriaux solubles et non bio-persistant telles que les
structures vsiculaires labiles dont font partie les liposomes et autres structures uni- ou
multi-lamellaires sur lesquels se sont ports nos choix de travaux ne sont pas dclarer
comme nanomatriaux [235,236,232].
2. RENDEMENTS DENCAPSULATION
Afin de calculer les rendements d encapsulation, il est ncessaire de sparer les actifs
non encapsuls des capsules. Diffrentes mthodes peuvent tre envisages pour y
parvenir telles que la dialyse [165], l ultracentrifugation [237], la chromatographie
d exclusion strique SEC [238], l extraction sur phase solide [239]. Nous avons
compar l ultracentrifugation et la SEC.
2.1 Comparaison des mthodes de sparation

2.1.1 Ultracentrifugation Chromatographie dexclusion strique
Dans un premier temps, nous avons prpar des dispersions d oignons contenant de la
rutine et de la naringnine (systme phospholipon 85G/(G-PG+actifs) 55 : 45) et avons
spar les actifs libres des actifs encapsuls suivant les deux mthodes.
Par ultracentrifugation, nous avons rcupr le surnageant et l avons analys par (PLC-
UV (voir protocole de prparation des chantillons chapitre IV, p. 209).
Par SEC, nous avons fractionn l chantillon de vsicules par dpt sur phase d exclusion
puis lution avec de l eau. Nous avons ainsi rcupr dans les premires fractions les
vsicules, suivies des actifs non encapsuls, lments plus petits. La rutine, de masse
molaire et de volume plus importants que la naringnine, a t rcupre avant cette
dernire. Les fractions contenant les oignons ont t traites avec un tensioactif non-
ionique, le Triton X100, permettant leur destruction pour librer les actifs pigs.
L ensemble des fractions a t analys par (PLC-UV. Nous noterons que deux phases
d exclusion ont t compares, une Sephadex G base de dextrane polymre
ramifi de dextrose rticul avec de l pichlorohydrine et une Sephacryl (R
base d acrylique copolymre de dextrane et de bisacrylamide). La premire, permet la
142
sparation de molcules de faibles poids molculaires (100-800 g/mol), la deuxime

tant mieux adapte des molcules de plus haut poids molculaire (104-2.106 g/mol).
La Sephadex s est montre peu adapte nos chantillons. En effet, bien qu elle ait
permis une bonne sparation des capsules et des deux analytes, les volumes d lution
taient bien trop importants (12-140 mL pour la rutine et 170-350 mL pour la
naringnine . La Sephacryl tait alors idale avec de faibles volumes d lution par
comparaison (6-25 mL pour la rutine et 15-40 mL pour la naringnine) tout en
permettant une bonne sparation entre les vsicules et les analytes. Suite ces essais
prliminaires de comparaison de phases, tous les essais d exclusion ont donc t raliss
avec la Sephadex 300HR.
Afin de valider la mthode de sparation par exclusion strique, les profils d lution de
solutions d actifs et de dispersions d oignons contenant l actif ont t compars pour
voir si un recouvrement pouvait avoir lieu et entraver la sparation vsicules/actifs
libres (Tableau 47).
Tableau 47 : caractrisation du fractionnement des actifs avec et sans oignons, avec la Sephacryl
300HR
% actif dos
Recouvrement
Volume dlution mL aprs
oignons/actif libre
fractionnement
Rutine 6-25
Oignons contenant de Non 106,0 4,0 %
1,5-5,0
la Rutine
Naringnine 15-40
Oignons contenant de Non 99,1 3,2 %
2,0-5,0
la Naringnine
N ayant pas observ de recouvrement entre les volumes d lution des oignons et des
actifs libres, la mthode a t valide.
La sparation et rcupration des actifs libres et encapsuls nous a permis de
dterminer les rendements d encapsulation des deux actifs Tableau 48, colonne 1). Le
rendement d encapsulation est le rapport entre les molcules encapsules et la totalit
des molcules introduites, exprim en pourcentage. Nous remarquons alors une
diffrence significative de rsultats entre les deux techniques avec des rendements
d encapsulation suprieurs lorsque la technique applique est l ultracentrifugation.
Nous avons alors envisag deux explications ces rsultats. L ultracentrifugation tant
ralise 4 C et l exclusion temprature ambiante, un phnomne de prcipitation
des actifs pouvait tre envisag froid. Nous pouvons noter ce stade que les
concentrations en actifs solubiliss dans le mlange G-PG sont trs nettement
suprieures aux limites de solubilit dans l eau Tableau 46). Donc si les rendements
d encapsulation sont faibles, nous pouvons nous attendre une prcipitation des actifs
libres dans la phase aqueuse de dispersion. Ensuite, nous avons galement pens qu une
143
partie des actifs libres pouvaient s adsorber en surface des oignons, ce phnomne
pouvant alors tre accentu par ultracentrifugation.
Les essais raliss avec des solutions contenant seulement les actifs, en l absence de
vsicules donc, montrent que l exclusion permet de rcuprer la totalit des actifs
(Tableau 48, colonne 2). Par ultracentrifugation, nous observons par contre une trs
lgre prcipitation (visible dans le culot du tube). Ceci est confirm par le dosage,
puisque notamment pour la naringnine, la totalit de la molcule n est pas retrouve
(93,76,7%). Toutefois, cette faible prcipitation ne peut expliquer un tel cart de
rendements d encapsulation entre les deux techniques.
Afin de vrifier l hypothse de l adsorption, nous avons prpar des oignons blancs
(oignons sans actifs, contenant simplement les lipides et le mlange G-PG) que nous
avons disperss dans une solution aqueuse contenant la rutine et la naringnine aux
concentrations quivalentes celles contenues normalement dans les dispersions
d oignons cRut = 289 g/mL et cNar = 77 g/mL). Les rsultats (Tableau 48, colonne 3)
montrent alors une adsorption systmatique des actifs en surface des oignons. Mais l
encore, les valeurs diffrent d une mthode l autre. Une raison possible ces
diffrences est la dure du protocole exprimental. En effet, la sparation par
ultracentrifugation dure 5 h, alors que le temps de dispersion appliqu avant sparation
par exclusion est d environ min. Nous avons donc ralis une cintique d adsorption
avant sparation par exclusion (Figure 49).
Tableau 48 : rendements dencapsulation et dadsorption de la rutine et la naringnine par

ultracentrifugation et chromatographie dexclusion
Rendements Rendements
Tmoins (actifs libres)
% dencapsulation dadsorption
UC* Exclusion UC Exclusion UC Exclusion
Rutine 71,2 1,0 32,0 6,6 97,3 1,6 106,0 4,0 67,3 1,1 17,9 0,6
Naringnine 99,6 0,2 63,1 8,1 93,7 6,7 99,1 3,2 99,8 0,1 65,6 1,9
*UC : Ultracentrifugation
Le pourcentage d adsorption de naringnine n augmente que trs faiblement et avec

constance (de 66,9 71,9 %) sur la priode de 27 h tudie, et peut alors tre considr
comme stable. Nous observons une cintique d adsorption plus marque de la rutine
entre 10 min et 2 h (de 18,4 24,7 %) qui se stabilise ensuite.
Sur la base de ces rsultats, nous avons conclu que les conditions de sparation par
ultracentrifugation devaient favoriser le phnomne d adsorption des actifs en surface
des oignons. Cette observation, couple la lgre prcipitation des actifs observe par
centrifugation, nous a conduit choisir la sparation par exclusion strique pour la suite
de nos travaux. Tenant compte de la cintique d adsorption des actifs en surface, nous
avons optimis le protocole de prparation des chantillons en appliquant un temps de
dispersion systmatique de 3 h avant sparation et dosage.
144
Figure 49 : cintique dadsorption de la rutine g/mL) et de la naringnine (77 g/mL) sur

des oignons blancs en fonction du temps de dispersion avant sparation par exclusion
2.2 Phnomne dadsorption et calcul des rendements

dencapsulation
Le phnomne d adsorption observ n est pas surprenant. Dans le cadre d tudes sur
l encapsulation d une protine dans les oignons, il a t montr que celle-ci pouvait
s adsorber leur surface [176]. De plus, Van Dijk et al. ont dmontr que les flavonodes
avaient une forte affinit avec la surface des vsicules lipidiques [240]. Effectivement, les
structures des analytes (rutine et naringnine) et des phospholipides sont propices la
formation de liaisons hydrognes entre les groupements hydroxyl (OH) des flavonodes
et la tte polaire des phospholipides [241].
Ce phnomne d adsorption mis en vidence, nous nous sommes alors interrogs sur les
rendements rels d encapsulation des actifs l intrieur des vsicules et sur la manire
de les calculer. Nos expriences nous permettent en effet de mesurer un pourcentage
d adsorption %A ainsi qu un pourcentage d encapsulation et adsorption %E+A, mais pas le
pourcentage d encapsulation %E comme schmatis Figure 50.
Pour ce faire, nous avons dvelopp un modle mathmatique prsent ci-dessous.
Le pourcentage d encapsulation et adsorption est dfini comme suit :
mE A mEA
%E A 100 (1)
mF mA mE mE mE A
O mE+A reprsente la masse d actifs encapsuls et adsorbs, mF la masse d actifs libres,

mA la masse d actifs adsorbs, et mE la masse d actifs encapsuls dans les oignons. Ce
pourcentage est mesur sur une dispersion d oignons dans lequel l actif a t encapsul
aprs sparation par SEC et destruction par TX100 de la fraction contenant les oignons.
Le pourcentage d adsorption est :
% = (2)
+
145
Figure 50 : reprsentation schmatique a dune dispersion doignons encapsulant la rutine et la

naringnine, b dune dispersion doignons blancs dans une solution contenant la rutine et la
naringnine et c dun oignon contenant uniquement la rutine et la naringnine encapsules.
Ce pourcentage est calcul partir d oignons blancs disperss dans une solution
contenant un actif, aprs sparation par SEC et destruction par le TX-100. Enfin, le
pourcentage d encapsulation s crit :
mE m mA
%E 100 E A (3)
mF mE A mF mE A
)l est alors possible d exprimer %E en fonction de %E+A et %A comme suit :
L quation dans l quation donne :
mA
%E %E A 100 (4)
mF mE A
146
Les quations 1 et 2 conduisent :
% % % +
= = ( ) (5)
+ % + + %
L quation dans l quation permet d obtenir :
% + %
% = (6)
%
Nous obtenons alors une expression du pourcentage d encapsulation %E en fonction des

pourcentages d adsorption et d encapsulation+adsorption. Ces deux derniers pouvant
tre sparment obtenus par l exprience, nous pouvons ds lors distinguer
l encapsulation de l adsorption dans les vsicules.
2.3 Rendements dencapsulation des oignons

A partir de l quation (6) et des mesures des %E+A et %A obtenues pour les oignons
composs de 55 % (en masse) de phospholipon 85G et 45 % (en masse) de matrice G-PG
(glycrine/propylne glycol 60 :40 v/v) contenant 30 mg/mL et 8 mg/mL de rutine et
naringnine, nous obtenons un rendement d encapsulation de la rutine de , 2,2 %.
Par contre, nous remarquons que nous n encapsulons pas la naringnine alors qu elle est
adsorbe plus de 64 % (Figure 51).
Figure 51 : pourcentages dencapsulation+adsorption %E+A et pourcentages dadsorption % A

mesurs pour la rutine et la naringnine dans le systme Phospholipon 85G/G-PG 55 : 45 et
pourcentages dencapsulation %E calculs. La matrice G-PG contient 30 mg/mL et 8 mg/mL de
rutine et naringnine respectivement.
Ces rsultats montrent que le phnomne d adsorption est ici prdominant pour la
rutine et exclusif pour la naringnine. L adsorption ne peut donc tre nglige dans nos
systmes. Mme si la rutine est partiellement encapsule, elle ne l est que trs
faiblement, montrant alors que ce systme n est pas optimis ce stade.
147
3. SUBSTITUTION DU PHOSPHOLIPIDE
Les faibles rendements d encapsulation obtenus, ainsi que la cessation de production du
phospholipide 85G utilis dans la composition prcdemment expose, nous ont amens
tester de nouveaux phospholipides dans une optique de dveloppement et
optimisation du systme. Aprs une recherche auprs de nouveaux fournisseurs, nous
avons obtenu et slectionn deux grades de phospholipides riches en
phosphatidylcholine (PC) et contenant de la lysophosphatidylcholine (LysoPC) :
l Emulmetik Unipex, Lucas Meyer et le Lipoid ( (Cosmetochem, Lipoid).
L Emulmetik est dj dcrit dans le Tableau 45 et avait t test lorsque la phase
hydrophile tait de l eau. Le Lipoid ( contient quant lui , % de PC et LysoPC avec
moins de 5 % de LysoPC.
3.1 Microscopie
Nous avons formul des oignons de composition lipides/phase hydrophile 55 : 45
(m :m) avec ces deux phospholipides. Des essais ont t raliss avec trois phases
hydrophiles :
Eau
Mlange G-PG
Mlange G-PG+ rutine/naringnine 30/8 mg/mL
La formation d oignons a t valide pour les deux phospholipides tests : l Emulmetik

930 et le Lipoid 75H. Nous noterons que les concentrations de 8 et 30 mg/mL tudies
correspondent aux limites de solubilits obtenues lorsque les actifs ont t solubiliss
dans le G-PG sous agitation magntique, 30 C.
3.2 Granulomtrie
Les mesures de granulomtrie ont t ralises sur le mme modle qu en 3.2 (mme
ratio lipides/phase aqueuse et mmes phases aqueuses). Les rsultats montrent que
lorsque la phase hydrophile est compose d eau, la taille des particules est
systmatiquement suprieure aux tailles mesures lorsque la phase aqueuse est
substitue par le mlange G-PG, et ce quelque soit le phospholipide considr. Comme
prcdemment, nous observons que la prsence des actifs n influence pas ou trs peu la
taille des particules. Enfin, une diffrence est observe entre les deux matires
premires testes. En effet, les particules base de G-PG sont systmatiquement plus
petites avec le Lipoid 75H (pic 316 nm avec ou sans actif qu avec l Emulmetik 930 (pic
417 nm sans actif et 479nm avec les actifs).
148
Figure 52 : distribution volumique de la taille des vsicules formules avec lEmulmetik et le

Lipoid 75H, suivant un ratio lipides/phase aqueuse 55 : 45, en fonction de la nature de la phase
aqueuse : eau, G-PG et G-PG + rutine et naringnine 30 et 8 mg/mL respectivement.
3.3 Rendements dencapsulation

Les rendements d encapsulation+adsorption, %E+A, mesurs partir de ces deux
phospholipides sont bons pour les deux actifs (Figure 53). En effet, les %E+A de la rutine
sont de 66,6 3,3 % avec l Emulmetik et de , 4,9 % avec le Lipoid 75H, ce qui
est nettement suprieur aux rsultats que nous avions obtenus avec le Phospholipon
85G (32,0 6,6 %). Les %E+A obtenus pour la naringnine sont quivalents ceux
obtenus avec le Phospholipon 85G (%E+A = 63,1 8,2 %), avec %E+A = 64,7 2,0 pour
l Emulmetik et %E+A = 62,8 1,0 % pour le Lipoid 75H.
Nous observons de nouveau une adsorption systmatique des actifs en surface des
oignons. Cette adsorption demeure relativement faible pour la rutine avec environ 15 %
d adsorption avec les deux lipides. Par contre, comme prcdemment, l adsorption de la
naringnine est trs importante et quivalente aux %E+A mesurs. L application du calcul
pour obtenir les rendements d encapsulation des actifs montre alors que la rutine est
encapsule 49,8 2,5 % avec l Emulmetik et , 3,6 % avec le Lipoid 75H. Ces
rsultats sont suprieurs ceux obtenus avec le phospholipon 85G, rendant ces matires
premires plus intressantes. L Emulmetik se distingue alors par le plus haut
rendement d encapsulation de la rutine. Puis, nous constatons de nouveau que, quelque
soit le phospholipide, la naringnine n est pas encapsule mais seulement fortement
adsorbe.
Figure 53 : pourcentages dencapsulation+adsorption %E+A et pourcentage dadsorption %A

mesurs pour la rutine et la naringnine dans le systme ( gauche) Emulmetik 930/G-PG 55 : 45
et ( droite) Lipoid 75H/G-PG ainsi que les pourcentages dencapsulation % E calculs. La matrice
G-PG contient 30 mg/mL et 8 mg/mL de rutine et naringnine respectivement.
Pour terminer la comparaison des phospholipides, nous avons souhait encapsuler

chaque actif sparment (Figure 54 , puisque jusqu prsent les tudes avaient t
faites sur l encapsulation du mlange d actifs. En effet, les diffrences de rsultats
149
obtenus pour chacun d eux nous permettent de penser une ventuelle comptition
entre les deux molcules.
Figure 54 : pourcentages dencapsulation+adsorption %E+A et pourcentages dadsorption % A

mesurs pour ( gauche) la rutine seule et ( droite) la naringnine seule dans les systmes
phospholipides/G-PG 55 : ainsi que les pourcentages dencapsulation % E calculs. La matrice G-
PG contient ( gauche) 30 mg/mL de rutine et ( droite) 8 mg/mL de naringnine.
Le comportement de la rutine dans les oignons reste semblable aux observations

prcdentes, avec des pourcentages d encapsulation et adsorption suprieurs % et
des pourcentages d adsorption d environ %, et ce quelle que soit la nature du
phospholipide. Nous notons tout de mme des pourcentages d encapsulation lgrement
infrieurs ceux trouvs lorsque les molcules taient mlanges. L Emulmetik
demeure le phospholipide qui donne les meilleurs rsultats avec ici 44,0 %
d encapsulation de la rutine contre , % avec le Lipoid 75H.
La naringnine value seule prsente de nouveau de trs hauts pourcentages
d adsorption suprieurs % . Le Lipoid ( ne permet toujours pas d encapsuler
cette molcule. Par contre, nous obtenons 10,0 % d encapsulation grce l Emulmetik
alors que cet actif n tait pas encapsul en prsence de rutine. Il semblerait donc
que la rutine empche l encapsulation de la naringnine.
Par ailleurs, quels que soient les cas tudis, l Emulmetik est le phospholipide qui a
donn les meilleurs rsultats d encapsulation. Nous l avons donc valid pour la suite des
travaux.
PARTIE III : OPTIMISATION DES OIGNONS
L optimisation du systme d encapsulation a t ralise en plusieurs tapes. Nous

avons commenc par comparer les rendements d encapsulation en fonction de la
concentration en analytes dans un systme de composition lipide/G-PG fixe. Puis, nous
avons ensuite tudi le systme en faisant varier la quantit de lipides afin d optimiser
les rendements d encapsulation et enfin, nous avons finalis l optimisation en valuant
la concentration optimale en rutine pouvant tre encapsule. L objectif de cette tude a
t d obtenir une composition permettant l encapsulation d un maximum d analyte s .
150
1. RENDEMENTS DENCAPSULATION EN FONCTION DES

CONCENTRATIONS EN ANALYTES
Cette premire optimisation a t ralise sur l encapsulation simultane de la rutine et

la naringnine. Comme prcdemment, la composition massique en lipides/solution
d analytes a t fixe :45 (m :m). Nous avons galement conserv la concentration
initiale en analytes dans la solution encapsuler 30 mg/mL (49,1 mol/mL) en rutine
et 8 mg/mL (29,4 mol/mL) en naringnine, soit un rapport massique entre les deux
analytes de 3,75. Cette solution constitue la solution mre en analytes.
Figure 55 : dosage et calcul des rendements dadsorption et dencapsulation de la rutine en

fonction des concentrations en rutine et naringnine
La premire tape consist en l valuation des rendements d encapsulation en fonction
des concentrations en analytes, en conservant le rapport massique 3,75. Les dilutions
de la solution encapsuler ont t ralises partir de la solution mre et d une solution
de glycrine/propylne glycol 60 : 40 v/v. Comme expos Figure 55 et Figure 56, 5
dilutions ont t testes. Des mesures d adsorption d une part, et d encapsulation et
adsorption d autre part, ont systmatiquement t effectues afin d en dduire les
pourcentages d encapsulation conformment l quation (6).
Nous mesurons alors entre 15 et 30 % d adsorption de la rutine et le pourcentage
d adsorption tend diminuer lorsque les concentrations en rutine et naringnine
augmentent (Figure 55). La tendance inverse est obtenue pour le rendement
d encapsulation : plus la solution de G-PG est concentre en actifs, plus le rendement
tend augmenter. Aux concentrations testes, il semblerait que nous n observions pas
de phnomne de saturation. La quantit de rutine encapsule augmente donc avec sa
concentration. Nous obtenons systmatiquement de bons rendements d encapsulation
de la rutine. Le plus faible rendement obtenu est %E = 54,0 % 17,5 pour les
concentrations les plus faibles en rutine et naringnine (3,75 et 1 mg/mL
respectivement). Le rendement le plus lev obtenu est %E = 65,9 % 3,5 lorsque la
concentration en rutine est de 20 mg/mL et celle en naringnine de 5,3 mg/mL
151
La naringnine prsente de forts rendements d adsorption, systmatiquement

suprieurs 52,7 % 11,4 et presque toujours suprieurs 61,7 % 2,1 (Figure 56).
Sur la base des taux d encapsulation calcul et des barres d erreurs obtenues, nous
remarquons alors que la naringnine n est pas ou peu encapsule l erreur est calcule
sur la base des erreurs mesures pour les taux d adsorption et
d encapsulation+adsorption .
Figure 56 : rendements dadsorption et dencapsulation de la naringnine en fonction des

concentrations en rutine et naringnine
Suite cette srie, nous avons ralis de nouveaux essais en faisant varier la
concentration en rutine de 30 3,75 mg/mL, tout en conservant la concentration en
naringnine fixe 8 mg/mL. Notre objectif tait de voir si la rutine tait en excs
30 mg/mL. En effet Faure et al. [178] ont montr que, pour un rapport lipides/actif fix,
le rendement d encapsulation dans les oignons est constant tant que l actif n est pas en
excs. Au-del, le rendement d encapsulation chute. L optimisation de la formulation des
oignons consiste se placer cette frontire entre les deux comportements : pour cette
concentration d actifs, le nombre d actifs encapsul est maximal.
La rutine prsente des pourcentages d adsorption variant de , 0,3 % 21,4 2,6 %
(Figure 57). Comme prcdemment, cet actif est fortement encapsul, avec des
rendements systmatiquement suprieurs 60,0 %. Le rendement le plus faible est de
61,8 4,3 %, obtenu pour la concentration en rutine la plus leve. Et nous observons
une lgre augmentation des rendements d encapsulation lorsque la concentration en
rutine diminue, avec un maximum de 65,4 7,8 % pour 3,75 mg/mL de rutine.
Toutefois, ces faibles variations de rendements d encapsulation nous amnent
conclure que la rutine n est pas en excs, mme mg/mL. Nous aurions donc pu
augmenter la concentration en rutine dans nos chantillons mais ce stade, la solubilit
limite de cet actif nous en a empch.
152
Figure 57 : rendements dadsorption et dencapsulation de la rutine en fonction de la

concentration en rutine, concentration fixe en naringnine (8 mg/mL)
Quelle que soit la concentration en rutine, la naringnine est trs fortement adsorbe,
avec des rendements variant de 65,6 8,5 % 72,2 4,9 % (Figure 58). Nous observons
que la naringnine n est jamais encapsule voir barres d erreurs .
Figure 58: rendements dadsorption et dencapsulation de la naringnine en fonction de la

concentration en rutine, concentration fixe en naringnine (8 mg/mL)
Nous avons alors envisag qu il pouvait y avoir une comptition entre les deux actifs et
avons souhait encapsuler la naringnine seule (Figure 59 . La concentration de l actif a
t fixe 8 mg/mL pour la ralisation de ces essais. Nous notons de nouveau une forte
adsorption de l actif , 5,6 % , se distinguant peu du rsultat d encapsulation et
adsorption (64,9 8,5 %) et donnant alors un rendement d encapsulation de
13,8 34,6 %. Ce rendement demeure faible et similaire aux rsultats obtenus en
prsence de la rutine.
153
Figure 59 : rendements dadsorption et dencapsulation dune solution de naringnine 8 mg/mL
Ainsi nous observons que le systme permet d immobiliser environ % de chacun des
deux actifs valus, quelle que soit leur concentration. Mais ils se diffrencient trs
nettement par leur partage l intrieur ou en surface des oignons. En effet, la rutine est
majoritairement encapsule (environ 65 % pour de faibles rendements d adsorption
(environ 20 % . A l inverse, la naringnine est fortement adsorbe (environ 70 %) et pas
ou peu encapsule (environ 12 %). Plusieurs explications peuvent tre envisages. En
premier lieu, ces diffrences peuvent tre expliques par la masse molaire de la
naringnine (272 g/mol) qui est infrieure celle de la rutine (610 g/mol). La
naringnine, plus petite, peut alors fuir plus facilement travers les membranes
phospholipidiques. Par ailleurs, la naringnine tant faiblement polaire, son adsorption
en surface des oignons est alors privilgie par rapport sa solubilisation dans l eau,
solvant de dispersion. En second lieu, la configuration des molcules peut influencer leur
facilit d intercalation dans les membranes phospholipidiques. Comme montr par Van
Dijk et al., les flavonols (rutine , de configuration plane, s intercaleront plus facilement
dans les membranes vsiculaires que les flavonones (naringnine), de configuration
courbe. [240]. Enfin, Pawlikowsja et al. ont conclu que les petits flavonoides se
localisent prfrentiellement dans la partie haute des bicouches, interagissant avec
les groupes polaires via des liaisons hydrognes. Ces lments pourraient expliquer
pourquoi la rutine est retenue au sein des vsicules alors que la naringnine est
davantage en surface.
2. RENDEMENTS DENCAPSULATION EN FONCTION DE LA COMPOSITION

DU SYSTEME

Les rendements d encapsulation de la rutine tant trs suprieurs ceux obtenus pour
la naringnine, nous avons optimis la formulation des oignons avec la rutine
uniquement. Ayant obtenu un bon rendement d encapsulation pour la plus forte
154
concentration en rutine ralise (30 mg/mL), nous avons travaill dans ces conditions
de concentration.
Figure 60 : reprsentation schmatique du diagramme de phase de la composition lipide/G-PG. Le

point D se situe dans le domaine monophasique constitu de phase lamellaire, le point A se situe
la frontire du domaine monophasique et est compos de phase lamellaire gonfle au maximum, le
point B se situe dans le domaine biphasique et est compos de phase lamellaire gonfle au
maximum en prsence dun excs de phase G-PG, et le point C nest compos que de phase G-PG
(monophasique)
Des tudes antrieures ont montr que l efficacit d encapsulation maximale des
oignons est rgie par la limite de gonflement des bicouches lamellaires les constituant
[178]. En effet, en ajoutant une phase aqueuse des phospholipides, ces derniers
s organisent en une succession de bicouches spares par une phase aqueuse : la phase
lamellaire. Pour de faibles quantits de phase aqueuse, les bicouches sont proches les
unes des autres, spares par cette petite quantit de phase. Lorsque l on augmente les
proportions en phase aqueuse, la distance entre les bicouches augmente : la phase
lamellaire gonfle . A un certain stade, la quantit de phase aqueuse que peut supporter
le systme atteint un maximum (gonflement maximal). Toute phase aqueuse
supplmentaire ne pntre plus entre les bicouches, mais se trouve en excs, formant
alors un systme diphasique. Ainsi, la formulation optimale en terme de rendement
d encapsulation est celle la frontire entre les domaines monophasique et diphasique
des phases lamellaires (point A de la Figure 60)
Dans le but de trouver cette formulation optimale, nous avons prpar diffrents
chantillons variant dans leurs rapports massiques lipide/G-PG de 55/45 (m/m)
15/85 (m/m) (Figure 61). Pour rappel, la phase G-PG contient la rutine (30 mg/mL).
155
Figure 61 : dosage et calcul des rendements dadsorption et dencapsulation de la rutine en

fonction de la composition massique lipide/G-PG. La rutine est solubilise 30 mg/mL dans la
matrice G-PG
L volution du pourcentage d encapsulation en fonction du pourcentage en phase G-PG

contenant la rutine est reprsent Figure 62. Ce graphique montre une lgre
augmentation du rendement d encapsulation de la rutine de , 2,0 % 62,4 0,6 %
lorsque la proportion en phase G-PG augmente de 45 63 %, suivi par une chute linaire
des rendements.
Figure 62 : rendement dencapsulation de la rutine en fonction de la concentration massique en

phase GPG contenant la rutine 30 mg/mL dans le systme lipide/GPG
156
2.2 Dfinition de la composition optimale Modle

mathmatique
Afin de dterminer la composition optimale du systme, nous avons dvelopp un
modle mathmatique qui s appuie sur le diagramme de phases reprsent Figure 63 et
bas sur les rsultats ports sur la Figure 62.
Figure 63 : reprsentation schmatique du diagramme de phase des oignons en fonction de la

composition du systme
La composition C du diagramme de phase correspond un chantillon fait d oignons

concentrs (domaine de phase lamellaire L ). En ce point, la majeure partie de la rutine
est encapsule l intrieur des oignons et le pourcentage d encapsulation sera not %E .
La composition A correspond un chantillon fait d oignons concentrs, dans un tat de
gonflement maximal de la phase lamellaire. La composition B correspond un
chantillon diphasique o des oignons contenant la rutine sont en prsence de la phase
G-PG contenant la rutine, en excs
Nous pouvons ds lors modliser l volution du pourcentage d encapsulation %E) en

fonction des proportions en phase G-PG contenant la rutine %Rutine).
2.2.1 Domaine diphasique : chantillon B
Le pourcentage d encapsulation de la rutine est dfini par :

% = ,
=% , (7)
,
,
Avec la masse de phase rutine encapsule dans l chantillon de composition B,

,
, la masse totale de phase rutine dans l chantillon de composition B, la masse

totale d chantillon B fait de lipides et de phase rutine , et %B le pourcentage massique
de phase rutine dans l chantillon B.
Nous basant sur l hypothse que la quantit de rutine dans les oignons est fixe par le
ratio lipides/rutine dfini par le point A, nous pouvons alors exprimer la masse de rutine
dans les oignons au point B comme suit :
157
, , (8)
, , =
,
Avec , et , les masses de lipides dans les chantillons B et A respectivement et

, la masse de rutine dans l chantillon A.
L quation (8) peut tre exprime en utilisant le pourcentage de rutine dans
l chantillon de la manire suivante :
% % (9)
, , =
%
Avec %A le pourcentage massique de phase rutine dans l chantillon A.

Supposant toujours que la quantit de rutine encapsule dans les oignons est constante
et correspond celle de la composition A, nous noterons le pourcentage d encapsulation
correspondant % , . La quantit de rutine encapsule en B est alors donn par :
% ,
(10)
, = , ,
En utilisant les quations (9) et (8) dans l quation (7), nous obtenons :
% % (11)
% , =% , %

%
L quation (11) peut tre exprime ainsi :
% , % % , % (12)
% , % = %
% %
Sur la base de ce modle, en traant, nous devrions obtenir dans le domaine diphasique,
% , %
une droite de pente = %
.
2.2.2 Domaine monophasique : chantillon C
L chantillon C se trouve dans le domaine monophasique dans lequel des oignons

concentrs contenant de la rutine sont prsents. D aprs nos hypothses, le pourcentage
d encapsulation y est constant et gal % , . Ainsi, en traant % % en
fonction de %Rut dans le domaine monophasique, nous devrions obtenir une droite
passant par l origine et de pente Sm= %Erut,on .
158
2.2.3 Limite entre les deux domaines : chantillon A
Les deux droites prcdemment dfinies devraient se couper en un point qui dfinira la
composition du point A, limite entre les deux domaines et dfinition du systme de
composition optimale pour une concentration en rutine fixe.
2.2.4 Composition optimale
En traant % % = % partir des donnes exprimentales, nous

obtenons bien les deux droites, comme prvu par le modle (Figure 64). La premire
droite a une pente de 0,6091, valeur qui correspond d aprs le modle au
pourcentage optimal d encapsulation pour le systme optimis, soit , %. La
% , %
deuxime droite a une pente de -1,2212, correspondant %
. Nous pouvons ds
lors en dduire la composition optimale en phase rutine %A qui vaut 66,7 %. Ainsi, le
gonflement maximum de la phase lamellaire est obtenu pour une composition en
lipides/phase rutine 33 : 67 lorsque la concentration en rutine est de 30 mg/mL. Nous
notons par ailleurs que les deux droites s interceptent pour %Rutine = 67 % et par
dduction %ERutine = 60 %, confirmant ainsi les rsultats calculs.
Figure 64 : trac de dont lintersection donne la composition optimale du systme lipide/G-PG

33 : 67
159
3. RENDEMENTS DENCAPSULATION EN FONCTION DE LA

CONCENTRATION EN RUTINE MODELE MATHEMATIQUE
L objectif de cette partie a t de dterminer la concentration optimale en rutine dans le

systme d encapsulation.

Nous avons fix le rapport lipide/G-PG 33 : 67, composition optimale trouve dans la
partie prcdente. Dans ce systme, nous avons alors fait varier la concentration en
rutine de manire observer les fluctuations des rendements d encapsulation dans ces
nouvelles conditions. Nous avons travaill sur 8 concentrations, de 10 70 mg/mL de
rutine dans le G-PG. Les concentrations en rutine suprieures 30 mg/mL ont pu tre
obtenues en optimisant les conditions de solubilisation, notamment par l utilisation d un
bain ultrasons. Comme le montrent les rsultats exposs Figure 65, nous obtenons des
pourcentages d adsorption variant de %, cette valeur diminuant lorsque la
concentration en rutine augmente. Alors que les pourcentages d encapsulation calculs
restent relativement stables (entre 57,4 1,1 % et 62,5 1,8 %) pour les concentrations
les plus basses (entre 10 et 30 mg/mL , nous observons qu partir de mg/mL en
rutine, le pourcentage d encapsulation diminue % environ.
Cette premire observation nous permet de supposer que la concentration optimale en
rutine doit se situer entre 30 et 40 mg/mL. Afin de traiter au mieux ces donnes, nous
avons cherch les interprter grce un modle mathmatique en raisonnant sur
notre comprhension du comportement physico-chimique du systme.
Figure 65 : rendements dadsorption et dencapsulation de la rutine en fonction de la

concentration en rutine (10 70 mg/mL) pour une composition massique lipide/G-PG fixe
33 : 67.
160
3.2 Dfinition de la concentration optimale Modle

mathmatique
Dans l laboration de ce modle mathmatique, la composition du systme lipide/G-PG
est fixe alors que nous faisons varier la concentration en rutine dans le G-PG, ce qui
correspond un dplacement vertical sur le diagramme de phases reprsent Figure 66.
Figure 66 : reprsentation schmatique du diagramme de phases des oignons en fonction de la

composition. L correspond la phase lamellaire et XS la phase en excs de G-PG contenant la
rutine non encapsule.
Comme prcdemment, nous supposons que le pourcentage d encapsulation dans le

domaine monophasique est constant. Nous le noterons ici %Em.
Dans le domaine diphasique, le pourcentage d encapsulation de la rutine est dfini par
l quation :

[ ]
% = % = % (13)

+ [ ] +[ ]
O
est la quantit de matire de rutine dans la phase lamellaire, la quantit de
matire de rutine dans la phase en excs XS, [ ] la concentration en rutine dans la
phase lamellaire, le volume de la phase lamellaire, [ ] la concentration en rutine
dans la phase en excs et le volume de phase en excs.
Suivant la rgle des leviers, nous pouvons exprimer:

= (14)

(15)
=
{
Avec Vt le volume total, A la fraction volumique de rutine dans l chantillon de

composition A et B la fraction volumique de rutine dans l chantillon de composition B.
En utilisant les quations (14) et (15) dans l quation (13), nous obtenons:
161

[ ]

% = % (16)

[ ] [ ]
+

[R ]XS
En dfinissant K = [R ] L

% = % = % (17)
+
+

Comme attendu, si , = alors %E = %Em .
Relation entre et
Nous considrerons le cas o l augmentation de la concentration en rutine mne la

transition entre les domaines monophasique et diphasique, c'est--dire < < .
En supposant que la frontire entre les deux domaines est linaire, sa pente est alors
donne par:
[ ][ ]
= (18)

L quation (18) peut encore tre crite:
[ ][ ]
= = [ ][ ] (19)
Avec =

En utilisant l quation (19) dans l quation (17):

% = % (20)
+ [ ] [ ]
L inverse de %Ed peut alors tre crit:
[ ] [ ]
= + (21)
% % % %
En traant = [ ] nous devrions alors obtenir un plateau tant que [Rut] [Rut]*
%
(puisque K=0 dans ce cas) correspondant , et ensuite une droite (ds lors que
%
[ ]
[Rut] > [Rut]*) de pente = et d ordonne l origine % [ ]
%
162
3.3 Composition optimale

Sur la base de ce modle, nous avons donc trac l inverse du pourcentage
d encapsulation en fonction de la concentration en rutine partir des rsultats
exprimentaux (Figure 67). Les rsultats obtenus sont en accord avec le modle. Le
plateau observ pour les concentrations les plus faibles dfinit un pourcentage
d encapsulation maximal de , 2,4 %, ce qui concorde avec les rsultats obtenus
dans les parties prcdentes. La concentration optimale en rutine est dfinie par
l intersection des droites et se situe mg/mL.
Figure 67 : trac de linverse du pourcentage dencapsulation en fonction de la concentration en

rutine. Lintersection des droites dfinit la concentration optimale en rutine, mg/mL.
Dans l ide d affiner notre comprhension du comportement du systme, nous avons

ralis ces mmes essais de variation de la concentration en rutine sur un systme de
composition lipides/G-PG fix 25 : . Pour ce cas particulier, nous n avons pas ralis
les essais d adsorption et nous nous sommes seulement concentrs sur les rsultats
d encapsulation et d adsorption. En effet, nous avons pu remarquer tout au long de nos
essais que les tendances observes entre l encapsulation d une part et l encapsulation et
adsorption d autre part sont les mmes les taux d absorption tant faibles, cela peut
expliquer que l on puisse travailler avec le taux d immobilisation, c'est--dire le taux de
molcules encapsules et adsorbes). Aussi avons nous pu comparer ces nouvelles
donnes avec celles obtenus pour le systme lipides/G-PG 33 : 67 (Figure 68). Avec ce
nouveau ratio, nous observons de nouveau un plateau aux faibles concentrations en
rutine puis une droite aux concentrations plus leves. Par comparaison avec le systme
prcdent, nous remarquons que les droites se coupent pour une concentration en
rutine plus faible, 15 mg/mL. Ainsi, nous pouvons en conclure logiquement que lorsque
la quantit de lipides dans le systme diminue, le domaine monophasique se restreint et
les concentrations d encapsulation optimale diminuent.
163
Figure 68 : trac de linverse des pourcentages dencapsulation et adsorption en fonction de la

concentration en rutine pour les systmes lipides/G-PG 33 : 67 et 25 : 75.
4. CONCLUSION
Ainsi, les essais raliss ont permis d optimiser l encapsulation de la rutine dans les
oignons et de dfinir que la composition optimale comporte 33 % de lipides et 67 % de
G-PG contenant 30 mg/mL de rutine. Ce systme permet d encapsuler , % de la
rutine, soit 16,54 mol de rutine par gramme d oignons. Cette valeur est suprieure
celle obtenue par Park et al. qui sont parvenus encapsuler la rutine 58 % dans des
liposomes base de cramide [242]. Une autre tude d encapsulation de la rutine dans
des liposomes a t ralise par Goniotaki et al. qui ont obtenu 71 10 %
d encapsulation [243]. Cependant, Goniotaki et al. n ont pas ralis de mesures
d adsorption. Si nous considrons notre rsultat combinant l encapsulation et
l adsorption, nous avons obtenu pour ce systme , 1,3 % de rtention de la rutine.
Ce rsultat est tout fait comparable celui de M. Goniotaki et al. si nous considrons
leur dviation standard.
Enfin, les donnes exprimentales recueillies sont conformes aux modles
mathmatiques dvelopps qui peuvent alors servir de base dans le cadre de
l optimisation de nouveaux systmes d encapsulation de type oignons.
PARTIE IV : CARACTERISTIQUES DU SYSTEME OPTIMISE
Afin de comparer ce systme optimis au premier systme travaill (2.1 , nous l avons
observ au microscope et avons ralis des mesures granulomtriques.
1. MICROSCOPIE
L observation au microscope optique montre la formation de vsicules multilamellaires,
nombreuses, homognes en forme et plutt htrognes en taille.
164
Figure 69 : rhoto au microscope optique X dune dispersion de capsules optimises : rapport

lipides/G-PG 33 :67, concentration en rutine dans le G-PG: 30 mg/mL.
2. GRANULOMETRIE
Les mesures granulomtriques ont t ralises sur la composition massique optimise
(33 :67), mais contenant 25 mg/mL de rutine. En effet, nous avons souhait suivre la
stabilit du systme sur environ un mois. Or, nous avons remarqu que la rutine non
encapsule des dispersions de capsules de concentrations suprieures ou gales 30 mg
de rutine/mL prcipitait au bout de quelques jours. Ce phnomne n tant pas observ
25 mg/mL, nous avons ralis le suivi de stabilit cette concentration.
La distribution de taille de ces capsules J0 (courbe orange, Figure 70) montre une
distribution plutt homogne entre 52 nm et 1,10 m avec un pic 158 nm ainsi que
quelques capsules entre 1,905 et 17,38 m. Nous notons que cette distribution de taille
est bien plus petite que celle que nous avions obtenue lors des premiers essais o les
deux actifs taient encapsuls simultanment (pic 479 nm, 3.2).
Les mesures ralises sur les oignons conservs sous leur forme concentre (non
disperss) montrent que le systme est extrmement stable (courbe rouge). La
distribution est lgrement plus fine, de 52 417 nm avec le mme pic 158 nm et
quelques capsules entre 1,7 et 17 m. Ce mode de conservation est donc d intrt pour
les capsules.
Les mmes mesures ont t effectues sur un chantillon conserv 5 semaines sous
forme disperse ( 25 mg/mL d onions dans l eau et nous observons de nouveau que la
taille des capsules reste stable (courbe verte). Le nombre de petites capsules tend
augmenter lgrement, ce qui est normal car, sous forme disperses, les couches
suprieures se dsagrgent petit petit, entrainant une libration des actifs et une
diminution de la taille des plus grosses capsules.
165
Figure 70 : distribution granulomtrique doignons de composition lipides/G-PG 33 : 67 contenant

25 mg/mL de rutine J0 (courbe orange), aprs 4 semaines conservs sous forme concentrs
courbe rouge et aprs semaines conservs sous forme disperss dans leau mg/mL
doignons dans leau courbe verte . Tous les chantillons sont conservs temprature ambiante.
Ainsi, la stabilit de la taille des capsules est bonne sur environ un mois, quelque soit la
forme de conservation teste.
3. CINETIQUE DE RELARGAGE
Une cintique de relargage de la rutine encapsule 25 mg/mL dans le systme
lipides/G-PG 33 : a t engage afin d approfondir notre connaissance du systme et
de rflchir ventuellement un mode de conservation des capsules. Nous avons
mesur uniquement les pourcentages d encapsulation et adsorption. Nous avons tudi
en parallle le comportement du systme sous forme dispers 25 mg/mL dans l eau
ainsi que conserv sous forme de pte, c est dire non dispers la dispersion tant
ralise le jour de l analyse Figure 71).
Nous observons alors que lorsque les capsules sont conserves sous forme disperse, la
rutine fuit linairement mais assez lentement et qu au bout de jours, les oignons
contiennent encore 16,0 0,3 % de rutine encapsule et adsorbe. Cette fuite peut tre
explique par les conditions de conservation (temprature ambiante) ainsi que par
l instabilit des oignons lorsqu ils sont disperss dans de l eau. En effet, les oignons sont
connus pour tre thermodynamiquement instables et pour revenir leur structure
lamellaire lorsqu ils sont disperss sur de longues priodes [178]. Une observation au
microscope (Figure 73) a permis de confirmer ces dires car nous y avons observ une
diminution visuelle du nombre et de la taille des capsules par rapport l observation
ralise J0, signifiant que la majorit des capsules prsentaient alors une taille
infrieure au seuil de dtection du microscope (environ 300 nm). Cela semble dire que
les oignons se dtruisent dans le temps. Par contre lorsque les oignons sont conservs
sous forme de pte, c'est--dire non disperss dans l eau, peu ou pas de fuite n est
dtecte. Ainsi la rutine ne fuit que lorsque les oignons se dtruisent au contact de l eau.
166
Figure 71 : cintique de fuite de la rutine encapsule, en orange - dispersion de capsules dans leau
25 mg/mL, en rouge capsules conserves sous forme concentre, Tamb
Lors des analyses HPLC, nous avons not un point intressant concernant la rutine libre,
c est dire non encapsule. En effet, nous avons observ qu aprs jours de cintique,
un fort pourcentage de querctine tait dtect dans les fractions contenant la rutine
libre (Figure 72 . Ceci s explique par une instabilit connue de la rutine dans l eau,
gnrant de la querctine par rupture de la liaison C-O entre le sucre (diglycoside) et le
groupement flavonol de la rutine (Tableau 49) [244]. Or, de trs faibles quantits de
querctine ont t dtectes dans les fractions contenant la rutine encapsule et
adsorbe. Ces observations dmontrent le potentiel des oignons protger la rutine, la
faible quantit de querctine forme provenant vraisemblablement de la rutine
adsorbe en surface des oignons.
Figure 72 : profils HPLC-UV 258 nm en orange dune fraction de rutine partiellement dgrade
en querctine et en vert dun standard de querctine.
167
Tableau 49 : structures de la rutine et de la querctine
Composs Rutine Querctine
Structure
Figure 73 : observation au microscope optique X dune dispersion de capsules lipides/GPG

37 : 63 contenant 25 mg/mL de rutine, disperses dans leau mg/mL, aprs 4 semaines
conservs Tamb.
168
4. TEST DACTIVITE ANTIOXYDANTE
Afin de finaliser l tude du systme encapsulant la rutine, nous avons ralis un test
antioxydant utilisant le radical 2,2-diphnyle-1-picrylhydrazyle DPPH. Ce test est bien
adapt pour valuer le potentiel antioxydant des composs phnoliques. Ces derniers
pigent les radicaux libres principalement par transfert d un atome d hydrogne vers le
DPPH [245].
L objectif de cette analyse a t de vrifier que seule la rutine non encapsule participe
l activit antioxydante et de valider ainsi la bonne protection de la rutine encapsule
ainsi que la prservation de sa biodisponibilit. De plus, ce test devait nous permettre de
savoir si la rutine adsorbe est biodisponible ou non. Les mesures ont t ralises par
spectrophotomtrie. En effet, les actifs antioxydants mis en contact avec le radical DPPH
rduisent ce dernier en DPPH. Le radical DPPH, de couleur violette, devient alors jaune
au cours de sa rduction.
Figure 74 : test dactivit antioxydante au DPP( pour la rutine libre (carrs oranges) et
encapsule (cercles rouges). Calcul thorique (triangles verts) ralis partir de la quantit de
rutine libre et adsorbe obtenu partir du pourcentage mesur dencapsulation+ adsorption
(62,5 %)
Habituellement, le DPPH est solubilis dans du mthanol et l absorbance UV est suivie

515-518 nm, absorbances maximales dans ces conditions [246,247]. Dans notre cas,
nous ne pouvions solubiliser le ractif dans du mthanol 100 % car les oignons se
dissolvent dans ce solvant. Nous avons pu dfinir qu partir de % de MeOH, les
bicouches lamellaires des oignons gonflent augmentation de l opacit des chantillons
disperss et validation de l observation au microscope optique et qu en augmentant
cette concentration, les oignons sont dtruits diminution de l opacit jusque l obtention
d une solution translucide . Nous avons donc fix la concentration maximale en MeO(
10 %. Nous avons alors adapt le test ces conditions en prparant une solution de
DPPH 0,6 mmol dans un mlange MeOH/H20 75 : 25 v/v alors que les chantillons
tester (rutine libre) ont t prpars en premier lieu dans le G-PG 25 mg/mL avant
d tre dilus dans l eau. Les chantillons de capsules ont, quant eux, t directement
169
disperss dans l eau. Le mlange ractionnel est prpar partir de 0,250 mL de

solution de DPPH et 1,750 mL de solution de principe actif, donnant une concentration
finale en MeOH de 9,4 %. Dans ces conditions, nous n avons pas observ de forte
absorbance 517 nm, mais 700 nm. Nous avons donc ralis le test cette longueur
d onde.
La Figure 74 montre le pourcentage d inhibition du radical DPP( en fonction de la
concentration en rutine. Les essais tmoins raliss partir de rutine libre, sans
capsules, montrent que pour les concentrations en rutine suprieures 8 g/mL,
l inhibition atteint un plateau autour de %. Sur la base de ces donnes qui nous
permet de fixer la gamme de concentrations de travail, nous avons ralis le mme test
sur de la rutine encapsule (cercles rouges) : une diminution systmatique de l activit
est mesure, dmontrant alors qu une partie de la rutine n est pas disponible pour la
raction. Nous avons alors calcul l inhibition que nous aurions d obtenir sur la base du
pourcentage d encapsulation et d adsorption pralablement mesur , %) en
supposant i que la rutine libre et adsorbe participaient l inhibition du ractif
(triangles vert), (ii) que la rutine adsorbe se comportait comme la rutine libre. Nous
sommes donc partis des mesures sur rutine seule (carrs orange) en appliquant le
pourcentage pralablement discut. Nous observons alors que pour la quasi-totalit des
essais, le pourcentage d inhibition mesur correspond celui attendu par le calcul.
Seules deux concentrations (4 et 5 g/mL) ont gnr des rsultats plus faibles que ceux
calculs.
Ces rsultats dmontrent que la rutine encapsule ne participe pas l activit
antioxydante, qu elle est donc bien protge par le systme et que la rutine adsorbe est
directement biodisponible. Ces rsultats valident galement le modle
mathmatique que nous avons dvelopp afin de calculer le pourcentage
dencapsulation.
Lensemble de ces travaux ont conduit la publication dun article dans Food
Chemistry [248].
PARTIE V : CAPSULES OPTIMISEES EN MILIEUX FORMULES
Les capsules de rutine optimises ont ensuite t incorpores dans quelques

formulations cosmtiques et les mthodes d extraction et de dosage des actifs
encapsuls ont t revus suivant les nouvelles contraintes apportes par ces matrices
complexes.
1. FORMULATION DES CAPSULES EN PRODUITS COSMETIQUES

Dans une premire tape, nous avons incorpor des capsules dans les 5 formulations
cosmtiques tmoins utilises tout au long de ces travaux de thse, savoir une lotion
170
tonique, un lait mulsionn froid, un lait mulsionn chaud, un gel et une crme
hydratante (p. 73).
Tout d abord, plusieurs essais nous ont amen incorporer les capsules pr-disperses
dans l eau en fin de formulation, lorsque la temprature est infrieure 30 C. En effet,
une temprature trop leve risque de les dstructurer voire les dtruire. Lors des
essais d incorporation de dispersions de capsules dans le lait mulsionn froid, nous
avons observ une rupture de l mulsion. Nous pouvons alors aisment conclure une
incompatibilit entre les capsules et le seul agent stabilisant de cette formule qui est un
mlange de sodium acrylates copolymer, parraffinum liquidum, PPG-1 trideceth-6. Etant
connu que les structures multilamellaires base de phospholipides peuvent tre
instables en prsence de tensioactifs [200], nous pouvons alors en dduire que l lment
d interaction dans cette formule est le PPG-1 trideceth-6.
Dans la suite des essais, nous nous sommes alors concentrs sur les 4 autres
formulations pour lesquelles aucune modification visuelle et microscopique des
formules n a t observe.
2. FRACTIONNEMENT PAR EXCLUSION STERIQUE

Le fractionnement par exclusion strique de la lotion contenant les capsules a t
envisag de la mme manire que les chantillons de capsules disperses dans l eau. En
effet, cette formule ne contenant pas d agent rhologique, sa fluidit rend le traitement
de l chantillon ais.
Le gel, le lait mulsionn chaud et la crme contiennent des agents viscosifiants. Leur
viscosit leve ne permet donc pas un fractionnement tel quel. Il a t ncessaire de
diluer les chantillons dans l eau par un facteur afin d augmenter leur fluidit et de
les rendre aptes au fractionnement. Malgr ce traitement, nous ne sommes pas parvenus
fractionner les chantillons. Nous en avons conclu que la prsence des polymres
hydrats devait freiner le fractionnement sur la phase utilise (Sephacryl 300HR).
Nous avons alors envisag une tape supplmentaire de prparation des chantillons de
lait et crme. Aprs dilution par 10, nous les avons centrifugs afin de sparer les phases
grasse et aqueuse. Ces deux phases ont alors pu tre rcupres sparment. Supposant
que les capsules devaient se trouver dans la phase aqueuse (surface externe des oignons
compose des ttes polaires des phospholipides), nous avons envisag le
fractionnement de cette phase. Nous sommes alors parvenus fractionner la phase
aqueuse issue de l chantillon de crme mais pas celle issu de l chantillon de lait
Sur la base de ces rsultats prliminaires de prparation d chantillons, nous avons
envisag le dosage des actifs libres et encapsuls dans la lotion ainsi que dans la crme.
171
3. DOSAGE DE LA RUTINE ENCAPSULEE PAR HPTLC

Le dosage de la rutine encapsule dans les produits cosmtiques a t envisag par
HPTLC. En effet, sachant que nous ne pourrions travailler simplement en HPLC avec
certaines matrices cosmtiques contenant des composs gras, polymriques, et des
tensioactifs, nous avons choisi de raliser tous les dosages d actifs incorpors dans les
produits cosmtiques partir de cette technique moins contraignante dans la mise en
uvre.
La rutine tant un standard rgulirement dos par HPTLC, nous avons utilis une
mthode classique utilisant une phase mobile actate d thyle/acide formique/acide
actique/eau 100 :11 :11 :26 et une rvlation au NP (Natural Product : compos d acide
diphnylboronique aminothylester dans de l actate d thyle [216]. Le dosage de
l actif est ensuite ralis nm. La rutine prsente alors un rapport frontal Rf de 0,30.
Afin de valider la mthode, nous avons tout d abord dos des chantillons dont nous
connaissions les rsultats de dosage par HPLC-UV, savoir des capsules contenant de la
rutine 25 mg/mL avant puis aprs fractionnement. Nous avons ainsi pu vrifier que
nous dosions 100,5 3,37 % de la rutine, dmontrant ainsi que la mthode de
dveloppement librait totalement la rutine encapsule et que le dosage effectu
correspondait la rutine libre, encapsule et adsorbe. En effet, nous avions dj
observ que l ajout de solvants organiques et d acides dtruisait les oignons. La phase
mobile de dveloppement contenant de l actate d thyle, de l acide formique ainsi que
de l acide actique, les oignons sont dtruits par ce mlange. Ce rsultat oblige donc un
fractionnement pralable des chantillons avant analyse afin de doser sparment actif
libre et actif encapsul et adsorb
Le dosage des fractions de capsules de rutine tmoins (non incorpor donc dans une
formulation cosmtique a donn un rendement d encapsulation encapsulation et
adsorption) de 67,3 3,7 % par HPTLC, valeur comparable celle obtenue par HPLC-
UV : 62,9 0,3 %.
Nous avons ensuite vrifi que les lipides constituant les vsicules n interagissaient pas
avec le dosage de l actif en analysant un chantillon de vsicules sans actif oignons
blancs). Les densitogrammes obtenus 366 nm valident l absence de co-lution des
phospholipides avec la rutine.
L ensemble de ces donnes nous ont permis de valider la mthode de dosage de la rutine
par HPTLC.
172
4. DOSAGE DE LA RUTINE ENCAPSULEE DANS UNE LOTION

4.1 Capsules dans la lotion tonique tmoin
Nous avons systmatiquement dos l chantillon de lotion contenant les capsules avant
puis aprs fractionnement. Nous avons alors constat une fuite totale de l actif encapsul
dans la lotion.
Au regard de la composition de la lotion, nous avons alors suppos que le PPG-1-PEG-9
lauryl glycol ther devait augmenter la permabilit des bicouches lamellaires,
entrainant la fuite de la rutine. Ce tensioactif n a pas dtruit les vsicules puisque leur
prsence est dtectable dans les chantillons par augmentation de leur turbidit alors
que leur destruction aurait gnr un chantillon limpide. Ce compos ayant pour
objectif de solubiliser le parfum dans la formule, nous avons envisag une modification
de la formulation par suppression et substitution du tensioactif afin de valider cette
hypothse.
4.2 Capsules dans la lotion tonique modifie

Deux essais ont t engags. En premier lieu, nous avons totalement supprim le
tensioactif ainsi que le parfum. En second lieu, nous avons substitu le PPG-1-PEG-9
lauryl glycol ther par un tensioactif non-ionique driv du sucre, mlange de glucoside
caprylique et caprique.
Figure 75 : plaque HPTLC (a) 254 nm et (b) 366 nm aprs rvlation au NP et (c) densitogrammes
associs. Dtection de la rutine Rf = 0,3. En 1 : chantillon tmoin de lotion sans capsules, en 2 :
chantillon de lotion contenant les capsules de rutine et en 3 : fraction de capsule obtenue aprs
sparation par SEC.
Dans la formule sans parfum ni tensioactif, nous avons mesur un rendement

d immobilisation (encapsulation + adsorption) de 51,4 0,1 % (Figure 75). Le dosage
effectu en parallle par HPTLC sur les mmes capsules tmoins (capsules non
incorpores dans la lotion) fractionnes a donn un rendement de 54,1 0,9 %. Ce
rsultat montre que la quasi-totalit de la rutine reste encapsule aprs incorporation
dans ce produit.
173
La formule contenant le parfum et le tensioactif de substitution a montr que la rutine

restait bien encapsule, avec une lgre fuite puisque nous avons obtenu 42,5 3,1 %
d encapsulation.
Nous pouvons ainsi conclure que c est bien le tensioactif qui tait l origine de la fuite
de la rutine travers les capsules et que la substitution s est montre bnfique avec un
trs bon rsultat d encapsulation aprs incorporation dans la lotion.
5. DOSAGE DE LA RUTINE ENCAPSULEE DANS UNE CREME

Tous les chantillons issus du fractionnement des chantillons de crme contenant la
rutine libre et/ou encapsule ont t analyss par HPTLC. En effet, la prsence de
composs gras dans la matrice ne permet pas une analyse simple par HPLC.
Le dosage de la crme contenant les capsules 40 mg/mL dilu par 10 (concentration
finale en capsule quivalente 4 mg/mL) permet de vrifier que nous dosons bien la
totalit de la rutine incorpore (94,1 7,6 %).
Puis nous avons dos la rutine prsente dans les phases grasse et aqueuse aprs
centrifugation et avons not que nous rcuprions 46,5 1,5 % de la rutine dans la
phase aqueuse et 50,6 2,0 % dans la phase grasse.
La phase grasse tant trop visqueuse pour tre analyse telle quelle, nous avons ajout
une tape d extraction au mthanol afin de rcuprer la rutine doser. Cette mthode a
t valide par l ajout d une quantit connue de rutine dans la phase grasse. L extraction
de ces chantillons tmoins a permis de vrifier que nous rcuprions 103,4 3,9 % de
rutine.
La surface externe des oignons tant polaire, il est peu probable qu il s en trouve dans la
phase grasse. Nous pouvons donc penser que la rutine dose dans cette phase
correspond de la rutine libre.
Nous avons alors fractionn la phase aqueuse et avons pu constater que les capsules
rcupres contiennent encore de la rutine encapsule. Le calcul du rendement
d encapsulation aprs incorporation dans la crme est alors de 27,3 3,2 % sur la
totalit de l chantillon en supposant l absence de capsules dans la phase grasse .
Ce rsultat montre qu environ % de la rutine fuit lors de l incorporation des capsules
dans la crme.
Ce rsultat est trs encourageant et montre qu il est possible d incorporer des actifs
encapsuls dans des matrices trs complexes. )l serait alors intressant d largir ces
essais d autres matrices et surtout de dvelopper des formules cosmtiques limitant
au maximum la fuite de l actif. Enfin, l tape suivante serait de suivre la cintique de fuite
de l actif dans le produit et de corrler ces rsultats avec l activit revendique.
174
6. CONCLUSION
Ainsi, nous avons pu dvelopper une mthode de prparation dchantillon et de
dosage dactif encapsul aprs incorporation dans des produits cosmtiques.
Grce ces mthodes, il devient possible de suivre lvolution des capsules dans le
temps et d appliquer ventuellement des conditions de stockage adaptes suivant la
vitesse de fuite observe. Il devient galement possible d amliorer ou dadapter les
formulations en fonction des observations d incompatibilits dtectes.
PARTIE VI : APPLICATION DU SYSTEME A DAUTRES MOLECULES
A partir des rsultats obtenus pour l encapsulation de la rutine dans les oignons, nous
avons souhait largir les essais d encapsulation d autres molcules afin de comparer
les rendements obtenus en fonction de la nature des actifs. Afin de dfinir des molcules
en adquation avec ces travaux, nous avons orient notre choix vers des actifs aux
proprits conservatrices :
Acide benzoque
Acide salycilique
Mthylisothiazolinone/Mthylchloroisothiazolinone
Chlorhexidine
Tableau 50 : caractrisation du fractionnement des actifs avec et sans oignons, avec la Sephacryl
300HR
% actif dos
Recouvrement
Volume dlution mL aprs
oignons/actif libre
fractionnement
Acide benzoique 5-15
Oignons contenant Oui 95,5 5,5 %
1,5-6
l acide benzoque
Acide salycilique 6-16
Oignons contenant Possible 90,0 %
1,5-6
l acide salycilique
MCI/MI 3,2-6,6
Oignons contenant Oui -
1,4-6,8
MCI/MI
4-9 puis en faibles
concentrations au del de
Chlorhexidine
10 mL (traces toujours
Oui 88,5 1,6 %
prsentes au del de 50 mL)
Oignons contenant
1,5-6
Chlorhexidine
175
Comme pour la rutine et la naringnine, pour chaque analyte test, les profils d lution
ont t dfinis par fractionnement de solutions d actifs sans oignons. Ces rsultats ont
t compars au volume d lution de la fraction d oignons contenant l actif tudi pour
dfinir si un recouvrement pouvait avoir lieu et empcher la sparation capsules/actifs
libres (Tableau 50). Nous observons alors un recouvrement partiel systmatique. Forts
de ces observations, nous avons donc rcupr les premires fractions d oignons, celles
ne prsentant pas de recouvrement avec les actifs libres.
1. ACIDES BENZOQUE ET SALYCILIQUE

Dans un premier temps, nous avons choisi les acides benzoque et salycilique (Tableau
51) qui sont deux conservateurs autoriss par COSMOS-Standard. De plus, la plante C
contient de l acide benzoque. Aussi, si les rendements d encapsulation de cet analyte
pur sont positifs, il sera intressant de transposer l encapsulation cet extrait et de
doser l actif retenu par le systme.
Connaissant la solubilit de ces actifs dans l eau, nous avons prpar des solutions
contenant 2,8 mg/mL d acide benzoque dans l eau d une part, et dans le G-PG d autre
part, ainsi que 2,0 mg/mL d acide salicylique dans l eau d une part, et dans le G-PG
d autre part. Le dosage des actifs a t ralis par HPLC-UV 230 nm pour l acide
benzoque et 234 nm pour l acide salicylique Figure 76). A partir des rsultats
obtenus avec la rutine, nous avons dcid de tester deux compositions massiques
lipides/phase hydrophile pour chaque actif : 55 : 45 et 33 : 67.
Tableau 51 : caractristiques des acides benzoque et salycilique
Solubilit dans leau

Composs Structure M (g/mol) Rf
(g/L) 20C
2,9 (faiblement
Acide benzoque 122,12 [249]
soluble)
2,0-2,2 (faiblement
Acide salycilique 138,12 [250]
soluble)
176
Figure 76 : profils HPLC-UV des acides benzoque (230 nm) et salycilique (234 nm).
1.1 Microscopie
Figure 77 : photos au microscope optique de dispersions de vsicules de composition (a) et (b)

lipide/eau 55 : , leau contenant , mg/mL dacide benzoque et c lipide/G-PG 55 45, le G-PG
contenant 2,8 mg/mL dacide benzoque
Les observations au microscope optique de capsules d acide benzoque acide dans

l eau ont montr des tailles de particules htrognes, mlanges d oignons points les
plus foncs) et de vsicules uni- ou multilamellaires classiques (formes les plus
claires, pour lesquels nous observons distinctement les bicouches) (Figure 77 (a) et (b)).
177
Lorsque l actif est solubilis dans le G-PG (Figure 77 (c)), les capsules sont beaucoup
plus petites, plutt claires, la limite de rsolution du microscope.

Comme montr dans le Tableau 51, une possibilit de recouvrement entre la fraction
d oignons et les actifs est envisageable avec la Sephacryl HR300. Nous avons donc
galement test la Sephadex G . Nanmoins, le volume d lution avec cette phase est de
4,0 7,5 mL pour les deux acides. Le recouvrement est donc plus important qu avec la
Sephacryl. Dans une premire phase d essai o nous avons simplement souhait valuer
l encapsulation de manire qualitative, nous avons donc ralis les essais avec la
Sephacryl. En effet, il nous a suffi de rcuprer la fraction d oignons en fois, la co-
lution entre les oignons et les actifs non encapsuls n tant envisageable que dans la
troisime fraction. Cette mthode assure l absence d acide libre dans les fractions et ,
la fraction 1 tant la plus concentre en oignons. Aussi, notre premier objectif a t de
vrifier si nous encapsulions les acides, sans pour autant les doser.
Quelle que soit la composition des capsules et la nature de l acide, nous avons alors
observ que nous n avions ni d encapsulation ni d adsorption.
Suite ces rsultats, nous avons alors pens que nous devrions acidifier l eau utilise
pour disperser les capsules ainsi que l eau utilise lors du fractionnement. En effet, bien
que la solution aqueuse d acide benzoque encapsule prsente un p( de -4 (pKa = 4,2),
nous avons envisag que le fractionnement avec l eau distille de p( non acidifi pouvait
entrainer une dissociation partielle de l acide avec une ventuelle rtention de la forme
benzoate sur la phase et/ou une modification des rendements d encapsulation. Aprs
avoir vrifi que le p( n influenait pas le dosage (PLC-UV de l acide, nous avons pu
conclure que l actif n tait pas encapsul, quelque soit la composition des capsules.
Sur la base de ses rsultats, nous pouvons conclure que les molcules sont trop petites
pour tre retenues dans les membranes avec des forces d interactions trop faibles pour
empcher leur fuite. En effet, des acides gras ont dj t encapsuls dans les oignons
la condition que la chaine aliphatique soit suffisamment longue [193]. La partie
hydrophobe de nos acides doit donc tre trop petite pour que les molcules soient
retenues entre les bicouches. Elles diffusent alors travers les membranes.
phospholipidiques.
2. METHYLISOTHIAZOLINONE ET METHYLCHLOROIZOTHIAZOLINONE
(MI/MCI)
Afin de complter notre comprhension du systme d encapsulation membranaire
dvelopp, nous avons choisi d encapsuler deux autres petites molcules, mais de
fonctions chimiques diffrentes des acides prcdemment tudis : les
mthylisothiazolinone (MI) et mthylchloroisothiazolinone (MCI) (Tableau 52). La
solution utilise est un mlange dj prdfini contenant 0,37 % de MI et 1,13 % de MCI
178
dans l eau. C est cette solution qui a t encapsule. Nous noterons que la solution
contient galement 23 % de sels de magnsium (chlorure et nitrate).
Tableau 52 : caractristiques des mthylisothiazolinone et mthylchloroizothiazolinone
Composs Structure M (g/mol)
Mthylisothiazolinone 115,15
Mthylchloroizothiazolinone 138,12
Les essais d encapsulation ont seulement t raliss sur un systme de composition

lipide/eau 55 : 45.
2.1 Microscopie
Les observations au microscope optique sont difficiles interprter (Figure 78). Nous
visualisons une trs forte agglomration des particules formes. La prsence de sel dans
la solution (23 % de sels de magnsium) peut expliquer ce phnomne. Des oignons sont
donc trs vraisemblablement forms en trs grande quantit, sous forme d aggrgats.
Figure 78 : photos au microscope optique de dispersions de vsicules de composition

lipides/solution aqueuse 55 : 45, la solution aqueuse contenant les MCI et MI 1,13 et 0,37 %
respectivement
179
Figure 79 : profils HPLC-UV en haut de la premire fraction doignons dtruite par TX-100 dans
laquelle seules des traces de MC)/M) sont dtectes et en bas de la deuxime fraction doignons
dans laquelle les actifs sont fortement prsents. En rouge les profils HPLC-UV du fractionnement
tmoin des actifs non encapsuls, en bleu les profils HPLC-UV des actifs encapsuls.
De mme que pour les acides, nous avons observ un fort recouvrement de la fraction
d oignons et des actifs libres. Sur le mme modle que les acides, nous avons rcupr la
fraction d oignons en fois. Comme le montrent les profils (PLC-UV Figure 79, nous
avons alors observ que dans la premire fraction fortement concentre en oignons,
seules des traces des actifs taient prsentes alors que dans la deuxime fraction plus
faiblement concentre en oignons, les deux actifs sont prsents trs haute dose. Ayant
ralis en parallle un fractionnement identique des deux actifs non encapsuls, la
superposition des profils UV nous a permis de conclure que les deux actifs n taient pas
encapsuls par le systme.
Nous avons alors conclu que le systme membranaire phospholipidique ne permettait
pas l encapsulation des M) et MC) ainsi que des acides prcdents, molcules au poids
molculaire trop faible pour tre retenues.
3. CHLORHEXIDINE
Dans une dernire perspective d encapsulation d actif conservateur, nous avons
slectionn la chlorhexidine, de poids molculaire suprieur aux actifs prcdents. La
solution mre que nous avons utilise est une solution de chlorhexidine digluconate
20 % dans l eau Tableau 53).
180
Tableau 53 : caractristiques de la chlorhexidine
Composs Structure M (g/mol)
Chlorhexidine
505,45
3.1 Microscopie
Les observations au microscope optique des capsules de chlorhexidine digluconate
montrent une distribution d oignons de taille relativement homogne.
Figure 80 : photos au microscope optique X de dispersions de capsules doignons de

composition lipides/solution aqueuse 55 : 45, la solution aqueuse contenant la chlorhexidine
20 % (en masse).

La mise au point de la mthode HPLC-UV pour la chlorhexidine selon la mme mthode
que pour la rutine montre que les deux actifs ont un temps de rtention proche. En effet,
la rutine lue 13 min et la chlorhexidine 14,5 min (Figure 81). Il sera donc
intressant de comparer les rendements d encapsulation des deux molcules.
Dans un premier temps, nous avons encapsul la solution mre sans dilution dans les
systmes lipides/solution mre 55 : 45 et 33 : 67. Nous avons alors obtenu des
rendements d encapsulation et adsorption %E+A de 30,9 2,3 % pour le premier systme
et de 36,9 4,1 % pour le deuxime. Ainsi, comme pour la rutine, nous observons de
meilleurs rendements lorsque le pourcentage en lipides est de 33 % dans le systme.
Afin d valuer le rendement rel d encapsulation, nous avons donc test le potentiel
d adsorption de cette nouvelle molcule en surface des oignons pour le systme
optimis. Nous avons alors mesur que seul 1,7 0,3 % de la chlorhexidine s adsorbe, ce
qui nous a permis de calculer un rendement d encapsulation %E de 35,8 7,3 %.
181
Figure 81 : profil HPLC-UV de la chlorhexidine a 258 nm
Le phnomne d adsorption est faible par comparaison avec celui observ pour la
rutine. Cela peut s expliquer par la diffrence de polarit des deux molcules. En effet, la
chlorhexidine, beaucoup plus polaire que la rutine, se distribuera prfrentiellement
dans le milieu dispersant l eau alors que la rutine s adsorbera majoritairement en
surface des capsules. Nous avons galement pens que la nature de la phase solubilisant
l actif pouvait influer sur les interactions entre celui-ci et les membranes lipidiques.
Nous avons alors dilu la solution mre de chlorhexidine 15 et 10 % dans l eau d une
part, et dans le G-PG d autre part. Des essais d encapsulation et adsorption ont alors t
engags avec le systme lipides/phase hydrophile 33 : 67.
Les essais raliss par dilution de la solution mre dans l eau montrent que plus le
pourcentage en chlorhexidine diminue, plus le rendement d adsorption augmente, pour
atteindre 12,3 % lorsque la solution contient 10 % d actif Figure 82). Malgr ce rsultat,
le pourcentage d encapsulation tend augmenter, notamment lorsque la concentration
en actif est abaisse 10 %. Nous obtenons alors un rendement de 49,5 0,9 %
d encapsulation. Ceci tend montrer que nous sommes dans la partie diphasique du
diagramme de phase (co-existence entre une phase lamellaire contenant de l actif et
d une phase d actif en excs lorsque la concentration en actif est importante voir partie
III, section 3.2).
Lorsque nous avons remplac le solvant de dilution par le G-PG pour obtenir des
concentrations en actif de 15, 10 et 5 %, nous avons alors not que le pourcentage
d adsorption tend galement augmenter lorsque la concentration en chlorhexidine
diminue pour ce stabiliser autour de 16 % en moyenne (Figure 83). Par comparaison
avec les essais raliss dans l eau, l adsorption est systmatiquement plus importante
lorsque du G-PG est incorpor. Ces rsultats paraissent valider l hypothse selon
laquelle la nature du solvant de dilution de l actif influe sur les interactions actif-
membranes. La prsence des fonctions hydroxyles sur la glycrine et le propylne glycol,
composs de la matrice G-PG, doit tre l origine de ces diffrences. En effet, les
fonctions hydroxyles peuvent crer des liaisons hydrognes avec l actif ainsi qu avec les
phospholipides augmentant alors la rtention en surface des oignons.
182
Figure 82 : rendements dadsorption et dencapsulation de la chlorhexidine dans le systme

lipides/phase hydrophile 33 : , pour diffrentes concentration en actif dans leau.
Figure 83 : rendements dadsorption et dencapsulation de la chlorhexidine dans le systme

lipides/phase hydrophile 33 : 67, pour diffrentes concentration en actif, la solution mre aqueuse
tant dilue dans le G-PG.
Le pourcentage d encapsulation maximal obtenu pour la solution % d actif est alors

de 44,6 2,7 %. Ce rsultat est infrieur celui obtenu avec l eau. Cette diffrence est d
l adsorption car les pourcentages d encapsulation et adsorption pour les deux
systmes sont quivalents, avec un %E+A de 55,6 0,8 % lorsque le solvant est de l eau et
%E+A de 54,0 2,0 % lorsque le solvant est le G-PG.
De manire surprenante, nous observons que lorsque la concentration en chlorhexidine
est abaisse 5 %, le rendement d encapsulation chute , 8,7 %
Il apparat donc clairement que nous pourrions appliquer le modle dvelopp pour la
rutine afin de dfinir la concentration optimale en chlorhexidine encapsuler ainsi que
la composition massique optimale des oignons. Notre objectif lors de ces essais tant
simplement de vrifier la possibilit d encapsuler un autre actif, nous n avons pas ralis
cette optimisation.
Cette tude rapide met en vidence plusieurs perspectives. En effet, nous avons observ
une influence de la nature du solvant de dilution de l actif sur les phnomnes de
rtention dans les oignons. A 10 %, des rsultats similaires ont t observs dans l eau et
183
dans le G-PG. Afin de slectionner le systme le plus performant, il serait intressant de

poursuivre avec une cintique de fuite de l actif. Enfin, l application des modles
mathmatiques dvelopps pour la rutine ce nouvel actif serait une bonne perspective
d approfondissement.
PARTIE VII : ENCAPSULATION DE LEXTRAIT DE PLANTE A
Dans une dernire tape de ces travaux, le systme d encapsulation t appliqu

l extrait de plante A. Plusieurs support liquides ayant t tests tout au long des essais
d optimisation de l extrait chapitre )), sections .2 et 1.4), nous avons tout d abord
tudi l influence de ces supports sur la formulation d oignons par analyse
microscopique. L actif d intrt de la plante tant connu et facilement dosable, la mesure
du rendement d encapsulation de cet actif pouvait ds lors se faire.
1. OBSERVATIONS MICROSCOPIQUES
Les supports liquides sont les suivants :
Ethylhxylglycrine
Glycryl caprate
Caprylyl glycol
Capryoloyl glycine
Glycryl caprylate
Glycrine
Propylne glycol
Butylne glycol
Propanediol
Ethylhexylglycrine/caprylyl glycol
TCM (Triglycrides chaines moyennes)
A cette liste s ajoute l encapsulation de l extrait pilote MeO( brut encapsul tel quel puis
avec le mlange G-PG. Tout les essais ont t raliss avec le systme optimis, compos
de 33 % de lipide et de 67 % d extrait sur support ou brut. Les extraits sur supports sont
composs d environ % d extrait et % de support, l exception de l extrait sur
support TCM. Nous ne connaissons pas la quantit de support TCM prsente pour cet
extrait, mais elle est estime plus de 90 %. Nous avons systmatiquement observ que
des rsidus d extraits taient prsents dans les dispersions des vsicules supposes. Ceci
s est traduit par un phnomne de prcipitation de l extrait non encapsul dans l eau, au
moment de la dispersion des capsules (25 mg/mL de capsules dans l eau . Ces rsidus
sont clairement visibles au microscope, comme le montrent les exemples exposs Figure
84. Pour la majorit des essais, la formation d oignons n a pas t observe. Certaines
formulations ont montr la formation de vsicules de tailles varies. Seuls les essais
d encapsulation de l extrait brut, de l extrait sur support TCM et ventuellement
glycrine nous ont paru former des oignons. Le Nous noterons nanmoins que des essais
184
complmentaires seraient envisager. En particulier, il serait ncessaire d observer au

microscope les extraits sur support non encapsuls, ainsi que des capsules formules
avec les supports sans l extrait de plante.
Tableau 54 rsume les observations.
Figure 84 : observation au microscope optique de dispersion de capsules dextrait de plante A brut,

sur support TCM, glycrine et glycryl caprate.
Suite ces observations, nous avons alors slectionn les formules les plus
prometteuses, savoir l encapsulation de l extrait brut et de l extrait sur support TCM.
Nous noterons nanmoins que des essais complmentaires seraient envisager. En
particulier, il serait ncessaire d observer au microscope les extraits sur support non
encapsuls, ainsi que des capsules formules avec les supports sans l extrait de plante.
Tableau 54 : rsultats des observations au microscope optique des essais dencapsulation de la

plante A
Matire encapsule Observation microscopique

Ethylhxylglycrine Pas de capsules
Glycryl caprate Des vsicules unilamellaires
Caprylyl glycol Pas de capsules
Capryoloyl glycine Pas de capsules
Glycryl caprylate Pas de capsules
Glycrine Oignons et vsicules unilamellaires
185
Matire encapsule Observation microscopique

Peu nombreux
Propylne glycol Trs rares vsicules unilamellaires
Butylne glycol Trs rares oignons ou vsicules unilamellaires
Propanediol Trs rares oignons ou vsicules unilamellaires
Ethylhexylglycrine/caprylyl glycol Trs rares vsicules unilamellaires
TCM Nombreux oignons et vsicules unilamellaires
Extrait brut Nombreux oignons
Extrait brut + G-PG Pas de capsules
2. RENDEMENTS DENCAPSULATION
L analyse des chantillons de capsules contenant l extrait de plante A a t ralise par
HPTLC. Avant de pouvoir entreprendre le fractionnement des chantillons disperss de
capsules de plante A, nous avons t confronts au problme de prcipitation de l extrait
non encapsul dans l eau. Nous avons alors procd une premire tape de filtration
sur des filtres en cellulose de 10-20 m. Des rsidus prcipits tant encore prsents
dans le filtrat (filtrat contenant galement les oignons), nous avons rduit la taille du
filtre (cellulose) 5-8 m et avons ralis deux filtrations successives avec succs. Nous
avons ainsi rcupr le filtrat contenant les oignons, tout en ayant limin les rsidus
d extrait prcipits.
Les chantillons de capsules filtrs ont alors t fractionns. Seulement, aucune fraction
d oignons n a t lue. Cette mthode de prparation d chantillon s est donc avre
inadapte dans ce cas particulier. Le mme rsultat a d ailleurs t obtenu par
fractionnement des capsules formules partir de l extrait brut. Nous pouvons supposer
que la prsence de certaines molcules en surface des oignons pourrait gnrer leur
rtention sur la phase d exclusion Sephacryl .
Nous avons alors modifi la technique de prparation des chantillons. En effet, nous
avons suppos que la totalit de l actif non encapsul et donc dispers dans l eau pouvait
prcipiter. Dans ce cas, la filtration pourrait suffire retenir cet actif libre, alors que les
capsules rcupres ne contiendraient que l actif encapsul. Le dosage direct du filtrat
aprs destruction des vsicules par TX-100 donnerait alors le rendement
d encapsulation.
Afin de valider cette hypothse, des chantillons contenant l extrait de plante A pilote
EtOH/H2O dcolor par distillation molculaire sur support TCM ont t prpars dans
l eau puis filtrs. Le filtrat a alors t dos. Les analyses ont montr que l actif tait
prsent dans le filtrat, mais en quantit ngligeable. En effet, nous n avons dos que
0,77 0,24 % de l actif dans la solution filtre. Nous avons donc valid la mthode. Les
calculs de rendements d encapsulation de l actif de la plante A ont alors t raliss par
dosage des solutions de vsicules traites par TX-100, avant et aprs filtration.
Les rendements d encapsulation mesurs sont de 89,1 2,4 %. Ce rsultat constitue le
meilleur rendement d encapsulation obtenu au cours de ces travaux. Nous avons
186
souhait le comparer avec l encapsulation d un autre extrait sur support TCM galement,
mais non dcolor et obtenu l chelle laboratoire. Nous avons alors mesur un
rendement d encapsulation beaucoup plus faible, de , 2,8 %. Ces rsultats sont trs
intressants et montrent que, quelque soit l extrait test l encapsulation, l actif
prsente une forte affinit pour les membranes des oignons. En effet, l extrait de plante
A est constitu de centaines de molcules, ce qui augmente la slectivit
l encapsulation, rduisant les possibilits de hauts rendements. La dcoloration
rduisant le nombre de molcules prsentes, nous pouvons supposer que nous
augmentons la charge en molcules restantes, dont l actif. Nous notons que nous avons
pu formuler ces oignons sans phase aqueuse puisque le support est constitu de
triglycrides. Bien que l hydratation des phospholipides se soit avre plus longue, le
concentr final d oignons est homogne et fluide. La nature de ce support ainsi que la
faible polarit de l extrait nous permettent de supposer qu il est retenu par les chaines
hydrophobes des phospholipides.
L tape suivante sera de tester l encapsulation de l extrait antimicrobien valid pour son
utilisation cosmtique.
PARTIE VIII : CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Ces travaux d encapsulation d actifs et d extrait naturel ont montr les perspectives
offertes par les systmes base de phospholipides tout en faisant ressortir les limites.
Nous avons encapsul avec succs un flavonol glycosyl (rutine) hauteur de 62,5 % et
avons montr un phnomne d adsorption de l actif en surface des oignons hauteur de
15 20 %. Le flavonone tudi (naringnine) a rvl un comportement diffrent, avec
une adsorption systmatique trs leve (environ 70 %) sans tre pour autant
encapsul. Nous pouvons ds lors conclure une slection du systme pour ce qui est de
l encapsulation des flavonodes.
Des modles mathmatiques ont par ailleurs permis d optimiser la composition des
oignons.
Nos rsultats ont montr que le systme ne permettait pas d encapsuler les molcules de
faible poids molculaire (< 140 g/mol , soit par manque d affinit avec les
phospholipides, soit cause d une fuite trop rapide lors de la dispersion des oignons
dans l eau.
La possibilit d encapsuler la chlorhexidine de plus haut poids molculaire semble
confirmer ces observations.
Enfin, nous avons pu appliquer le systme l encapsulation de l extrait de plante A sur
support TCM avec succs. L actif y est en effet retenu hauteur de , 2,1 %, ce qui
constitue le meilleur rendement obtenu au cours de nos travaux. Ces rsultats sont trs
prometteurs et aprs une validation de ces rendements d encapsulation sur l extrait de
187
plante finalis pour la commercialisation, la dernire tape sera d valuer l impact du

systme sur la protection antimicrobienne des produits cosmtiques.
188
CHAPITRE IV
MATERIEL ET METHODES
189
1. OPTIMISATION DE FORMULATIONS COSMETIQUES PAR DIMINUTION DE

LACTIVITE DE LEAU
1.2. Aw-mtre
Les mesures d activit de l eau sont ralises avec un aw-mtre Labswift-aw (Novasina,
Suisse . L appareillage possde une plage de mesure de l aw s tendant de ,
1,000 , , sur une gamme de temprature d chantillon de C.
Afin de raliser l analyse, l chantillon est introduit dans une coupelle en polypropylne
dpose dans une enceinte tanche de l appareillage. L eau libre humidifie ou assche
l air l intrieur de la chambre jusqu ce que l quilibre soit atteint. La mesure
d humidit relative est ralise l aide d un capteur lectrolytique puis la valeur est
convertie en aw. La temprature est contrle par infrarouge. Lorsque la mesure est
stable sur une dure de 2 min conformment aux conditions de mesures que nous avons
choisies, la mesure est alors valide.
L talonnage de l appareil se fait l aide de sels talons d humidits relatives calibres
11 %, 58 %, 84 % et 97 %, en fonction des chantillons mesurer.
1.2. Formules tmoins
Tous les composs sont pess l aide d une balance de prcision New Classic MF
(prcision 0,0001 g) ou ML204/01 (prcision 0,01 g) (Mettler Toledo) en fonction des
masses.
Les formulations cosmtiques sont prpares l aide d un agitateur de paillasse
Turbotest Rayneri quip d une hlice flux radial dfloculeuse de taille adapte la
quantit de formule prpare ainsi qu au volume du bcher.
Dans certains cas, des matires premires peuvent tre pr-mlanges avant d tre
ajoutes la formulation, elles sont alors homognises par agitation magntique
plaque d agitation chauffante )KA C-MAG HS 10, Grosseron).
1.3. Modlisation molculaire
Les structures molculaires ont t construites avec le logiciel Gaussview 2.1. Les
gomtries ont t optimises en minimisant les forces sur les atomes l aide du logiciel
Gaussian03. La fonctionnelle de densit lectronique est B3LYP et les bases 6-31+g(d,p).
Le modle du continuum polarisable (PCM) a t utilis afin de modliser les effets du
solvant, l eau dans notre cas.
190
2. ANALYSE HPLC DES EXTRAITS ET DOSAGE
2.1 Analyse HPLC des extraits de plantes

Les extraits de plante A, B et C ont t analyss par HPLC Agilent muni d un
dtecteur barrettes de diodes (DAD diode-array detector). La sparation est ralise au
moyen d une colonne analytique C Luna Phenomenex, 250 4,6 mm, 5 m, ),
quipe d une prcolonne C Phenomenex, 3,0 mm i.d.). La phase mobile est
constitue d eau A et d actonitrile (B) et parfois d isopropanol C acidifis avec 0,1%
d acide formique.
Le dbit d lution est de mL/min et le gradient de solvant est dcrit dans les Tableau
55 Tableau 57, en fonction de la nature des chantillons. Les chantillons sont
prpars 20 mg/mL dans du mthanol et sont filtrs sur filtre PTFE 0,45 m avant
analyse. Tous les essais sont raliss en triplica.
Tableau 55 : gradient dlution % volumiques des chantillons de plante A pour le dosage de
lactif. Plante A = 300 nm.
Temps (min) Eau Actonitrile Isopropanol

0 95 5 -
5 95 5 -
35 0 100 -
37 0 100 -
38 0 40 60
43 0 40 60
(Post-time = 10 min)
Tableau 56 : gradient dlution (% volumiques) des chantillons de plante B. Plante B = 280 nm.

0 95 5 -
5 95 5 -
35 0 100 -
45 0 100 -
55 0 40 60
60 0 40 60
65 95 5 -
(Post-time = 0 min)
191
Tableau 57 : gradient dlution (% volumiques) des chantillons de plantes C. Plante C = 280 nm.

0 98 2 -
5 98 2 -
40 30 70 -
43 30 70 -
50 0 100 -
52 0 100 -
53 98 2 -
63 98 2 -
(Post-time = 0 min)
2.2 Dosage de lactif de la plante A

Le dosage de l actif d intrt dans la plante A t ralis l aide d un standard, l acide
cinnamique (Sigma Aldrich). La mthode de dosage par HPLC-UV applique est dcrite
Tableau 58.
Tableau 58 : gradient dlution de lacide cinnamique pour le dosage de lactif dans la plante A.
= 300 nm.

0 95 5 -
5 95 5 -
35 0 100 -
La courbe talon est tablie partir de 5 points chelonns de 6,25 150 g/mL en
triplica avec une erreur relative infrieure 9 %. L quation de la courbe obtenue par
rgression linaire est :
y = 110,53x + 319,13 ; R = 0,99876
Le dosage de l actif dans les extraits de plante A est alors exprim en mg d quivalent
acide cinnamique/g d extrait.
192
3. ANALYSES MICROBIOLOGIQUES
3.1. Analyses microbiologiques des extraits vgtaux
Les analyses microbiologiques des extraits vgtaux ont t ralises par la socit Nixe
(Sophia-Antipolis).
3.1.1 Principe de la mthode danalyse
L analyse, effectue par spectrophotomtrie (mesure de densit optique DO), permet de

mesurer l inhibition de croissance du myclium de diffrents champignons et l inhibition
de la multiplication de diffrentes bactries et levures en prsence du produit tester.
3.1.2 Milieux de culture, souches
L eau utilise pour la prparation des milieux et des essais est de l eau distille strile,
obtenue par autoclavage.
3.1.2.1 Milieux de culture gloss
La souche de champignon et la souche de levure utilises pour le test sont cultives sur
de la glose Sabouraud (SAB) en tube inclins. Les souches de bactries utilises pour le
test sont cultives sur de la glose Tripcase Soja Agar (TSA) en tube inclin (Tableau 59).
Tableau 59 : composition des milieux SAB et TSA gloss
Milieu SAB Milieu TSA

Composition Masses (g) Composition Masses (g)
Peptone pepsique de viande 10,0 Tryptone 10,0
Glucose anhydre 36,4 Extrait de levure 5,0
Agar 10,0 NaCl 10,0
- - Agar 15,0
3.1.2.2 Milieux de culture liquide
Le test d activit antifongique sur les spores et le test d activit contre la levure se
droulent dans le milieu bouillon de Sabouraud (Bouillon de SAB). Le test d activit
antibactrien se droule dans le milieu Tripcase Soja Bouillon (TSB) (Tableau 60).
Tableau 60 : composition des milieux SAB et TSB liquides
Milieu Bouillon de SAB Milieu TSB

Composition Masses (g) Composition Masses (g)
Peptone peptsique de viande 10,0 Tryptone 10,0
Glucose anhydre 36,4 Extrait de levure 5,0
- - NaCl 10,0
193
3.1.2.3 Souches de rfrence
Les souches d intrts sont conserves dans une mycothque. Une culture sur glose
SAB incline dans un tube essai en verre bords droits (60 ml) a t ralise pour
l Aspergillus niger (AN) ATCC 16404 et pour Candida Albicans (CA) ATCC 10291. Une
culture sur glose TSA incline dans un tube essai en verre bords droits (60 ml) a t
ralise pour Pseudomonas aeruginosa (Pda) ATCC 9027 et Staphylococcus aureus (SA)
ATCC 6538.
3.1.3 Mode opratoire
3.1.3.1 Prparation des cultures
3.1.3.1.1 Champignon
La souche de champignon est repique sur des boites de glose SAB partir des tubes de
conservation de la mycothque. Pour cela, un fragment de glose portant du myclium
est mis en culture au centre de la boite pour permettre au champignon de coloniser
toute la surface. Un myclium portant des spores est gnralement obtenu au bout de
quelques jours de culture (8 10 jours) dans une tuve thermostate 32C.
L observation des boites et l observation microscopique permettent de visualiser les
spores produites.
3.1.3.1.2 Bactries et levure
Quelques jours avant l essai, les souches de bactries et la souche de levure sont
repiques dans des tubes inclins de TSA (pour les bactries) et SAB (pour la levure)
partir des tubes de conservation de la mycothque. Pour cela, le tube inclin de
rfrence est immerg avec 3 mL d eau strile. L de la suspension sont prlevs
pour ensemencer un nouveau tube TSA et SAB inclin. Aprs 24h de culture 37C, le
tube est nouveau immerg avec 3 mL d eau strile. , mL de cette suspension sont
alors prlevs pour ensemencer 10 mL de milieu TSB pour les bactries et 10 mL de
bouillon SAB pour la levure.
3.1.3.2 Dosage des spores, de la levure et de la suspension bactrienne
3.1.3.2.1 Dosage des spores
Les spores de AN sont directement accessibles en surface du myclium : 3 mL de

bouillon SAB strile sont dposs la surface de la boite et les spores sont mises en
solution avec un rteau (pipette pasteur coude) en frottant la surface de la boite. Cette
manipulation doit se faire sous une hotte spcialement ddie aux champignons
sporulant.
194
Le surnageant est ensuite rcupr et le comptage est ralis avec la cellule de Malassez
pour connatre le titre (nombre de spores par mL) de la solution.
3.1.3.2.2 Dosage de la suspension de levure et de la suspension

bactrienne
La culture liquide dure quelques heures (2h 3h) 37C jusqu ce que la suspension
titre 0,6 DO 620 nm.
3.1.4 Conduite de lessai
L essai est ralis sur une microplaque puits. Les spores de AN, la suspension de
levure CA, les suspensions bactriennes de Pda et SA sont mis en contact dans les puits
avec la substance analyser.
La premire tape consiste diluer la substance examiner dans le milieu bouillon SAB
(pour le champignon et la levure) ou le milieu TSB (pour les bactries). Nous avons
choisi de tester les extraits (200 mg/mL) 2 % et 0,2 %. En effet, cela permet d obtenir
une concentration finale en extrait dans le puits de 0,4 % et 0,04 %, concentrations
reprsentatives et comparables l efficacit obtenu avec notre tmoin de synthse
(parahydroxybenzoate de mthyle sod). Ces dilutions peuvent tre ralises de faon
simple, comme indiqu dans le Tableau 61 :
Tableau 61 : dilutions et prparations des essais en microplaques
1/50 1/500
Dilution finale de la substance examiner
0,4 % 0,04 %
Dilution pralable de la substance examiner 1/25 -
Volume d eau dans les puits - 90 L
Volume de substance dilue 100 L 10 L de 1/25
Volume de milieu dans les puits 95 L 95 L
Volumes de suspensions de spores/bactries/levures 5 L 5 L
Nous prparons ainsi 100 microlitres de la dilution 1/25 de chaque extrait tester et
pour chacun des microorganismes tests. Deux rptitions sont effectues. Un tmoin
ngatif est galement ralis en remplaant le volume de substance dilue (100
microlitres par de l eau. Un tmoin positif est galement ralis en remplaant le
volume de substance dilue (100 microlitres) par 0,8 % de parahydroxybenzoate de
mthyle sod (soit 0,4 % final).
Nous ajoutons dans chaque puits, 100 microlitres de la dilution 1/25. Nous effectuons
alors une dilution srielle partir de cette dilution (1/25) soit jusqu la dilution / 50.
Chaque puits est alors complt avec 95 L de milieu bactries, levures ou champignons
selon le microorganisme test. Nous ajoutons dans les puits 5 microlitres d une solution
titrant 40 spores/mL obtenue en diluant les spores rcupres sur les boites de culture
195
ou/et 5 microlitres d une solution titrant , DO 620 nm pour les bactries et la levure.
Pour bien homogniser les solutions, il est ncessaire de mlanger la solution de
spores/bactries/levures celle contenant la substance tester en ralisant deux ou
trois va et vient avec la pipette.
Les boites 96 puits charges sont dposes dans une atmosphre sature en humidit et
37C.
La lecture s effectue au lecteur de plaques 620 nm T0, T24h, T48h et T72 heures
pour estimer la croissance du microorganisme en prsence de la substance teste par
rapport la croissance du microorganisme dans les puits tmoins. Pour les
microorganismes non mobiles (Staphylococcus et Candida) il est ncessaire de mlanger
le contenu des puits avant chaque lecture. Pour l Aspergillus cela n est pas utile car nous
allons mesurer la croissance du myclium.
3.2. Challenges tests
Les challenges tests sont raliss suivant les critres de la Pharmacope europenne par
la socit IDEATest (Plouzan).
PROTOCOLE EXPERIMENTAL :
Les souches testes sont les suivantes :

Souches bactriennes :
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
Staphylococcus aureus ATCC 6538
Escherichia coli (recommande Ph. Eur.) ATCC 8739
Souches fongiques :
Candida albicans ATCC 10231
Aspergillus brasiliensis ATCC 16404
Conditions de prparation et de conservation :
Tableau 62 : tableau rcapitulatif des conditions de prparation des souches.
Densits Tempratures
Souches Conservation Milieux de culture
(UFC/mL) dincubation
P. aeruginosa -80C 5C Tripcase Soja Agar (TSA) 107-108 32,5C 2,5C

S. aureus -80C 5C Tripcase Soja Agar (TSA) 107-108 32,5C 2,5C
E. coli -80C 5C Tripcase Soja Agar (TSA) 107-108 32,5C 2,5C
C. albicans -80C 5C Sabouraud Dextrose 107-108 22,5C 2,5C
A. brasiliensis -80C 5C Sabouraud Dextrose 106-107 22,5C 2,5C
196
Produit tester :
Le produit tester est rparti aseptiquement en flacons striles usage unique, raison
d un flacon par souche teste. g de produit sont prlevs dans chaque flacon.
Mise en contact souche-produit :
Chaque flacon de produit est innocul avec la suspension d une des souches tester, afin
d obtenir une concentration finale de 5 106 microorganismes/g.
Validation de la neutralisation :
Elle est ralise sur les 5 souches, la dilution 1/10me et 1/100me dans un bouillon de
LT100. La composition de ce neutralisant est dcrite dans le Tableau 63.
Tableau 63 : composition de bouillon de LT100 utilis pour la neutralisation des conservateurs
LT100
Composition Masses (g/L)
Peptone pancratique de casine 15,0
Peptone papanique de soja 5,0
L-Cystine 0,7
Chlorure de sodium 4,0
Sulfite de sodium 0,2
Glucose 5,5
Lcithine d oeuf 1,0
Polysorbate 80 5,0
Triton X100 1,0
Evolution des densits de souches dans le temps :
Des prlvements et analyses sont raliss, intervalles de temps donns (T.2 jours, T.7
jours, T.14 jours, et T.28 jours), partir des diffrents flacons ; la phase de neutralisation
des conservateurs est effectue en LT100 la plus faible dilution compatible avec la
validation. La mthode de dnombrement utilise est l inclusion rsultats en UFC/g ou
mL).
Les produits ensemencs sont conservs 22,5 C l obscurit pendant les jours du
test.
INTERPRETATION :
Le compte-rendu prcise les densits microbiennes obtenues au cours du suivi pour

chaque souche testes et dresse un tableau de la conformit du produit cosmtique, par
comparaison avec les seuils de rduction logarithmiques imposs par la Pharmacope
Europenne (Tableau 64).
197
Tableau 64 : seuils de rductions logarithmiques devant tre mesurs pour quun produit
cosmtique soit conforme la Pharmacope Europenne
Pharmacope Europenne
Rduction logarithmique
Souches Critres
2J 7J 14 J 28 J
A 2 3 / NI
Bactriennes
B / / 3 NI
A / / 2 NI
Fongiques
B / / 1 NI
(/ : pas dabattement minimal requis, NI : pas daugmentation
Les critres A reprsentent l efficacit qu il est recommand d atteindre. Dans des cas
justifis, lorsque les critres A ne peuvent tre respects e.g. en raison d une
augmentation du risque de ractions indsirables les critres B s appliquent. Une
tolrance de 0,3 log est admise pour chaque critre.
4. FORMULATION DES EXTRAITS
4.1. Solubilisation des extraits
4.1.1 Support solide
Afin de solubiliser l extrait de plante A sur support maltodextrine dans les diffrentes
matires premires liquides testes, l extrait est ajout par tape. )l est d abord ajout
1 % (massique) dans les solvants et mis sous agitation magntique 40C. Dans les cas
o la solubilisation se montre difficile, l chantillon est plac au bain ultrasons pendant
30 min. A ce stade, si des rsidus insolubles persistent, nous estimons la solubilit
mauvaise dans le solvant test. Pour les essais fructueux, la concentration en extrait est
augmente 2 % et ainsi de suite jusqu dfinir le maximum de solubilit. Lorsque
l extrait est solubilis de fortes concentrations ds % , l ensemble peut se montrer
sombre et il peut tre difficile de dceler la prsence de particules insolubles. Dans ce
cas, l chantillon est observ la lumire du jour et/ou laiss au repos pendant une nuit
afin d observer un ventuel dpt au fond du rcipient.
4.1.2 Support liquide
L ajout du support liquide avec l extrait de plante est ralis au cours de l extraction du
vgtal. Une fois l extraction au MeO( ralise, le support cosmtique liquide est ajout
dans des proportions 50 : 50 extrait/support (m /m) puis le solvant est vapor. Nous
obtenons alors un extrait liquide plus ou moins visqueux en fonction de la matire
premire teste et plus ou moins homogne en fonction de la solubilit de l extrait dans
celle-ci.
198
4.2. Dosage de lactif dans les produits cosmtiques : HPTLC
4.2.1 Prparation et incorporation des extraits en cosmtique
Les extraits que nous avons choisis pour tre incorpors dans des produits cosmtiques
et une analyse microbiologique sont les extraits pilotes de la plante A MeOH sur
supports liquides cosmtiques S1, S et S ainsi qu un extrait de plante C .
Les supports liquides sont les suivants :
S1 : thylhexylglycrine stabilise avec de la vitamine E (Sensiva
SC50, Schlke, Gentilly)
S2 : caprylyl glycol et thylhexylglycrine stabilise avec de la
vitamine E (Sensiva SC10, Schlke, Gentilly)
S3 : caprylyl glycol (Microcare Emollient CLG, Thor Personal Care,
distribu par Coptis, Croissy-sur-Seine)
Les extraits de plante A sont incorpors sous leur forme liquide directement dans les
produits cosmtiques en fin de formulation 30 C sous agitation.
L extrait de plante C ncessite quant lui une prparation prliminaire avant d tre
incorpor dans le produit. Se prsentant sous la forme d une rsine, il est tout d abord
rduit l tat de poudre dans un mortier l aide d un pilon. )l est ensuite mlang dans
du C12-15 alkyl benzoate, matire premire cosmtique slectionne pour la
solubilisation de l extrait. La solution prpare contient % massique d extrait de
plante C. Elle est mise sous agitation magntique puis au bain ultrasons pendant 1h.
L ensemble est ensuite filtr afin d liminer les rsidus d extraits avant incorporation
dans la matrice cosmtique.
4.2.2 Dveloppement de la mthode de dosage par HPTLC
Les analyses (PTLC ont t ralises l aide d un systme Camag (Muttenz, Suisse)
quip d une chambre de dveloppement automatise ADC avec contrle de l humidit,
d un visualiseur et d un scanner contrls par le logiciel WinCATS.
Les chantillons ont t dposs sur des plaques de gel de silice 60 F254 (20 x 10 cm x
0,20 mm fournies par Merck. Toutes les plaques ont t dveloppes jusqu mm
partir du bord infrieur, avec un contrle de l humidit variant de % et 20 min
de saturation.
Une inspection visuelle des plaques a systmatiquement t ralise 254 et 366 nm
ainsi qu en lumire blanche.
Les plaques ont t scannes aux longueurs d ondes dfinies au fil des dveloppements
de mthodes en mode rflexion, avec des lampes D2 (deutrium) et W (tungstne), la
dimension des fentes tant fixe 8,00 mm x 0,40 mm. La vitesse de scan est prdfinie
20 mm/s, avec une rsolution de 100 m/tape. 15 chantillons ont systmatiquement
199
t appliqus sur chaque plaque (largeur de bande : 8 mm, vitesse de dpt : 50 nL/s,
distance entre chantillons : 11,4 mm, distance des bords externes : 20 mm).
Le Tableau 65 rsume les 3 mthodes testes pour optimiser la mthode de dosage du
principe actif de la plante A dans des matrices cosmtiques. La premire mthode avait
t dveloppe dans le cadre de l approfondissement de la connaissance phytochimique
de l extrait. Dans ce cadre, l actif d intrt a t dtect avec un rapport frontal Rf de
0,65, facilement dtectable par la couleur verte de la zone observe en lumire blanche
aprs rvlation l anisaldhyde. Cet indice de rtention tant jug trop lev pour
envisager un dosage optimal de l actif ; la mthode a t revue afin de l abaisser. De plus,
l application de cette mthode aux chantillons de crmes cosmtiques contenant ou
non l extrait de plante a montr une co-lution de matires premires grasses avec l actif
de la plante (par analyse des densitogrammes).
Nous avons alors modifi les proportions en solvants dans la phase mobile selon la
mthode 2. Aprs rvlation l anisaldhyde, nous avons pu constater que nous avions
bien abaiss le Rf de l actif , , mais qu il y avait toujours un problme de co-lution.
Enfin, en modifiant de nouveau la phase mobile conformment la mthode 3 et en
effectuant le densitogramme de la plaque sans effectuer de rvlation, nous avons pu
constater que l actif prsente une bonne absorbance UV, avec un maximum
= 315 nm, sans qu il n y ait de co-lution avec d autres composs cette longueur
d onde.
Cette dernire mthode a donc t retenue pour le dosage de l actif.
Tableau 65 : mthodes (PTLC testes pour loptimisation du dosage de lactif de lextrait de plante
A dans les crmes cosmtiques.
Mthode 1 Mthode 2 Mthode 3

Tolune/Ac. Tolune/Ac. Tolune/Ac.
Phase mobile d thyle*/Ac. Formique d thyle/Ac. Formique d thyle/Ac. Formique
70 :30 :1 96 :4 :1 98 :2 :1
Oui
Densitomtre - -
max = 315 nm
Rvlation Anysaldhyde Anysaldhyde -

Densitomtre = 420 nm = 420 nm -
Rf du principe actif
0,65 0,43 0,42
de la plante A
Co-lution avec des
composs de la Oui Oui Non
matrice cosmtique
* Ac. dthyle = Actate dthyle ; Ac. Formique = Acide Formique
200
4.2.3 Extraction de lactif de plante A
Le dosage de l actif dans les extraits bruts de plante A par (PLC et (PTLC est ralis
partir d chantillons d extraits solubiliss dans du mthanol. Avant analyse, l chantillon
est extrait au bain ultrasons pendant 15 min puis centrifug afin de rcuprer le
surnageant limpide pour l analyse. Nous avons donc choisi d extraire l actif de plante A
incorpor dans les crmes cosmtiques sur le mme modle. Pour ce faire, nous avons
ralis une dilution par 10 des chantillons de crme dans du MeOH. Les chantillons de
crmes dilus ont ensuite t homogniss au vortex suivi de 15 min aux ultrasons.
Finalement, ils ont t centrifugs et le surnageant limpide prlev pour ralisation de
l analyse L de dpt systmatique).
4.2.4 Dosage de lactif par (PTLC
Trois courbes d talonnages ont t effectues partir des trois extraits de plante A sur
supports liquides. Ces trois courbes ont servi de support pour le dosage de l actif dans
les diffrentes crmes contenant les extraits. Le dosage ralis est un dosage relatif, bas
sur la concentration en extrait dans nos chantillons et non pas sur la quantit relle en
actif car le standard utilis pour l talonnage par (PLC l acide cinnamique n tait pas
adapt ici et nous n avions pas d actif isol disposition pour la ralisation d un
talonnage partir de celui-ci.
Nous avons systmatiquement prpar une solution 1 mg/mL en extrait et avons
ralis en triplica des dpts de 1 ; 2 ; 6 ; 8 et 12 L (par tapes de 1 ou 2 L) pour la
ralisation des courbes talons. Les rsultats obtenus sont exposs dans le Tableau 66.
Tableau 66 : courbes dtalonnage des extraits de plantes A sur les trois supports liquides par
HPTLC, 315 nm
Extraits Equations R2 Erreur relative

Plante A S1 y = -4,9053x2 + 383,06x + 32,952 0,99996 <7,3 %
Plante A S2 y = -6,0177x2 + 439,99x + 32,172 0,99933 <6,4 %
Plante A S3 y=- 5,9473x2 + 411,49x - 0,112 0,99965 <5,6 %
Chaque essai a t reconduit 3 fois afin d valuer la reptabilit. Pour cela, un mme
chantillon a t dos fois puis chaque chantillon a t prpar fois afin d effectuer
les dosages.
201
1 DEVELOPPEMENT ET VALIDATION DUN SYSTEME DENCAPSULATION
1.1 Glation ionotropique
1.1.1 Matires premires
Les deux grades d alginates utiliss sont le Manugel GMB et le Protanal RF FMC
Biopolymer, Philadelphia, USA) Le Manugel GMB prsente une viscosit de 110-270
mPa.s 1%, le Protanal RF 6650 une viscosit de 400-600 mPa.s 1%. Tout deux ont
une forte capacit de rticulation. Le chlorure de calcium anhydre CaCl2 (granuls 1-2
mm est fourni par Merckmillipore. L extrait hydro-alcoolique d Hypericum perforatum
(millepertuis commun) est fourni par Naturex (Avignon) et la gomme de xanthane
Satiaxane CX930 par Laserson (Etampes).
1.1.2 Rticulation directe
Les solutions de calcium sont prpares par solubilisation du calcium dans l eau sous
agitation magntique temprature ambiante aux concentrations massiques suivantes :
1,0 % ; 2,0 ; 5,0 et 10,0 %.
Les solutions d alginate sont prpares par dissolution des alginates saupoudrs dans
l eau sous agitation mcanique l aide d un agitateur Turbotest Rayneri quip d une
hlice flux radial dfloculeuse 0,5 et 1 %.
L extrait vgtal est ajout , % massique dans les solutions d alginate sous
agitation.
Les capsules sont formes par addition goutte goutte des solutions d alginate dans les
bains de calcium l aide d une pipette de mL.
1.1.3 Rticulation indirecte
Afin d augmenter la densit des solutions de calcium, de la satiaxane CX est ajout

0,3 et 0,5 %. Pour cela, les solutions de calcium sont chauffes 55 C et la gomme y est
saupoudre sous agitation avec une hlice dfloculeuse. L agitation est poursuivie
jusqu hydratation complte du polymre.
Les solutions de calcium 1 et 10 % massique sont ajoutes goutte goutte dans une
solution 1 % de Manugel GMB l aide d une seringue de mL quipe d une aiguille, la
distance entre l aiguille et la solution d alginate devant tre suprieure cm.
202
1.2 Coacervation complexe : gomme arabique/lcithine
1.2.1 Matires premires
La gomme arabique utilise est du Kahlgum 6644 (Brenntag), la lcithine de soja non
purifie est du SOLEC (Solae), la lcithine purifie en phosphatidylcholine de
l Emulmetik Unipex, Lucas Meyer . L huile de noyau d abricot est fournie par
Protival et l huile essentielle de cannelle par Bernardi.
1.2.2 Protocole opratoire
Les capsules coacerves sont ralises selon le protocole suivant :
Disperser la lcithine dans l eau distille et ajuster p( afin d optimiser la

solubilisation
Ajouter l actif hydrophobe encapsuler
Homogniser pendant 5 min 3300 tr/min
Ajouter la solution de gomme arabique 7,5 % massique
Ajouter mL d eau distille
Maintenir la solution sous agitation magntique 30 min 50 C pour
permettre la raction
1.2.3 Essais raliss
Le Tableau 67 rsume les diffrents protocoles tests.
Tableau 67 : dtails des diffrents essais raliss par coacervation complexe entre une gomme
arabique et des lcithines
Essai 1 Essai 2 Essai 3 Essai 4

m (g) m (g) m (g) m (g)
Eau
40,02 50,03 40,02 50,03 40,00 50,02 40,03 50,05
osmose
Gomme
3,25 3,25 3,25 3,25
arabique
Lcithine
3,75 NP 3,75 NP 3,76 NP 3,76 P
NP* ou P
Ajustement NaOH NaOH NaOH NaOH
pH 8 2,5% 2,5% 8% 8%
Huile NA
0,50
(HNA) ou HE 1,02 0,99 0,51
HE
cannelle HNA HNA HNA
Cannelle
(HEC)
Ajustement
10,00 10,00 10,00 10,00
eau
AJustemnet
Ac. Citrique 2% Ac. Citrique 8 % Ac. Citrique 8% Ac. Citrique 8%
pH 4
*NP : non purifie ; P : purifie, HNA : huile de noyau dabricot, (E Cannelle : huile essentielle de
cannelle. Chaque case mise en valeur en rouge correspond la modification de protocole apporte
par rapport la colonne prcdente.
203
1.3 Vsicules multilamellaires type oignons
Les oignons sont prpars selon un protocole dj tabli [113,223]. La phase hydrophile
est tout d abord prpare. Les oignons sont produits dans un tube en verre de 4 mL dans
lequel sont pess les phospholipides et la phase hydrophile. L ensemble est ensuite
cisaill pendant environ 3 min avant d tre centrifug min 4000 tr/min. Le mlange
est de nouveau cisaill et centrifug deux reprises dans les mmes conditions comme
dcrit sur la Figure 85. Ces tapes permettent dans un premier temps la bonne
hydratation des phospholipides par la phase hydrophile (hydratation plus aise avec
l eau qu avec la matrice G-PG) et leur organisation en phase lamellaire et enfin, sous
l action du cisaillement et grce la composition des phospholipides, la formation des
vsicules multilamellaires. Nous obtenons finalement une pte qui est un concentr
d oignons que nous dispersons ensuite dans l eau pour obtenir une dispersion d oignons.
Tout au long des travaux, les essais ont t formuls sur 200 1000 mg d oignons.
Figure 85 : reprsentation schmatique de la prparation des oignons
2 DEVELOPPEMENT ET OPTIMISATION DES VESICULES

MULTILAMELLAIRES : OIGNONS
2.1 Phospholipides
Les trois phospholipides compars sont le Phospholipon 85G et le Lipoid 75H

Cosmetochem, Lipoid ainsi que l Emulmetik Unipex, Lucas Meyer .
204
2.2 Analytes modles
Les deux premiers analytes tudis pour l encapsulation sont la rutine hydrate >94%,
grade HPLC (Sigma-Aldrich) et la naringnine 98% (Sigma-Aldrich).
Puis le systme a t largi diffrentes molcules conservatrices que sont l acide
benzoque, l acide salycilique Sigma-Aldrich), les mthylisothiazolinone et
mthylchloroisothazolinone (MI/MCI) (Masso) et la chlorhexidine (Masso).
2.3 Solubilisation des actifs
La matrice G-PG, base de glycrine (Interchimie, Compans, France) et propylne glycol

(Interchimie, Compans, France) 60 : 40 v : v est prpare l avance et conserve
temprature ambiante. La viscosit de ces matires premires ne permet pas de
prlvement volumique. Sur la base des densits des matires premires (dGlycrine=1,26
et dPropylne glycol= 1,04), nous prparons donc un mlange G-PG 64,6 : 35,4 m : m. Les
actifs sont alors additionns cette matrice et solubiliss.
Les premiers essais contiennent de la rutine et de la naringnine 30 et 8 mg/mL
respectivement. Ces actifs ont t solubiliss dans la matrice G-PG sous agitation
magntique et chauffage 40C. Dans ces conditions, ces concentrations se sont avres
tre les limites de solubilit des analytes. Par la suite, des essais ont t raliss avec la
rutine seule que nous sommes parvenus solubiliser plus largement (jusque 70 mg/mL)
en alternant l agitation magntique avec des tapes de min au bain ultrasons
chauff 40C. Si des rsidus insolubles d actifs persistaient aprs passages aux
ultrasons, alors nous estimions la limite de solubilit atteinte.
Les acides benzoque et salycilique ont t solubiliss 2,8 et 2,0 mg/mL
respectivement dans l eau et dans le G-PG sous agitation magntique temprature
ambiante.
Les mthylisothiazolinone et mthylchloroizothiazolione (MI/MCI) se prsentant dj
sous forme d une solution aqueuse dilue, nous l avons directement encapsule telle
quelle.
La chlorhexidine digluconate utilise est une solution aqueuse 20 %. En fonction des
essais, cette solution a t encapsule telle quelle ou bien aprs avoir t dilue 15 et
10 % dans l eau, ou encore ; 10 ou 5% par ajout de la matrice G-PG.
L homognisation des solutions a t ralise sous agitation magntique.
2.4 Microscope optique
La formation des oignons ainsi que leur morphologie ont t observes l aide d un
microscope OPTECH Biostar BASP T (objectifs plans 4X, 10X, 40X, 100X). Le microscope
est quip d un filtre contraste de phase pour les objectifs 10X et 40X.
205
2.5 Granulomtrie
Les mesures de taille de particules sont ralises avec un granulomtre laser

Mastersizer Hydro 2000S (Malvern Instrument GmbH). La gamme des tailles pouvant
tre mesures par l appareil est comprise entre , m et mm.
Les mesures ont t ralises sur des dispersions de vsicules dans l eau. Quatre
mesures sont ralises sur chaque chantillon. Les oignons sont prpars la veille de
l analyse et les dispersions le jour mme. Quelques millilitres de dispersion sont
ncessaires pour raliser la mesure. L agitation est rgle 3500 tr/min et deux lavages
successifs de la cuve d analyse sont appliqus entre chaque mesure l eau distille et
aux ultrasons.
Les indices de rfractions (IR) des capsules ont t valus suivant les indices de
rfraction des matires premires les constituants et sur la base du calcul suivant :
O xi reprsente la fraction massique de l ingrdient i dans les capsules, et IRi l indice de

rfraction de l ingrdient i mesur l aide d un rfractomtre 350 (Anton Paar GmbH,
Allemagne) ou suivant les donnes de la littrature.
Le Tableau 68 donne les indices de rfraction des diffrents composs des capsules.
Tableau 68 : indices de rfractions des composs des capsules
Lcithine
GPG+rutine/ Eau (donne
GPG (IR (donnes de la
Composs naringnine de la
mesur) littrature
(IR mesur) littrature)
[251,252])
Indices de
1,45780,0008 1,46310,0005 1,3303 1,42-1,49
rfractions
Nous avons alors calcul les valeurs des indices de rfraction partir des indices de
rfraction bas et haut pour la lcithine et avons calcul leurs moyennes, donnes que
nous avons utilises pour raliser nos mesures (Tableau 69).
Tableau 69 : indices de rfractions calculs des capsules en fonction de la composition
Lcithine/GPG
Lcithine/GPG+r
Lcithine/GPG +rutine/narin Lcithine/eau
Systme utine
45 :55 gnine 45 :55
33/67
45 :55
Indices de
1,46 1,46 1,39 1,43
rfractions
206
2.6 Prparation des chantillons: Chromatographie dexclusion

strique
Le fractionnement des dispersions de capsules a t ralis avec une phase d exclusion

strique Sephacryl 300HR (Sigma Aldrich), conserve dans un mlange eau/alcool 4C.
La phase est conditionne dans une colonne ouverte (1x10 cm).
Environ 4 mL de phase sont conditionns pour le fractionnement des chantillons.
Chaque colonne est relie par un tuyau situ sur sa partie suprieure un rservoir
d eau positionn 70 cm au dessus de celleci (Figure 86). Un dbit d eau d environ
1 mL/min traverse alors la phase ainsi conditionne.
Figure 86 : photo du montage utilis pour le fractionnement par exclusion
Avant tout dpt d chantillon, les colonnes sont systmatiquement satures avec
400 L d une dispersion d oignons blancs (sans actifs) 20 mg/mL dans l eau. La
sparation entre les vsicules et les actifs non encapsuls est ensuite effectue partir
de 400 L de l chantillon d oignons disperss 25 mg/mL dans l eau. Cette
concentration a t dfinie car plus hautes concentrations, la viscosit de la dispersion
empche la pntration de la phase.
Pour les premiers essais de faisabilit, le dpt de l chantillon s est fait dans les 5 -
10 min suivant la prparation de la dispersion.
Aprs optimisation de la mthode, notamment observation du phnomne d adsorption,
le temps de dispersion systmatiquement appliqu avant dpt a t fix 3 h.
L lution de l chantillon est effectue sous l effet de la gravit, le solvant d lution tant
de l eau. Un total de 50 mL de fractions est collect. Le volume d lution de la fraction
207
d oignons est de , mL en fonction de la composition des oignons et donc de la taille

des capsules formes. Les actifs libres sont lus entre 6 et 45 mL.
Dans le cadre de l optimisation de la mthode et des essais de faisabilit, une autre
phase d exclusion a t utilise, la Sephadex G Sigma Aldrich . Cette phase se
prsente sous forme dshydrate. Elle doit donc tre pralablement hydrate dans le
solvant choisi, de l eau dans notre cas. Nous avons poursuivi l hydratation sur une nuit
systmatiquement. La phase a ensuite t conditionne dans les mmes conditions que
la Sephacryl 300HR.
2.6.1 Fractionnement des oignons : Rutine et Naringnine
Les essais prliminaires de fractionnements n ont pas montr de recouvrement entre la

fraction d oignons et l lution des actifs libres. Ces fractionnements ont
systmatiquement t raliss comme suit:
Rcupration de fractions de 0,5 2 mL entre 0 et 5 mL d lution afin de
rcuprer les oignons ;
Rcupration de 3 fractions de 15 20 mL pour le dosage des actifs libres
entre et mL d lution.
2.6.2 Fractionnement des oignons : Acides benzoque et salycilique
Les essais prliminaires de fractionnement ont montr la possibilit d un recouvrement

entre la fraction d oignons et les acides libres.
Nous avons alors ralis une valuation qualitative de l encapsulation. )ci, la fraction
d oignons lue entre , et , mL. Nous avons alors rcupr cette fraction en 3
volumes comme suit :
Volume de la fraction 1 prleve: 1,6-1,8 mL
Volume de la fraction 2 prleve : 1,4-1,5 mL
Cette mthode assure l absence d acide libre dans les fractions et . Le dbut d lution
des actifs libres est aisment dtect par une trs forte augmentation de la
concentration en actif dos. L lution de l actif libre est systmatiquement dtecte dans
la fraction . Cette mthode permet de vrifier si l actif est encapsul grce l analyse
des fractions 1 et 2 (la fraction 1 tant la plus concentre en oignons). La mthode donne
un rsultat qualitatif sur la prsence ou l absence d actifs dans la fraction d oignons.
2.6.3 Fractionnement des oignons : Mthylchloroisothiazolinone et

Mthylisothiazolinone
Les essais prliminaires de fractionnement ont montr la possibilit d un fort

recouvrement entre la fraction d oignons et les actifs libres.
208
Cette mthode assure l absence d acide libre dans la fraction 1 (fraction la plus
concentre en oignons et permet de dtecter le dbut l lution des actifs libres dans les
fractions et . Le dbut d lution des actifs libres est aisment dtect par une trs
forte augmentation de la concentration en actif dos. L lution de l actif libre est
systmatiquement dtecte dans les fractions 2 et 3. Cette mthode permet de vrifier si
l actif est encapsul grce l analyse de la fraction fraction la plus concentre en
oignons). La mthode donne un rsultat qualitatif sur la prsence ou l absence d actifs
dans la fraction 1.
2.6.4 Fractionnement des oignons : Chlorhexidine
Les essais prliminaires de fractionnement ont montr la possibilit d un fort

recouvrement entre la fraction d oignons et les actifs libres.
Volume de la fraction 1 : 1,4-1,6 mL
Cette mthode assure l absence d acide libre dans les fractions . Le dbut d lution
des actifs libres est aisment dtect par une trs forte augmentation de la
concentration en actif dos. L lution de l actif libre est systmatiquement dtecte dans
la fraction 6, parfois ds la fraction 5 et rarement ds la fraction 4. Cette mthode
permet de vrifier si l actif est encapsul et de calculer des rendements d encapsulations
car les fractions 4 6 ne contiennent que des traces de capsules en comparaison avec les
fractions 1 3.
2.7 Mthode de sparation : Ultracentrifugation
Les chantillons ont t spars l aide d une ultracentrifugeuse Serval Discovery

M150SE (rotor S100-AT6). Les sparations ont t effectues sur 1 mL de dispersion
209
d oignons 40 mg/mL, 55 000 tr/min pendant 5 h, 4 C. La vitesse d acclration a

t fixe son maximum et celle de dclration 50 % du frein.
2.8 Mthode de dosage par HPLC-DAD
Les dosages d actifs ont t raliss par (PLC Agilent muni d un dtecteur
barrettes de diodes (DAD diode-array detector). La sparation est ralise au moyen
d une colonne analytique C18 Luna (Phenomenex, 250 4,6mm, 5 m, ), quipe
d une prcolonne C Phenomenex, 3,0 mm i.d.). La phase mobile est constitue
d eau A et d actonitrile B et parfois d isopropanol C acidifis avec , % d acide
formique.
Le dbit d lution est de 1 mL/min et le gradient de solvant est dcrit dans les Tableau
70 Tableau 73, en fonction de la nature des analytes. L analyse des chantillons
d oignons contenant des phospholipides et le tensioactif de destruction (Triton X100)
ncessite de prolonger l lution avec un gradient d isopropanol afin d liminer ces
composs. L analyse des spectres UV des composs a permis de dfinir les longueurs
d ondes judicieuses pour la dtection et quantification de chacun des analytes. Le
volume d injection est fix L. Les courbes d talonnages sont obtenues par
rgressions linaires sur 5 6 points sauf pour la chlorhexidine dont la courbe a t
ralise sur 9 points. Tous les essais sont raliss en triplica.
Tableau 70 : gradient dlution % volumique des chantillons base de rutine et/ou

naringnine. Les fractions onions contiennent des phospholipides et du Triton X100.
Rutine = 258 nm, Naringenine = 290 nm

0 95 5 -
Fractions classiques
5 95 5 -
20 38 62 -
21 0 100 -
23 0 100 -
28 0 60 40
Fractions
onions
33 0 60 40
35 95 5 0
(Post-time = 5 min)
210
Tableau 71 : gradient dlution (% volumique) des chantillons base de

mthylchloroisothiazolinone/mthylisothiazolinone. = 273 nm.

0 95 5 -
Fractions
7 95 5 -
Toutes
8 38 62 -
18 0 100 -
Tableau 72 : gradient dlution (% volumique) des chantillons base dacides benzoque ou

salycilique. Les fractions onions contiennent des phospholipides et du Triton X100.
AcBenz = 230 nm, AcSal = 234 nm

0 95 5 -
5 95 5 -
19 38 62 -
20 0 100 -
22 0 100 -
27 0 60 40
Fractions
onions
32 0 60 40
34 95 5 0
(Post-time = 5 min)
Tableau 73 : gradient dlution (% volumique) des chantillons base de chlorhexidine. Les

fractions onions contiennent des phospholipides et du Triton X . = 258 nm.

0 95 5 -
5 95 5 -
17 49,4 50,6 -
18 0 100 -
20 0 100 -
25 0 60 40
Fractions
onions
30 0 60 40
32 95 5 0
(Post-time = 5 min)
211
Les conditions de dosage et de ralisation de la courbe d talonnage pour chaque actif

sont dcrites dans le Tableau 74.
Tableau 74 : conditions de dosages et courbes dtalonnages de chaque actif analys.
Gamme de Erreur
Longueur
concentration R2 relative TR (min)
donde nm
(g/mL) (%)
Rutine 258 0,2 - 100 0,99992 <2,5 12,95

Naringnine 290 0,05 - 26,46 0,99995 <3,6 18
Acide
230 0,28 -140 0,9994 <0,8 12,9
Benzoique
Acide
234 0,1 -100 0,9997 <2,6 13,9
Salycilique
MCI/MI 273 - - - 1,9 et 2,85
Chlorhexidine 258 1,875-300 0,99968 <4,86 14,5
2.9 Test dactivit anti-oxydante
Les mesures d absorbances ont t ralises l aide d un spectrophotomtre Agilent

8453 (logiciel 845x UV-Vis) 700 nm et d une cuve en quartz QS x 10 x 45 mm.
Le pourcentage d inhibition du radical DPP( a t calcul selon l quation suivante :

% =
O A0 est l absorbance du contrle sans actif et A1 l absorbance de l actif test.

Une solution 0,6 mmol/L de DPPH est prpare dans un mlange MeOH/H2O 75 : 25
(v/v). Pour cela, le DPPH est pes ; le MeOH est ensuite ajout et l ensemble est
homognis au bain ultrasons puis l eau est enfin additionne. Cette solution est
prpare avant chaque nouvelle analyse et conserve l abri de la lumire.
Le test est effectu sur 2 mL d chantillon. Chaque chantillon contient 0,250 mL de
solution de DPPH et 1,750 mL de solution tester.
Les chantillons de rutine libre, tmoins du test, ont t prpars partir d une solution
de rutine concentre 25 mg/mL dans le G-PG et dilue dans l eau g/mL. Cette
dernire solution sert de base pour la prparation des 9 chantillons de concentration
variantde 0,5 14 g/mL. Le volume total de chaque chantillon est de 1,75 mL.
Les vsicules multi-lamellaires contenant la rutine encapsule sont composes de
lipides/G-PG 37 : 63 (m :m). La rutine est solubilise dans le G-PG 25 mg/mL. Une
212
dispersion mre 25 mg/mL de capsules dans l eau est prpare. Puis cette dispersion
est dilue dans l eau afin d obtenir des chantillons contenant ; 4 ; 5 ; 6 ; 8 et 10 g/mL
de rutine. Le volume total des dispersions dilues est de 1,75 mL pour les analyses.
Pour chaque essai, un chantillon contrle est prpar. Cet chantillon possde la mme
composition que l chantillon tester, sans le principe actif ici la rutine . L absorbance
mesure est note A0. De plus, un blanc est systmatiquement ralis. Cet chantillon
blanc possde la mme composition que l chantillon tester sans le DPP( . Enfin
l chantillon test contient le principe actif ainsi que le DPP(.
Chaque chantillon est prpar comme suit :
Ajout de la solution tester dans un vial vis (avec ou sans principe actif, avec
ou sans capsules) : V=1,75 mL
Ajout de la solution de DPPH 0,6mmol/L : V=0,250 mL
Homognisation manuelle des chantillons
Conservation des chantillons l abri de la lumire pendant min avant
mesure des absorbances 700 nm
L erreur relative sur les mesures est infrieure % (<7,4 %)
Tous les chantillons ont t mesurs en triplica.
2.10 Mthode de dosage par HPTLC
Les chantillons ont t dposs sur des plaques en verre de gel de silice 60 F254
(20 x 10 cm x 0,20 mm) fournies par Merck. Toutes les plaques ont t dveloppes
jusqu mm partir du bord infrieur, avec un contrle de l humidit variant de
38 % et 20 min de saturation.
Une inspection visuelle des plaques a systmatiquement t ralise 254 et 366 nm
ainsi qu en lumire blanche.
Les plaques ont t scannes 366 nm en mode rflexion, avec des lampes D2
(deutrium) et W (tungstne), la dimension des fentes tant fixe 8,00 mm x 0,40 mm.
La vitesse de scan est prdfinie 20 mm/s, avec une rsolution de 100 m/tape. 15
chantillons ont systmatiquement t appliqus sur chaque plaque (largeur de bande :
8 mm, vitesse de dpt : 50 nL/s, distance entre chantillons : 11,4 mm, distance des
bords externes : 20 mm).
La mthode applique utilise une phase mobile constitue d actate d thyle/acide
formique/acide actique/eau 100 : 11 : 11 : suivi d une rvlation au NP Natural
Product compos de 1 g d acide diphnylboronique aminothylester dans 200 mL de
methanol). Nous ralisons ensuite le densitogramme de la plaque 366 nm pour le
dosage de l actif. La rutine prsente alors un Rf de , .
213
2.10.1 Dosage de la Rutine par HPTLC
Le dosage de la rutine a t effectu partir d une solution de rutine mg/mL dans la

matrice G-PG dilue 40 g/mL dans l eau. Des dpts de ; 4 ; 6 ; 8 et 10 L ont t
effectus en triplica partir de 3 chantillons. Nous avons obtenu une courbe talon
d quation :
Y = 0,0021x2+2,9013x-51,62 ; R2 = 0,99997
L erreur relative sur la mesure est infrieure %.
2.10.2 Validation de la mthode
Des chantillons tmoins de capsules de rutine de composition lipides/G-PG 37 : 63,

concentre 25 mg/mL en rutine dans le G-PG ont t prpars. Ces capsules ont t
disperses 25 mg/mL dans l eau puis fractionnes par SEC dpt L). La
dispersion mre 25 mg/mL a t dilue 12,5 mg/mL pour tre dpose sur la plaque
HPTLC avec un volume de 2 L. Les fractions de capsules ont t dposes sans
traitement pralable. En effet, les solvants de la phase mobile dtruisent les capsules et
librent la rutine ; il n est donc pas ncessaire de les dtruire au Triton X dans ce cas.
2 L de chaque fraction ont systmatiquement t analyss. Tous les essais ont t
raliss en triplica, tous les fractionnements ayant t eux-mmes raliss en triplica.
L chantillon de capsules sans actif a t prpar partir de lipides/G-PG 37 : 63 sans
rutine, disperses 25 mg/mL dans de l eau, dilues , mg/mL puis dposes 2L
sur la plaque pour analyse.
2.10.3 Prparation des chantillons
Les capsules prpares pour tre incorpores dans les formules sont composes de
lipides/G-PG 37 : 63. La rutine est solubilise 25 mg/mL dans le G-PG. Ces capsules
sont ensuite disperses 400 mg/mL dans de l eau avant d tre ajoutes en fin de
formulation aux produits. Les chantillons ont t disperss au vortex. Nous avons
ralis cette dispersion trs concentre en capsules afin de limiter au maximum les
quantits ajouter dans les produits.
2.10.3.1 Lotion
Les capsules ont t incorpores dans les trois lotions testes suivant le mme
protocole. La premire lotion correspond la lotion tmoin. Dans la deuxime lotion, le
parfum et le tensioactif ont t retirs. Enfin, dans la troisime lotion, le tensioactif a t
substitu par un mlange de glucoside caprylique et caprique.
La solution de capsules 400 mg/mL a t ajoute dans les diffrentes lotions afin
d obtenir une concentration de mg/mL en capsules dans la lotion, soit 6,25 % v/v.
Les chantillons ont t homogniss au vortex.
214
Un tmoin de chaque lotion sans capsules a systmatiquement t analys pour vrifier

l absence de co-lution avec la rutine (dpt 2 L).
Chaque lotion contenant les capsules a t analyse avant fractionnement (dpt 2 L).
Chaque fraction de capsules rcupre a t analyse pour le dosage de la rutine
encapsule et le calcul des rendements d encapsulation. L de chaque fraction a t
dpos sur les plaques. Ces 10 L ont t dposs par tape de 2 L afin de limiter
l talement de la zone de dpt.
2.10.3.2 Crme
10 % de dispersion concentre 400 mg/mL en capsules a t ajout dans le crme afin

d obtenir un produit contenant mg/mL de capsules. Les chantillons ont t
homogniss l aide d une micro-spatule. L ensemble a ensuite t dilu par dans
l eau. Ces chantillons ont t homogniss au vortex.
Des chantillons tmoins de crme sans capsules ont t prpars sur le mme modle.
4 L de ces chantillons tmoins (avec et sans capsule) ont systmatiquement t
appliqus et analyss par HPTLC. Les dpts ont t raliss par tapes de 2 L pour
limiter l talement de la zone de dpt.
Les chantillons dilus contenant les capsules ont ensuite t centrifugs 3000 rpm
par tapes de 5 min afin de rcuprer sparment les phases grasses et aqueuses.
La phase aqueuse ainsi prleve a t dpose hauteur de 12 L pour valuer la
rpartition de la rutine dans celle-ci. Cette phase a ensuite t fractionne par SEC. La
fraction de capsules rcupre a t dpose (20 L) et analyse.
La phase grasse a t extraite au mthanol (1 g de phase grasse extraite avec 2 mL de
MeO( . L chantillon dilu a t homognis au vortex, puis extrait par ultrasons
(30 min avant d tre centrifug min 3000 rpm pour rcuprer le surnageant charg
en actif. 8 L de cet chantillon ont t dposs (par tapes de 2 L) et analyss par
HPTLC.
Afin de valider la mthode d extraction de la rutine contenue dans la phase grasse au
mthanol nous avons ajout une quantit connue de rutine (252 g) 1 g de phase
grasse et l avons extraite avec mL de MeOH sur le mme protocole que prcdemment.
4 L du surnageant de mthanol enrichi en rutine ont t dposs et analyss par
HPTLC.
Chaque chantillon a t prpar et analys en triplica.
215
CONCLUSION GENERALE
CONCLUSION GENERALE
Les objectifs de cette thse taient d optimiser le potentiel de formulations cosmtiques

pour lutter contre les prolifrations microbiennes, d optimiser un ou des extraits
vgtaux antimicrobiens en vue d une utilisation comme conservateur naturel pour la
cosmtique et de dvelopper un systme d encapsulation d actifs naturels.
La premire partie de ces travaux a mis en vidence la possibilit d abaisser l activit de
l eau, facteur limitant la croissance microbienne, par augmentation de la concentration
en glycrine ou glycols usuels. Ces rsultats ont montr que le nombre de groupements
hydroxyles ainsi que leur position sur la chaine carbone influent sur la capacit de la
molcule interagir avec l eau. )l a galement t montr que le protocole de
formulation, notamment l ordre dans lequel sont ajouts les ingrdients, impacte ce
paramtre. Le challenge test ralis pendant 14 jours sur la crme hydratante optimise
selon les critres pr-cits a montr un bnfice sur les 3 bactries tudies mais pas sur
les champignons et levures. Ces rsultats ne permettent cependant pas d attribuer le
potentiel d autoconservation antibactrien de cette formulation la concentration en
glycrine augmente ou l activit de l eau abaisse.
A partir des rsultats antimicrobiens obtenus avec les extraits bruts de plantes A, B, C1
et C , des essais d optimisations de la forme finale de l extrait ont t mens en se
focalisant sur la plante A, premire ressource vgtale prometteuse du projet
NATUBAVAL. Ces essais ont t raliss dans le but de faciliter la manipulation de
l ingrdient final pour sa formulation en produits cosmtiques. Les tudes de mise sur
supports ont rvl que les supports liquides taient plus judicieux que le support
solide. En effet, l extrait sur support solide devait tre pr-solubilis avant son
incorporation dans le produit fini, tape juge dlicate. Les extraits sur supports liquides
ont quant eux pu tre directement ajouts en fin de formulation sans que des
contraintes spcifiques n aient t dceles. Parmi les supports liquides choisis, celui
base de caprylyl glycol s est avr le plus intressant dans son association avec la plante
A. Test 0,4 % en microplaques, il s est montr trs actif contre les 5 souches testes.
A partir des challenges tests, trois essais se sont particulirement distingus. Un produit
prsente une conformit aux critres A de la Ph. Eur. sur les cinq souches. )l s agit de la
crme tmoin contenant l extrait de plante A sur support S3. Cet essai met
particulirement en vidence l activit de l extrait sur A. brasiliensis. L essai contenant
l extrait de la plante A sur support S est tout fait intressant galement car il s avre
conforme aux critres A sur 4 souches et aux critres B sur A. brasiliensis avec une
augmentation de la dcroissance sur cette levure entre et jours. Enfin, l essai
contenant l extrait de plante A sur support S formul dans la crme optimise en a w se
montre prometteur car il prsente une conformit aux critres A sur les 3 bactries et le
champignon tout en tant conforme aux critres B sur A. brasiliensis.
Nous observons globalement que les supports liquides choisis participent de manire
consquente l activit notamment contre les bactries. Ces rsultats ne nous
216
CONCLUSION GENERALE
permettent donc pas d valuer l apport des extraits sur ces micro-organismes. Bien que
les essais de challenges tests contenant 0,5 % d extraits ne se soient pas montrs
suffisamment performants pour tre poursuivis au-del de 14 jours, ils ont permis de
mettre en vidence l activit de l extrait sur S. aureus et C. albicans lorsqu associ au
support S2.
Nous observons par ailleurs que la souche qui se montre la plus rsistante dans nos
essais est A. brasiliensis. Cette rsistance nous a alors permis de diffrencier les essais et
de valider les trois plus prometteurs pour poursuivre le dveloppement d un ingrdient
antimicrobien pour l industrie cosmtique.
Afin de poursuivre le dveloppement de cet ingrdient conservateur, plusieurs tapes
doivent tre envisages. Tout d abord, il est ncessaire de tester et comparer le potentiel
de l extrait dcolor par distillation molculaire seul et associ au support liquide
caprylyl glycol dans la crme tmoin utilise tout au long de ces essais. Les essais de
dcoloration au charbon actif doivent tre approfondis, l activit antimicrobienne d un
extrait dcolor charg en actif devant tre value pour conclure sur la suite de
l optimisation de l extrait. Le procd d extraction avec mise sur support caprylyl glycol
devra ensuite tre amlior, en affinant le ratio plante A/support liquide. Ensuite, une
optimisation de l association avec la plante C peut tre envisage afin de renforcer
l activit contre A. brasiliensis. La concentration minimale d inhibition restera alors
dfinir. Enfin, lorsque la remise en culture de la plante B aura permis de rcolter
suffisamment de matire vgtale, il sera des plus intressant de l intgrer aux essais.
Pour terminer, la ou les forme s d ingrdient rpondant tous les critres d exigences
pourra tre test dans une plus large gamme de produits cosmtiques afin de dfinir la
gnralisation de son utilisation et les concentrations d utilisation.
Par la suite, une mthode de dosage de l actif principalement responsable de l activit
antimicrobienne de la plante A a t dveloppe par HPTLC. Cette mthode a t
dveloppe pour pouvoir suivre une ventuelle cintique de dgradation de cette
molcule dans des matrices cosmtiques complexes. Les dosages raliss pendant deux
mois sur des crmes conserves temprature ambiante ont montr que la
concentration en actif reste plutt stable alors qu une dgradation est observe aprs
conservation 42C sur 5 semaines. Grce cette mthode, il devient possible de suivre
le comportement de l actif d intrt tout au long de la dure de vie du produit. Ce dosage
pourra en particulier aider dfinir le meilleur mode d utilisation des produits
cosmtiques packaging, dure limite d utilisation aprs ouverture), mais galement
comparer la consommation de celui-ci en fonction de la nature des produits cosmtiques
lotion, crme, gel, shampoing . )l serait galement intressant de vrifier la
compatibilit de la mthode avec une plus large gamme de cosmtiques afin de dfinir
ou dtecter d ventuelles matires premires susceptibles de co-luer avec l actif et
d interagir dans le dosage.
La deuxime partie de ces travaux a port sur le dveloppement d un systme
d encapsulation d actifs naturels et synthtique. Le systme slectionn pour son
217
CONCLUSION GENERALE
potentiel encapsuler des molcules aux proprits diverses est compos de

phospholipides s organisant en bicouches concentriques pour former des liposomes
appels oignons. Ces capsules prsentent l avantage d tre produites sans excs de
matire encapsuler. Les rendements d encapsulation se voient alors augments par
rapport aux liposomes classiques . Deux autres avantages majeurs sont l absence de
solvants organique dans le procd de formulation et l utilisation de matires premires
d origine naturelle. Ce systme vsiculaire a pu tre optimis selon les contraintes du
projet. En particulier, la nature de la phase hydrophile contenant les actifs compose
d un mlange de glycrine et de propylne glycol est novatrice. De plus, la mise au point
de la mthode de sparation des actifs libres et encapsuls a mis en vidence un
phnomne d adsorption des actifs en surface des capsules. La mthodologie adopte
dans le traitement des chantillons ainsi que la mise en place d un calcul mathmatique
ont permis de calculer les rendements rels d encapsulation, rsultat bien distincts du
rendement considrant l encapsulation et l adsorption simultanes. Cette approche est
tout fait intressante lors du dveloppement d un systme d encapsulation afin de
mieux comprendre les phnomnes d interactions entre les actifs et la membrane des
capsules.
Les essais raliss sur la rutine et la naringnine ont montr qu environ % des deux
actifs taient retenus par les oignons quelque soit leur concentration. Par contre, ils se
sont nettement diffrencis par leur partage en surface ou l intrieur des capsules. En
effet, la rutine est majoritairement encapsule (environ 65 %) pour de faibles
rendements d adsorption environ % . A l inverse, la naringnine est fortement
adsorbe (environ 70 %) et pas ou peu encapsule (environ 12 %). Plusieurs hypothses
ont t envisages pour expliquer ces phnomnes : les masses molaires, la polarit, la
configuration et la glycosylation sont diffrents facteurs qui peuvent expliquer que
l encapsulation ou l adsorption est privilgie.
Par la suite, la composition des oignons a t optimise en terme de rendement
d encapsulation de la rutine, actif principalement encapsul. Deux modles
mathmatiques ont t proposs afin de dfinir la composition lipide/phase hydrophile
permettant d obtenir une phase lamellaire gonfle son maximum sans excs de phase
hydrophile ainsi que la concentration optimale en actif dans cette phase lamellaire
gonfle donnant le meilleur rendement d encapsulation. Le systme optimal est
compos de 33 % de lipides et 67 % de phase hydrophile constitue de
glycrine/propylne glycol 60 : 40 v/v additionne de 30 mg/mL de rutine. Le
rendement d encapsulation de la rutine associ cette composition est de 62,5 % soit
16,54 mol de rutine par gramme d oignons. La cintique de fuite de la rutine ralise
dans des conditions drastiques a mis en avant que la fuite est lente et qu au bout de
jours, encore 16 % de l actif se trouve encapsul. Cette tude a galement mis en
vidence l intrt de l encapsulation de la rutine, molcule instable qui se dgrade en
querctine en milieu aqueux, alors que la rutine encapsule reste stable. La ralisation
d un test anti-oxydant au DPPH a dmontr la bonne protection de l actif encapsul,
218
CONCLUSION GENERALE
tout en dvoilant la disponibilit de l actif adsorb et en confirmant le modle de calcul

du rendement d encapsulation.
Le dveloppement d une mthodologie de prparation d chantillons et de dosage par
HPTLC a permis d valuer le comportement des capsules de rutine dans deux matrices
cosmtiques : une lotion et une crme. Les essais raliss dans le premier produit ont
rvl une incompatibilit avec un tensioactif anionique : le PPG-1-PEG-9 lauryl glycol
ether. Nos observations nous ont amen supposer que ce solubilisant augmentait la
permabilit des bicouches lamellaires, entrainant une fuite rapide de la rutine. La
suppression et la substitution de cette matire premire par un autre tensioactif ont
permis de conforter cette ide. )l serait alors d intrt de dfinir avec prcision la nature
des tensioactifs prsentant une bonne compatibilit avec cette forme de capsules. Le
calcul du rendement d encapsulation aprs incroporation dans la crme est alors de
27,3 3,2 % d encapsulation. Ceci signifie qu environ % de la rutine fuit lors de
l incorporation des capsules dans la crme. Ce rsultat est trs encourageant et montre
qu il est possible d incorporer des actifs encapsuls dans des matrices trs complexes. Il
serait alors intressant d largir ces essais d autres matrices et surtout de dvelopper
des formules cosmtiques limitant au maximum la fuite de l actif. Enfin, l tape suivante
serait de suivre la cintique de fuite de l actif dans le produit et de corrler ces rsultats
avec l activit revendique.
Suite ces rsultats, nous avons souhait largir l encapsulation d autres molcules,
slectionnes parmi les conservateurs autoriss par la rglementation cosmtique. Nous
avons alors observ que les petites molcules que sont les acides benzoque, salycilique
et les mthylchloroisothiazolinone et mthylisothiazolinone n taient pas encapsules
alors que la chlorhexidine, de poids molculaire suprieur la rutine l tait hauteur de
40 50 % en fonction de la nature de la phase hydrophile. Les essais raliss sur cette
dernire molcule ont mis en avant l influence de la nature de la phase hydrophile sur le
phnomne d adsorption.
Dans une ultime tape, le systme a enfin t appliqu l encapsulation de l extrait de
plante A. L extrait encapsul se prsentait sur support TCM, dcolor ou non par
distillation molculaire. Nous avons alors obtenu un excellent rendement
d encapsulation de l actif suivi dans le cas de l extrait dcolor. Avec 89,1 2,1 %
d encapsulation, ce dernier rsultat est le meilleur obtenu tout au long de nos travaux.
Aprs validation de ces rendements d encapsulation sur l extrait de plante finalis pour
la commercialisation, la dernire tape sera d valuer l impact du systme sur la
protection antimicrobienne des produits cosmtiques.
En conclusion, nos travaux prsentent une avance majeure dans la recherche de
nouveaux conservateurs pour l industrie cosmtique mais galement un potentiel plus
large chelle pour les industries agro-alimentaire, du btiment (peintures), voire
pharmaceutique. Les mthodes de dosages dveloppes par HPTLC sont rapides et
avantageuses pour du travail de routine. Les modles mathmatiques dvelopps pour
l optimisation du systme d encapsulation base de phospholipides sont des plus utiles
219
CONCLUSION GENERALE
pour des dveloppements systmatiques. Enfin, les excellent rsultats obtenus dans le
cas de l encapsulation de l extrait de plante A sont des plus prometteurs pour la
finalisation du projet tout en ouvrant une perspective des plus intressante dans le
cadre de l encapsulation d extraits vgtaux par les phospholipides.
220
ANNEXES
ANNEXE 1
Liste des agents conservateurs admis dans les produits cosmtiques (Rglement CE 1223 2009 du parlement europen pour la cosmtique)
Identification des substances Co ditio s dutilisatio

Concentration Libell des
N maximale co ditio s de ploi
Structure chimique
dordre Dnomination commune du Type de produit, dans les et des
Nom chimique/DCI N CAS NCE Autres
glossaire des ingrdients parties du corps prparations avertissements
prtes
le ploi
1 Acide benzoque et son sel Benzoic acid 65-85-0 200-618-2 Produits rincer, sauf 2,5 % (acide)
de sodium les produits bucco-
Sodium Benzoate 532-32-1 208-534-8 O dentaires
OH
Produits bucco- 1,7 % (acide)
dentaires
Produits sans rinage 0,5 % (acide)

1a Les sels da ide e zo ue Ammonium benzoate, 1863-63-4, 217-468-9, 0,5 % (acide)
autres que ceux lists sous calcium benzoate, 2090-05-3, 218-235-4,
le numro potassium benzoate, 582- 25-2, 209-481-3,
do d e et les este s magnesium benzoate, MEA- 553-70-8, 209-045-2,
da ide e zo ue benzoate, methyl benzoate, 4337-66-0, 224-387-2,
ethyl benzoate, propyl 93-58-3, 93- 202-259-7,
benzoate, butyl benzoate, 89-0, 2315- 202-284-3,
isobutyl benzoate, isopropyl 68-6, 136-60- 219-020-8,
benzoate, phenyl benzoate 7, 120-50-3, 205-252-7,
939-48-0, 93- 204-401-3,
99-2 213-361-6,
202-293-2
2 Acide propionique et ses Propionic acid, ammonium 79-09-4, 201-176-3, 2 % (acide)
sels propionate, calcium 17496-08-1, 241-503-7,
propionate, magnesium 4075- 81-4, 223-795-8,
propionate, potassium 557-27-7, 209-166-0,
propionate, sodium pro- 327-62-8, 206-323-5,
pionate 137- 40-6 205-290-4
ANNEXES

Structure chimique
prtes
le ploi
3 Acide salicylique (1) et ses Salicylic acid, calcium 69-72-7, 824- 200-712-3, 0,5 % (acide) Ne pas utiliser Ne pas employer
sels salicylate, magnesium 35-1, 18917- 212-525-4, OH O
dans les produits chez les enfants de
salicylate, MEA- salicylate, 89-0, 59866- 242-669-3, pour les enfants moins de 3 ans (2)
sodium salicylate, potassium 70-5, 54-21-7, 261-963-2, OH gs de moins de
salicylate, TEA- salicylate 578-36-9, 200-198-0, 3 ans,
2174-16-5 209-421-6, le eptio des
218-531-3 shampooings
4 Acide sorbique et ses sels Sorbic acid, calcium sorbate, 110-44-1, 203-768-7, 0,6 % (acide)
sodium sorbate, potassium 7492-55-9, 231-321-6,
sorbate 7757- 81-5, 231-819-3,
24634-61-5 246-376-1
5 Formaldhyde et Formaldehyde 50-00-0, 200-001-8 Produits bucco- 0,1 % (en for- Ne pas utiliser
paraformaldhyde (3) Paraformaldehyde 30525-89-4 dentaires maldhyde dans les arosols
libre) (sprays)
Autres produits 0,2 % (en for-

maldhyde
libre)
6 Dplac ou supprime
7 Biphnyle-2-ol et ses sels o-Phenylphenol, sodium o- 90-43-7, 132- 201-993-5, 0,2 % (en
phenylphenate, potassium 27-4, 13707- 205-055-6, phnol)
o-phenylphenate, MEA o- 65-8, 84145- 237-243-9,
phenylphenate 04-0 282-227-7
8 Pyrithione de zinc (4) Zinc pyrithione 13463-41-7 236-671-3 Produits pour les 1,0 % Uniquement pour
cheveux et la pilosit les produits
du visage rincer
Autres produits 0,5 % Ne pas utiliser

dans les produits
bucco-dentaires
ANNEXES

Structure chimique
prtes
le ploi
9 Sulfites et bisulfites odium sulfite, ammonium 7757-83-7, 231-821-4, 0,2 % (en SO2
inorganiques (5) bisulfite, ammonium sulfite, 10192-30-0, 233-469-7, libre)
potassium sulfite, potassium 10196-04-0, 233-484-9,
hydrogen sulfite, sodium 10117-38-1, 233-321-1,
bisulfite, sodium 7773-03-7, 231-870-1,
metabisulfite, potassium 7631-90-5, 231-548-0,
metabisulfite 7681- 57-4, 231-673-0,
16731-55-8 240-795-3
10 Dplac ou supprime
11 1,1,1-Trichloro-2- Chlorobutanol 57-15-8 200-317-6 0,5 % Ne pas utiliser Contient:

mthylpropanol-2 dans les arosols Chlorobutanol
(Chlorobuta- (sprays)
nol)
12 Acide p- 4-Hydroxybenzoic acid, 99-96-7, 99- 202-804-9, 0,4 % (en
hydroxybenzoque, ses methylparaben, 76-3, 94-26-8, 202-785-7, acide) pour
sels et esters butylparaben, potassium 36457-19- 202-318-7, un ester
ethylparaben, potassium 9,16782-08-4, 253-048-1,
paraben, propylparaben, 94-13-3, 240-830-2, 0,8 % (en
isobu- tylparaben, sodium 4247-02-3, 202-307-7, acide) pour
methylparaben, sodium 5026- 62-0, 224-208-8, les mlanges
ethylparaben, sodium 35285-68-8, 225-714-1, deste s
propylparaben, sodium 35285-69-9, 252-487-6,
butylparaben, sodium 36457-20-2, 252-488-1,
isobutyl- paraben, 84930-15-4, 253-049-7,
ethylparaben, sodium 120- 47-8, 284-595-4,
paraben, isopropylparaben, 114-63-6, 204-399-4,
potassium methylparaben, 4191-73-5, 204-051-1,
potassium butylparaben, 2611-07-2, 224-069-3,
potassium propylparaben, 38566-94-8, 247-464-2,
sodium propylparaben, 84930-17-4, 254-009-1,
calcium paraben, 35285-69-9, 284-597-5,
phenylparaben 69959-44-0, 252-488-1,
17696-62-7 274-235-4,
241-698-9
ANNEXES

Structure chimique
prtes
le ploi
13 Acide dhydroactique et Dehydroacetic acid, sodium 520-45-6, 208-293-9, 0,6 % (en Ne pas utiliser
ses sels dehydroacetate 4418-26-2, 224-580-1 acide dans les arosols
16807- 48-0 (sprays)
14 Acide formique et son sel Formic acid, sodium formate 64-18-6, 141- 200-579-1, 0,5 %
de sodium 53-7 205-488-0 (en acide)
15 1,6-Di (4-amidino-2- Dibromohexamidine 93856-83-8 299-116-4 0,1 %
bromophnoxy)-n-hexane Isethionate
(Dibromohexamidine) et
ses sels (y compris
lisethio ate
16 Thiosalicylate Thimerosal 54-64-8 200-210-4 Produits pour les yeux 0,007 % (en Contient: Thio-
d thylmercure sodique Hg) sali late d th l
(Thiomersal) mercure sodique
En cas de
mlange avec
daut es
composs
mercuriels
autoriss par
le prsent
rglement,
la
concentration
maximale en
Hg reste fixe
0,007 %
ANNEXES

Structure chimique
prtes
le ploi
17 Phnylmercure et ses sels Phenyl Mercuric Acetate, 62-38-4, 94- 200-532-5, Produits pour les yeux 0,007 % (en Contient des
(y compris le borate) Phenyl Mercuric Benzoate 43-9 202-331-8 Hg) composs
En cas de phnylmercuriques
mlange avec
daut es
composs
mercuriels
autoriss par
le prsent
rglement,
la
concentration
maximale en
Hg reste fixe
0,007 %
18 Acide undcylnique et Undecylenic acid, potassium 112-38-9, 203-965-8, 0,2 % (en
ses sels undecylenate, sodium 6159-41-7, 222-264-8, acide)
undecylenate, calcium 3398- 33-2, 215-331-8,
undecylenate, TEA- 1322-14-1, 282-908-9,
undecylenate, MEA- 84471-25-0, 260-247-7
undecylenate 56532-40-2
19 1,3-bis(2- Hexetidine 141-94-6 205-513-5 0,1 %
thylhexyl)hexahydro- 5-
mthyl-5-pyrimidinamine
20 Bromo-5-nitro-5 dioxane 5-Bromo-5-nitro-1,3- 30007-47-7 250-001-7 Produits rincer 0,1 % viter la forma-
1,3 dioxane tion de
nitrosamines
21 Bromo-2 nitro-2 2-Bromo-2-nitropropane- 52-51-7 200-143-0 0,1 % viter la
propanediol 1,3 1,3- diol formation de
(Bronopol) nitrosamines
22 Alcool dichloro-2,4- Dichlorobenzyl Alcohol 1777-82-8 217-210-5 0,15 %
benzylique
ANNEXES

Structure chimique
prtes
le ploi
23 1-(4-Chlorophnyl)-3-(3,4- Triclocarban 101-20-2 202-924-1 0,2 % Critres de
dichlorophenyl)ure (6) puret:
3-3-4-4-
Ttrachloroazo-
benzne < 1 ppm
3-3-4-4-
Ttrachloroa-
zoxybenzne < 1
ppm
24 Chlorocrsol p-Chloro-m-Cresol 59-50-7 200-431-6 Ne pas utiliser dans 0,2 %
les produits destins
aux muqueuses
25 5-Chloro-2-(2,4- Triclosan 3380-34-5 222-182-2 0,3 %
dichlorophnoxy) phnol
26 Chloroxylnol Chloroxylenol 88-04-0 201-793-8 0,5 %
27 N,N-M th l e is[N-[3- Imidazolidinyl urea 39236-46-9 254-372-6 0,6 %

(hydroxymthyl)-2,5-
dioxoimidazolidine-4-
yl]ure]
28 , -bis Polyaminopropyl biguanide 70170-61-5, 0,3 %
[[[(Aminoiminomthy- 28757-47-3,
l)amino]iminomthyl] 133029-32-0
amino-
]poly(mthylne),
dichlorhydrate
29 Phnoxy-2-thanol Phenoxyethanol 122-99-6 204-589-7 1,0 %
30 Mthnamine Methenamine 100-97-0 202-905-8 0,15 %
31 Chlorure de 1-(3- Quaternium-15 4080-31-3 223-805-0 0,2 %

chloroallyl)- 3,5,7-triaza-1-
azonia adamantane
ANNEXES

Structure chimique
prtes
le ploi
32 1-Imidazolyl-1-(4- Climbazole 38083-17-9 253-775-4 0,5 %
chlorophnoxy) 3,3-
dimthyl-butane-2-one
33 Dimthylol, DMDM Hydantoin 6440-58-0 229-222-8 0,6 %
dimthylhydantone
34 Alcool benzylique (7) Benzyl alcohol 100-51-6 202-859-9 1,0 %
35 1-Hydroxy-4-mthyl-6 1-Hydroxy-4-methyl-6- 50650-76-5, 272-574-2 Produits rincer 1,0 %

(2,4,4- trimthyl-pentyl) 2- (2,4,4- trimethylpentyl) 2- 68890-66-4
piridon et pyridon, Piroctone Olamine Autres produits 0,5 %
son sel de monothanol
amine
36 Dplac ou supprime
37 , -Mthylnebis(6- Bromochlorophene 15435-29-7 239-446-8 0,1 %

bromo-4- chlorophnol)
38 Isopropyl-mtacrsol o-Cymen-5-ol 3228-02-2 221-761-7 0,1 %
39 Chloro-5-mthyl-2- Methylchloroisothiazolinone 26172-55-4, 247-500-7, 0,0015 %

isothiazoline-4-one-3 + et Methylisothiazolinone 2682-20-4, 220-239-6 du
mthyl- 55965-84-9 mlange dans
2-isothiazoline-4-one-3 + un rapport
du chlorure de 3:1 de chloro-
magnsium et du nitrate 5- mthyl-2-
de magnsium isothiazoline-
4- one-3 et
mthyl-2-
isothiazoline-
4- one-3)
40 Benzyl-2-chloro-4-phnol Chlorophene 120-32-1 204-385-8 0,2 %
41 Chloractamide Chloroacetamide 79-07-2 201-174-2 0,3 % Contient:

Chloroacetamide
ANNEXES

Structure chimique
prtes
le ploi
42 N,N-bis(4-Chlorophnyl)- Chlorhexidine, 55-56-1, 56- 200-238-7, 0,3 % (en
3,12- diimino-2,4,11,13- Chlorhexidine Diacetate, 95-1, 18472- 200-302-4, chlo-
ttraazattradcanediami Chlorhexidine Diglu- conate, 51-0, 3697- 242-354-0, rhxidine)
dine: actate, gluconate Chlorhexidine Dihydro- 42-5 223-026-6
et chlorhy- drate chloride
43 Phnoxypropanol (8) Phenoxyisopropanol 770-35-4 212-222-7 Uniquement pour les 1,0 %
produits rincer
44 Alkyl (C12-22) trimthyl Behentrimonium chloride, 17301-53-0, 241-327-0, 0,1 %
ammonium, bromure de, cetrimonium bromide, 57-09-0, 112- 200-311-3,
chlorure de cetrimonium chloride, 02-7, 1119- 203-928-6,
laurtrimonium bromide, 94-4, 112-00- 214-290-3,
laurtrimonium chloride, 5, 1120-02-1, 203-927-0,
steartrimonium bromide, 112-03-8 214-294-5,
steartrimonium chloride 203-929-1
45 4,4-Dimthyl-1,3- Dimethyl Oxazolidine 51200-87-4 257-048-2 0,1 % pH>6
oxazolidine
46 N-(Hydroxymthyl)-N- Diazolidinyl Urea 78491-02-8 278-928-2 0,5 %
(dihydroxymthyl-1,3-
dioxo-
2,5-imidazolidinyl-4)-N-
(hydroxymthyl) ure
47 , -(1,6- Hexamidine, Hexamidine 3811-75-4, 211-533-5, 0,1 %
Hexanediylbis(oxy)) bis- diise- thionate, Hexamidine 659-40-5, 299-055-3
benznecarboximidamide paraben 93841- 83-9
et ses sels (incluant
lis thio ate et
le p-hydroxybenzoate)
48 Glutaraldhyde (1,5- Glutaral 111-30-8 203-856-5 0,1 % Ne pas utiliser Contient: Gluta- ral
pentanedial) dans les arosols (9)
(sprays)
ANNEXES

Structure chimique
prtes
le ploi
49 5-thyl-3,7-dioxa-1- 7-Ethylbicyclooxazolidine 7747-35-5 231-810-4 0,3 % Ne pas utiliser
azabicyclo [3.3.0] octane dans les produits
bucco- dentaires
et dans les pro-
duits destins aux
muqueuses
50 3-(p-Chlorophnoxy)- Chlorphenesin 104-29-0 203-192-6 0,3 %
propane- 1,2 diol
51 Hydroxymthylaminoact Sodium 70161-44-3 274-357-8 0,5 %
ate de sodium Hydroxymethylglycinate
52 Chlo u e da ge t d pos Silver chloride 7783-90-6 232-033-3 0,004 % (en 20 % AgCl (m/m)
sur dioxyde de titane AgCl) sur TiO2. Ne pas
utiliser dans les
produits pour les
enfants gs de
moins de 3 ans,
dans les produits
bucco-dentaires
et dans les pro-
duits pour les
yeux ou les lvres
53 Chlorure de N,N-dimthyl- Benzethonium Chloride 121-54-0 204-479-9 a) Produits rincer 0,1 %
N-[2- [2-[4-(1,1,3,3-
ttramthylbutyl) b) Produits sans
phnoxy]thoxy]thyl] rinage autres que les
benzne- mthanaminium produits bucco-
dentaires
54 Chlorure, bromure et Benzalkonium chloride, ben- 8001-54-5, 264-151-6, 0,1 % (en viter le contact
saccharinate de zalkonium bromide, 63449-41-2, 293-522-5, chlorure de avec les yeux
benzalkonium (10) benzalkonium saccharinate 91080-29-4, 273-545-7, benzalk-
68989-01-5, 270-325-2, onium)
68424-85-1, 269-919-4,
68391-01-5, 263-080-8,
61789-71-7, 287-089-1
85409-22-9
ANNEXES

Structure chimique
prtes
le ploi
55 (Phnylmthoxy) Benzylhemiformal 14548-60-8 238-588-8 Produits rincer 0,15 %
mthanol
56 Carbamate de 3-iodo-2- Iodopropynyl 55406-53-6 259-627-5 a) Produits rincer a) 0,02 % Ne pas utiliser a) Ne pas utiliser
propynylbutyle butylcarbamate pour les produits pour des
b) Produits sans b) 0,01 % bucco- dentaires enfants gs de
rinage et les produits moins de 3 ans (11)
pour les lvres b) et c) Ne pas
c) Dodorants/ c) 0,0075 % a) Ne pas utiliser utiliser pour des
antiperspirants dans des produits enfants gs de
pour les enfants moins de
gs de moins de 3 ans (12)
3 ans, sauf dans
des produits de
bain/des gels de
douche et des
shampooings
b) Ne pas utiliser
dans les
lotions et crmes
pour le corps (13)
b) et c) Ne pas
utiliser dans des
produits pour les
enfants gs de
moins de 3 ans
57 2-Mthyl-2H-isothiazole- Methylisothiazolinone 2682-20-4 220-239-6 0,01 %
3-one
(1) Pour une utilisation autre que comme agent conservateur, voir annexe III, no 98.
(2) Uniquement pour les produits qui pourraient ventuellement tre utiliss chez les enfants gs de moins de 3 ans et qui restent en contact prolong avec la peau.
(7) Pour une utilisation autre que comme agent conservateur, voir annexe III, nos 45 et 68.
ANNEXES
(9) Seulement si la concentration dpasse 0,05 %.
(11 U i ue e t pou les p oduits, aut es ue les p oduits de ai /gels de dou he et sha pooi gs, sus epti les d t e utilis s pour des enfants gs de moins de 3 ans.
(12) Uniquement pou les p oduits sus epti les d t e utilis s pou des e fa ts g s de oi s de a s.
(13) Concerne tous les produits destins tre appliqus sur une partie tendue du corps.
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COMMUNICATIONS ORALES ET ECRITES
Communications orales :
A. Kerdudo, A. Dingas, C. Faure, X. Fernandez, Development of Natural Preservatives

Extracts Natural Actives Vectorization. FORMULA VII, Mulhouse, 1-4 juillet 2013.
A. Kerdudo, A. Dingas, C. Faure, X. Fernandez, Les polyphnols : agents de protection et/ou
actifs cosmtiques. 32mes Journes Internationales des Huiles Essentielles et Extraits,
Digne-les-Bains, 18-20 septembre 2013.
Communications par affiches :
A. Kerdudo, F. Merck, X. Fernandez, A. Dingas, Y. Rolland, La biodiversit vgtale

mditerranenne: source de nouveaux conservateurs naturels pour la cosmtique. 30mes
Journes Internationales des Huiles Essentielles et Extraits, Digne-les-Bains, 6-8
septembre 2011.
A. Kerdudo, A. Dingas, C. Faure, X. Fernandez, Multilamellar encapsulation of Rutin and
Naringenin Application on natural preservatives extracts. Colloque des doctorants, Nice,
15 mai 2012.
A. Kerdudo, A. Dingas, C. Faure, X. Fernandez, Encapsulation of Natural Preservative
Extracts Multilamellar vesicles development. 31mes Journes Internationales des Huiles
Essentielles et Extraits, Digne-les-Bains, 20-22 septembre 2012.
Brevet
Brevet dpos : BEP140143EP
Articles publis :
Kerdudo, A., Dingas, A., Fernandez, X and Faure, C., Encapsulation of rutin and
naringenin in multilamellar vesicles for optimum antioxidant activity. Food Chemistry,
159, (2014), p. 12-19.
X. Fernandez, F. Merck, A. Kerdudo, Conservateurs pour les cosmtiques Gnralits et
conservateurs antimicrobiens. J 84, Formulation, Techniques de l)ngnieur .
X. Fernandez, F. Merck, A. Kerdudo, Conservateurs pour les cosmtiques Antioxydants et
anti-UV. J2285, Formulation, Techniques de l)ngnieur .
Food Chemistry 159 (2014) 1219
Contents lists available at ScienceDirect
Food Chemistry
journal homepage: www.elsevier.com/locate/foodchem
Encapsulation of rutin and naringenin in multilamellar vesicles

for optimum antioxidant activity
Audrey Kerdudo a,b, Alexandre Dingas a, Xavier Fernandez b, Chrystel Faure c,
a
S.O.F.I.A. Cosmtiques, 1re Avenue, 1re Rue, 06514 Carros, France
b
Universit Nice Sophia Antipolis, ICN, UMR 7272, Parc Valrose, 06108 Nice CEDEX 2, France
c
Laboratoire de Chimie et Biologie des Membranes et Nano-objets, Univ. Bordeaux, CBMN, UMR 5248, Alle Geoffroy St. Hilaire, F-33600 Pessac, France
a r t i c l e i n f o a b s t r a c t
Article history: Rutin and naringenin, two phenolic compounds with antioxidant properties were encapsulated in lipid-
Received 29 November 2013 based onion-type multilamellar vesicles (MLVs). After vesicles formation, the free, adsorbed/encapsu-
Received in revised form 14 February 2014 lated analytes were well separated with size exclusion chromatography (SEC), and rutin and naringenin
Accepted 1 March 2014
were quantified with UV-HPLC at 258 nm and 290 nm. A mathematical model was developed to
Available online 12 March 2014
separately calculate the encapsulation and the adsorption yields of both phenols. Naringenin was shown
to be poorly encapsulated (<10%) but highly adsorbed on MLVs surface (>60%) whatever MLVs composi-
Keywords:
tion. Conversely, rutin showed high encapsulation efficiency (>60%). Entrapment of rutin was proved to
Encapsulation
Antioxidant activity
be efficient since no leak was observed within 30 days in concentrated MLVs phase, while 16.0 0.3% of
Flavonoids rutin was still encapsulated after 30 days when MLVs were diluted in water. Free rutin broke up into
Multilamellar vesicles quercetin while the encapsulated one remained stable. DPPH assay confirmed that only free and
adsorbed rutin participated in antioxidant activity.
2014 Elsevier Ltd. All rights reserved.
1. Introduction tea tree or curcumin (Takahashi et al., 2009; Yen et al., 2013). Espe-
cially, phenolic compounds, such as flavonoids, are widespread in
The human body suffers from oxidative stress due to high expo- vegetables and known to confer antioxidant (Fernandez, Merck, &
sure to sunlight, pollution, daily stress, unbalanced diet or smoke Kerdudo, 2012), anti-inflammatory (Pelzer, Guardia, Juarez, &
(Rovito & Oblong, 2013). It is commonly accepted that oxidative Guerreiro, 1998), antibacterial (Cushnie & Lamb, 2011), antiviral,
stress causes excessive production of reactive oxygen species and antifungal (Orhan, zelik, zgen, & Ergun, 2010) properties.
(ROS) (Cheng et al., 2013) and is associated with the origin of some But, as the biological activity of natural compounds, such as
human diseases including cancer and aging (Chen, Lin, & Hsieh, flavonoids, can be affected by physico-chemical factors (light, heat,
2007). Some studies have shown that a diet rich in polyphenolic oxygen, humidity), various encapsulation methods have been
compounds can help to fight against ROS production due to their developed to confer them protection and thus to enhance their
antioxidant activity (Yen et al., 2013). Such compounds are also activity in situ. Encapsulation is also a possible solution to preserve
used for their antioxidant properties to enhance the shelf life of the antioxidant activity of molecules until consumption, to insure
food products that can suffer from UV radiation, temperature or an extended life-span, or to avoid unpleasant taste of high concen-
oxygen contact (Myers, Fuller, & Yang, 2013). This use of antioxi- tration of some molecules (astringency, bitterness) (McClements,
dants assumes a decrease of their concentration before food 2010).
consumption. In order to preserve the bioavailability of natural Two flavonoids were chosen here to develop an encapsulation
antioxidants for an optimised activity in the human body, it is system: naringenin and rutin. These molecules were chosen be-
possible to protect them using encapsulation systems (Takahashi, cause of their different polarity (See Supplemental information,
Uechi, Takara, Asikin, & Wada, 2009). S1); quercetin, which is the aglycon form of rutin was not used
Natural extracts are known to have antimicrobial and/or antiox- as it is not stable in our conditions. Naringenin is the predominant
idant properties (Kabara & Orth, 1997). Some of them have been flavanone in grapefruit (Sansone et al., 2011) whereas rutin is a
studied for food protection or to fight ROS production, such as common flavonol glycoside of vegetables (Iacopini, Baldi, Storchi,
& Sebastiani, 2008). Both display antioxidant and antimicrobial
Corresponding author. Tel.: +33 540006833. activities. Rutin was successfully encapsulated using ionotropic
E-mail address: chrystel.faure@enscbp.fr (C. Faure). gelation (Jantrawut, Assifaoui, & Chambin, 2013), in chitosan
http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2014.03.005
0308-8146/ 2014 Elsevier Ltd. All rights reserved.
A. Kerdudo et al. / Food Chemistry 159 (2014) 1219 13
particles (Konecsni, Low, & Nickerson, 2012), in multiple emulsions lamellar phase appeared homogeneous. Empty onions (blank
(Akhtar, Murray, Afeisume, & Khew, 2014), and in polymer nano- onions) were prepared with lipid and GPG containing no flavonoid.
capsules (Almeida et al., 2010). Less amount of work has been car- Once sheared, onions were in close contact forming a compact
ried out with naringenin: it was encapsulated using cyclodextrin phase. They were then dispersed in distilled water (25 mg
complexation (Hadaruga, Hadaruga, Bandur, & Isengard, 2012), onions/mL, unless specified) by gentle mixing with a mechanical
and also by spray drying, making gastroresistant microparticles stirrer (500 rpm) for 3 h.
(Lauro, Maggi, Conte, De, & Aquino, 2005; Lauro, De, Sansone,
Iannelli, & Aquino, 2007; Sansone et al., 2011). 2.3. Optical microscopy
As protecting and delivery systems, liposomes (lipid-based ves-
icles) display many advantages; biocompatibility, non-toxicity, MLVs were observed with an Optech microscope using 40X and
adjustable size, enhancement of molecules chemical and physical 100X objectives. The former objective was supplied with a phase
stability (Mller, Petersen, Hommoss, & Pardeike, 2007), ability contrast filter.
to encapsulate hydrophobic and hydrophilic molecules (Charrois
& Allen, 2003), and controlled delivery (Maherani, Arab-Tehrany, 2.4. Particle size analysis
Kheirolomoom, Geny, & Linder, 2013). However, liposomes are
usually produced by the hydration of a dried lipid film with an Vesicle size was measured using a Mastersizer 2000S (Malvern
aqueous phase in excess. This process requires the use of organic Instruments), with a measure scale from 20 nm to 2 mm. Four
solvents. Moreover, encapsulation yields are often limited. measurements were performed per sample.
Onion-type multilamellar vesicles are obtained with an easier pro-
cess, consisting in shearing a swollen lamellar phase leading to the 2.5. Size exclusion chromatography (SEC)
formation of controlled, reproducible, multilamellar vesicles, the
so-called onions (Diat & Roux, 1993). Onions display the same SEC was performed to separate MLVS from free flavonoids in or-
advantages as unilamellar liposomes but their production does der to measure both the encapsulation and adsorption percent-
not require organic solvents (Roux, Degert, & Laversanne, 1996). ages. An open microcolumn (1 8 cm) filled with a Sephacryl
Moreover, they were shown to encapsulate biomolecules with high S300HR gel (Sigma Adrich, Saint-Quentin Fallavier, France) was
encapsulation efficiency (Mignet, 2000; Olea & Faure, 2003; used. The column flow, which was about 1 mL/min, was controlled
Dhanikula, Lafleur, & Leroux, 2006; Prvoteau & Faure, 2012). and kept constant by fixing the vertical position of the eluent pool
This study investigates the encapsulation of naringenin and ru- (distilled water).
tin in onion-type MLVs. The aim of this work is to optimise a pro- In order to determine the elution profile of free (non-entrapped)
tective and delivery system with model molecules before the flavonoid, a mixture (400 lL) of rutin and naringenin was depos-
encapsulation of a natural extract. ited onto the column gel. To do this mixture, rutin and naringenin
were first both diluted in GPG at 30 mg/mL and 8 mg/mL, respec-
tively, and then diluted in water (*100). 0.51 mL fractions were
2. Materials and methods
collected and a total volume of 60 mL was eluted. Each collected
fraction was analysed using UV-HPLC at 258 and 290 nm for rutin
2.1. Materials
and naringenin, respectively. The elution volume (Ve) ranged from
6 to 25 mL, and 15 to 40 mL for rutin and naringenin, respectively.
Rutin hydrate (P94%) and naringenin (P98%) were purchased
Total amount of analytes was eluted.
from SigmaAldrich (Saint-Quentin Fallavier, France). Emulmetik
The MLVs elution volume was determined using MLVs contain-
930 (E930, a 95% purified phosphatidylcholine isolated from soy-
ing both rutin (30 mg/mL of GPG) and naringenin (8 mg/mL of
bean lecithin, containing less than 1% of lysophosphatidylcholine)
GPG). SEC column was initially saturated with 400 lL of blank
was obtained from Unipex (Saint-Ouen LAumone, France).
MLVs and washed with distilled water. MLVs (25 mg/mL of water)
Glycerin 99.5% and propylene glycol (PG) were purchased from
were found to elute between 1.5 and 5 mL.
Interchimie (Bobigny, France). Solvents (water, acetonitrile and
To determine the amount of adsorbed and encapsulated flavo-
2-propanol) were from HPLC grade, used with 0.1% of formic acid
noids, flavonoid-containing MLVs were separated from the dispers-
and purchased from Sigma Aldrich (Saint-Quentin Fallavier,
ing medium by SEC, and the MLVs-containing fractions (10 mg)
France) for HPLC study. Triton X100 was purchased from Sodipro
were treated with 20 w% Triton X-100 (80 lL) to destroy MLVs
(Echirolles, France).
for HPLC convenience. The measured flavonoid concentration cor-
responds to the fraction of flavonoid adsorbed on and encapsulated
2.2. Preparation of onion-type multi-lamellar vesicles in MLVs.
To determine the amount of adsorbed flavonoids on MLVs,
The general preparation of onion-type multilamellar vesicles blank MLVs were dispersed in an aqueous solution containing
(MLVs) was described in details elsewhere (Roux et al., 1996). either naringenin or rutin, or both flavonoids. This solution was
Flavonoids were first dissolved in 24 mL of 60:40 v/v glycerin: prepared as described previously: flavonoid-GPG solution was
propylene glycol mixture (GPG). For rutin and naringenin concen- diluted in water to get a final concentration in flavonoid similar
trations below 30 mg/mL of GPG and 8 mg/mL of GPG, respectively, to the dispersions of flavonoid-loaded MLVs. SEC was performed
dissolution was performed in mild conditions (magnetic mixing at to separate MLVs from the dispersing medium. MLVs fractions
40 C). For higher concentrations, dissolution required the use of an were then treated with Triton X-100. The measured flavonoid
ultra-sound bath (from 30 to 90 min) (Fisher Scientific FB15049, concentration corresponds to the fraction of flavonoid adsorbed
Germany). A lamellar phase was prepared by mixing Emulmetik on MLVs surface.
930 (c.a. 250 mg) with the flavonoid-GPG solution in a given
weight proportion (from 55/45 to 15/85 (w%/w%)). Mixing was 2.6. High performance liquid chromatography (HPLC)
performed with a micro-spatula for 34 min in a 4 mL vial. The
tube was centrifuged at 4000 rpm for 5 min (Sigma 26, Germany). HPLC analyses were performed using an Agilent 1200 system
Shearing was then resumed followed by further centrifugation. The (Courtaboeuf, France), equipped with a quaternary solvent delivery
cycle was repeated 3 times until the resultant yellow/brown system, an autosampler, a degasser and a DAD (Diode-Array
14 A. Kerdudo et al. / Food Chemistry 159 (2014) 1219
Detection) detector. Separation was performed using a Luna C18 poorly soluble in water. The substitution of water by GPG (without
column (Phenomenex, 250 4.6 mm; 5 lm). Rutin was detected any flavonoid) leads to both a decrease of vesicles size and of size
at 258 nm with a retention time (TR) of 13.1 min while naringenin dispersion (see Supplemental information, SI3). The diameter of
was detected at 290 nm with a TR of 18.3 min. Calibration curves vesicles ranged from 0.4 to 20 lm, and from 0.1 to 2 lm when ves-
for both molecules were obtained after dissolving each one in 2 icles were prepared with water and GPG, respectively. The addition
3 mL GPG to get a 30 mg/mL and 8 mg/mL concentration in rutin of rutin and naringenin in GPG did not have any significant impact
and naringenin, respectively. Subsequent dilutions in water were on MLVs size (maximum volume distribution at 0.48 lm).
then performed to get concentrations ranging from 0.2 to 100 lg/ Another MLVs composition was also studied since it revealed to
mL, and 0.05 to 26.46 lg/mL for rutin and naringenin, respectively. be optimised for rutin encapsulation (see Section 3.3.3): 33/67
Response factors were determined by linear regression for each (w%/w%) (E930/rutin-GPG) instead of 55/45 (w%/w%). For this
standard with R2 coefficients all deemed acceptable above 0.99. optimised composition, MLVs were smaller: their diameter ranged
The column was eluted with a flow rate of 1.0 mL/min, and the from 60 to 500 nm with a mean size at 160 nm (see SI3). It must be
composition of the mobile phase consisted of 0.1% acid formic noted that only the biggest ones could then be imaged by optical
acidified water (A), acetonitrile (B) and 2-propanol (C). Gradient microscopy (300 nm is the resolution limit).
conditions were as follows: 05 min, 5% B; 520 min, 562% B;
2021 min, 100 % B; 2123 min, 1005% B. To assay rutin and 3.2. Adsorption of rutin and naringenin on vesicle surface
naringenin adsorbed or/and encapsulated into MLVs, SEC fractions
containing MLVs (10 mg) were treated with 20 w% Triton X100 Onion-type MLVs have been largely studied for their encapsula-
(80 lL) to destroy them. For samples containing E930 and/or Triton tion ability. In some cases, such as proteins (Prvoteau & Faure,
X100, an additional gradient was applied as follows: 2328 min, 2012), adsorption of non-encapsulated molecules on onion surface
60 % B and 40 % C; 2833 min, 60 % B and 40% C; 3335 min, 5% was reported. Moreover, Van Dijk et al. demonstrated that flavo-
B. Injection volume was 30 lL. noids have a strong affinity for vesicle surface (Van Dijk, Driessen,
& Recourt, 2000). We first evaluated whether adsorption of
2.7. DPPH radical-scavenging activity naringenin and rutin on MLVs surface could occur using the meth-
od described in Section 2.5. The yield of adsorbed actives is defined
The antioxidant activity of the samples was determined using as:
the known scavenging effect of DPPH free radical. Classically, DPPH mA
%A 100 2
is dissolved in methanol and its assay is performed at 517 nm mF mA
(Sharma & Bhat, 2009; Manjunath, Lavanya, Sivajyothi, & Reddy,
where mA is the mass of rutin or naringenin adsorbed on MLVs
2011). In our case, a 0.6 mM DPPH solution was first prepared in
surface and measured in the MLVs fractions after Triton X100
MeOH/water 75:25 v/v. Rutin was dissolved in GPG (25 mg/mL
disruption, and mF is the mass of free (i.e. non-adsorbed) rutin or
GPG) and then diluted in water to get a rutin final concentration
naringenin. mF + mA is measured in all SEC fractions.
ranging from 0.5 lg/mL to 16 lg/mL. 0.25 mL DPPH solution was
Blank MLVs were dispersed in an aqueous solution of rutin
then added to 1.750 mL of rutin solution. Two peaks were visible
(289 lg/mL) and naringenin (77 lg/mL). HPLC revealed adsorption
in UV spectra located at 517 nm and 700 nm with these solvents.
of both flavonoids from 10 min of incubation with MLVs: 17.9 6%
The DPPH activity was measured at 700 nm for both systems (rutin
and 65.6 1.9% for rutin and naringenin respectively (Fig. 1). Rutin
solution and rutin-containing MLVs) since sensitivity was better at
adsorption increased during the two first hours and then stabilized
this wavelength. For studies on MLVs, 0.25 mL DPPH (0.6 mM) was
at 28%. Naringenin adsorption was almost maximal from 10 min
mixed with 1.750 mL of MLVs dispersion. MLVs were prepared
dispersion. The MLVs dispersion time was then fixed to 3 h to
using rutin dissolved in GPG (25 mg rutin/mL GPG). The rutin con-
ensure a complete and stable adsorption of flavonoids on MLVs
centration was then varied by changing the MLVs concentration.
before measuring encapsulation and adsorption yields.
The absorbance at 700 nm was determined after 40 min incubation
at room temperature in the dark. Inhibition activity was calculated
in the following way: 3.3. Encapsulation of rutin and naringenin in MLVs
A0 A1 3.3.1. Expression of the encapsulation yield

I% 100 1
A0 As significant adsorption was measured on MLVs surface,
experiments were performed to distinguish adsorption onto the
where A0 is the absorbance of the control (samples with DPPH but
no rutin), A1 is the absorbance of rutin. For each measurement, a 80% Naringenin
blank with solvents only was used. All tests were carried out in
70%
triplicate.
60%
3. Results and discussion 50%

%A
40%
3.1. Vesicles characterisation Rutin
30%
The validation of onion-type multilamellar vesicles formation 20%

was performed by optical microscopy. Onions were imaged while 10%
some unilamellar liposomes were also present but in negligible
amount. The onions sizes were smaller than 0.5 lm as estimated 0%
0 5 10 15 20 25 30
by this method (see Supplemental information, SI2).
To better characterise their size, laser light scattering was per- Time (h)
formed and the influence of replacing water by GPG (60:40 v/v) Fig. 1. Adsorption percentage (%A) of rutin (289 lg/mL) and naringenin (77 lg/mL)
in onion composition was also evaluated. As detailed in Section 2, on blank MLVs in function of incubation time. Naringenin adsorption is much
naringenin and rutin were solubilised in GPG since they were higher than rutin one.
MLVs surface from encapsulation inside MLVs, and to calculate the Rutin
corresponding yield. (a) 80%
%A %E
The percentage of encapsulated and adsorbed rutin or naringe-
Adsorption /Encapsulation
70%
nin is defined by the following equation:
60%
mEA mEA
%EA 100 100 3 50%
mF mA mE mF mEA
40%
where mE+A is the mass of rutin or naringenin encapsulated and ad-
sorbed (measured in the MLVs fractions after MLVs destruction), mE 30%
is the mass of rutin or naringenin encapsulated in MLVs, mF is the 20%
mass of free rutin or naringenin.
10%
Encapsulation efficiency is defined by:
0%
mE mEA mA
%E 100 100 4 30/8 20/5.3 15/4 10/2.7 7.5/2 3.75/1
mF mEA mF mEA
One can express %E as a function of %A and %E+A as shown below. Rutin/naringenin concentration (mg/mL)
Using Eq. (3) in Eq. (4) gives:
mA (b) Naringenin %A %E
%E %EA 100 5 80%
mF mEA
70%
Eq. (2) and Eq. (3) give:
Adsorption/Encapsulation
60%
mA mF

%A %A %EA 50%
1 6
mF mEA 100 %A mF mEA 100 %A 100 40%
Eventually, injecting Eq. (6) into Eq. (5) leads to the wanted 30%
expression: 20%
%EA %A 10%
%E 100: 7
100 %A 0%
As %A and %E+A can be measured separately (see material and -10%
methods, Section 2.5), one can separately calculate the percentage 30/8 15/4 10/2.7 7.5/2 3.75/1
-20%
of flavonoid encapsulated into MLVs (given by Eq. (7)) and
Rutin/naringenin concentration (mg/mL)
adsorbed onto MLVs (given by Eq. (2)).
Fig. 2. Encapsulation (%E) and adsorption (%A) percentages of (a) rutin and (b)
3.3.2. Influence of flavonoid concentration on the encapsulation yield naringenin in function of flavonoids concentration in GPG. Composition of MLVs:
A 55/45 (w%/w%) ratio (E930/flavonoid-GPG) was chosen for 55/45 (w%/w%) (lipid/flavonoids-GPG). Rutin is mainly encapsulated while naringe-
nin is mainly adsorbed whatever concentration of the flavonoid mix.
MLVs composition since this lipid/active ratio led usually to the
highest encapsulation yield for MLVs composed of phosphatidyl-
choline (Olea & Faure, 2003; Faure, Meyre, Trpout, Lambert, &
Lebraud, 2009). Rutin and naringenin were encapsulated alto- 65.4 3.0%. Naringenin was not encapsulated in most of the cases
gether, keeping a constant weight ratio between both molecules except for one of the intermediaries concentration where the
of 3.75. This ratio was chosen because 30 mg of rutin/mL and encapsulation yield was much weaker than rutin: c.a. 12%. Here
8 mg of naringenin/mL are the limits of solubility in GPG in mild again the adsorption of naringenin was predominant since %A
conditions (i.e. simple agitation at 40 C without any ultrasounds, reached almost 70%. Similar results were obtained when naringe-
see Section 2). Rutin concentration in GPG was varied from 30 to nin (8 mg/mL) alone was encapsulated in MLVs: c.a. 13% were
3.75 mg/mL, and naringenin then from 8 to 1 mg/mL. The encapsu- encapsulated vs. 59% adsorbed.
lation efficiency was deduced from Eq. (7) after measuring %E+A and In summary, c.a. 80% of both molecules were immobilized in
%A, from Fig. 2. A high rutin encapsulation efficiency was measured MLVs but rutin was mainly encapsulated whereas naringenin
for all tested concentrations. The best encapsulation yield, was mainly adsorbed on MLV surfaces. This difference could be ex-
%Erutin = 66.0 3.3%, was obtained for a solution containing both plained by the smaller molar weight of naringenin (Mw = 272 g/
rutin and naringenin concentrated at 20 mg/mL of GPG and mol) compared to rutin (Mw = 610 g/mol). Naringenin being smal-
5.3 mg/mL of GPG, respectively. The worse rutin encapsulation ler than rutin may more easily leak from MLVs. Furthermore, mol-
yield, %Erutin = 54.0 5.7%, was obtained for the smallest rutin and ecules configuration may influence their affinity with
naringenin tested concentrations: 3.75 and 1 mg/mL, respectively phospholipidic membranes as assumed by Van Dijk et al. They
(Fig. 2a). Naringenin was mostly adsorbed in comparison with ru- showed by fluorescence quenching that the glucosylation of
tin. A percentage of naringenin adsorption larger than 61.7 2.1% naringenin and eriodictyol (a flavanone as naringenin) results in
was indeed measured for all experiments except for the two inter- a higher affinity for the vesicle membrane compared to the corre-
mediary concentrations where c.a. 12% was encapsulated (Fig. 2b). sponding aglycons. Glycosylation of flavonoids would favour a
Using the same lipid/GPG weight ratio (55/45 (w%/w%)), the more planar configuration and then an easier intercalation in ves-
encapsulation efficiencies were measured for systems containing icle membrane (Van Dijk et al., 2000). Eventually, Pawlikowska
fixed concentration of naringenin (8 mg naringenin/mL of GPG) et al. (Pawlikowska-Pawlega et al., 2013) concluded from FTIR,
and varying concentrations of rutin (from 30 to 3.75 mg rutin/mL EPR and NMR analyses that small flavonoids such as apigenin are
of GPG). As previously reported, rutin showed high and rather con- preferentially located in the upper part of the phosphatidylcholine
stant encapsulation efficiency, c.a. 60%, for all the tested concentra- membrane interacting with headgroups through hydrogen bonds.
tions (see Supplemental information SI4). Maximum encapsulation All these reasons could explain the difference in naringenin and ru-
yield was obtained for the weakest rutin concentration: tin behaviours.
3.3.3. Influence of lamellar composition on rutin encapsulation yield rutin-GPG solution. This optimum ratio is different from the 55/45
As rutin was successfully encapsulated, MLVs composition was (w%/w%) usually found in phosphatidylcholine lamellar phase
optimised with this flavonoid alone. In order to optimise the (Olea & Faure, 2003; Faure et al., 2009; Prvoteau & Faure, 2012).
amount of encapsulated rutin, the E930/rutin-GPG ratio was This difference is likely to be due to the nature of the lamellar
changed, keeping constant rutin concentration (30 mg/mL of hydrating solution; GPG instead of water.
GPG). Previous studies (Prvoteau & Faure, 2012) showed that
the maximal encapsulation efficiency in onion-type MLVs is
reached when the lamellar phase is at maximal swelling, i.e. just 3.3.4. Optimisation of rutin concentration
before the diphasic composition when the rutin-loaded lamellar The lipid/rutin-GPG proportion was fixed to 33/67 (w%/w%),
phase coexists with the rutin-GPG phase. Rutin-GPG is then in and the rutin concentration in GPG was increased. If our prediction
excess. Several lipid/rutin-GPG compositions were then studied on the phase diagram was correct, plotting the reverse of %Erutin as
from 55/45 to 15/85 (w%/w%) (Fig. 3a). The rutin encapsulation a function of the rutin concentration in GPG should give two
yield (%Erutin) first increases, from 53.7 2.0 to 62.4 0.6%, with separate behaviours: a constant value for the low concentrations
the rutin-GPG weight percentage (%rutin), and then linearly corresponding to the monophasic lamellar domain and a straight
decreases for rutin-GPG percentage higher than 63 w%. line in the biphasic domain where rutin-GPG solution is in excess
These data can be modelled assuming that increasing the rutin- (see inset Fig. 4 point E, and additional material SI6). Results shown
GPG proportion in the lamellar phase led to the passage from a in Fig. 4 are in accordance with these predictions. The optimal rutin
monophasic lamellar phase (point D in the inset of Fig. 3a) to a concentration was indeed 30 mg rutin/mL (49.1 lmol/mL) as
diphasic domain where a fraction of rutin-GPG solution forms an shown in the previous section: %Erutin was found to be
excess phase (point B in the inset of Fig. 3a). With these assump- 62.5 2.2%, i.e. 16.54 lmol of rutin per gram of MLVs. This value
tions, plotting %rutin %Erutin vs. %rutin should give two straight lines is higher than that reported by Park et al. who encapsulated rutin
with their intercept being the composition of the swollen lamellar in ceramide liposomes with an optimal encapsulation efficiency of
phase, i.e. the boundary between both domains (point A in the 58 % (Park, Lee, Kim, & Yu, 2013). Goniotaki et al. measured that
inset of Fig. 3a). The slope of the increasing line gives the encapsu- 71 10% was immobilized in liposomes. However, Goniotaki
lation yield while that of the decreasing line allows the determina- et al. did not distinguish adsorption from encapsulation (Goniotaki,
tion of the maximum swelling composition (see additional Hatziantoniou, Dimas, Wagner, & Demetzos, 2004). Doing so, our
material, SI5). Fig. 3b displays the corresponding plots. optimal %E + Arutin value is 66.9 1.3% corresponding to %Erutin
Using the mathematical model, the encapsulation yield is found 62.5 2.2%, which is comparable to that from M. Goniotaki et al.
to be 61 % and the optimal composition is 33/67 (w%/w%) of lipid/ taking into consideration their standard deviation.
Rutin
concentration L + free rutin
(a) phase
70%
60% D A B C
30mg/mL
%Erutin
50% Lamellar
phase L
40%
%lipid %rutin
30%
20%
10%
0%
40 50 60 70 80 90 100
%rutin
(b)45
40
%rutin * %Erutin /100
y = 0.6091x - 0.6810 y = -1.2212x + 122.43

35 R = 0.9900 R = 0.9982
30
25
20
15
10
5
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
%rutin
Fig. 3. (a) Encapsulation percentage of rutin (%Erutin) in function of rutin-GPG weight proportion (%rutin) in MLVs composition. Rutin concentration was fixed at 30 mg/mL of
GPG. (Inset) Schematic representation of the phase diagram of lipid/rutin-GPG system. (b) Determination of the optimal rutin-GPG weight proportion using the model
described in SI5. The optimal MLVs composition for rutin encapsulation is 33/67 (w%/w%) of lipid/rutin-GPG solution with an encapsulation yield of 61%.
Rutin
concentration L + free
rutin
0.30 30mg/mL
E
Lamellar
0.25 phase L
%lipid 67 %rutin
1/%Erutin
0.20
0.15
0.10
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Rutin concentration (mg/mL)
Fig. 4. Determination of the optimal rutin concentration using the model described in SI6 and plotting the reverse of %Erutin as a function of the rutin concentration (mg/mL of
GPG) for a 33/67 (w%/w%) (lipid/rutin-GPG) MLVs composition. (Inset) Schematic representation of the phase diagram of lipid/rutin-GPG system. The constant value for the
low rutin concentrations corresponds to the monophasic lamellar domain and the straight line to the biphasic domain where rutin-GPG solution is in excess.
cetin was observed by HPLC on fractions containing free rutin,

Diluted MLVs showing that rutin lost its sugar groups. Quercetin formation was
70%
Not-diluted MLVs much less pronounced in MLVs fractions (after their destruction),
60% indicating that only the adsorbed rutin molecules were degraded
(See additional information, SI7). This observation demonstrates
50% the ability of MLVs to protect rutin and preserve its integrity.
When onion-type MLVS were stored without being diluted/
%E+A
40%
dispersed in water, almost no rutin release was measured (less
30% than 10% in 31 days). This was expected since after mixing lipid
with rutin-GPG solution, the resulting onions are in close compact
20%
without any external liquid phase; this drastically limits molecules
10% release.
0%
0 10 20 30
3.5. Antioxidant activity: DPPH assay
Days
Fig. 5. Kinetics of rutin release from MLVs for two different storage processes at The ability of rutin to reduce DPPH radicals was determined by
room temperature: when diluted in water (25 mg/mL), and when stored in their UV absorbance at 700 nm (see Section 2). Fig. 6 shows the DPPH
compact state. Dilution in the latter case was performed 3 h before measurement. radical scavenger activity as a function of the rutin concentration
16% was still encapsulated and adsorbed after 31 days of dispersion while release
for rutin-loaded MLVs and for rutin solution. Without MLVs (full
was negligible when MLVs were stored in their compact state.
squares), DPPH radical scavenger activity stabilized around 60%
3.4. Kinetic release of rutin for rutin concentrations higher than 8 lg/mL. When assays were
realised on the optimised rutin-loaded MLVs (empty circles), a
We have demonstrated in previous sections the ability of MLVs diminution of DPPH radical scavenger activity was observed at
to encapsulate a large quantity of rutin. It was then important to
evaluate the permeability of these capsules, in other words, the 70%
DPPH radical scavenger activity
kinetics of rutin leakage from the multilamellar vesicles composed

60%
of 33 w% lipid and 67 w% GPG containing 25 mg rutin/mL, kept at
room temperature during 1 month. Above 25 mg rutin/mL of 50%
GPG, non-encapsulated rutin precipitated in water after few days.
All dispersions were dispersed for 3 h the first day and shacked 40%
again for few seconds before fractionation the day of analysis. 30% Rutin without onions
Fig. 5 indicates that rutin gradually leaked from MLVs. This leakage
can be explained by the conditioning conditions (room tempera- 20% Rutin-loaded onions
ture) and by the instability of onion-type MLVs when dispersed
10% Calculated scavenging activity from
in water: onions are known to be thermodynamically unstable free and adsorbed Rutin
and to return to lamellar structure when dispersed, in c.a. 7 weeks 0%
(Olea & Faure, 2003), which is comparable to liposomes stability 0 2 4 6 8 10 12 14 16
(Goniotaki et al., 2004). This was evidenced by optical microscopy. Rutin concentration (g/mL)
Only onion-type multilamellar vesicles were observed the first day,
Fig. 6. DPPH radical scavenger activity percentage in function of rutin concentra-
whereas unilamellar vesicles appeared after 25 days. After 31 days, tion. The theoretical activity is calculated assuming that only free and adsorbed
16.0 0.3% of rutin was still encapsulated. An interesting point is rutin molecules are responsible for the scavenging activity. This is confirmed since
the instability of free rutin. After 9 days, a high percentage of quer- calculated activities match activities measured on rutin-loaded MLVs.
equivalent rutin concentration, showing the protection of encapsu- Chen, H.-Y., Lin, Y.-C., & Hsieh, C.-L. (2007). Evaluation of antioxidant activity of
aqueous extract of some selected nutraceutical herbs. Food Chemistry, 104(4),
lated rutin.
14181424.
Knowing that 62.5 2.2% of rutin was encapsulated (see Cheng, N., Wang, Y., Gao, H., Yuan, J., Feng, F., Cao, W., et al. (2013). Protective effect
previous section), we calculated from free rutin radical scavenger of extract of Crataegus pinnatifida pollen on DNA damage response to oxidative
activity the theoretical activity of MLVs, assuming that only free stress. Food and Chemical Toxicology, 59, 709714.
Cushnie, T. P. T., & Lamb, A. J. (2011). Recent advances in understanding the
and adsorbed rutin was responsible for their scavenging activity. antibacterial properties of flavonoids. International Journal of Antimicrobial
Fig. 6 shows that for almost all assays, the theoretical radical scav- Agents, 38(2), 99107.
enger activity (empty triangles) corresponded with the measured Dhanikula, A. B., Lafleur, M., & Leroux, J.-C. (2006). Characterization and in vitro
evaluation of spherulites as sequestering vesicles with potential application in
data. Only two measurements gave weaker data than those ex- drug detoxification. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomembranes,
pected when the rutin concentration was 4 and 5 lg/mL. Firstly, 1758(11), 17871796.
this confirms the validity of our models to differentiate adsorption Diat, O., & Roux, D. (1993). Preparation of monodisperse multilayer vesicles of
controlled size and high encapsulation ratio. Journal de Physique II, 3(1), 914.
from encapsulation, and secondly, this evidences that anti-oxidant Faure, C., Meyre, M.-E., Trpout, S., Lambert, O., & Lebraud, E. (2009). Magnetic
activity was thus provided by adsorbed and free rutin, showing multilamellar liposomes produced by in situ synthesis of iron oxide
that adsorbed rutin molecules are actives contrarily to encapsu- nanoparticles: Magnetonions . The Journal of Physical Chemistry B, 113(25),
85528559.
lated ones. Fernandez, X., Merck, F., & Kerdudo, A. (2012). Conservateurs pour cosmtiques
Antioxydants et Anti-UV. Techniques de lIngnieur.
Goniotaki, M., Hatziantoniou, S., Dimas, K., Wagner, M., & Demetzos, C. (2004).
4. Conclusions Encapsulation of naturally occurring flavonoids into liposomes:
Physicochemical properties and biological activity against human cancer cell
lines. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 56(10), 12171224.
The immobilization of rutin and naringenin was successfully Hadaruga, D. I., Hadaruga, N. G., Bandur, G. N., & Isengard, H.-D. (2012). Water
performed in phosphatidylcholine-based MLVs; c.a. 80% was either content of flavonoid/cyclodextrin nanoparticles: Relationship with the
encapsulated or adsorbed on MLVs surface. A mathematic model structural descriptors of biologically active compounds. Food Chemistry,
132(4), 16511659.
was developed to allow the distinction between encapsulated Iacopini, P., Baldi, M., Storchi, P., & Sebastiani, L. (2008). Catechin, epicatechin,
and adsorbed molecules. Naringenin was mainly adsorbed on quercetin, rutin and resveratrol in red grape: Content, in vitro antioxidant
MLVs surface (>60%), whereas rutin was mainly encapsulated activity and interactions. Journal of Food Composition and Analysis, 21(8),
589598.
(>60%).
Jantrawut, P., Assifaoui, A., & Chambin, O. (2013). Influence of low methoxyl pectin
A maximum of 16.5 lmol of rutin was encapsulated per gram of gel textures and in vitro release of rutin from calcium pectinate beads.
MLVs, when composed of 33 w% of E930 and 67 w% of rutin-GPG Carbohydrate Polymers, 97(2), 335342.
Kabara, J. J., & Orth, D. S., (1997). Preservative-free and self-preserving cosmetic and
(30 mg/mL of GPG), corresponding to an encapsulation yield of
drug products: The future. In Kabara, & D.S. Orth (Eds.), Preservative-free and
62.5%. This value is higher or comparable to those published on self-preserving cosmetics and drugs: Principles and practices (pp. 243261). New
the encapsulation of rutin in liposomes. York: Marcel Dekker.
Concerning leakage, 16.0% 0.3 of rutin was still encapsulated Konecsni, K., Low, N. H., & Nickerson, M. T. (2012). Chitosantripolyphosphate
submicron particles as the carrier of entrapped rutin. Food Chemistry, 134(4),
in onion-type MLVs dispersion after 31 days whereas no leakage 17751779.
was measured when MLVs were kept in their concentrated form Lauro, M. R., De, S. F., Sansone, F., Iannelli, P., & Aquino, R. P. (2007). Preparations
within a month. Moreover, MLVs were shown to protect rutin from and release characteristics of naringin and naringenin gastro-resistant
microparticles by spray-drying. Journal of Drug Delivery Science and
degradation in quercetin. Eventually, the DPPH test revealed that Technology, 17(2), 119124.
anti-oxidant activity was provided by free and adsorbed rutin. Lauro, M. R., Maggi, L., Conte, U., De, S. F., & Aquino, R. P. (2005). Rutin and quercetin
The next step of the study will be the application of this encapsu- gastro-resistant microparticles obtained by spray-drying technique. Journal of
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lation system on natural antimicrobial and antioxidant extract for Maherani, B., Arab-Tehrany, E., Kheirolomoom, A., Geny, D., & Linder, M. (2013).
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The authors are grateful to SO.F.I.A. Cosmtiques and Associa- bioavailability of lipophilic food components. Journal of Food Science, 75(1),
tion Nationale de la Recherche et de la Technologie (ANRT) for R30R42.
financial support of this project. The authors wish to thank FEDER Mignet, N. (2000). The spherulitesTM: A promising carrier for oligonucleotide
delivery. Nucleic Acids Research, 28(16), 31343142.
and PACA area for financial support. This project was supported by Mller, R. H., Petersen, R. D., Hommoss, A., & Pardeike, J. (2007). Nanostructured
the University of Nice-Sophia Antipolis the University of Bordeaux lipid carriers (NLC) in cosmetic dermal products. Advanced Drug Delivery
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113, 12021205.
Supplemental information
Encapsulation of Rutin and Naringenin in multilamellar vesicles

for an optimized antioxidant and preservative activity.
Audrey Kerdudo1, 2, Alexandre Dingas1, Xavier Fernandez2, Chrystel Faure3*
1
SO.F.I.A. Cosmtiques, 1re Avenue, 1re Rue, 06514 Carros, France
2
Universit Nice Sophia Antipolis, ICN, UMR 7272, Parc Valrose, 06108 Nice CEDEX 2,
France
3
Laboratoire de Chimie et Biologie des membranes et nano-objets, Univ. Bordeaux, CBMN,
UMR 5248, Alle Geoffroy St Hilaire, F-33600 Pessac, France
1
SI1: CHEMICAL STRUCTURES OF RUTIN AND NARINGENIN
Chemical structures of rutin and naringenin
Rutin Naringenin
SI2: OPTICAL MICROSCOPY OBSERVATION OF MULTIAMELLAR
Zoom
10m
VESICLES
Optical microscopy observation (X100) of multilamellar vesicles (black dots) composed
of 55wt% of lipids and 45wt% of GPG phase. Concentrations in GPG phase (60:40, v/v)
were 30 mg of rutin/mL and 8 mg of naringenin/mL.
SI3: SIZE DISTRIBUTION OF MULTIAMELLAR VESICLES
2
Particle size of MLV in function of aqueous phase composition and
lipid/aqueous phase composition
14
12
10
Volume (%)
0
0,01 0,1 1 10 100 1000
Particles size (m)
Size distribution of MLVs containing: water (gray curve), GPG (dark gray dotted
curve), 30 mg rutin/mL of GPG and 8 mg naringenin/mL of GPG (dark gray dash
dotted curve), 25 mg of rutin/mL of GPG (black curve). All vesicles were composed of 55
wt% of E930 except for the rutin-containing ones (33 wt% of lipid).
SI4: ENCAPSULATION YEILD OF RUTIN AND NARINGENIN IN FUNCTION OF RUTIN
CONCENTRATION WHEN NARINGENIN CONCENTRATION WAS SET TO 8MG/ML FOR A
55/45 WT% LIPID TO GPG WEIGHT FRACTION
3
Encapsulation efficiency of rutin and naringenin in function of rutin
concentration (fixed naringenin concentration)
80% %E Rutin
70% %E Naringenin
60%
50%
Encapsulation (%)
40%
30%
20%
10%
0%
-10%
30/8 15/8 7.5/8 3.75/8
-20%
Rutin/naringenin concentration (mg/mL)
Encapsulation yield of rutin and naringenin in function of rutin concentration when naringenin
concentration was set at 8 mg/mL for a 55/45 wt% lipid to GPG weight fraction.
Rutin showed high encapsulation yield whatever the concentration (from 61.0 1.0 % to 65.4 3.0
%). No naringenin encapsulation was observed but large adsorption except at 15 mg/mL where
%ENaringenin was 12.3 3.0 %.
SI5: MODEL TO FIT THE ENCAPSULATION YIELD AS A FUNCTION OF
LIPID/RUTIN COMPOSITION
In that section, the rutin concentration in samples is fixed but the sample composition is
changed from composition C to composition B.
4
Composition C corresponds to a sample made of concentrated onions (domain of lamellar
phase): a major part of the rutin is encapsulated inside onions and the encapsulation yield will
be noted %E. Composition A corresponds to a sample made of concentrated onions with the
maximal swelling. Composition B corresponds to a diphasic sample where diluted onions
coexist with a GPG phase containing rutin.
One want to model the evolution of the encapsulation yield (%E) as a function of the rutin
phase proportion (%rutin phase).
Diphasic domain: Sample B:
The rutin encapsulation yield is defined as:
(A)
=
With the mass of encapsulated rutin in a sample of composition B, the total
mass of rutin phase in a sample of composition B, the total mass of sample B (made of
lipid and rutin phase), and %B the percentage of rutin phase in sample B.
Assuming that the amount of rutin in the onion phase is fixed by the lipid-to-rutin ratio
found in sample A, on can express the mass of rutin in the onion phase in point B as:
(B)
With and the mass of lipids in sample B and A respectively, and the
mass of rutin in sample A.
Equation B can be expressed using the percentage of rutin in samples as follows:
(C)
5
With %A the percentage of rutin phase in sample A.
We also assume that the amount of encapsulated rutin in the onion phase is constant and
corresponds to that of sample of composition A. Let us note this encapsulation yield.
The encapsulated amount of rutin in B is then defined as:
(D)
Using Eq. C and Eq. B in Eq. A leads to
= (E)
Eq. E can be expressed as:
(F)
Following this model, if we plot we should obtain, in the
diphasic domain, a straight line with a slope
Monophasic domain: sample C
Sample C is the monophasic domain, when concentrated onions are present. According to
our assumption, the encapsulation yield is constant and equals to . Therefore, if we
plot in the monophasic domain, we should obtain straight line
intercepting the graph origin and with a slope Sm= %Erut,on.
Limit between two domains: sample A
Both lines should intercept in a point that will give the composition of point A, the limit
between the monophasic and diphasic domains.
6
SI6: MODEL TO FIT THE ENCAPSULATION YIELD AS A FUNCTION OF RUTIN
CONCENTRATION
In that section, the lipid-to-rutin composition is fixed but the rutin concentration is changed.
One assumes that the encapsulation yield is constant through the monophasic domain. It
will be noted %Em
In the diphasic domain, the rutin encapsulation percentage is given by:
(1)
Where is the molar number of rutin in lamellar phase, the molar number of rutin
in excess phase, the rutin concentration in lamellar phase, the volume of the
lamellar phase, the rutin concentration in excess phase, the volume of the excess
phase.
Following the lever rule:
(2)
(3)
With Vt the total volume, A the volume fraction of rutin in a sample of composition A, B
the volume fraction of rutin in a sample of composition B.
7
Using Eq. 2 and 3 in Eq. 1 gives:
(4)
If we define
(5)
As expected, if , then
Relationship between and
We will consider the case where increasing the rutin concentration leads to the transition
from the monophasic to the diphasic domain, i.e. .
Assuming a linear boundary between both domains, the slope is defined as:
(6)
Equation 6 can be written:
(7)
With
Using Eq.7 in Eq.5:
(8)
The reverse of %Ed will then be written:
8
(9)
Plotting should give firs a pla ea for [ ] [ ]* (as =0 in his case)
corresponding to and then a straight line (as soon as [Rut] > [Rut]*) with a slope
and an Y-intercept of
SI7: DEGRADATION OF RUTIN INTO QUERCETIN UV-HPLC ANALYZE
mAU
700
quercetin
600
lipids + Triton
500 rutin X100
400
300
200
100
0 5 10 15 20 25 30 min
UV-HPLC chromatograms performed at 258 nm. Dotted line: pure quercetin. Full line: rutin-
containing MLVs after triton X100 treatment.

Optimisation de La Conservation Des Cosmétiques

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HAL is a multi-disciplinary open access Larchive ouverte pluridisciplinaire HAL, est

Ecole Doctorale Sciences Fondamentale et Appliques

pour obtenir le titre de

DOCTEUR EN SC)ENCES DE LUN)VERS)TE DE N)CE SOPHIA ANTIPOLIS

prsente et soutenue par

OPTIMISATION DE LA CONSERVATION DES COSMETIQUES

Thse co-dirige par Pr. Xavier FERNANDEZ et Pr. Chrystel FAURE

Jean-Marie AUBRY Professeur lENSCL Rapporteur

Je remercie galement le docteur Alexandre Dingas, docteur en Chimie et directeur des

Merci au personnel des laboratoires SO.F.I.A. Cosmtiques pour le support et la

Je remercie galement Fabien Fontaine-Vive pour son aide et ses explications en

Avec toute mon affection,

ASES Systme d extraction de solvant d arosols (Aerosol Solvent Extraction

INTRODUCTION GENERALE ................................................................................................................................................. 12

1. Activit antimicrobienne des extraits vgtaux ............................................................................................ 94

L ensemble de ces travaux de thse a t ralis au sein du groupe Mtabolome,

PARTIE I : LES COSMETIQUES

La mise sur le march d un produit cosmtique est soumise une rglementation en

1. QUEST-CE QUUN PRODUIT COSMETIQUE ?

L activit et l efficacit cibles des produits cosmtiques dpendent tout

Les conservateurs ont pour but d empcher la prolifration des

2.2 Pourquoi la conservation ?

les matires premires (principes actifs, eau, colorants...) ;

La majorit des produits cosmtiques doivent donc contenir des conservateurs.

Formol Acide lactique Acide formique

Imidazolidine ure Chlorhexidine

Certaines substances peuvent galement tre utilises dans la formulation de produits

2.3.2 Cosmetics Organic Standard (COSMOS-standard)

2.3.2.1 Les cosmtiques biologiques

Pour se voir attribuer l appellation biologique, les produits cosmtiques doivent

Surtout actif contre Gram (+)

2.4 Les conservateurs de synthse

pour la bactrie ce qui diminue sa vitesse de reproduction. Ce procd abaisse

2.4.2 Le cas des parabnes

Tableau 2 : structures et proprits physico-chimique des parabnes

R mthyl thyl propyl butyl

N CAS 99-76-3 120-47-8 94-13-3 94-26-8

N EINECS 202-785-7 204-399-4 202-307-7 202-318-7

Point de fusion (C) 131 116-118 96-98 68-69

Solubilit dans leau

pKa 8,17 8,22 8,35 8,37

Lorsque la longueur de leur chane alkyle augmente, leurs proprits antibactriennes

2.5 Extraits naturels et proprits antimicrobiennes

2.5.2 Huiles essentielles

2.5.2.1 Mode d obtention

Soit partir de matires premires vgtales par distillation l eau

2.5.2.2 Mode d action

2.5.2.3 Contraintes de formulation

2.5.3 Extraits naturels

Avec la diminution de l utilisation des matires premires animales, la consommation en

2.5.3.1 Modes d obtention

2.5.3.1 Contraintes d utilisation

2.5.3.1.2 Couleur des extraits

Extraits Noms commerciaux Actifs Activit Fournisseurs Rfrences

Extraits Noms commerciaux Actifs Activit Fournisseurs Rfrences

2.5.4 Huiles vgtales

3 LES ALTERNATIVES A LUTILISATION DES CONSERVATEURS

Afin de se multiplier, les microorganismes doivent tre en prsence d eau en quantit

L activit de l eau correspond la mesure des molcules d eau non complexes

HRE (%) = 100 * aw

3.1.1.2 Activit de l eau et conservation