Manual de Microbiologia 2 Sem

Universidad Autnoma del Estado de Morelos
Facultad de Medicina
Laboratorio de Microbiologa
CONTENIDO
I PARTE
Pg.
NORMA OFICIAL MEXICANA
(RESIDUOS BIOLOGICOS INFECCIOSOS)
INTRODUCCION A LA BACTERIOLOGIA GENERALIDADES
MANEJO DEL MICROSCOPIO OPTICO
TIPOS DE PREPARACION PARA MICROSCOPIA DE BACTERIAS
DIAGNOSTICO DE LA TUBERCULOSIS POR MICROSCOPIA Y CULTIVO
MORFOLOGIA Y TIPOS DE AGRUPACIONES DE LAS BACTERIAS
MANEJO DEL AUTOCLAVE
DIVERSOS METODOS DE ESTERILIZACION PARA MATERIAL
BACTERIOLOGICO
PREPARACIONES DE MEDIOS DE CULTIVO SINTETICOS
METODOS DE INOCULACION BACTERIANA EN TUBO
METODOS DE INOCULACION BACTERIANA EN PLACA
IDENTICACION BACTERIANA GRAMPOSITIVOS Y GRAMNEGATIVOS
(PRUEBAS DE IDENTICACION :BIOQUIMICAS, CAMP, CATALASA, OXIDASA
ETC.
ACCION DE ANTISEPTICOS Y DESINFECTANTES IN VITRO
PRUEBA DE SENSIBILIDAD BACTERIANA IN VITRO : ANTIBIOGRAMA
EXUDADO FARINGEO
AISLAMIENTO DE ENTEROBACTERIAS : COPROCULTIVO
ANLISIS BACTERIOLOGICA DE LA ORINA
EXUDADO NASAL
EXUDADO OPTICO
EXUDADO OCULAR
EXUDADO VARIOS
II PARTE
EXTRACCION Y MANEJO DE SANGRE PARA ANLISIS
PRUEBAS DE PRECIPITINAS (FLOCULACION)
REACCIONES DE AGLITINACION PARA EL DX. REACCIONES FEBRILES
REACCIONES DE PRECIPITACION PARA DETERMINACION DE PCR
TITULO DE ANTIESTREPTOLISINAS O
Profra. Ma. Leticia Garca Gmez

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MEDIDAS DE SEGURIDAD
En todo laboratorio debe existir un manual de seguridad cuyos principios deben aplicarse en todo
momento. A continuacin se mencionarn las normas bsicas que el alumno debe conocer con el fin
de poner en situacin de riegos la seguridad personal o del grupo.
1. Usar bata blanca de laboratorio con las siguientes caractersticas: bata larga (no filipina), con
manga larga preferentemente sin botones en los puos; con botones al frente y siempre
debidamente abotonada.
2. Para el manejo de material infeccioso usar siempre guantes de ltex o plsticos, gogles, cubre
boca y gorra (cuando no lleve el pelo recogido)
3. Para el manejo de material custico, voltil o inflamable protegerse con los gogles y guantes de
cidos.
4. A partir del momento en que el alumno cruza la puerta del laboratorio deber respetar las cinco
normas de NO.
* NO FUMAR, NO CONSUMIR ALIMENTOS NI BEBIDAS, NO RECIBIR AMIGOS, NO JUGAR CON

APARTOS E INTRUMENTAL DE LABORATORIO, NO ORGANIZAR EVENTOS NI BROMAS SUS
COMPAEROS.*
5. El uso del mechero debe ser razonable, debe encenderse solo en el momento de ejecutar la
maniobra que lo requiere. Mantenerlo apagado cuando no se necesario.
6. Las sustancias que se utilizan y las operaciones que se realizan son potencionalmente txicas y
peligrosas; se debe evitar la inhalacin de vapores y el contacto con cualquier parte del cuerpo. Si
se tiene accidentalmente, lavarse de inmediato con abundante agua de la llave y AVISAR AL
PROFESOR O AL TECNICO ACADEMICO
7. Loa alumnos que tengan el cabello largo debern llevarlo recogido o usar gorra.
8. Para el uso del microscopio, se recomienda evitar el uso de cosmticos en los ojos (rmel).
9. Por ningn motiv arrojar materiales slidos al desage del lavabo o del escurridero de las mesas
de trabajo.
10. Usar bolsas de polietileno para la recoleccin de material slidos de desechos como: torundas,
jeringas, palillos, gasas, que contengan sangre en bolsa roja, en el depsito de punzo cortantes
las agujas, lancetas, vidrios de los tubos y laminillas en depsito de basura municipal se desecha
las bolas de los guantes, de las cajas Petri y papel.
11. Si accidentalmente se derrama material infeccioso sobre la mesa, se deber absorber con un
pao impregnado de solucin de hipoclorito al 1 % o fenol al 5% (solucin custicas).
12. No cambiar de lugar los reactivos para usos del grupo. Deben estar disponibles para todos.
13. No confundir los tapones de los frascos reactivos, ni introducir una misma pipeta a diferentes
reactivos.
14. Conservar limpia el rea de trabajo.

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15. Utilizar las gavetas inferiores de las mesas de trabajo para guardar tiles escolares u objetos que
no tengan relacin con el experimento en curso.
16. Maniobrar y trasladar cuidadosamente el material de vidrio, ste deber enjuagarse con agua
corriente, lavarse con jabn lquido, enjuagarse con agua destilada y con alcohol etlico al 70% y
secarse a temperatura ambiente en la estufa de calor seco para mayor rapidez.
17. Los materiales calientes debern manipularse con pinzas adecuadas o bien usar guantes de
material a prueba de calor.
18. Prevenir la deglucin de reactivos custicos, txicos o infectantes evitando al mximo los pipeteo
orales directos. Usar perillas apropiadas o bulbos goteros.
19. Lavarse las manos con jabn antes de abandonar el laboratorio.
20. La entrada al laboratorio debe de ser puntual. No hay tolerancia despus de la hora asignada.
21. El alumno no puede abandonar el laboratorio a su libre criterio. Deber solicitar autorizacin al
profesor o al tcnico acadmico.
22. Todos los accidentes que en su persona o en el experimento que se realiza ocurran, por triviales
que stos parezcan deben comunicarse al profesor o al tcnico acadmico.

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INTRODUCCIN
La tecnologa del laboratorio es una profesin prctica; adems de realizar lo mejor posible los
distintos anlisis de laboratorio, el tcnico debe recordar constantemente las posibles causas de
accidentes, los eventuales peligros y las medidas ms eficaces para disminuir las probabilidades de
daos materiales y contaminacin infecto contagiosa.
La produccin de bienes y servicios, los hbitos de consumo y la explosin demogrfica, han llevado a
niveles antes inimaginables la generacin de residuos incrementando los riesgos para la salud y la
amenaza de contaminacin del ambiente. Uno de los campos de mayor evolucin en la sociedad
moderna ha sido el dedicado el cuidado a la salud, actividad que si bien no genera una importante
cantidad de residuos, algunos de ellos deben considerarse como potencialmente peligrosos.
En el momento presente se hace necesario establecer un sistema dinmico que incorpore los avances
tecnolgicos que garanticen mejores resultados acordes a las necesidades actuales apegado a la
legislacin vigente en la materia expedida por las Secretaria de Salud y la del Medio Ambiente,
Recursos Naturales y Pesca para llevar a cabo acciones y tareas a ejecutar en cada una de distintas
etapas por personal asignado a las diferentes reas que conforman las unidades institucionales:
Identificacin, separacin, envasado, almacenamiento, recoleccin, tratamiento y disposicin final,
incluyendo las tcnicas de derrame por accidentes as como las relativas a la inspeccin y vigilancia
en la aplicacin.
La Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-1995, establece los requisitos para la separacin,

envasado, almacenamiento, recoleccin, transporte, tratamiento y disposicin final de los residuos
peligrosos biolgico-infecciosos que se generan en establecimientos que prestan atencin mdica.
Los residuos peligrosos en cualquier estado fsico por sus caractersticas corrosivas, reactivas,
explosivas, txicas, inflamables, venenosas y biolgico-infecciosos representan un peligro para la
salud humana y el ambiente.
Los errores humanos y las prcticas incorrectas realizadas en las unidades de atencin mdica y
Laboratorios Clnicos, contrarrestan la eficacia de las medidas y el equipo utilizado para la proteccin
al personal.
OBJETIVO
Establecer un sistema confiable y seguro para el manejo y control de los residuos que se generan en
la operacin cotidiana en el laboratorio de anlisis clnicos a fin de evitar la existencia de riesgos de
orden sanitario y el deterioro ambiental, reincorporado el proceso productivo aquellos desechos
susceptibles de reciclamiento y sometiendo tratamientos a los residuos biolgico-infecciosos y toxico-
peligrosos.
MARCO JURDICO
Los procedimientos a realizar derivan y se encuentran fundamentados en las siguientes disposiciones

jurdicas aplicables en materia de residuos peligrosos y municipales.
LEY GENERAL DE SALUD: Norma Oficial Mexicana NOM-003-SSA2-1993 para la disposicin de

Sangre Humana y sus componentes con fines teraputicos.

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LEY GENERAL DEL EQUILIBRIO ECOLGICO Y LA PROTECCIN AL AMBIENTE: Reglamento

de La Ley General de Equilibrio Ecolgico y la Proteccin al Ambiente Materia de Residuos
Peligrosos.
NORMA NOM-CRP-001-ECOL./93, que Establece las Caractersticas de los Residuos Peligrosos, el

Listado de los mismos y los Limites que hacen a un Residuo Peligroso por su Toxicidad al Ambiente.
PROYECTO DE LA NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-087-7101-T994, que establece los requisitos

para la clasificacin, separacin, envasado, almacenamiento, recoleccin, transporte, tratamiento y
disposicin final de los residuos peligrosos biolgico-infecciosos que se generen en establecimientos
que presten atencin mdica, tales como hospitales y consultorios mdicos, as como laboratorios
clnicos, laboratorios de produccin de biolgicos, de enseanza y de investigacin, tanto humanos
como veterinarios.
LEY GENERAL DE LAS VAS DE COMUNICACIN: Reglamento para el Transporte Terrestre de

Materiales y Residuos Peligrosos.
NORMA NOM-003-SCT2, Caractersticas de las Etiquetas de Envases y Embalajes destinados al

Transporte de sustancias y Residuos Peligrosos.
NORMA NOM-005-SCT2, Informacin de Emergencia de Transportacin para el Transporte Terrestre

de Materiales y Residuos Peligrosos.
NORMA NOM-007-SCT2, -Envases -y - Embalajes destinado al Transporte de Sustancias. y Residuos

Peligrosos.

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ASPECTOS GENERALES
El laboratorio de Anlisis Clnicos desarrolla diferentes actividades por las cuales se generan diversos
tipos de residuos, en algunos casos de tipo biolgico-infecciosos y txico-peligrosos. A continuacin se
identifican los residuos y fuentes de generacin.
Identificacin de residuos
Grupo Tipo de Residuo
Biolgico Infeccioso - Sangre

- Cultivo y Cepas
- Punzo-cortantes
Toxico Peligroso - Medicamento Caduco

- Reactivos de Laboratorio
- Caducos o daados
- Mercurio
Comn basura municipal - Reciclables

- Papel
- Cartn
- Plstico
- Vidrio
- Metal
Con fundamento en la NOM-O52-ECOL-1993 y la NOM-087-ECOL-1995; los residuos peligrosos

biolgicos - infecciosos que se generan en diversas reas de atencin mdica son las siguientes:
Residuos peligrosos biolgicos - infeccioso:
Es el que contiene bacterias, virus u otros microorganismos con capacidad de causar infeccin que
contiene o puede contener toxinas producidas por microorganismos que canses efecto nocivo a seres
vivos y al ambiente que se generan en establecimientos de atencin mdica.
Objetos punzo-cortantes:
Aquellos que han estado en contacto con pacientes o con sus muestras clnicas durante el diagnstico
y tratamiento.
Fuentes de Generacin.
Fuentes de generacin Clasificacin de residuos

Asistencia Biolgico Toxico - Peligroso Basura comn Reciclables
medica Infeccioso
Banco de sangre X X X
Laboratorio X X X X

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GENERALIDADES DE LAS BACTERIAS
Las bacterias son clulas unicelulares y procariotas, son pequeas que solo se pueden observar con
la ayuda del microscopio. Ya que pueden medir de 0.2 m hasta 35 m. Incluso al mejorar la ptica,
no se poda analizar la estructura subcelular ni siquiera de las mayores clulas animales y vegetales.
La estructura celular no se pudo analizar con ms detalle hasta la introduccin del microscopio
electrnico en el siglo XX este instrumento junto con la tincin de Gram.
Se puede clasificar a las bacterias en dos familias:
GRAMPOSITIVAS
FORMA CELULAR FAMILIA GNERO
Cocos Micrococcaceae Staphylococcus

Streptococcaceae Streptococcus
Bacilos Esporulados Bacillus
Clostidium
Mycobacteruaceae Mycobacterium
GRAMNEGATIVOS
FORMA CELULAR FAMILIA GNERO
Cocos Neisseriaceae Neisseria

Moraxellaceae Moraxella
Brahamella
Veillonella
Bacilos Enterobacteriaceae Escherichia
Salmonella
Shigella
Klebsiella
Proteus
Yersinia
Enterobacter
Vibrionaceae Vibrio
Spirillaceae Campylobacter
Helicobacter
Miscelnea Bordetella
Brucilla
Legionellaceae Legionella
Una estructura exclusiva de las bacterias y en la que se basa su clasificacin es el pptido glicano. A
excepcin de la Archaeobacteriasque no poseen, y los Micoplasmas ya que carecen de pared celular.
Este pptido glicano es un heteropolimero regular de molcula de N-acetilglicano y cido N-
acetilmuramico. Lo cual le proporciona a la bacteria rigidez a la bacteria.
Los antibiticos -lactamicos inhiben la sntesis de peptidoglucano lo cual suele conducir a la muerte
celular. El peptidoglucano interfiere con la fagocitosis, es mitogeno porque estimula la mitosis de los
linfocitos y tiene una actividad pirgena ya que induce la fiebre.
Aunque tanto las bacterias grampositivas como las gramnegativas contienen peptidoglucano en sus
paredes, los dos tipos de paredes, los dos tipos de paredes celulares son muy distintos.

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Las grampositivas suelen tener de 30 a 200 molculas de grosor, y tienden a carecer de lpidos y
proteicas.
Las paredes contienen tambin polmeros hidrosolubles de fosfatos de poliol llamados cido teicoicos,
que son antgenos de superficie y funcionan como estructuras de unin a otras bacterias as como
receptores especficos en la superficie de las clulas.
Las gramnegativas son mucho ms complejas, ya que contiene dos capas por fuera de la membrana
citoplasmtica.
Contienen de dos a tres molculas de peptidoglucano y por fuera de esta capa se encuentra la
membrana externa exclusiva de las Gramnegativo el rea entre la superficie externa de la membrana
citoplasmica y la cara interna de la membrana externa se conoce como espacio periplasmico el cual
contiene enzimas hidroliticas para el metabolismo de la clula.
Membrana externa esta membrana es una bicapa lipidica, la cual es una hoja externa contiene el
polisacrido el cual es una molcula anfipatica que se comprende de tres regiones lpido A ,
polisacrido central y antigeno O, la molcula fue llamada originalmente endotoxina.
El movimiento de las bacterias se mueve que se extiende desde la superficie celular hacia fuera.
Puesto que la disposicin y numero de flagelos son caractersticos de cada especie.
ATRICO Sin flagelos

MONOTRICO Un flagelo externo
ANFITRICO Uno o ms flagelos en cada externo
LOFOTRICO Dos o ms flagelos en ambos externos
PERITRICO Flagelos alrededor de la clula
Pilis o fimbras son proyecciones de las clulas, su funcin primaria consiste en medir la adherencia de
la clula a otras bacterias para transmisin de plasmados (material extragenetico que sirve para
transferir informacin de bacterias para hacerse resistente a los medicamentos. Tambin sirve para la
adherencia a clulas epiteliales.

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INTRODUCCIN A LA BACTERIOLOGA
INDICACIONES GENERALES PARA EL TRABAJO BACTERIOLGICO
INTRODUCCIN.
Como un gran nmero de tcnicas de laboratorio y otros procedimientos relacionados con la salud se
centran en bacterias, una visin general de estos microorganismos ensear al estudiante de
Medicina los fenmenos bsicos de la Bacteriologa.
El estudio de las bacterias y de su estructura es particularmente difcil debido al tamao pequesimo

de las mismas, ya que sus dimensiones promedio son de 1 a 6 micras; por tanto, no pueden ser
observadas a simple vista para su estudio, para lo cual es necesario el empleo del microscopio ptico
compuesto y en ocasiones se requiere del microscopio electrnico.
En cuanto a la nomenclatura de las bacterias, los largos y complicados nombres que estas llevan se
basan en un sistema binominal (dos nombres) cientfico, siendo el primer nombre el gnero y el
segundo la especie, (ejemplo: Neisseria gonorrea). Considerando como especie a un grupo en el
que todos los individuos son esencialmente iguales, identificables como pertenecientes al grupo y no a
ningn otro; un gnero es un grupo de especies similares.
El primer nombre, el genrico, se escribe solo con la primera letra mayscula y el segundo nombre, el
de la especie, deber escribirse con todas las letras minsculas. Cuando estos nombres se imprimen
debern ir con letras cursivas o negritas y cuando son manuscritos debern ir subrayados tanto el
nombre genrico como el nombre especifico. Estos nombres cientficos provienen del griego o del latn
y sus races algunas veces intentan ser descriptivas de sus caractersticas fundamentales o bien
provienen de lugares o personas relacionadas con el descubrimiento del organismo.
Cuando se estudia a las bacterias bajo el microscopio ya sea ptico o electrnico, se dice que el
anlisis es por microscopia, el cual es descriptivo para la morfologa, agrupamiento y reacciones de
tincin. Cuando el estudio es bacteriano requiere del uso d medios de cultivo vivos o sintticos, se
refiere este anlisis como cultivo.
Para poder clasificar un microorganismo hasta su especie, es conveniente estudiar de manera

sistemtica sus caractersticas descriptivas (caracteres taxonmicos) mediante estudios de
laboratorio, los cuales se consideran en cuatro categoras, que en orden de importancia son:
1).- Morfologas micro y macroscpica:
Refirindose el primer trmino al estudio microscpico (microscopia) descriptivo de la morfologa, tipo

de agrupamiento celular y reacciones de coloracin especiales (Gram, Zhiel-Neelsen), etc.). El anlisis
microscpico considera las caractersticas del desarrollo de las bacterias sobre medios de cultivo
slidos.
2).- Reacciones bioqumicas:
Evalan los cambios que se producirn sobre medios de cultivo diferenciales enriquecidos con
azucares, enzimas y otras sustancias al ser inoculados con bacterias.
3).- Inoculacin en animales de experimentacin:

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Para estudiar la patologa de las enfermedades infecciosas. Los animales generalmente utilizados
para estos fines son: conejos, cobayos (cuyos), ratones y ratas blancas.
4).- Reacciones inmunolgicas:
Las cuales sirven para identificar bacterias segn sus anfgenos constituyentes. Tales caracteres
inmunolgicos estn subordinados a la diferenciacin bioqumica de las especies en tipos
inmunolgicos.

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RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL TRABAJO BACTERIOLGICO.
Con respecto al trabajo que habr de realizarse en el laboratorio relacionado con anlisis
bacteriolgicos, es conveniente que desde que se inicia un experimento se tengan en cuenta las
condiciones que se requieren tanto de esterilidad de productos como prevencin de contaminacin del
personal y del medio ambiente.
Dichos conceptos o recomendaciones rara vez se mencionan en los mtodos bacteriolgicos, ya que
se considera que el investigador o el estudiante de Microbiologa los ha estudiado ampliamente en
forma terica y habr de ponerlos en prctica en el momento oportuno; sin embargo, es conveniente
enlistar a continuacin aquellas recomendaciones bsicas, mnimas que se deben cumplir para
realizar todo tipo de trabajo bacteriolgico, sin perder de vista que en algunos procedimientos pueden
exigirse condiciones especiales aparte de las que a continuacin se mencionan:
Siempre que se trabaje con agentes biolgicos o sus productos es necesario el uso de cubre
bocas y gorro de tipo quirrgico.
Los estudiantes que tengan el cabello largo, debern traerlo recogido todo el tiempo que
permanezcan en el laboratorio.
Trabajar siempre con la flama del mechero cercana al rea de inoculaciones o muestreos con
agentes biolgicos.
Evitar corrientes de aire con objeto de que la flama no se propague a otros lugares u objetos o se
diseminen los microorganismos motivos de estudio.
No se debe estar hablando cuando se estn manipulando materiales estriles o con cultivo
Flamear hasta el rojo el asa bacteriolgica, lo mismo que los tubos de ensaye conteniendo medios
de cultivo.
Por ningn motivo dejar sobre la mesa asas sin flamear, pipetas con muestra liquida, tubos de
cultivo destapados o cualquier material contaminado.
Manipular adecuadamente las cajas de Petri estriles o con materiales bacteriolgicos. Nunca
habrn de destaparse completamente, si no en forme de ostra. Solicitar al profesor o al tcnico
acadmico, si lo considera necesario una demostracin objetiva de esta tcnica.
Teniendo en cuenta las recomendaciones anteriores y/o las adicionales que se requieren es posible
asegurar el xito y la veracidad en los experimentos o investigaciones que se emprendan.

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PRACTICA 1
MANEJO DEL MICROSCOPIO PTICO
OBJETIVO:
El alumno aprender a manejar el microscopio compuesto y conocer las partes de que consta; de
igual manera se ensear a cuidarlo y a tratarlo como un importante aparato de laboratorio; para lo
cual deber desarrollar la siguiente metodologa:
I.- MARCO TEORICO:
1.- Resea histrico del microscopio ptico

2.- Conocimiento de sus partes fundamentales
3.- Tipos de microscopios
II.- MEDIDAS DE SEGURIDAD:
1.- Para el transporte del microscopio.

2.- Para su manejo
3.- Para su almacenaje
4.- Factores que lo daan
III.- OBSERVACIN DE PREPARACIONES MICROSCPICAS:
1.- Iluminacin del campo microscpico

2.- Observaciones con objetivo seco dbil
3.- Observaciones con seco fuerte
4.- Observaciones con objetivo de inmersin
5.- Observaciones en placa de Mazzinni.
IV.- REPORTE
1.- Citado al final de la prctica
I.- MARCO TEORICO:
1.- Resea histrica del microscopio ptico
El microscopio compuesto, a diferencia del microscopio simple, est provisto de dos sistemas de
lentes: uno son los objetivos y el otro son los oculares, usualmente montados en un tubo o cuerpo del
microscopio.
La invencin de este aparato o herramienta de laboratorio fue indispensable para que el hombre
pudiera observar los microorganismos y determinar su morfologa como la conocemos hoy en da.
Este hecho se atribuye indistintamente al fabricante de gafas dans Zacaras Jensen (1590), y a
Galileo (1609) aunque la capacidad de aumento de los lentes convexos era ya conocida tiempo atrs.
Sin embargo en la historia del microscopio ptico compuesto se atribuye mencin oficial al Holands
Anthony Van Leeuwenhoek (1632-1723); quien fue uno de los primeros en dejar constancia de sus
observaciones, elaborando notas detalladas y bosquejos de los diminutos pobladores de las aguas
estancadas, de las heces de un diarreico y del sarro dental.

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Leeuwenhoek diseo diferentes tipos de microscopios. Todos ellos posean una gran capacidad
ptica. Se estima que monto alrededor de 247 lentes, la mitad de las cuales eran de plata, tres de oro
y el resto de bronce. Aunque la estructura era rudimentaria, la calidad de las lentes utilizadas y su
capacidad como observador dieron como resultado una serie de observaciones que causaron
sensacin entre los naturistas de su poca. Durante su vida envi a las sociedades cientficas ms de
350 cartas con observaciones microscpicas.
En la subsiguiente evolucin del microscopio ptico han participado eminentes cientficos y tcnicos
desde si invencin hasta nuestros das, para darnos el modelo de instrumento de laboratorio que
podemos emplear exitosamente en nuestras experimentaciones da con da.
2.- Conocimiento de sus partes fundamentales:
Se considera que la fsica del microscopio ptico (que en lo sucesivo llamaremos simplemente
microscopio) consta de tres sistemas: sistema ptico, sistema mecnico y sistema de iluminacin;
cada uno de los cuales posee las siguientes partes, mismas que podemos observar en la figura 1, son
las siguientes:
Sistema ptico (O): Est formado por oculares, objetivos y condensador.
Sistema mecnico (M): Est formado por soporte, el brazo, la platina, el revlver, tornillo
macromtrico y micromtrico, tornillo del condensador y otros.
Sistema de iluminacin: (I): Formado por una fuente luminosa generalmente integrada a la base
del microscopio, aunque puede darse el caso de que esta sea una lmpara perifrica, ajena a la
estructura del instrumento.
El sistema ptico puede ser muy variado segn el modelo del instrumento de que se trate, as puede
tener un solo ocular (monocular) o dos oculares (binocular), adems pueden ser un solo tipo de
aumento o juegos de oculares de diferentes aumentos.
Los objetivos generalmente son varios, por lo regular tres montados en el revolver. Estos objetivos
son:
Objetivo 10 X o seco dbil

Objetivo 40 X o seco fuerte
Objetivo 100 X o de inmersin
Por ltimo, el condensador de la luz tiene tambin una lente o juego de lentes que sirven para
concentrar y orientar los rayos luminosos hacia la preparacin
El sistema mecnico consta del tubo del microscopio, en cuya parte superior estn colocados los
oculares y en la inferior sobre el revlver estn los objetivos, los cuales estn montados por medio de
engranes a un soporte y este es accionado por dos tornillos: el primero es el macromtrico, de
movimientos rpidos y el segundo es el micromtrico, de movimientos lentos o finos. Hacia la mitad
inferior del tubo se encuentra el dispositivo para sostener las preparaciones en la posicin correcta: la
platina, que puede ser fija o mvil, para lo cual estar provista de dos tornillos que constituyen el carro
y que permiten desplazar con seguridad la preparacin hacia atrs y hacia delante o a la izquierda y a
la derecha. El tornillo del condensador se encuentra en la parte inferior de la platina
Para el sistema de iluminacin, dos tipos de fuentes luminosas se pueden encontrar: una puede ser
una lmpara perifrica que proyecta la luz que choca contra un espejo cncavo o plano; la segunda es

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una lmpara nter construida en el microscopio que proyecta los rayos luminosos directamente al
condensador sin el uso del espejo
3.- Tipos de microscopios
Siendo la microscopia el examen de preparaciones a travs del microscopio, es sin lugar a dudas ms
que este simple concepto; ya que el uso de este y los diferentes tipos que existen le dan la capacidad
de ser multifactico y su uso se ha extendido a todas las ramas del rea biomdica. De tal modo que
los microscopios se clasifican por el tipo de fuente luminosa empleada y por el medio de refraccin y
resolucin en:
a).- Microscopios pticos:
Usan la luz blanca visible (con sus diferentes modificaciones). Se basan parcial o totalmente en la
refraccin o desviacin de la luz visible, fenmeno que ocurre cuando esta pasa de un medio
transparente a otro o de idntica caracterstica pero ptimamente ms densa que el primero.
Dentro de estos se encuentra el microscopio simple o lupa, el microscopio compuesto, el

estereoscopio, el de polarizacin, el de fluorescencia, el de campo oscuro, el de fase, el de
interferencia, el de proyeccin y otros.
b).- Microscopios no pticos:
Los que utilizan radiaciones tales como: de onda corta, de rayos X, de iones o de electrones. Estos
instrumentos aumentan el tamao de los objetos por medio de radiaciones d onda corta, de rayos X,
de iones o de electrones. El aumento depende de la emisin de onda, mientras ms corta, mayor
aumento. Su aumento puede ser de 100,000 o mas que el de los pticos (tomando como referencia el
aumento 200 X). En estos, la obtencin de la imagen se logra de varias maneras: por medio de una
pantalla fluorescente, por medio de una pelcula fotogrfica o por medio de tubos de televisin y de
rayos catdicos especiales. Entre estos microscopios destaca el microscopio electrnico con el cual
es posible observar estructuras como los virus, que no pueden ser vistos con el microscopio de luz
ordinaria.
1.- Para el transporte del microscopio:
Al trasladarlo del rea de despacho del material a la mesa de trabajo debe tomarse con la mano
derecha el brazo del microscopio, deslizarse hasta la orilla de la mesa y apoyar la base sobre la
palma de la mano izquierda. Mantenerlo siempre en posicin vertical, por ningn motivo inclinarlo
puesto que se le pueden caer las piezas que no son fijas, como el filtro azul, los oculares u otras.
Para colocarse sobre la mesa de trabajo debe depositarse suavemente sobre ella y deslizarlo son
cuidado hacia el lugar donde se encuentran las conexiones de corriente elctrica.
Nunca deber colocarse cerca de mecheros encendidos ni sobre mesas en donde halla equipos
que al estar en funcionamiento estn vibrando; como rotadores, agitadores, centrfugas, etc.
2.- Para su manejo

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Antes de hacer uso de el debe cerciorarse de que los oculares, objetivos y condensador estn
limpias; de no ser as, deber proceder a limpiarlas con un trozo de papel seda (papel especial
para instrumentos pticos). Nunca usar papeles ni telas que desprendan pelusas.
No deben quitarse ni desarmarse las lentes de su lugar, porque al hacerlo permite el paso del
polvo al interior del microscopio que no podra ser quitado con una limpieza simple, si no mediante
el desensamble de las lentes y esto solo puede hacerlo un tcnico especializado.
Los objetivos, el condensador y los oculares en los que la limpieza con papel seda no sea
suficiente para remover los residuos debern reportarse al tcnico auxiliar del laboratorio; por
ningn motivo el alumno podr usar agua, detergentes, jabones, solventes orgnicos como el xilol,
etc.
Cuando se ha usado el objetivo de inmersin, se deber quitar primero el exceso de aceite con un
pao o trozo de papel suave y posteriormente con papel seda. Nunca se usar xilol.
3.- Para su almacenaje:

Mientras el microscopio no se est usando debe de mantenerse protegido del polvo, la humedad y los
vapores corrosivos, por lo que debe mantenerse en lugares secos y guardados en su estuche o
cubierto con una funda de material plstico de tamao adecuado.
4.- Factores que lo daan:

Todos los mencionados en cada maniobra que se ejecute para su manejo, transporte y almacenaje.
III.- OBSERVACIN DE PREPARACIONES MICROSCPICAS:
Tomando en consideracin el contenido temtico de la materia de Microbiologa y la naturaleza del

trabajo del laboratorio que el alumno desempeara, es indispensable que su entrenamiento en el
manejo adecuado del microscopio ptico compuesto los inicia con los diferentes tipos de
preparaciones que tendr necesidad de efectuar en la mayora de sus prcticas; las cuales son:
Preparaciones en portaobjetos para objetivos 10X, 40X, 100X; adems de la tcnica de iluminacin
del campo microscpico.
A continuacin se dan las metodologas y tcnicas que el alumno tendr que desarrollar para cada
una de las secciones antes mencionadas.
1.- Iluminacin del campo microscopio.
a) Conectar el cable del microscopio a la corriente elctrica, cerciorndose de que no halla falsos
contactos ni alambres que puedan ocasionar un corto circuito.
b) Efectuar las maniobras de limpieza en oculares, objetivos y condensador.
c) Colocar el objetivo 10X (seco dbil) sobre la apertura de l platina teniendo cuidado de que este no
quede de lado (inclinado) si no exactamente vertical a la platina y al condensador.
d) Cerrar el diafragma para evitar una cantidad de luz excesiva que pueda daar la vista.
e) Encender la fuente luminosa. Si esta tiene galvanmetro para ajuste de la intensidad, tener
cuidado de que no quede al mximo; un ajuste entre 2 y 3 graduaciones puede ser bueno.
f) Observar a travs de los oculares. El campo microscopio estar oscuro.

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g) Abrir lenta y cuidadosamente el diafragma hasta obtener un campo microscopio ntido, uniforme,
sin destellos policromticos ni sombras, de tal manera que no hiera la vista.
h) Si estos pasos se han realizado adecuadamente, el campo microscpico deber ser semejante a
la imagen que nos proporciona una luna llena. De lo contrario vuelva a repetir el procedimiento; si
el instrumento tuviese algn desperfecto comunicarlo al profesor o al auxiliar acadmico.
El campo microscpico se encuentra ahora listo para que sea posible colocar sobre la platina la
preparacin que se desee observar, siguiendo la tcnica de enfoque adecuada.
MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPO:
Portaobjetos (4)
Cubreobjetos (2)
Muestra bacteriolgica en tubo de 16 x 150 con 10 ml de caldo nutritivo
Pipetas Pasteur con gotero (1)
Mechero Bunsen
Tina de Tincin con puente de vidrio
Preparacin bacteriolgica teida, fija en portaobjetos, SIN CUBREOBJETOS
Microscopio ptico compuesto
Papel seda
Aceite de inmersin
PROPIEDADES DE LOS OBJETIVOS DE UN MICROSCOPIO
Propiedad Objetivo
De rastreo o lupa Bajo aumento Gran aumento Gran aumento

Inmersin aceite
Aumento 4x 10x 40x 45x 90x - 100x

Apertura numrica 0-10 0.25 0.55 a 0.65 1.25 1.4
Distancia focal aprox. () 40 mm 16 mm 4 mm 1.8 a 2.0 mm
Distancia de trabajo 17- 20 mm 4 8 nm 0.5 0.7 mm 0.1 mm
Poder de resolucin aprox. 2.3 m 0.9 m 0.35 m 0.18 m
con luz de 450 nm (azul)
2.- OBSERVACIN CON OBJETIVO 10x (Seco Dbil)
Para llevar a cabo este mtodo o tcnica, el alumno requiere haber realizado la revisin ocular de los
puntos de seguridad para el manejo del microscopio y la tcnica de iluminacin del campo
microscpico

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METODO:
1.- Cerciorarse de que el objetivo 10X este colocado correctamente sobre la apertura de la platina y de
que se encuentre a la altura tope.*
* Si el microscopio esta provisto de tope mvil por medio de un tornillo situado entre la platina y el
brazo; se deber buscar la altura tope idnea mediante la ubicacin primero del objetivo de mayor
tamao (el de 100X), el cual deber quedar a una altura aproximada al espesor del portaobjetos (2 a
3 mm. aproximadamente). Fijar en este punto el tornillo tope mvil e INTERCAMBIAR inmediatamente
al objetivo 10X
2.- Solicitar al profesor o al auxiliar del laboratorio, una preparacin fresca de muestra microbiana
montada entre porta y cubreobjetos
3.- Colocar la preparacin sobre la platina del microscopio, teniendo cuidado de accionar la pinza para
sujetar en firme el portaobjetos.
4.- Observar a travs de los oculares. Verificar que la iluminacin del campo sea correcta.
5.- Para el caso de las preparaciones en fresco, suele ser til cerrar parcialmente el diafragma antes
de intentar el enfoque de la preparacin. Ajustarlo a posterior.
6.- Sin dejar de observar el campo microscpico, accionar mediante movimientos suaves el tornillo
macrometrico en sentido contrario al movimiento realizado para localizar el punto tope (haciendo que
la distancia entre la preparacin y el objetivo 10X sea mayor) hasta encontrar el punto de enfoque, o
sea una imagen mas o menos definida del objetivo microscpico.
7.- Mediante movimientos finos con el tornillo micromtrico, afinar la imagen microscpica.
8.- Analizar la preparacin recorrindola con el objetivo 10X mediante el dispositivo del carro de la
platina; empezando en el ngulo superior derecho del rea del cubreobjetos y terminando en el
ngulo inferior correspondiente, teniendo cuidado de que el traslado de la preparacin sea siempre
con movimientos finos o suaves de derecha a izquierda y a la inversa.

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9.- Anotar las tcnicas y procedimientos manuales, representar grficamente los campos
microscpicos importantes, etc.
3.- OBSERVACIONES CON OBJETIVO 40 x (Seco fuerte)

Para este mtodo se contina trabajando con la preparacin anterior.
METODO:
1.- SIN RETIRAR DE LA PLATINA LA PREPARACIN DEL PROCEDIMIENTO ANTERIOR, SIN

MOVER EL ENFOQUE LOGRADO CON EL OBJETIVO 10X; girar el revolver hacia el objetivo 40X,
teniendo cuidado de que quede ajustado en posicin exactamente vertical.
2.- Observar a travs de los oculares. Como el enfoque ya esta dado por el objetivo 10X, la imagen
del objeto se observar ahora (con el objetivo 40X) inmediatamente, pero ahora con mayor aumento
(poder de resolucin).
3.- Si la imagen no este bien definido, ajustar el enfoque accionando el tornillo micromtrico
suavemente en el sentido que sea necesario (hacia el frente o hacia atrs)
4.- Analizar la preparacin recorrindola de la misma manera que para el objetivo seco dbil. Punto 8
del mtodo anterior,
5.- Anotar las tcnicas y procedimientos manuales, representar grficamente los campos
microscpicos importantes, etc.
4.- OBSERVACIONES CON OBJETIVO 100x, (INMERSIN):

Para este tipo de observaciones se requiere que el alumno halla realizado la tcnica de iluminacin
del campo microscpico; la revisin ocular de los puntos de seguridad del microscopio.
METODO:

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1.- Para Realizar la observacin de este tipo de preparaciones se debe empezar SIEMPRE con el
enfoque del objetivo 10X, por lo que, el alumno deber de ejecutar primeramente la tcnica de
definicin del tope de los objetivos de manera idnticos a la sealada por los mtodos 2 y 3.
2.- solicitara al profesor o al auxiliar de laboratorio una preparacin bacteriana teida y fija sobre
portaobjetos, sin cubreobjetos. Tener a la mano un recipiente gotero con aceite de inmersin.
3.- Colocar la preparacin sobre la platina, teniendo cuidado de: accionar la pinza para sujetar en
firme el portaobjetos y de que este quede colocado con la superficie que contiene la muestra
bacteriolgica hacia arriba.
4.- Observara a travs de los oculares. Verificar que la iluminacin del campo sea correcta.
5.- Sin dejar de observar el campo microscpico, accionar mediante movimientos suaves el tornillo
macrometrico en sentido contrario al movimiento realizado para definir el tope (haciendo que la
distancia entre la preparacin y el objetivo 10X sea mayor), hasta encontrara el punto de enfoque, o
sea una imagen mas o menos definida del objeto microscpico.
6.- Afinar la imagen microscpica mediante movimientos finos accionado el tornillo micromtrico en el
sentido necesario.
7.- SIN MOVER LOS TORNILLO MACRO Y MICROMETRICO, pasar al objetivo de 40X girando el
revolver el sentido de localizacin de dicha lente.
8.- Observar a travs de los oculares. La imagen microscpica se encuentra enfocada, aunque tal vez,
no totalmente definida. Afinar dicha imagen accionando mediante movimientos finos el tornillo
micromtrico.
9.- Girar el revolver para retirar el objetivo 40X en el sentido de localizacin del objetivo de 100X, SIN
COLOCAR TODAVA ESTE ULTIMO.
10.- Sin mover ningn dispositivo del microscopio, depositar una gota de aceite de inmersin sobre la
preparacin, teniendo cuidado de no usar este en exceso.
11.- Girar suavemente el revolver para colocar el objetivo 100X sobre la preparacin observando
macroscopicamente (a simple vista) que este haga contacto con el aceite, puesto que es el objetivo de
inmersin.
12.- Observar a travs de los oculares. La imagen microscpica aparece instantneamente, aunque
tal vez no totalmente definida. Afinar la imagen del objeto accionando mediante movimientos finos a
discrecin el tornillo micromtrico.
13.- Analizar la preparacin recorrindola a discrecin segn sea necesario
14.- Anotar los procedimientos manuales, representando grficamente los campos importantes, etc.
5.- OBSERVACIONES EN PLACA DE MAZZINNI:
Tambin Es conveniente llevar a cabo el entrenamiento previo necesario para la observacin de

preparaciones que deban valorarse en placa de aglutinacin o placa de Mazzinni (tambin llamada
placa excavada); en virtud de que algunos experimentos de la seccin de Inmunloga requieren que el
examen microscpico se realice en este tipo de instrumentos. En este caso, las observaciones se
llevan a cabo en el OBJETIVO 10x (Seco dbil) EXCLUSIVAMENTE.
METODO:

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Para llevar a cabo este mtodo, el alumno requiere haber realizado la revisin ocular de los puntos de
seguridad para el manejo del microscopio y la tcnica de iluminacin del campo macroscpico.
1.- Empleando una pipeta Pasteur provista de gotero disponer de la muestra bacteriolgica fresca
contenida en el tubo de ensaye una muestra pequea y homognea. No inclinar la pipeta con el
contenido. Evitar todo contacto con la muestra, pues es material biolgico activo.
2.- Trasladar la pieza hasta la placa de Mazzinni accionando suavemente el gotero depositar dos o
tres gotas de la muestra bacteriolgica en una de las excavaciones de la placa. No debe excederse la
cantidad de muestra para evitar que se derrame fuera de la placa. NO COLOCAR CUBREOBJETOS.
3.- Tomando la placa por la orillas, evitando siempre el contacto manual con el liquido, trasladar la
placa al microscopio. Accionar la pinza de fijacin y colocarla sobre la platina.
Es conveniente mencionar que algunas placas de Mazzinni, son ms grandes que la amplitud que
proporciona la pinza de fijacin, lo que representa cierta dificultad para su manipulacin por medio del
carro de la platina; en cuyo caso la placa se colocar sobre la platina y sobre la pinza, es decir, no
quedarse fija.
4.- Colocar la preparacin que contiene la muestra en la posicin del campo microscpico.
5.- Empleando el objetivo 10X (seco dbil), bajarlo mediante movimientos suaves del tornillo
macrometrico hasta la altura de la superficie plana de la placa, sin hacer contacto EVITAR
ABSOLUTAMENTE EL CONTACTO DEL OBJETIVO CON EL LIQUIDO DE LA EXCAVACIN.
6.- Observar a travs de los oculares. Verificar que la iluminacin del campo microscpico sea
correcta. Cerrar parcialmente el diafragma
7.- Girar lentamente el tornillo macrometrico en sentido contrario hasta lograr observar la imagen del
objeto ms o menos definida.
8.- Afinar la imagen mediante movimientos finos discrecin del tornillo micromtrico segn sea
necesario.
9.- Analizar la muestra recorrindola en todos sus campos. Se recomienda hacer esto en un tiempo
razonable, no ms de cinco minutos, ya que como no lleva cubreobjetos, el lquido se seca
rpidamente.
IV. REPORTE:
BUSCAR UN MICROSCOPIO
1) Sealar en el esquema del microscopio a que sistema (ptico, mecnico, o de iluminacin)
pertenecen las partes ah sealadas. Usar la tcnica de los colores distintos.
2) Sealar en el mismo esquema el tornillo para la definicin de tope de objetivos.
3) Sealar mediante tcnicas de colores los distintos objetivos bsicos del microscopio ptico
compuesto, su poder de aumento y su nombre comn.
4) Recurrir a las fuentes bibliografas referentes a los antecedentes histricos de la invencin

del microscopio y de la Microbiologa general. Incluir el reporte slo aqullos datos que sean
novedosos o diferentes a los que en esta prctica se han encontrado.
5) Representar con dibujos o esquemas los procedimientos manuales realizados para cada
paso, anotando siempre las leyendas de los materiales y reactivos empleado.

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6) Los campos microscpicos se deben de representar siempre con un crculo de 8 cm. De

dimetro y dibujar dentro de l los objetos microscpicos observados con su forma, tamao,
color etc. que sean originales SIEMPRE anotar en la parte inferior el poder de aumento del
objetivo empleado, tambin una descripcin de su observacin.
7) Anotar conclusiones, comentarios, sugerencias y bibliografas.
Cuestionario 1
1. Seale las ventajas e inconvenientes del examen en fresco
2. Por qu se coloca un cubreobjetos sobre la muestra?
3. Enumere las diferencias de tamao y de otros tipos (morfolgicos, estructurales) que

haya observado en los microorganismos procariotas y eucariotas.
4. Si ha podido observar microorganismos mviles, explique qu tipo de estructuras

cree que generan este movimiento.
5. Enumere las partes del microscopio.
6. Define:
-Resolucin
-Apertura numrica
-Distancia de trabajo
-Flurocromo
7. Define como funcionan:

-Microscopio de campo oscuro
-Microscopio de contraste de fases
-Microscopio de fluorescencia

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PRACTICA 2
TIPOS DE PREPARACIONES PARA MICROSCOPIA
DE BACTERIAS.
OBJETIVOS:
Elaborar diferentes tipos de preparaciones para la observacin microscpica de las

bacterias y conocer la morfologa elemental de los representantes de los principales grupos (gneros)
bacterianos, desarrollando la siguiente metodologa:
5. MARCO TEORICO. Introduccin.
II. METODOS.
1. Preparacin de laminillas (frotis).

2. Frotis en fresco
3. Coloracin ( o tincin) simple
4. Coloracin (o tincin) de Gram.
III. REPORTE.
I. INTRODUCCION:
Para la mejor compresin de la bacteriologa, es importante tener la idea de la forma y tamao de los
microorganismos para lo cual se observarn al microscopio ptico compuesto tal y como se
encuentran en los tejidos y en la naturaleza (frotis en fresco) y con tcnicas de coloracin especiales
(como la Gram. y otras) para el anlisis de estructuras celulares y de sus caractersticas taxonmicos.
Para identificar un microorganismo desconocido, las primeras etapas importantes estriban en

determinar su forma, movimiento, tipo de agrupacin celular si es que la hay, reacciones de tincin y
otras caractersticas morfolgicas visibles por microscopa, todas las cuales requieren una clara visin
de las clulas bacterianas aisladas, por lo que es de suma importancia saber realizar los tipos de
preparaciones o frotis necesarios para tales fines, por lo que a continuacin se dan a conocer y el
alumno deber llevar a la prctica los mtodos ms usuales.
II. METODOS:
MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS:
Tubo de ensaye de 16 x 150 con 10 ml. de caldo nutritivo inoculado con pajas y materia
orgnica hidrolizada y fermentada.
Cultivos sp. En agar nutritivo en placa o en tubo.
Portaobjetos (4).
Cubreobjetos (4)
Pipetas Pasteur con bulbo gotero.
Asa bacteriolgica.
Tina y puente de tincin.

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Equipo de colorantes de Gram.:

Cristal violeta, lugol, safranina, alcohol-cetona.
Piseta para agua corriente.
Microscopio ptico compuesto.
Aceite de inmersin, papel seda.
Mechero bunsen.
Lmpara de alcohol.
1. PREPARACIONES DE LOS FROTIS.
Por lo general la microscopa bacteriana se realiza en unas laminillas de vidrio de 22 x 22 mm.

Llamadas portaobjetos en los que se realizan los frotis, los cuales deben estar perfectamente limpios y
desengrasados, as que para asegurar lo anterior es necesario:
1. Lavar con esponja impregnada de solucin jabonosa cada uno de los portaobjetos.
2. Enjuagarlos con abundante agua de la llave.
3. Frotarlos con una torunda con alcohol etlico clnico.
4. Dejarlos secar al aire libre o de otra manera con un pao de algodn sin pelusas.
5. Manipularlos por las orillas. Se debe evitar tocar las superficies con los dedos, ya que se pueden
volver a engrasar y quedar con las huellas digitales gravadas.
6. Pasar cada uno de los portaobjetos por la flama del mechero, durante dos o tres veces.
Si no se tiene cuidado de los puntos anteriores, es posible que las dificultades que se presenten al
observar al microscopio las bacterias se deben a descuidos desde esta parte.
2. FROTIS EN FRESCO.
Este tipo de preparacin se efecta colocando una muestra bacteriana en medio lquido sobre un
portaobjetos y siempre debe ir protegida con un cubreobjetos. Son preparaciones entre lmina y
laminilla.
1. Tomar con una pipeta Pasteur manipulada con un gotero una muestra del tubo que contiene la
materia orgnica hidrolizada.
2. Depositar una gota de esta muestra en el centro de un portaobjetos previamente limpio.
3. Cubrir la preparacin con un cubreobjetos, evitando que se forme burbujas de aire.
4. Eliminar si es necesario el lquido que se salga de la superficie del cubreobjetos, absorbiendo con
pequeos rollitos de papel suave absorbente.
5. Inmediatamente observarlos al microscopio primero bajo objetivo seco dbil (10X) y despus con
seco fuerte (40X) siguiendo las tcnicas de iluminacin y enfoque previstas.
Es conveniente mencionar que este tipo de frotis NO DEBE OBSERVARSE EN Objetivo 100 X ni por
supuesto emplear aceite de inmersin.
3. FROTIS PARA INMERSION:

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Este tipo de frotis se utiliza para la observar preparaciones de microorganismos que se habrn de fijar
mediante calor al portaobjetos con la finalidad de teirlos por la tcnica ms conveniente. Este tipo de
frotis no UTILIZAN CUBREOBJETOS
1. Disponer de un cultivo bacteriano en placa (medio slido) o en tubo Inclinado.
2. Disponer de la charola de tincin provista de un puente de varilla de vidrio (puente de tincin).
3. Colocar sobre el puente un portaobjetos previamente lavado y completamente seco.
4. Depositar una gota de suero fisiolgico en el centro del portaobjetos.
5. Encender la flama del mechero de alcohol y colocar ste cerca del rea de trabajo. Tener cuidado
de que sobre la mesa de trabajo no halla solventes u otros materiales inflamables ni corrientes de
aire.
6. Con la mano izquierda tomar la placa o el tubo con el cultivo y con la derecha manipular el as
bacteriolgico calibrada.
7.a) Si el cultivo proviene de placa, abrir parcialmente la caja petri (en modo de ostra), teniendo
siempre la flama del mechero cerca.
7.b) Si el cultivo proviene de tubo inclinado, destaparlo retirando el tapn con el dedo meique de la
mano derecha sin soltarlo. Sostener al mismo tiempo el asa. Mantener siempre la flama del mechero
cerca.
La operacin de cualquiera de los puntos anteriores requiere de habilidad y adiestramiento, por lo que
si se tienen dudas, es recomendable solicitar al auxiliar o profesor la demostracin objetiva de los
mismos.
8. Flamear el asa al rojo.
9. Flamear por algunos segundos la abertura de la caja Petri o de la boca del tubo de cultivo.
10. Introducir el asa. Enfriarla al contacto con una parte de la superficie del medio (agar) que No
presente desarrollo bacteriano (colonias).
11. Inmediatamente despus de tomar un inocul del materia bacteriolgico mediante contacto suave
del asa con alguna de las colonias seleccionadas. Evitar introducir el asa a la parte slida (o
sea del agar). No tratar de extraer trozos de materia slida, sino del material biolgico, el cual es
de consistencia suave, blanda o cremosa.
12. Retirar el asa. Cerrar la caja Petri o colocar el tapn al tubo de cultivo, previamente flamear por
algunos segundos sin soltar en ningn momento el asa que contiene el inocul.
13. Dirigir el asa al portaobjetos con la gota de suero fisiolgico, Introducirla al lquido y emulsionar
mediante agitacin suave el contenido bacteriano de la misma (inocul), procurando que la
muestra quede del tamao y forma de una monedita de baja denominacin.
14. Retirar el asa, flamearla al rojo. Depositarla en la charola de materiales.
15. Dejar secar a temperatura ambiente el lquido del portaobjetos. Para abreviar tiempo, puede
hacerse pasar rpidamente el portaobjetos por la flama de una lmpara de alcohol a intervalos de

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unos 30 segundos hasta que seque. No calentar demasiado la muestra. Se debe tocar el frotis con
el dorso de la mano y no debe dar la sensacin de quemadura, de este modo ha quedado fijado
por calor al portaobjetos.
16. El frotis est listo para teirse por la tcnica ms conveniente. A continuacin se mencionarn dos
mtodos de uso frecuente en Bacteriologa.
4. TINCION SIMPLE:
Se da este nombre aqullos tcnicas en que solo se emplea un colorante para teir a las clulas
bacterianas, por ejemplo; soluciones de azul de metileno, de eosina, de verde de malaquita,etc. Estas
tinciones no tienen carcter taxonmico.
1. Colocar sobre el puente y la charola de tincin el frotis con el inocul ya fijado a la flama.
2. Cubrir la muestra con algunas gotas de la solucin de los colorantes antes mencionados, por
ejemplo azul de metileno.
3. Dejar actuar el colorante sobre la muestra por un tiempo de treinta segundos a un minuto.
4. Inclinar el portaobjetos y lavarlo con agua de la llave potable proveniente de una piseta.
5. Dejar secar el portaobjetos al aire libre. No usar papel o tela absorbente para eliminar las gotas
de agua.
6. Observar al microscopio bajo objetivo 100X. No olvidar usar aceite de inmersin .Emplear la
tcnica de enfoque practicada al inicio de esta prctica.
5. TINCION DE GRAM.
Una coloracin simple como azul de metileno muestra muy bien la forma y dimensin de los
microorganismos, pero existen otros mtodos que dan ms informacin.
El mtodo ms generalmente usado para identificar bacterias fue creado por el cientfico dans Hans
Christian J. Gram, de quien lleva su nombre: tincin de Gram. Se califica de tincin diferencial
porque divide a las bacterias en dos grupos, las Grampositivas y las Gramnegativas, mediante el
uso de un colorante bsico, el cristal violeta y de un colorante de contraste, el rojo de safranina, el cual
a continuacin se describe.
METODO:
1. Disponer sobre el puente y la charola de tincin un frotis de muestra bacteriana en portaobjetos,

previamente preparado para tincin y fijado a la flama.
2. Disponer a la mano los frascos reactivos del equipo de coloracin de Gram: Cristal violeta, lugol,
alcohol-cetona, rojo de safranina y la piseta con agua de la llave en una piseta.
3. Cubrir la preparacin con unas gotas de colorante bsico, el cristal violeta. Dejarlo actuar durante
un minuto.
4. Inclinar el portaobjetos y lavar con agua de la piseta.
5. Cubrir ahora la muestra con unas gotas de lugol. Dejarlo actuar durante un minuto.
6. Inclinar el portaobjetos y lavar con agua de la piseta.

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7. En la misma posicin inclinada del porta, lavar con unas gotas de alcohol-cetona durante un
tiempo de 10 a 30 segundos o hasta que los residuos del lavado sean incoloros.
8. Lavar con agua corriente.
9. Cubrir la muestra con el colorante de contraste, el rojo de safranina. Dejarlo actuar durante un
minuto.
10. Inclinar el portaobjetos y lavar con agua corriente hasta que los residuos del lavado sean
incoloros.
11. Dejar secar el frotis al aire libre. No aplicar calor directo ni papel absorbente.
12. Observar al microscopio con el objetivo de 100X empleando la tcnica de enfoque ensayada en la
prctica primera. No olvidar aplicar aceite de inmersin.
INTERPRETACION DE LA REACCION DE GRAM.
Las paredes celulares de las bacterias grampositivas retienen el complejo cristal violeta yodo; en
este momento todas las bacterias se tien de morado. Con el lavado de alcohol cetona las bacterias
gramnegativas se decoloran, no as las Gram positivas que permanecen de color morado. Con la
aplicacin del colorante de contraste, el rojo de safranina, las bacterias gramnegativas previamente
decoloradas absorben este colorante quedando teidas de rojo plido o rosa intenso.
III. REPORTE:
1. Representar con esquemas las operaciones llevadas a cabo para los mtodos del 1 al 5.
2. Representar los campos microscpicos del frotis en fresco, la tincin simple, y las tinciones
diferenciales como es tincin de Wright, la tincin de Gram y tincin de Zhiel Neelssen.
Describir al pie de los campos sus caracteres taxonmicos elementales: morfologa a,
agrupacin, reaccin de Gram.
3. Investigar la pared celular de las bacterias Grampositivas y Gramnegativas
El uso de colores en los mtodos de tincin es importante.

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PRACTICA 2 1
TIPOS DE PREPARACIONES PARA MICROSCOPIA
DIAGNOSTICO DE LA TUBERCULOSIS POR BACILOSCOPIA Y CULTIVO.
OBJETIVOS:
Efectuar los mtodos de laboratorio para la identificacin de Mycobacterium

tuberculosis mediante la tincin especial de Zhiel Neelsen y cultivo de Lowenstein Jensen. Con la
siguiente metodologa:
MARCO TEORICO. Introduccin.
METODOS.
REPORTE.
INTRODUCCION:
La tuberculosis es una enfermedad infecta contagiosa causada por M. tuberculosis

(bacilo de Koch). El cual es un bacilo que no se tie por el mtodo de Gram.; sino que requiere de una
tincin especial llamada Zhiel Neelsen; debido a que es un bacilo acido alcohol resistente (BAAR)
que posee una capsula cerosa que impide la permeabilidad de los colorantes de Gram.
Pueden encontrase bacilos tuberculosos en el esputo, la orina, el liquido de lavado gstrico

los lquidos cefalorraqudeo y pleural, las heces, el pus y los tejidos. Muchos de estos materiales
contiene normalmente un gran nmero de bacterias (heces, esputo, lavado gstrico); otros se
contaminan con facilidad (orina) y lo habitual es que el pus tuberculoso presente infeccin
secundarias.
Se utilizan mtodos de concentracin para aqullas muestras que contengan

microorganismos distintos de Mycobacterium para destruir las bacterias contaminantes dejando vivo
el bacilo tuberculoso. Sin embargo los mtodos de concentracin pueden matar parte de los bacilos
de Koch, y normalmente para muestras como el L.C.R. y el Lquido pleural no se utilizan
concentracin, aunque s centrifugacin. Adems de destruir los microorganismos contaminantes, los
mtodos de concentracin reducen el volumen de la muestra, y permiten manejarla con ms facilidad.
Cuando se trabaja con bacilo tuberculoso, el mayor peligro corresponde a las

partculas suspendidas en el aire. Se debern tomar toda clase de precauciones contra la produccin
y diseminacin de esta clase de partculas. De se posible, la zona del laboratorio donde se realice el
trabajo con material tuberculoso debe apartarse, y no se debe emplear para otros fines. Tendr piso
artificial, con mesas, paredes y piso fciles de lavar. Las sustancias desechables se deben desinfectar
inicialmente con solucin de hipoclorito y luego ponerse al autoclave.

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METODO:
I. IDENTIFICACION DE M. tuberculosis POR MICROSCOPIA:
BACILOSCOPIA O B. A. A. R.
Equipo de tincin de Zhiel Neelsen

Carbolfuccina bsica (frasco gotero)
Acido sulfrico (H2SO4) al 20 %
Alcohol etlico al 95 %
Azul de metileno de Loeffer (frasco gotero)
Pinzas de diseccin, lmpara de alcohol
Torunda con alcohol, puente de vidrio
Portaobjetos, tiras de papel filtro, piseta.
Muestra bacteriolgica sospechosa de BAAR.
Microscopio ptico, papel seda, aceite de inmersin.
ES INDISPENSABLE TRABAJAR CON CUBREBOCAS Y EVITAR EL CONTACTO MANUAL DE

LAS MUESTRAS SOSPECHOSAS DE BAAR.
1. Solicitar al profesor o al auxiliar acadmico un frotis para baciloscopia y fijarlo a la

flama.
2. Colocar sobre el portaobjetos una tira de papel filtro que cubra la superficie de la
muestra.
3. Colocar el portaobjetos sobre el puente de vidrio o un triple.
4. Se cubre la preparacin con la solucin de Carbolfuccina bsica hasta que el papel
filtro quede bien humedecido.
5. Tomar con una pinza de diseccin una torunda impregnada de alcohol, prenderle
fuego.
6. Comenzar a calentar lentamente por debajo el portaobjetos hasta la emisin de
vapores. No se debe dejar secar el colorante.
7. El calentamiento debe ser intermitente, no continuo, porque la muestra puede
quemarse.
8. Volver a cubrir la muestra con la Carbolfuccina conforme esta se vaya evaporando.
9. Continuar calentando en forma intermitente y adicionando colorante a discrecin
durante 20 minutos.
10. Al trmino de este tiempo, retirar el papel filtro y lavar la preparacin con agua
destilada.
11. Lavar la preparacin en posicin inclinada con acido sulfrico al 20 %, hasta que el
liquido que escurra sea amarillo o cristalino (no rojizo).
12. Lavar la muestra con agua y si esta vuelve rosada, repetir el lavado con acido
sulfrico hasta que el agua de lavado sea amarillo o cristalino.
13. Volver a colocar el porta en el puente de tincin y cubrirlo con suficiente alcohol etlico
al 95 % dejndolo actuar sobre la preparacin por 2 minutos
14. Lavar con agua destilada.
15. Cubrir la muestra con azul de metileno Loeffler o verde de malaquita y dejarlo actuar
30 segundos, para la tincin de contraste.
16. Lavar con agua, dejar secar a temperatura ambiente.
17. Observar al microscopio con objetivos de 100 X.
INTERPRETACION:

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Los bacilos de Koch o Mycobacterias, que son las nicas alcohol acido resistente,
aparecern con barritas tipo cigarrillo o como bastoncillos rojos ligeramente curvos, mientras que los
microorganismos que no son acido alcohol resiste, las clulas epiteliales, los leucocitos, los
filamentos mucosos y otros artefactos se observaran teidos de azul o verde, segn el colorante de
contraste empleado.
METODO:
II. DIAGNOSTICO DE M. tuberculosis POR CULTIVO:
Tubos con medio inclinado de Lowestein Jensen.

Equipo de cultivos.
Equipo de tincin de Zhiel Neelsen.
Muestra bacteriolgica sospechosa a BAAR.
1. Hacer una concentracin asptica de la muestra sospechosa de BAAR, bien sea

centrifugndola en caso de que esta sea liquida o mezclndola a partes iguales con NAOH al
4 % para homogeneizarla.
2. La mezcla se lleva a la incubadora a 37 C durante 30 min. Agitndola ocasionalmente.
3. Centrifugarla mezcla a 3, 000 rpm durante 5 min para concentrar los bacilos.
4. El sedimento de la muestra concentrada se siembra por estras en cuatro tubos por lo menos
en el medio de Lowestein Jensen, en superficie inclinada.
5. Se incuban los tubos en posicin horizontal a 37 C. Se examinan con lupa al cumplirse los 15
primeros das buscando colonias de Mycobacterias.
6. En caso de ser negativo el primer anlisis se deber dejar en incubacin hasta 6 o 8
semanas, revisndose cada semana.
7. En caso de no haber desarrollo de colonias en este lapso, el estudio se reportara negativo.
8. Si los medios de cultivo presentan algunas colonias tpicas, deber de efectuarse la tincin de
Zhiel Neelsen de la misma manera que para la baciloscopia.
9. Al trmino del estudio, esterilizar los tubos con el medio de cultivo, lavar y secar.
REPORTE:
1. Representar los pasos efectuados para la tincin de Zhiel Neelsen.

2. Representar el campo microscpico de un anlisis positivo de Mycobacterium tuberculosis.
3. Investigar bibliogrfica sobre el bacilo de Koch o M. tuberculosis.

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PRACTICA 3
MORFOLOGIA Y TIPO DE AGRUPAMIENTOS DE LAS BACTERIAS.
OBJETIVOS:
Estudiar la morfologa al microscopio de gneros bacterianos representativos, su tipo de

agrupamiento y su reaccin a Gram:
MARCO TEORICO. Introduccin.
REPORTE.
I. INTRODUCCION:
La observacin directa de todos los microorganismos es esencial para su estudio. Tienen

gran valor diferencial caractersticas taxonmicas tales como la forma y agrupamiento de las clulas;
distincin de estructura celulares especiales tales como: capsula, flagelos y endosporas; reaccin a
colorantes diferenciales como el de Gram, etc.
La forma de las bacterias es un carcter taxonmico importantsimo tanto para su

clasificacin como para su identificacin; para determinar este se acude al recurso de la microscopia
mediante el cual son dos los criterios que determinaran la morfologa bacteriana: la forma elemental
unicelular y la disposicin o tipo de agrupamiento permanente de mas de dos clulas. Aunado a la
descripcin morfologa esta el anales del tamao o dimensiones de cada clula bacteriana.
Como la morfologa celular es la diferencia ms manifiesta entre las bacterias, constituye

esta el principal carcter taxonmico para la clasificarlas en tres grupos bsicos netamente distintos:
1. Cocos.
2. Bacilos y cocobacilos.
3. Espirilos o helicoidales.
COCOS: La clasificacin de las clulas esfricas y esferoidales en gneros se basa

fundamentalmente en tipos distintos de agrupamiento de clulas despus de su fisin.
As las bacterias de diversas especies que se renen apareadas (disposicin de par)

despus de la fisin se denominan diplococos, del prefijo diplo que significa dos o un par. A este
grupo pertenecen el gnero Neisseria (al que pertenecen los meningococos y gonococos) y la
especie Diplococos pneumoniae, ambos grupos netamente distintos en virtud de que el primero es
Gramnegativo y el segundo Grampositivo entre otras diferenciales taxonmicas.

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Los cocos que se renen en disposicin de collar de cuentas o perlas o diese tambin en
cadenas de ms de cuatro clulas en disposicin lineal se denominan estreptococos. El grupo
representativo es el gnero Streptococcus.
Otras bacterias cocoides no forman pares regulares ni cadenas, sino grupos irregulares y
masa como acumulo de frutas de uvas a los que se le llama estafilococos, los cuales constituyen el
gneros Staphylococcus. Algunos cocos de poder patolgico incierto forman grupos de cuatro
clulas como la especie Gaffkya tetragena, otros forman acmulos cbicos de ocho clulas,
disposicin a la que se le denomina sarcina.
BACILOS: Son bacterias de forma alargada o de barra que cuando se observan in vivo
efectan un movimiento curvo en uno de sus extremos y dan la apariencia de bastoncillos. A este
grupo corresponden una gran diversidad de gneros bacterianos de dimensiones y otros
caractersticas taxonmicos muy diversos. Se clasifican por su afinidad a colorantes diferenciales en
Grampositivos, Grannegativos y bacilos acido alcohol resistente (BAAR). Los bacilos Grampositivos
pueden ser esporulados, no esporulados, aerobios o anaerobios.
Los bacilos Grannegativos por su parte, constituyen tambin un grupo muy amplio y
diverso en el que se encuentran los bacilos esfricos o entero bacilos y los bacilos Grannegativos
pequeos, los cuales requieren la reaccin bioqumica de sus cultivos para clasificarlos
taxonmicamente.
Los cocobacilos son bacterias de forma esferoidal (esfrico-alargado). Encontrndose

como ejemplo tpico la especie Moraxella lacunata, que un bacilo rechoncho muy corto de forma casi
de coco, provoca un tipo de conjuntivitis en el hombre. Existen otras especies de forma similar que en
ocasiones se llegan a encontrar como bacilos pequeos, algunos de estos son Bordetella pertussis y
especies de Brucella.
ESPIRILOS O BACTERIAS HELICOIDALES: Se encuentran dos tipos de bacterias esta

forma, las rgidas y las flexibles. Las especies rgidas se enrollan en varias vueltas, otras tienen
simplemente forma de coma, de las primeras tenemos Spirillum minor y de las segundas
encontramos Vibrio cholerae o Vibrio comma. Las bacterias helicoidales flexibles constituyen la
familia Spirochaetaceae del orden Spirochaetales y comprenden a tres gneros de vida libre:
Treponema, Borrelia y Leptospira.
METODOS:
MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS:
Equipo de colorantes de Gram:

Cristal violeta, lugol, safranina, alcohol-cetona.
Cultivos slido de 24 horas de: Staphylococcus aureus, S. albus, S. epidermidis,
Streptococcus sp.
Portaobjetos (4)
Cubreobjetos (4)
Pipetas Pasteur con bulbo gotero.
Asa bacteriolgica.
Tina y puente de tincin.
Piseta para agua corriente.

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Microscopio ptico compuesto.

Aceite de inmersin, papel seda.
Mechero bunsen.
Lmpara de alcohol.
METODO:
Se proporcionaran cultivos puros de diferentes gneros bacterianos con la finalidad de que

el alumno prepare frotis para teir por Gram y observe por microcopia la morfologa exacta de cada
unos de ellos.
a. Preparar un frotis para inmersin de cada cultivo.
b. Teirlos por la tcnica de Gram.
c. Observar al microcopia bajo objetivo 100X.
III. REPORTE:
1. Representar el campo microscpico de cada gnero bacteriano. Describir morfologa, tipo de

agrupamiento y reaccin a Gram. El uso de colores es indispensable.
2. Realizar investigacin bibliografa de cada gnero.
El uso de colores en los mtodos de tincin es importante.

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PRACTICA 4
ESTERILIZACIN
MANEJO DEL AUTOCLAVE
OBJETIVO:
El alumno aprender a manejar el autoclave y conocer las partes de que consta; de igual manera se
ensear a cuidarlo y a tratarlo como un importante aparato de laboratorio; para lo cual deber
desarrollar la siguiente metodologa:
I.- MARCO TEORICO:
1.- Introduccin
2.- Conocimiento de sus partes fundamentales
3.- Diferentes aparatos.
1.- uso y manejo del autoclave

2.- Para su almacenaje
3.- Factores que lo daan
III.- Conocimiento de diversos mtodos de esterilizacin:
1.- Calor hmedo (vapor de presin)

2.- Calor seco
3.- Luz ultravioleta
4.- Germicidas qumicos.
IV.- REPORTE
1.- Citado al final de la prctica
I.- MARCO TEORICO: INTRODUCCIN.
La terminologa tiene una especial importante cuando se aborda el control microbiano, porque hay
trminos como desinfectantes y antispticos que se emplean a menudo libremente. Esta situacin es
incluso ms confusa porque un tratamiento particular puede inhibir el crecimiento o destruir los
microorganismos. Segn las condiciones.
La capacidad de controlar las poblaciones microbianas sobre el objeto inanimado, como utensilios de
alimentacin o instrumentos quirrgicos, tiene una importancia prctica considerada. A veces, es

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necesario eliminar todos los microorganismos de unos objetos, mientras que otras situaciones puede
ser necesario solo destruir parcialmente la poblacin microbiana.
La esterilizacin del latn sterilis, incapaz de reproducirse. Es el proceso por el que todas las
clulas vivas, son destruidos o eliminados de unos objetos o hbitat. Un objeto esterilizado est
totalmente libre de microorganismos viables, esporas y otros agentes infecciosos. Cuando se
esterilizacin con un agente qumico, ste se denomina esterilizante. Por el contrario, la desinfeccin
consiste en la destruccin, inhibicin o eliminacin de microorganismos que pueden causar
enfermedad. Los desinfectantes son agentes, normalmente qumicos, empleados para desinfectar y
se utiliza normalmente con objetos inaminados. Un desinfectante no esteriliza necesariamente un
objeto, porque pueden permanecer esporas y algunos microorganismos viables. El saneamiento
tiene una estrecha relacin con la desinfeccin. Con este sistema la poblacin microbiana se reduce a
niveles que se consideran seguros segn la norma de salud publica. Los objetos inaminados suele
limpiar y desinfectar parcialmente. Por ejemplo, los productos de saneamiento se emplean en
restaurantes para limpiar utensilios de alimentacin.
CINTICA DE MUERTE MICROBIANA.
Una poblacin microbiana no se destruye instantneamente cuando se expone aun agente letal. La
muerte de una poblacin, al igual que su crecimiento, es generalmente exponencial logartmica, es
decir la poblacin se reduce en niveles iguales o intervalos constantes.
Experimento terico de destruccin microbiana
Minutos Numero de microorganismos Microorganismos Microorganismos Log.10 de
al comienzo de ensayo destruidos en 1min. al final de 1min supervivencia
1 106 9 x105 105 5
2 105 9 x104 104 4
3 104 9 x103 103 3
4 103 9 x102 102 2
5 102 9 x101 101 1
6 101 9 1 0
7 1 0.9 0.1 -1
6
Se supone que la muestra inicial contiene 10 microorganismos vegetativos por mL, y que el 90 % de los microorganismos se
destruyen durante cada minuto de exposicin. La temperatura es de 121 C.
Si se representa el logaritmo del numero de microorganismos de la poblacin de la sobrevive, frente a

tiempo de exposicin a un agente determinado.
Cuando la poblacin se ha reducido, la velocidad de destruccin puede disminuir debido a la

supervivencia de la cepa microbiana ms resistente.
Para estudiar la eficacia de un agente letal hay que saber cuando los microorganismos estn muertos,
es una tarea no tan fcil como en el caso de organismos de mayor tamao. Es imposible tomar el
pulso a una bacteria Una bacteria se considera muerta si no hay crecimiento cuando se inocula en un
medio de cultivo que normalmente facilitara su crecimiento.
METODOS DE ESTRILIZACION O DESINFECCIN: Nivel de actividad de germicidas lquidos

seleccionados.

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METODO CONCENTRACIN NIVEL ACTIVDAD

DESINFECTANTE
Esterilizacin:
Calor 250 F (121C) o 271F (132C)
Calor hmedo (vapor o presin) Durante diversos intervalos de
tiempo.
Calor seco 171 C Durante 1 hora, o 160 c
Durante 2 horas.
121 C Durante 16 horas.
Gas
Oxido de etileno 450 a 500 mg/litro a 55- 60 C
Liquido
Glutaraldehido Variable
Perxido de hidrogeno 6 a 30 %
Dixido cloro 6a8%
cido paracetico Variable
Desinfeccin:
Calor: ALTO
Calor Hmedo 75 a 100 C
Pasteurizacin con agua caliente
Liquido
Glutaraldehido Variable Alta a intermedia
Peroxido de hidrogeno 3a6% Alta a intermedia
Formaldehdo 1a8% Alta a baja
Dixido de cloro Variable Alta
cido paracetico Variable Alta
Productos clorados 500 a 5.000 mg de cloro
libro o disponible a litro Intermedia
Alcoholes
(etlico, isopropilico) 70 % Intermedia
Productos fenoliticos 0.5 a 3 % Intermedia o baja
Productos yodoforos 30 a 50 mg de yodo libre /litro Intermedia o baja
hasta 10,000 mg de yodo disponible
/ litro.
Productos de amonio cuaternario 0.1 a 0.2 % Baja
Antisepsia:
Alcoholes
(etlico, isopropilico) 70 %
Yodoforos 1 a 2 mg de yodo libre /litro;
1 a 2 % de yodo disponible
Clorhexidina 0. 75 a 4 %
Hexaclorofeno 1a3%
Paraclorometaxileno 0.5 a 4 %
AUTOCLAVE:

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La esterilizacin con calor hmedo debe realizarse a temperaturas superiores a 100 % para destruir
las endoesporas bacterianas; esto requiere la utilizacin de vapor saturado a presin. La esterilizacin
con valor en autoclave, aparato similar a una olla de presin especial. El desarrollo del autoclave que
fue creado por Chamberland, en 1884, estimul enormemente el progreso de la microbiologa. Se
hierve agua para producir vapor, que pasa a travs de una <<camisa>>al interior de la cmara del
autoclave. Se expulsa el aire que inicialmente se encuentra en la cmara hasta que este quede llena
de vapor saturado y se cierran las salidas. El vapor saturado y caliente continua entrando en la
cmara hasta que se alcanza la temperatura y presin deseada, normalmente, 121C y 6.8 Kg ( 15
Libras) de presin. A esta temperatura, el vapor saturado destruye todas las clulas vegetativas y
endosporas en volmenes pequeo de liquido, entre 10 y 12 minutos. El procedimiento se contina
durante 15 minutos para permitir un margen de seguridad siempre y cuando sea esterilizacin de
medios de cultivo, pero si son desechos de medios de cultivo con bacterias el tiempo ser de 20 a 30
minutos.
PROCEDIMIENTO (METODO)
El uso adecuado de la autoclave se realiza:

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1. Se conecta la autoclave.
2. Se agrega agua dentro del cilindro hasta la marca que indica la columna del nivel del
agua.
3. Se introduce el material a esterilizar (en recipiente).
4. Se cierra la autoclave en forma de cruz con las llaves de mariposa (sin aplicar ninguna
fuerza).
5. Checa que el manmetro nos indique cero y que la vlvula de escape de aire se
encuentre abierta.
6. Encienda, mediante el termostato colocado en el nivel mximo.
7. Cuando el aire sea constante en la vlvula de aire, se cierra (para aplicar el vapor
saturado).
8. Al marcar el manmetro 15 libras de presin se controla con el termostato durante 15

minutos (temperatura de 121 C); este punto si es esterilizacin de medios de cultivo ser
lo adecuado a 121 C; 15 libras de presin durante 15 minutos; pero o si es para
desinactivacion de microorganismos ser:121C, 15 libras de presin durante de 20 a 30
minutos.
9. Concluido este tiempo se apaga el autoclave y se deja enfriar hasta que el manmetro
llegue a cero. (Nunca colocar lienzos con agua; o agregar agua al aparato; esto
ocasionara que la esterilizacin no sea confiable)
Abrir las llaves o las mariposas de cierre hermtico en la misma forma de cerrarla (en forma de
cruz). Se saca el material ya esterilizado y se drena el agua.
CUIDADOS DEL AUTOCLAVE
1. Dejar que tome la autoclave a temperatura ambiente.
2. Abrir la llave que se encuentra en la parte inferior del aparato es la vlvula de drenaje de
esta manera no tendera agua.
3. Quitar el recipiente de esterilizacin.
4. Limpiar y secar la autoclave con un pao (jerga) seco. Evitando que el autoclave se
oxide.
5. Dejar abierto la autoclave por lo menos 8 horas.
REPORTE:
Definir los siguientes trminos y citar ejemplos de cada uno de ellos.

Esterilizacin

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Desinfeccin
Antisepsia
Germicida
Esporicida
PRACTICA No.4
DIVERSOS METODOS DE ESTERILIZACION
PARA MATERIALES BACTERIOLOGICOS
OBJETIVO:
Conocer y aplicar los mtodos de esterilizacin adecuados para cada tipo de material bacteriolgico,
tanto para el uso en la experimentacin como para el material de desecho.
I MARCO TEORICO:
La esterilizacin se logra por un proceso que suprime completamente o destruye todos los organismos
vivos encima o dentro de un objeto. Cualquier proceso destinado a esterilizar ha de ser adecuado
tambin para destruir todo tipo de esporas. Para este fin suelen utilizarse diversos mtodos a base de
calor; aunque en la actualidad es posible disponer de ciertos agentes qumicos como el oxido de
etileno y la beta propiolactona, gases o vapores germicidas capaces de destruir las esporas
bacterianas, que estn sustituyendo el calor en algunas aplicaciones selectivas.
Si se utiliza calor para esterilizacin, puede ser calor seco como se aplica en un horno, o calor
hmedo mediante vapor de agua.
La susceptibilidad de los microorganismos al calor hmedo es variable, pero a una temperatura similar
a la lograda con vapor saturado a 15 libras de presin (en autoclave: 121 C, durante 15 a 20 min.) es
eficaz contra grmenes formadores de esporas. Si en lugar de vapor se emplea el horno (calor seco),
hay que utilizar una temperatura mucho ms elevado por ms tiempo (165 C durante 2 horas). Los
virus de la hepatitis pueden sobrevivir a la ebullicin, pero no al autoclave o al calentamiento en horno.
Inversamente, algunos grmenes patgenos que no forman esporas, como los bacilos diftricos, son
sensibles a temperaturas tan bajas como de 55 C durante 10 min. La tcnica de pasteurizacin (63
C durante 30 min.) se basa en que la mayora de los microorganismos que provocan epidemias y que
contaminan la leche, no forman esporas y que son destruidos con dicha exposicin.
II. METODOS.
1.- ESTERILIZACIN DE CAJAS PETRI PARA CULTIVO.
Las cajas de Petri son instrumentos de vidrio en que se preparan los medios de cultivo slidos para el
aislamiento la reproduccin de un agente etiolgico en particular, es necesario debidamente
esterilizadas. Es conveniente mencionar que actualmente se dispone en el comercio de cajas de
plstico estril, lo que representa cierta comodidad para el analista aunque a un costo ms elevado.

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MATERIAL Y EQUIPO:
Cajas de Petri de vidrio.
Horno o autoclave.
Papel grueso para envoltura.
Cinta testigo.
METODO:
1. Lavar y secar perfectamente las cajas de Petri.
2. Cortar hojas de papel para envoltura (estraza, manila o aluminio) en proporcin de tres
veces el dimetro de la caja para lo largo y dos veces para el ancho.
3. Ensamblar cada caja y colocarla sobre una hoja de papel para envoltura. No colocar cinta
o etiquetas adhesivas directamente sobre el vidrio.
4. Envolver la caja, para lo cual; levantar primero los extremos laterales largas de la hoja,
unirlos, hacer dos dobleces de un centmetro aproximadamente. Despus doblar los
extremos hacia adentro para formar puntas en ambos lados. Doblarlos hacia abajo.
Sujetarlos con un trozo de cinta testigo.
5. Rotular sobre la envoltura con: fecha, equipo y escuela.
6. Llevarlas a esterilizar al autoclave o al horno.Para el primer caso, someterlas a 15 libras

de presin durante 20 min. Para el segundo caso, a 160 C durante 90 min.
7. Al trmino de este tiempo, dejar enfriar el horno o la autoclave. Retirar las cajas.
8. Dejar enfriarlas completamente. Se puede disponer de ellas de inmediato o bien se

pueden almacenar en refrigeracin o a temperatura ambiente en un lugar seco y donde
no exista riesgo de romperse la envoltura.
2. ESTERILIZACION DE CAJAS DE PETRI CON CULTIVO.

Siempre que una caja o placa contiene medio de cultivo inoculado que ya se termin de analizar
deber estrelizarse antes de proceder a lavarla. El mtodo ms indicado para ello es el de la
autoclave, nunca por calor seco.
MATERIAL Y EQUIPO:
Cajas de Petri inoculada con bacterias.
Horno o autoclave.
Papel grueso para envoltura.
Cinta testigo.
METODO:
1. Preparar el autoclave.
2. Retirar cualquier tipo de etiquetas adhesivas que se encuentran pegadas a la caja de

Petri.
3. Envolver cada caja en una hoja para envoltura, teniendo cuidado de que sta quede
en posicin derecha, no invertida, para que el medio de cultivo no se derrame al
calentarse.
4. Rotular la envoltura con el nmero de equipo.

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5. Llevarlas al autoclave. Tener cuidado de no colocarlas en posicin invertida ni de lado.
6. Esterilizar a 15 Libras de presin durante 30 min.
7. Finalizado este tiempo, dejar que se enfre gradualmente el autoclave.
8. Retirar las cajas. Esperar a que se enfren.
9. Quitar la envoltura. Desechar en la bolsa roja RPI el medio de cultivo. Nunca se

derramar al drenaje.
10. Lavar con detergentes.
11. Secar con un lienzo de algodn o en la estufa.
12. Ensamblar cada caja teniendo cuidado de que correspondan exactamente la base y la
tapa.
13. En estas condiciones, las cajas estn listas para esterilizarse nuevamente y usarse
con nuevos medios de cultivo o bien para devolverlas al almacn.
3. ESTERILIZACION DE MEDIOS DE CULTIVO.

Como ya se ha mencionado, no todos los medios de cultivo se esterilizan por el mismo mtodo;
recordar que, por ejemplo el calor no es recomendable para los casos en que se trabaja con
sustancias termolbiles; por tanto, se debe consultar siempre que se vaya a hidratar un medio,
con las indicaciones del envase en que vienen contenidos.
A continuacin se mencionaran los mtodos generales para la preparacin de medios de cultivo
que requieren esterilizarse al autoclave. En caso de que las especificaciones del medio de cultivo
indiquen la aplicacin de un proceso distinto del autoclave (por ejemplo filtracin, ultra
centrifugacin, etc.) se recomienda consultar las tcnicas apropiadas para dicho fin.
A). ESTERILIZACION DE MEDIOS EN MATRAZ.

Este mtodo es recomendable para cuando el volumen de medio de cultivo a preparar no es muy
grande (alrededor de 50 mL), de tal manera que se podr verter directamente del matraz a cajas
de Petri estriles o a algn otro recipiente con facilidad, sin tener que efectuar maniobras
riesgosas.

Frasco de medio de cultivo. Autoclave.
Matraz Erlenmeyer. Balanza granataria.
Probeta de 100 mL. Incubadora a 37 C.
Agitador de vidrio de 25 cm. Mechero.
Pinzas de tenaza.
METODO:
1. Pesar la cantidad necesaria del medio de cultivo en polvo, segn la dosificacin indicada
en el frasco.
2. Medir en una probeta el volumen de agua destilada necesaria para la cantidad del medio
que se ha pesado.
3. Vaciar el agua destilada a un matraz erlenmeyer de capacidad adecuada.

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4. Rotular la envoltura con el nmero de equipo.
5. Agitar con un agitador de vidrio hasta obtener una suspensin homognea.
6. Calentar lentamente hasta que el medio se disuelva por completo. Una disolucin
completa es cuando el medio en vez de verse opaco se ve cristalino a contra luz.
7. Tapar la boca del matraz con un tapn del algodn compacto con una gasa y cubrirlo con
un capuchn de papel aluminio que llegue hasta cuello del matraz.
8. Llevar a la autoclave que ya estar dispuesta para usarse como se ha indicado.
9. Esterilizar bajo las condiciones de presin y temperatura indicadas para cada medio.
10. Dejar enfriar el autoclave y retirar el o los matraces que contienen el medio de cultivo.
11. a) El medio de cultivo puede almacenarse en el matraz en que se prepar. Dejar enfriar
hasta la solidificacin a temperatura ambiente. b) El medio de cultivo puede distribuirse
por tanteo a cajas Petri o a tubos previamente esterilizados; en cuyo caso debe de
hacerse en caliente lo ms rpido posible a fin de evitar la formacin de grumos o la
solidificacin total antes de destruirse adecuadamente. Tmense rodas las medidas
pertinentes de esterilizacin en cualquier maniobra con material de cultivo.
12. En ambos casos, someter los materiales a la prueba de la esterilizacin o (control de

calidad), que consiste en llevar a la incubadora a 37C durante 24 horas. Rotular con
etiquetas adhesivas con nombre del medio de cultivo, nmero de equipo, escuela y fecha.
Al da siguiente:
13. Revisar el material de la incubadora. Desechar el material que se muestre signos de

contaminacin. Conservar el material que s se mantiene estril.
14. Disponer de los medio de cultivo en el experimento requerido o bien almacenarlos en el

refrigerador debidamente etiquetados y sellados hasta el momento de uso y anotar la
fecha de caducidad.
ESTERILIZACION DE MEDIOS DE CULTIVO EN TUBOS.
Este mtodo se habr de utilizar cuando:
a).- No sea estudio de la morfologa de las colonias un carcter determinante, sino que sea de
ms importancia estudiar sus reacciones metablicas, como es el caso de las reacciones
bioqumicas para Enterobacterias.
b).- Tambin para conservar microorganismos en medios lquidos o slidos inclinados por tiempos
relativamente grandes, ya que en estas condiciones la deshidracin es ms lenta.
c).- Asimismo, este mtodo ofrece una buena alternativa para cuando se habrn de preparar
grandes volmenes de agares que se tendrn que vaciar a placas y cuya manipulacin sea difcil.
d).-Se preparan medios lquidos o caldos.
De lo anterior se derivan dos variantes de este mtodo: Preparacin de medios lquidos (caldos) y
preparacin de agares; que a continuacin se describen.
PREPARACION DE CALDOS.

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1. Disponer el material necesario, cuidando que los tubos, matraces y pipetas estn
perfectamente limpios y secos.
2. Pesar la cantidad necesaria del medio de cultivo para el volumen que se requiera,
siguiendo las indicaciones de la etiqueta del envase.
3. Medir en la probeta el volumen requerido de agua destilada y pasarlo a un matraz

erlenmeyer.
4. Vaciar el medio de cultivo en polvo al agua contenido en el matraz.
5. Mezclar, agitar, calentar, hasta obtener una disolucin completa del medio, siguiendo
las indicaciones de la etiqueta del frasco reactivo. Una disolucin correcta es cuando
el medio vuelve cristalino.
6. En caliente, pasar el volumen requerido para cada tubo, midiendo el medio por
comparacin con un blanco de agua. No se recomienda medir los medios con pipetas.
7. Tapar cada uno de los tubos con tapones compactos de algodn o con tapones
especiales (de acero inoxidable o de PVC) para tubos de cultivos, en cuyo caso no es
necesario el tapn de algodn.
8. Roturar en los capuchones con: nombre del medio, numero de equipo, fecha, escuela.
9. Colocar los tubos en canastillas de mallas de alambre propias para autoclave, en

posicin vertical.
10. Llevar el autoclave.
11. Esterilizar segn las especificaciones del medio de cultivo.
12. Al trmino de la esterilizacin, dejar que los tubos se enfren un poco. Retirar de la
autoclave.
13. Dejar enfriar a temperatura ambiente y llevarlos a la incubadora a 37C durante 24

horas, para someterlos a la prueba de la esterilidad. Mantenerlos siempre en posicin
vertical.
Al da siguiente:
14. Revisar cada uno de los tubos. Descartar los que presenten desarrollo bacteriano.
15. Conservar los medios estriles. Si no se usarn de inmediato, almacenarlos en

refrigeracin hasta el momento de su uso. Mantenerlos en gradilla siempre en
posicin vertical.
PREPARACION DE MEDIOS DE AGAR EN TUBO.

1. Disponer el material necesario, cuidando que los tubos, matraces y pipetas estn
perfectamente limpios y secos.
2. Pesar la cantidad necesaria del medio de cultivo en polvo para el volumen que se
requiera, siguiendo las indicaciones de la etiqueta del envase.

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3. Medir con la pipeta el volumen requerido de agua destilada y pasarlo a un matraz

erlenmeyer.
4. Vaciar el medio de cultivo en polvo al agua contenida en el matraz.

5. Mezclar, agitar, calentar, hasta obtener una disolucin completa del medio, siguiendo
las indicaciones de la etiqueta del frasco reactivo. Una disolucin correcta es cuando
el medio se vuelve cristalino.
Es importante que el medio est bien disuelto, de lo contrario la concentracin de agar

podra ser diferente en cada tubo y por lo tanto no tendrn la misma consistencia.
6. En caliente, pasar el volumen requerido para cada tubo, midiendo el medio por
comparacin con un blanco de agua. No se deben usar pipetas para medir los medios
de agar.
7. Tapar cada uno de los tubos con tapones compactos de algodn o con tapones
especiales (de acero inoxidable o de PVC) para tubos de cultivo, en cuyo caso no es
necesario le tapn de algodn.
8. Si se tapan con algodn, se debern cubrir stos con capuchones de papel grueso o
aluminio uno por uno. Preguntar por la tcnica de doblado para los capuchones.
9. Rotular en los capuchones con: nombre del medio, nmero de equipo, fecha, escuela.
10. Colocar los tubos en la canastilla de malla de alambre propio para el autoclave, en
posicin vertical.
11. Llevar al autoclave, esterilizar segn las especificaciones del medio de cultivo.
12. Al trmino de la esterilizacin, dejar que los tubos se enfren un poco. Retirar del
autoclave.
13. Si es necesario que el agar proporcione una superficie inclinada, en caliente se

colocan los tubos sobre la mesa de trabajo ligeramente inclinado, cuidando que el
medio no toque el tapn de algodn. No mover. Dejar enfriar a temperatura ambiente
hasta que solidifiquen. El medio se volver opaco.
14. Llevarlos a la incubadora a 37 C durante 24 horas para someterlos a prueba de

esterilidad. Mantenerlos en posicin vertical.
Al da siguiente:
15. Revisar cada uno de los tubos, descartar los que presenten desarrollo bacteriano.
16. Conservar los medios estriles. Si no se van a usar de inmediato mantenerlos en

refrigeracin hasta el momento de su uso.
III METODOS DE ESTERILIZACION DE DIVERSOS MATERIALES BIOLOGICOS.
En virtud de que cada tipo de material biolgico requiere de mtodos de esterilizacin especiales,
diferentes autoclaves, algunos de estos materiales y las condiciones especiales de esterilizacin.

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SISTEMA DE ESTERILIZACION DEL MATERIAL DE LABORATORIO

RECIPIENTE MATERIAL METODO
Pipetas o placas Petri limpias Para esterilizacin conjunta: Estufa

cajas (1) de cobre o aluminio
con tapas imbricadas (2),
individual: envoltura de papel
kraf
Tubos de ensaye o de Gradilla de aluminio Estufa
centrifuga, de vidrio con
tapones de metal, algodn, o
laminas metlicas
Matraces de vidrio, vasos de Castillos de alambre Estufa
precipitados y recipientes
cerrados con tapones
metlicos o laminas metlicas
Jeringuillas de vidrio (3) Tubos de vidrio con tapones Estufa
de algodn; tubos de aluminio.
Frascos a vacos con tapones Cestillos de alambres Autoclave
de rosca y junto de goma (4)
1. Las cajas para la esterilizacin de las pipetas deben tener algodn en el fondo, para evitar la
rotura de los picos.
2. Para evitar la contaminacin por la entrada de aire.
3. Las soldaduras de metal y vidrio pueden fundirse incluso a 115 C en el autoclave.

4. O por esterilizacin por separado de frasco y tapones la goma de silicn soporta el calor
seco.

Pipetas contaminadas Recipiente cilndrico de Hipoclorito(10);
vidrio(9) lisol; autoclave
Porta-objetos contaminados;
fragmentos de vidrio, algodn, Recipiente cilndrico de vidrio. Lisol (10)
etc.
Tubos de centrifuga de nylon,
nitratos de clulas (11, limpios
y otros plsticos que no -------------------------------- Radiacin ultravioleta (12)
resisten el calentamiento.
Tubos de centrifuga de nylon,
nitratos de clulas (11, limpios
y otros plsticos que no -------------------------------- Lisol; HCl
resisten el calentamiento.
Propileno y otros plsticos que
resistente el calentamiento -------------------------------- Autoclave
Aire -------------------------------- Calor ,filtracin, irradiacin

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9.- De propileno goma de vidrio. Algunos recipientes de goma soportan muchas esterilizaciones.
Los recipientes de vidrio para las pipetas deben en el fondo fibra de vidrio para evitar que se
rompan los picos. El algodn no deben emplearse, pues reduce el Hipoclorito.
10.- Los objetos a esterilizar tiene que sumergirse por completo en hipoclorito, durante 12 horas,
por lo menos.
11.- Los tubos de nitratos de celulosa pueden explotar si se esterilizan al autoclave (Silver, 1963)
12.- La luz ultravioleta no atraviesa el vidrio, el plstico, o las soluciones de protena o de base de
los cidos nucleicos. Por tanto, los objetos tienen que se expuestos a la luz directa de la lmpara y
almacenados despus en recipientes estriles.

Soportes para los filtros en los Envoltura de papel kraf Autoclave.
frascos. o papel de estraza
Los corrientes medios de Frascos con tapn de rosca (5) Autoclave.
cultivo slido y lquidos, tubos cerrados, ampolletas
soluciones salinas, azucares
etc.
Soluciones termolabiles Frascos con tapn de rosca (5) Tindalizacin; filtracin;
tubos cerrados, ampolletas Desinfectante voltil
Suero Frasco de tapn de rosca (5) Desinfectante voltil; Filtracin.
tubos cerrados, ampolletas.
Medios de cultivo con suero. Frascos con tapn.

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PRACTICA 5
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO SINTTICOS:
NUTRICIN DE LAS BACTERIAS
OBJETIVO:
Conocer tanto los factores de crecimiento como los factores ambientales de crecimiento que
requieren las bacterias para su cultivo in Vitro mediante la preparacin d medios de cultivo sintticos.
I.- MARCO TEORICO.
Para sintetizar los diversos compuestos de su protoplasma y por lo tanto crecer y

multiplicarse, las bacterias han de disponer de un medio que contenga los compuestos qumicos
adecuados para sostener las reacciones biosinteticas necesarias. As, estas sustancias qumicas se
consideran como necesidades nutritivas, las cuales se clasifican en:
1.- COMPUESTOS NECESARIOS COMO FUENTE DE ENERGIA
En las bacterias no foto sintetizadora, el ATP se genera por medio de reacciones de

oxidorreduccin, las cuales pueden considerarse como reacciones medias de donadores y receptores
de hidrgeno. Las sustancias que desempean estas funciones son de naturaleza diferente,
dependiendo del tipo de respiracin: aerbica, anaerbica o fermentacin; como por ejemplo el NH3,
el fumarato, el cido lctico, el oxigeno y el azufre.
2.- COMPUESTOS NECESARIOS PARA LA FORMACIN DE CELULAS.
Estos deben ser de dos tipos: fuentes de carbono y fuentes de nitrgeno.
a).- Fuentes de Carbono:
Necesario para la sntesis de numerosos compuestos orgnicos que constituyen el

protoplasma. Siendo el CO2 la principal fuente de carbono.
b).- Fuentes de Nitrgeno:
Indispensable para la formacin exclusiva de nuevas clulas. Siendo la principal fuente de

este elemento en la mayora de las bacterias el NH3, el cual es introducido a las molculas orgnicas
mediante una reaccin catalizada por la deshidroginasa glutamica.
3.- COMPUESTOS ORGANICOS.

Necesarios en su forma intacta como factores de crecimiento. Entre ellos estn las vitaminas
del complejo B, tiamina. Ac. Nicotnico, pirodixina, biotina. Estos suministran enzimas necesarias que
las bacterias son incapaces de suministrar.
4.- COMPUESTOS INORGNICOS.

Necesarios Para el metabolismo. Ejemplos de estos son: Cloruro de Sodio, Agua, Bixido de
Carbono, Azufre, Hierro, Hidrgeno. Algunos de estos nutrientes son necesarios en cantidades tan
pequeas que se denominan oligoelementos, siendo algunos de ellos el Cinc, Manganeso, Calcio y
Cobalto. Estos elementos son asimilados por los microorganismos en forma inica.
Cada uno de estos elementos es sintetizado por una sucesin discreta de reacciones
enzimticas y cada enzima se produce bajo el control de un gen especfico. Cuando el
microorganismo experimenta una mutacin gentica, la cadena se rompe y el producto final no se

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forma ms. El organismo debe entonces obtener ese compuesto del medio y entonces se considerar
como un factor de crecimiento para el organismo afectado.
Adems, independientemente de estos factores nutricionales que la clula elaborar o
recibir, existen tambin factores fsicos y qumicos que se le debern proporcionar a fin de que pueda
multiplicarse, los cuales se consideran como factores ambientales que afectan el crecimiento celular
bacteriano in Vitro, los cuales son:
CONCENTRACION DE IONES HIDRGENO O pH.
Los microorganismos tienen un rango de pH bastante limitado y debe determinarse

empricamente el pH ptimo para cada especie. Las bacterias en su mayora crecen entre rangos de
6.5 a 7.5 aunque existen algunas como Thiobacillus thioxidans que necesitan un pH de 2 y otras
que requieren un rango de 8.5 como Alcaligenes faecalis.
TEMPERATURA.
Las especies bacterianas varan ampliamente en cuanto a sus condiciones trmicas optimas
para su desarrollo, las cuales pueden agruparse en tres categoras: Psicrofilas, que son las que
crecen mejor a temperaturas bajas (15 a 20 C); mesofilas, las que se desarrollan mejor a
temperaturas de 30 a 37 C y termofilas, cuya temperatura optima para su desarrollo es de 50 a 60 C.
La mayora de las especies son mesofilas, ya que este rango comprende la temperatura
ptima para los organismos de vida libre (huspedes) y para las formas parsitas.
HUMEDAD.
La humedad abundante es esencial para la multiplicacin de las clulas vivas pero no
para esporas, quistes y clulas durmientes, esto es por que viven pero no se reproducen.
ATMSFERA.
Los microorganismos de acuerdo al tipo de respiracin que realizan pueden requerir o
no del oxigeno del aire, por lo que pueden ser aerobios estrictos, facultativos y anaerobios estrictos.
LUZ.
La mayora de las bacterias se desarrollan mejor en ausencia de esta. La luz solar con
su componente ultravioleta puede incluso ser letal para los microorganismos
Para realizar estudios sobre el metabolismo microbiano, in Vitro generalmente es necesario

preparar medios de cultivo sintticos en los cuales las caractersticas y la concentracin de cada uno
de los ingredientes son exactamente conocidas y se han calculado considerando las necesidades
nutricionales y ambientales de los microorganismos que se desea cultivar; ya que es lgico penar que
los medios naturales son los tejidos infectados del husped y que los microorganismos causales de la
enfermedad crecern mejor en los medios de cultivo sintticos que se asemejan mas al medio
ambiente proporcionado por los tejidos del husped.
CLASIFICACION Y SELECCIN DE MEDIOS DE CULTIVO.
En el laboratorio de Microbiologa se emplean diferentes tipos de medios, debe tenerse cuidado de

emplear el medio mas adecuado para el asilamiento e identificacin del microorganismo que sea el
objeto de estudio.
En general, los medios de cultivo sintticos se agrupan en dos categoras; la primera considera es
estado fsico en que se somete al inoculo microbiano y la segunda considera su contenido de
nutrientes y factores de crecimiento en las dosis o formulacin final.
Considerando el estado fsico de un medio de cultivo cuando esta listo para ser inoculado, estos se
clasifican en:

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Medios de cultivos slidos o medios de agar.

Medios de cultivos lquidos o caldos de cultivo.
Medios de cultivo semislidos.
a).- Medios de cultivo slidos:

Estos medios contienen aparte de los nutrientes una sustancia que se extrae de una especie de alga
marina llamada agar, en una concentracin que varia segn la dosificacin de nutrientes; as, un
medio que contiene agar es slido desde los 4 C y funde a 98 C. De este modo, estos se identifican
mediante el termino agar seguido de un nombre especifico; por ejemplo: Agar nutritivo, Agar SS,
agar manitol, etc.
Las ventajas de utilizar medios slidos estriban en que, como se obtiene una superficie de contacto
relativamente amplia y compacta como para que los microorganismos no se difundan ni se mezclen,
esto permite que cada germen que ha sido inoculado se nutra y se multiplique para formar
conglomerados de bacterias que pueden verse a simple vista y que son llamados colonias.
Asimismo, en este tipo de medios, es posible detectar algunas caractersticas metablicas
taxonmicas tales como las hemlisis en sus diversos grados y reacciones bioqumicas.
Tambin el utilizar un medio slido permite al investigador aplicar tcnicas especficas de inoculacin y
darse cuenta a simple vista si el cultivo ha sido o no contaminado con grmenes extraos a la muestra
que es objeto de estudio.
Otra ventaja muy importante es que en este tipo de medios es posible determinar no solo la
morfologa microbiana, si no tambin el recuento de colonias o recuento de grmenes.
b).- Medios de cultivo lquidos:

En estos medios solamente se encuentran los factores de crecimiento en solucin acuosa, no
contienen agar, por lo que las bacterias crecen sin formar colonias, ya que al irse multiplicando van
quedando suspendidas en el seno del liquido. Son referidos comnmente con el trmino de caldos
seguido de un nombre especfico, por ejemplo: caldo nutritivo, caldo destrozado. Caldo de Stuart, etc.
Las ventajas de estos medios son muy diversas, por ejemplo, son tiles como medio de transporte o
de conservacin de muestras por periodos de tiempo largos, ya que como estos medios siempre estn
contenidos en tubos de ensaye y tapados hermticamente, la desecacin es lenta. Tambin son tiles
para estudiar caractersticas metablicas de ciertos grupos bacterianos, como por ejemplo, pruebas
de fermentacin en Entero bacterias
c).- Medios de cultivo semislidos:

Son medios de cultivo que estn adicionados con agar o gelosa en una concentracin menor que la
de los medios slidos o agares, aproximadamente 6 g/lt, razn por la que no solidifican
completamente ni proporcionan una superficie slida compacta. Estos medios vienen referidos con el
termino mdium seguido a antecedido por un nombre especifico, por ejemplo SIM mdium.
Por lo que respecta a la clasificacin de medios de acuerdo a su contenido de nutrientes o de factores

de crecimiento, existe en el comercio una amplia gama de medios de cultivo deshidratados, de los
cuales se puede disponer si se conocen los requerimientos nutricionales y el tipo de material que se
desea cultivar. Debe tenerse cuidado de emplear el medio mas adecuado para el aislamiento o
identificacin de las bacterias motivo de estudio. As, los medios se clasifican en cuatro grupos
principales, que son:
Medios simples o bsales.
Medios enriquecidos.
Medios selectivos o especiales.
Medios para pruebas bioqumicas.

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a).- Medios simples o bsales:

Estos medios son de uso general en el laboratorio, para grmenes no exigentes, entre los cuales
estn los siguientes:
Agua peptonada: Se emplea como solucin de peptona al 1 0 2 % y suministra metabolitos

nitrogenados.
Agar nutritivo: Consiste en extractos de carne, peptona, agar y agua. Es de uso general y se
emplea a menudo como base en la elaboracin de medios ms complejos.
Caldo nutritivo: Es un extracto acuoso de carne con peptona al 1% adicionado con Cloruro
de Sodio. Su uso principal en el laboratorio es de almacenaje de especimenes.
b).- Medios enriquecidos:

Estos medios estn adicionados con complementos para crecer, necesarios para microorganismos
patgenos importantes. Algunos de estos complementos pueden ser: sangre fresca desfibrinada,
suero, huevo y glicerol. Entre los medios enriquecidos mas usados se encuentran los siguientes:
Agar sangre (o gelosa sangre): Es un medio base al que se le adiciona un 10 % de sangre

desfibrinada estril, el cual debe tenerse a 45 C aproximadamente y vaciarse directamente a
cajas de Petri. Este medio se recomienda para identificar bacterias hemolticas como el
genero Streptococcus.
Agar chocolate: Es el medio base para agar sangre, solo que es llevado a 100 C antes de
vaciarse a cajas de Petri, durante un minuto en bao Maria hirviendo, con lo que ocurre la
hemlisis y se vuelve un mejor sustrato para Haemophilus sp.
Medio Leffler: Es un medio sumamente enriquecido con suero, de utilidad para el cultivo de
bacterias del genero Corynebacterium.
Medio de Bordet-Gengou: Es un medio complejo que contiene patata, glicerol y sangre, se

emplea en el aislamiento y cultivo de Bordetella pertusis.
Medio de Robertson: Este medio contienen adems de la sustancia basal, carne cocida,
peptona y cloruro de sodio. Es til para el cultivo de anaerobios y para mantener algunos
cultivos patrn.
c).- Medios de cultivo selectivos:

Son medios que deben su importancia al hecho de que contienen sustancias que impiden el desarrollo
de la flora bacteriana no patgena, permitiendo el crecimiento solo de los grmenes patgenos para
los que este formulado. Para tal objetivo se emplean diferentes sustancias como por ejemplo, sales
biliares que impiden el desarrollo de microorganismos no entricos; el verde malaquita, que impide el
crecimiento de bacterias que no pertenecen a las Mico bacterias, reactivos que proporcionan un pH
cido, con lo que se permite el desarrollo de los hongos pero se inhibe el de las bacterias, etc.
Tambin en algunos de estos medios se incorporan sustancias que estimulan el desarrollo de
bacterias especficas.
Algunos de estos medios son:
Agar McConckey: A este medio se le han incorporado sales biliares, ya que es selectivo para
bacilos entricos, adems de los nutrientes bsicos contienen lactosa y rojo neutro como
indicador de fermentacin.
Agar SS: El cual aparte de las sales biliares contienen verde brillante que inhibe a bacterias
coliformes y permite el crecimiento de Salmonella y Shigella
Agar Sabouroud: Es un medio de dextrosa y peptona con un pH ajustado a 5 o 5.5 con lo

que se favorece el desarrollo de los hongos e inhibe las bacterias.

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Medio de Lowenstein Jensen: Es u medio completo que Contiene varios fosfatos

minerales, sulfatos y citratos as como glicerol, almidn y huevo, sustratos necesarios
para el desarrollo de la familia de las Micobacterias. Adems se ha adicionado con verde
de malaquita como inhibidor de otros microorganismos.
Infusin de cerebro y corazn o BHI: Este es un medio lquido muy til, pues permite el
desarrollo de microorganismos delicados. Puede adicionarse con agar.
Agar soya tripticasa: En este medio la triptona y la peptona de soya permiten el desarrollo
de microorganismos delicados que requieren de suero.
Medio de Thayer-Martin: En este medio se han incorporado dos antibiticos, la polimixina y

la ristocetina, que inhiben el desarrollo de la mayora de los microorganismos, con excepcin
de las especies patgenas de Neisseria, gonococos y meningococos.
Adems de muchos otros medios de este tipo como el caldo de tetrationato, agar END, agar endo,
agar verde brillante, Biggy agar, etc.
d).- Medios para reacciones bioqumicas:

Su composicin generalmente consta de peptona enriquecida con un azcar al 1%. Se agrega un
indicador, por lo general rojo de fenol, para sealar la acidez producida por la fermentacin del azcar.
Tambin con estos medios puede observarse la formacin de gases en los medios lquidos si se
emplean tubos de Durham invertidos.
Los medios ms usados para las pruebas bioqumicas son los siguientes:
Agar citrato de Simmons: Contiene citrato de sodio como nica fuente de carbono y azul de
timol con indicador. Los microorganismos que pueden utilizar el citrato como fuente de
carbono se desarrollan bien y el indicador se vuelve azul. Los dems microorganismos no
crecen y el medio conserva su color verde.
SIM mdium o medio SIM: Este medio se utiliza para la valoracin de tres reacciones
bioqumicas:
o S: sulfuro de hidrgeno o 1 Para observar la produccin de este gas a partir de

tiosulfato. El medio contiene adems hierro ferroso que toma un color negro cuando
se produce el H2S.
o I: indol. Para observar la produccin de indol a partir de triptofano o de un aminocido

semejante. Esta prueba debe hacerse despus de valorar la movilidad y la produccin
da H2S, para lo cual es necesario agregar unas gotas de reactivo de Erlich o de
Kovacs a la superficie del medio entubado. En presencia de indol se produce un anillo
rojizo entre el medio y el reactivo.
o M: motilidad. La movilidad a travs del medio semislido se traduce por diseminacin
de la opacidad bacteriana a partir del trayecto de la picadura de inoculacin.
Agar Kligler: Se le ha incorporado a la sustancia nutritiva: lactosa, dextrosa, tiosulfato de

sodio y rojo de fenol como indicador. Sirve para valorar la fermentacin de estos dos azcares
y tambin para la produccin de sulfuro de hidrgeno.
Agar triple azcar: Semejante al agar Kligler, solo que se le ha adicionado un tercer
carbohidrato, la sacarosa.

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Caldo dextrosado PM: Es un medio compuesto por peptona fosfato de glucosa. Sirve para
efectuar la prueba del rojo de metilo. Al medio inoculado e incubado de 24 a 48 horas se le
agregan cuatro gotas de indicador rojo de metilo. Un color rojo indica una reaccin positiva
(cida).
Caldo dextrosado VP: Se utiliza para valorar la reaccin de Voges Proskauer (de las
pruebas IMVIC). Es un caldo idntico al anterior solo que vara en la reaccin final. Se aade
un mililitro de KOH al 10% al caldo inoculado e incubado. Se observa de cuando en cuando
las 24 horas siguientes. Un color rosa de eosina indica una reaccin positiva debida a la
produccin de acetilmetilcarbinol (CH3CO.CHOH.CH3) a partir de glucosa.
Se obtiene una reaccin ms rpida aadiendo huellas de creatinina al medio incubado ms 2.5
ml de NaOH al 40%. En este caso el color rosa aparece en pocos minutos.
Caldo urea: Contiene extractos de levadura, urea como sustrato, fosfatos y rojo de fenol. Es
til para la observacin de la produccin de ureasa por bacterias del gnero Proteus.
Gelatina: Se emplea este sustrato puro hidratado a una sola dosis apropiada, de tal manera
que solidifique a temperatura de incubacin (37C). Sirve para observar la licuacin de la
gelatina por accin de las gelatinasas bacterianas producidas por algunas enterobacterias.
Medios con descarboxilasa: Se logra una mejor diferenciacin de las enterobacterias

estudiando la actividad especfica de la descarboxilasa sobre una serie de cidos aminados,
como lisina, arginina y ornitina. Los medios contienen una base nutritiva, adems de glucosa,
el cido aminado del caso y azul de bromotimol como indicador. Si el cido aminado es
descarboxilado, el pH del medio se vuelve alcalino, a pesar de la fermentacin de la glucosa,
pues los productos de la descarboxilacin son siempre alcalinos. Sin embargo, si esto no
ocurre el medio permanece cido y conserva su color amarillo.
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO SINTETICOS
Todos los medios de cultivo que se mencionan en los prrafos anteriores son algunos de los que se
encuentran disponibles en el comercio de la industria qumica. Se proporcionan envasados en forma
deshidratada (en polvo) en frascos los cuales traen impreso en una etiqueta la composicin
aproximada en g/l de los nutrientes; la naturaleza o el tipo de microorganismos para el que se ha
sintetizado; el modo de preparacin hasta el momento de su uso; las condiciones de envase y
almacenaje y la dosificacin peso/volumen a la que deber de hidratarse para obtener un medio
adecuado
MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS.
Frasco reactivo de agar nutritivo Balanza granataria

Frasco reactivo de caldo nutritivo Autoclave
Agua destilada: 200 ml aprox. Incubadora a 37 C
Matraz Erlenmeyer 100 ml (1) Mechero Bunsen
Matraz Erlenmeyer 200 ml (i) Probeta de 100 ml (1)
Pinzas de tenaza para matraz Tubos de 16 x 150 (12)
Agitador de vidrio de 25 cm. de largo Gradilla para 12 tubos
Pinzas para tubo de ensaye Esptulas o cucharas
METODO.

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1. Disponer una serie de 4 tubos de 16x150 para contener cada uno 10 ml de caldo nutritivo.
2. Disponer una serie de 8 tubos de l6x150 para contener cada uno 10 ml de agar nutritivo.
3. Leer las indicaciones impresas en la etiqueta de cada frasco reactivo o el instructivo anexo
de cada medio de cultivo.
4. Determinar el volumen total que se requiere de cada medio de cultivo, segn el volumen
requerido para cada tubo y el nmero de tubos.
5. Calcular por regla de tres la cantidad de cada medio de cultivo en polvo deshidratado que
se requiere pesar para el volumen total requerido, en base a la dosificacin sealada en el
instructivo del frasco reactivo. Por lo general, la relacin peso/volumen est dada en g/l o
sea g/l000 ml.
6. Construir una cajita de papel doblado para cada medio y proceder a pesar la cantidad
requerida de cada medio de cultivo en polvo. Anotar en cada cajita el nombre del medio de
cultivo, la cantidad y el volumen.
7. Disponer de una balanza granataria, la cual puede ser de tipo convencional (de platillos) o
elctrica (de tipo digital). El manejo de ambos tipos de balanzas es sencillo pero diferente,
si no se saben emplear es conveniente recurrir al auxiliar del laboratorio o al profesor para
solicitar entrenamiento o instrucciones para el manejo de las mismas.
8. Colocar sobre el platillo de la balanza la cajita de papel doblado y pesarlo (esta tcnica se
refiere como tarar). Agregar con cuidado por medio de una esptula o cucharilla la
cantidad en gramos requerida del medio de cultivo en polvo.
9. Continuar la preparacin de cada medio de acuerdo a las instrucciones del frasco reactivo.
Generalmente consisten en: vaciar el polvo a un matraz erlenmeyer que contenga ya el
volumen exacto (se mide siempre con probeta, no con el matraz) de agua destilada
requerida para el total de tubos de ensaye de cada medio.
10. Disolver por agitacin el polvo en el agua. Calentar directamente a la flama con ayuda de
una pinza de tenaza o sobre una parilla elctrica, teniendo cuidado de que no se queme ni
derrame al empezar la ebullicin.
11. Distribuir el medio de cultivo ya hidratado a los tubos de ensaye. Medir por tanteo el
volumen requerido para cada tubo. No usar pipeta. Tapar cada uno de los tubos con
algodn compacto y cubrirlos con un capuchn de papel estraza.
12. Apartar de la serie de tubos con caldo nutritivo un tubo con medio de cultivo y dejarlo a
temperatura ambiente Etiquetar con nombre del medio de cultivo, fecha, equipo, escuela.
13. Apartar de la serie de tubos de agar nutritivo dos tubos con medio de cultivo. En caliente
colocar uno de ellos en posicin inclinada sobre la mesa de trabajo, el otro mantenerlo en
posicin vertical en una gradilla y dejarlos a temperatura ambiente hasta que solidifiquen.
Etiquetar.
14. Esterilizar por el mtodo que se indique. Por lo general, se procede con la autoclave a 15
lb. /pulg. durante 15 a 20 minutos segn el tipo de medio del cultivo.

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15. Retirar de la autoclave, continuar con el medio de cultivo en los tubos. Dejar enfriar a
temperatura ambiente. Etiquetar con nombre del medio de cultivo, fecha, equipo, escuela.
Marcarlos con la leyenda estril.
16. Someter a la prueba de esterilidad TODOS los tubos, tanto los que se esterilizaron como
los que no se sometieron a este proceso; la cual consiste en llevarlos a la incubadora 37
C durante 24 horas.
Al da siguiente:
17. Efectuar anlisis macroscpico de la serie de tubos con esterilizacin.
18. Efectuar anlisis macro y microscpico de la serie de tubos sin esterilizar.
19. Comparar ambos resultados.
20. Conservar los tubos que no manifiesten ningn tipo de contaminacin microbiana. Se
utilizarn en la siguiente prctica.
21. Los tubos que si presenten contaminacin microbiana, se debern esterilizar primero,
despus lavar y secar. Ver anexo de esterilizacin por autoclave
REPORTE.
Anotar la composicin de cada uno de los medios de cultivo preparados, as como el

mtodo de preparacin.
Anotar los clculos necesarios para pesar la cantidad necesaria de cada medio de cultivo
para el volumen requerido.
Representar con dibujos los procedimientos de preparacin de medios de cultivo,
distribucin en los tubos, esterilizacin y prueba de esterilidad.
Anotar los resultados obtenidos despus de la prueba de esterilidad con los tubos
sometidos a esterilizacin y con los que no se sometieron a este proceso.
Investigacin bibliogrfica sobre nutricin bacteriana y curva de crecimiento bacteriano.

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PRACTICA 6
METODOS DE INOCULACIN BACTERIANA EN TUBOS.
OBJETIVO:
Conocer los mtodos de aislamiento de las bacterias provenientes de diversas fuentes y

ensayar las tcnicas de inoculacin en tubo.
INTRODUCCIN.
La siembra, el aislamiento o la resiembre de un microorganismo requieren de tcnicas

adecuadas tanto para el propsito del cultivo como para la naturaleza y requerimientos del germen.
Por lo que es de gran importancia conocer las diversas al respecto y su aplicacin, a fin de saber
llevarlas a la prctica en los experimentos que lo ameriten.
1.- Inoculacin en medios inclinados.

2.- Inoculacin por picadura
3.- Inoculacin por emulsin
4.- Inoculacin por agitacin.
MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPO.
2 Agar nutritivo inclinado en tubo de 16 x 50 estriles.

4 Agar nutritivo vertical en tubo de 16 x 50 estriles.
2 Caldo nutritivo vertical en tubo de 16 x 150 estriles.
1 Agar nutritivo inclinado en tubo de 16 x 150 inoculado con cultivo puro.
1 Placa de cualquier medio con cultivo puro.
1 Gradilla para tubos de 16 x 150.
2 asas, una calibrada y una recta.
2 Mechero Bunsen
AL DIA SIGUIENTE:
4 Portaobjetos
4 Cubreobjetos
Equipo de Tincin (Tina, puente, asa, mechero, lmpara.)
Colorantes para Tincin de Gram. (Cristal Violeta, lugol, safranina, suero fisiolgico, alcohol-
cetona 70-30, piseta.
Microscopio.
Aceite de inmersin.
Papel seda.
NOTA: Por cada tipo de inoculacin se deber incubar un tubo testigo negativo.
1.- INOCULACIN EN MEDIOS INCLINADOS.
Este tipo de cultivo es empleado principalmente para el aislamiento o la resiembra de cepas

que pueden provenir de otro medio inclinado, de un medio en placa o de medios lquidos en tubo, ya
sea para su identificacin posterior o para base de cultivo.
METODO:

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1. Tmese las medidas de seguridad bsicas: uso de cubre bocas, recogerse el cabello
(mujeres), eliminar las corrientes de aire, disponer la flama del mechero cercana al rea
de siembre, disponer sobre la mesa de trabajo exclusivamente el material de cultivo, etc.
2. Si la muestra bacteriolgica (inculo) proviene de un tubo de cultivo, tomar con la mano

izquierda el tubo con cultivo y el tubo con medio estril.
3. Tomar con la mano derecha el asa calibrada de la misma manera que se sostiene un
lpiz.
4. La manipulacin de los tubos debe hacerse frente a la flama del mechero. Sin soltar ni el
asa ni los tubos, quitar el tapn del tubo que contiene el cultivo bacteriano, usando el dedo
meique de la mano derecha. As se sostiene el tapn hasta el trmino de la manipulacin
de este tubo. PRECAUCIN!, no depositar los tapones en ningn lado.
5. Flamear durante algunos segundos la boca del tubo y al mismo tiempo el asa hasta el rojo
vivo.
6. Introducir el asa al agar, enfriarla por contacto con un punto del agar que no presente
desarrollo de colonias.
7. Tomar con el asa calibrada un inoculo. PRECAUCIN!, no introducir el asa a la

profundidad del agar. No se trata de extraer trozos del medio, si no del material
bacteriolgico que ha crecido en la superficie, el cual es de consistencia blanda, suave o
cremosa.
NOTA: Un inoculo suficiente es tan solo la pequea porcin de colonias que se adhieren al
asa al primer contacto.
8. Retirar el asa. Se contina sosteniendo con la mano derecha. Flamear la boca del tubo.
Colocar el tapn. PRECAUCIN!, evitar el contacto de la mano con la boca de los tubos
despus de flamearlos.
9. Sin soltar el asa con el inoculo, colocar el tubo con cultivo en la gradilla. Manipular ahora
el tubo estril para inocular.
10. Sin soltar el asa, quitar el tapn del tubo con agar nutritivo estril usando el dedo meique
de la mano derecha.
11. Flamear la boca del tubo durante algunos segundos.
12. Introducir el asa con el inoculo hasta el fondo de la superficie inclinada y tocando
suavemente la superficie del medio, trazar una estra (zig-zag) abierta a lo largo de la
superficie.
13. Retirar el asa sin soltarla, flamear la boca del tubo recin inoculado. Colocarle un tapn.
PRECAUCIN!
14. Esterilizar al rojo vivo el asa puesto que contiene residuos de material bacteriolgico.
Depositarla sobre la mesa.
15. Colocar al tubo recin sembrado un capuchn o gorrito de papel. Rotular con: nombre del
medio de cultivo, numero de equipo, fecha, escuela y con el numero uno.

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16. Colocar este tubo en una gradilla y llevarlo a la incubadora a 37 C junto con los otros tres
tubos de los procedimientos siguientes recin inoculados. Incubarlos durante 24 horas.
2.- INOCULACIN POR PICADURA.
Para este mtodo se utilizan medios slidos contenidos en tubo de cultivo endurecido en
posicin vertical, usndose asa recta para inocular. El mtodo es empleado para conocer la motilidad
de las bacterias, para conservar cultivos patrn y para algunas otras pruebas bioqumicas de
Enterobacterias.
METODO:
1. Proceder repitiendo exactamente los puntos del 1 al 11 del caso anterior, con la nica
diferencia de que el asa para inocular no es calibrada si no recta.
12. Introducir el asa con el inculo al centro del agar hasta la profundidad que permita el largo
del asa. Tener cuidado de que la trayectoria de la inoculacin de efectu en lnea recta.
13. Retirar el asa teniendo cuidado de que el trayecto de salida se el mismo que el de
entrada, es decir, que quede una sola picadura.
14. Flamear la boca del tubo recin inoculado. Colocarle el tapn. PRECAUCIN!
15. Proceder de la misma manera que para el mtodo del tubo inclinado repitiendo
exactamente los puntos 14, 15 y 16.
3.- INOCULACIN POR EMULSIN.
Este mtodo es adecuado para la inoculacin de medios de cultivo lquidos. Se usa para
efectuar pruebas bioqumicas de Enterobacterias y en algunas ocasiones para conservar muestras
bacteriolgicas por periodos de tiempo grandes.
METODO:
1. Proceder repitiendo exactamente los puntos del 1 al 11 de los mtodos anteriores. Para
inocular se utiliza asa calibrada.
12. Al inocular un medio liquido, el cual siempre estar contenido en un tubo de ensaye, se
introduce el asa al tubo ligeramente inclinado y el inoculo que lleva se vierte por
frotamiento contra la pared del tubo, emulsionndolo con la misma asa en el seno del
liquido
13. Repetir exactamente los puntos del 13 al 16 de los mtodos anteriores. PRECAUCIN!,
estos tubos de cultivo no deben ir acostados nunca en las rejillas contenedoras ni en la
incubadora.
4.- INOCULACIN POR AGITACIN.
Este tipo de inoculacin es de empleo particular en el aislamiento de microorganismos

anaerobios esporulados. Para ello se utilizan medios slidos previamente calentados hasta una
temperatura de 50 C al momento de inocular. Se deben mantener en posicin vertical sobre todo
cuando ocurre la solidificacin del medio ya inoculado.

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METODO:
1. Llevar a bao Mara de 50 C un tubo de agar nutritivo estril, durante 10 minutos.
2. Repetir exactamente los pasos del 1 al 11 de los mtodos anteriores.
12. Inocular introduciendo el asa calibrada con el material bacteriolgico en el seno del medio
de cultivo que se encuentra semislido. Retirar el asa procurando siempre que la muestra
quede en el fondo del tubo.
13. Flamear la boca del tubo inoculado. Sin soltar el asa, colocarle el tapn. PRECAUCIN!
14. Esterilizar al rojo el asa con los residuos del inculo. Depositarla sobre la mesa.
15. Rotar entre las manos el tubo para homogenizar el inculo en el fondo del medio de
cultivo.
16. Colocar el tubo en una gradilla en posicin vertical hasta que solidifique a temperatura
ambiente.
17. Colocar al tubo un capuchn o gorrito de papel. Rotular con: nombre del medio de cultivo,
num. de equipo, fecha, escuela y el numero 4.
18. Llevarlo a la incubadora junto con los otros tres tubos inoculados. Incubar a 37 C durante
24 horas.
Al da siguiente:
19. Efectuar el anlisis microscpico de cada tipo de siembre. Comparar con el medio testigo
negativo.
20. Efectuar frotis en fresco para los cultivos lquidos que presentes desarrollo bacteriano.
21. Efectuar frotis de Gram para los cultivos slidos que presentes desarrollo bacteriano.
REPORTE:
1. Representar con esquemas los procedimientos de inoculacin para cada tubo de los tipos de
siembra.
2. Dibujar los resultados del anlisis macroscpico de cada uno de los cultivos.
3. Representar los campos microscpicos de cada uno de los cultivos. Describir cada uno. No es
suficiente el esquema.
4. Efectuar investigacin bibliografa de los gneros o especies bacterianas que se aslen

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PRACTICA No. 7
OBSERVACIN Y ANALISIS DE LAS COLONIAS
METODO DE INOCULACIN EN PLACA.
OBJETIVO:
Efectuar el mtodo de asilamiento de bacterias en placa de agar a partir de muestras

bacteriolgicas puras o mixtas y observar las caractersticas morfolgicas macroscpicas del
crecimiento bacteriano.
MARCO TEORICO.
Cuando Se deposita una bacteria en la superficie de un medio slido, esta se divide

rpidamente y su progenie se agrupa en una masa de clulas idnticas que quedan prcticamente en
posicin fija. Esta masa se llama colonia y por lo general es visible a simple vista en 24 hrs.
Las colonias as formadas tienen dimensiones desde mnimas, apenas visibles, hasta masas
de varios milmetros de dimetro; presentan caractersticas no solo de volumen si no tambin de
forma, textura y color. Si bien es cierto, hasta cierto punto depende de la naturaleza del medio, en un
gran nmero de casos es constante y de gran valor diferencial.
Los medios de cultivo slidos se hacen adicionando una sustancia solidificante al caldo de
cultivo. Debemos a las investigaciones de Robert Koch el descubrimiento en 1881 del primer agente
solidificante adecuado para el desarrollo bacteriano: la gelatina.
Los estudios iniciales demostraron que cuando se colocan las bacterias en un medio slido
como pan, huevo duro, albmina o la superficie fresca de papas cortadas, puede desarrollarse una
colonia formada por una sola especie bacteriana. Sin embargo, Koch enfrent el problema de que
dichas superficies carecan de los nutrientes necesarios para que se desarrollaran las bacterias
productoras de enfermedad. Koch enfrent esta limitante agregando gelatina al caldo de cultivo.
Aunque en poco tiempo descubri que esta no era la solucin adecuada a su bsqueda; ya que,
algunas bacterias digieren la gelatina y a la temperatura optima para el desarrollo bacteriano (37 C)
sta ya no era slida, por lo que los medios de cultivo con ese sistema equivalan a caldo de cultivo.
Una solucin al problema provino algunos aos mas tarde gracias a la observacin hecha por
Hesse, ayudante de Koch, quien empleo el agar, un solidificante vegetal extrado de algas marinas.
METODO:
INOCULACIN EN PLACA CON ASA BACTERIOLGICA. (ESTRIAS SECTORIALES O ESTRIAS
CRUZADAS).
Placas con base de agar sangre o agar soya tripticasa.

Cultivo puro sp en placa o en tubo inclinado
Asa calibrada
Mechero
Incubadora
AL DIA SIGUIENTE:
Microscopio ptico.
Equipo de Gram.

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Equipo de tincin.
Aceite de inmersin.
Papel seda.
METODO
SE RECOMIENDA USAR CUBREBOCAS SIEMPRE QUE SE TRATE DE INOCULAR O AISLAR

MICROORGNISMOS. NO SE DEBE HABLAR.
1. Con un plumn o lpiz de cera, marcar la base de una caja con base de agar sangre o
agar soya tripticasa estril, (como se indica en la siguiente figura), teniendo cuidado de no
levantar de ninguna manera la tapa de la caja pues el medio de cultivo podra
contaminarse.
I III
X II
2. Esto nos da tres sectores, siendo el sector I el mas pequeo y el que debe quedar hacia el
lado izquierdo del analista al momento de manipular en posicin derecha (no invertida) la
caja para su inoculacin.
3. Disponer la flama del mechero en el rea de inoculacin.
4. Con la mano izquierda manipular la caja de Petri en posicin derecha o el tubo inclinado
con cultivos puros. Con la mano derecha manipular el asa.
5. Esterilizar el asa al rojo vivo.
6. Tomar un inculo (una asada es suficiente) de la misma manera como se explica en la

practica anterior.
7. Sin soltar el asa con el inoculo, colocar sobre la mesa el tubo o caja con cultivo puro.
8. Tomar la caja de Petri en posicin derecha y previamente marcada con tres sectores.
Manipularla de tal manera que el sector uno quede hacia el lado izquierdo del analista.

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9. Levantar la caja a la altura de la flama a una distancia de separacin de no mas de 20 cm.

Levantar parcialmente la tapa (modo de ostra)
10. Introducir hasta el fondo del sector I el asa con el inoculo. Trazar suavemente una serie de
zig-zag o estras muy cerradas a todo lo largo de esta superficie. Tener cuidado de no
introducir el asa en la profundidad del agar de siembra, ya que la superficie de cultivo
debe mantenerse totalmente plana
11. Sin retirar la caja de la flama del mechero, retirar el asa y esterilizarla al rojo vivo. Cerrar la
caja previamente.
12. Girar la caja hasta que el sector II quede ahora hacia la izquierda.
13. Sin volver a tomar inculo, trazar un zig-zag mas abierto que el del sector I, empezando
en el rea de cruce de estos dos sectores. Cerrar la caja. Esterilizar el asa.
14. Girar nuevamente la caja, hasta que el sector III quede a la izquierda.
15. Sin volver a tomar inculo, trazar un solo zig-zag mas abierto que el del sector II,
empezando este en el rea de cruce de los dos sectores anteriores. Cerrar la caja.
Esterilizar el asa.
X I
II III
I III
X II
16. Por ningn motivo de deber abrir la caja. Mantenerla sobre la mesa en posicin invertida.
Etiquetar con los datos de rutina. Si se considera necesario, sellar la caja con cinta
adhesiva.
17. Llevar las placas a la incubadora, colocarlas en posicin invertida. No apilar mas de dos
cajas. Incubar a 37 C durante 24 Hrs.
Al da siguiente:

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18. Efectuar el anlisis macroscpico de las placas dirigido hacia la descripcin de la

morfologa colonial. Tmese como gua los siguientes parmetros mnimos:
FORMA: Puntiforme, circular, filamentosa, rizoide.

TAMAO: Consiste en estimar la superficie que ocupa cada colonia en mm.
COLOR: Blanco, amarillo, dorado, etc.
SUPERFICIE: Plana, saliente, convexa, abultada, ondulada, anillada concntrica etc.
CONSISTENCIA: Dura, cremosa, mieloide, mucosa, etc.
Nota: Se deber efectuar una descripcin de la morfologa colonial por cada tipo de colonia que haya
desarrollado.
19. Efectuar el anlisis microscpico con el mtodo de Gram. por cada variedad de colonia.
REPORTE.
1. Representar con esquemas los resultados de los puntos 1 y 2 posteriores a la incubacin.
2. Investigar acerca de los parmetros bsicos para la descripcin de la morfologa colonia.
3. Investigar las caractersticas de cultivo de los microorganismos identificados.
4. Investigar otras tcnicas de aislamiento de colonias, tales como inoculacin por cuadros, por
surcos, etc.

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PRACTICA 8
PRUEBAS BIOQUIMICAS, OXIDASA Y CATALASA.
IDENTICACION DE BACTERIAS GRAM NEGATIVAS
OBJETIVOS.
El alumno al trmino de esta prctica aprender:

Tcnica de inoculacin en las pruebas bioqumicas.
Identificar bacterias por medio de las pruebas bioqumicas apropiadas para cada una de las bacterias
en estudio.
Conocer las caractersticas de las pruebas bioqumicas y la forma en que se realizan cada una de
ellas.
INTRODUCCIN.
ENSAYOS BIOQUIMICOS.
La identificacin de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes
combinaciones de caractersticas y diferentes criterios en la evaluacin de similitudes.
Los ensayos bioqumicas tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioqumicas
convencionales, generalmente determinan la actividad de una va metablica (conjunto de reacciones
qumicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer
transforma o no.
Existen diferentes sistemas que facilitan la realizacin de tales ensayos, porque proponen el
mejor conjunto de pruebas bioqumicas para la identificacin de un grupo bacteriano, porque
simplifican la interpretacin de un resultado utilizando un valor numrico, por que proveen los
reactivos prontos para su uso o porque son totalmente automatizables.
Las pruebas o ensayos bioqumicas, son pruebas simples que se han desarrollado para
demostrar en forma clara una determinada caracterstica bioqumica como presencia o ausencia de
una determinada actividad enzimtico, grupo de enzimas o determinada va metablica, crecimiento a
una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significa de ninguna
manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano.
Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de cultivo,
indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente an para el mismo ensayo si se trata de diferentes
microorganismos. Por ejemplo se debe suplir con factores de crecimiento el medio de cultivo para
estudiar la fermentacin de distintos azucares cuando se sabe que el microorganismo en estudio es
exigente.
A la determinacin de la especie se puede llegar segn diversos sistemas (manuales de
identificacin, comerciales, etc.).
a).- Los comerciales utilizan modificaciones de las pruebas bioqumicas convencionales, ya sea
sustratos deshidratados, tiras de papel filtro impregnadas en reactivos o pequeos compartimentos
con medios prontos para sembrar. En todos los casos se emplean cdigos numricos para la
interpretacin de resultados.
Los sistemas comerciales mas comnmente utilizados son:
BBL, ENTEROTUBE II (Becton Dickinson). Es un sistema pronto para usar para la

identificacin de Enterobacterias, definida como bastones Gram. (-), aerobios o anaerobios

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facultativos, oxidasa (-). Consiste en un tubo de plstico con 12 medios de cultivo contenidos
en compartimentos individuales que se inoculan simultneamente en una etapa y permiten la
deteccin de 15 caractersticas bioqumicas.
OXI/FFERM TUBE II (Becton Dickinson). Es un sistema listo para usar para la identificacin
de bastones Gram. (-), aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa (+). Consiste en un tubo de
plstico de 12 medios de cultivo que permite la realizacin simultnea de 14 pruebas
bioqumicas.
API 20 E. Es un sistema estandarizado para la identificacin de bacterias Gram. (-). Consiste
en una plantilla de micro tubos conteniendo medios de cultivo deshidratados que se
reconstituyen al agregar una suspensin bacteriana. Permite la realizacin de 20 pruebas
bioqumicas a partir de una nica colonia bacteriana.
Otros sistemas:
Quintet 3H de diagnostics Pasteur para Enterobacterias.

API10S, versin miniaturizada del API 20 E
API Listeria
API NH (Neisseria-Haemophilus)
Existen tambin sistemas de identificacin comerciales para levaduras:
API 20 C (Para levaduras del genero Candida)

Auxacolor de Diagnostics Pasteur
Fongiscreen 4H de Diagnostics pasteur (para identificacin de lavaduras de inters mdico)
b).- En la ctedra se desarrollo un sistema para la identificacin de Enterobacterias que consta de

nueve pruebas bioqumicas convencionales (SYS 9E). Este sistema identifica las 23 especies mas
frecuentemente aisladas de muestras clnicas. Esta integrado por las siguientes pruebas: Produccin
de H2S en agar triple azcar hierro (TSI), fenilialanina deaminasa, produccin de indol,
descarboxilacin de lisina, descarboxilacin de ornitina, crecimiento en citrato, fermentacin de
arabinosa, fermentacin de sorbitos y produccin de acetona (VP)
En esquema la realizacin de una prueba bioqumica implica:
1).- Cultivar el microorganismo en un medio que contiene un determinado sustrato o inhibidor y luego
de la incubacin visualizar el crecimiento y la degradacin de un sustrato, ya sea por viraje de un
indicador o por agregado de un reactivo revelador de la presencia del sustrato, o de algn producto de
su degradacin.
2).- Cultivar el microorganismo de un medio de propagacin que contenga el sustrato de una enzima
inducible y luego de la incubacin demostrar la actividad enzimtico.
En todos los casos se debe tener un cultivo fresco (18-24 hrs. de incubacin) en un medio en
el que el microorganismo se desarrolla en forma optima, a pH, fuerza inica, atmsfera y temperatura
adecuados.
Siempre que se prepare un nuevo lote de medio de cultivo para una prueba, deben llevarse a
cabo los correspondientes controles de calidad, sembrando en dicho medio una cepa positiva y otra
negativa para este test.
Si bien existen una gran variedad de pruebas bioqumicas empleadas con fines de
identificacin, se enumerarn a continuacin solo las que se utilizan mas frecuentemente, agrupadas
segn el tipo de ensayo y se denominan segn su nombre corriente:

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1.- Enzimas vinculadas con la respiracin.
a) Oxidasa
b) Catalasa
2.- Descomposicin de azucares simples, cidos orgnicos y otros.
2.1.- Requerimientos de oxigeno

OF (Oxido-fermentacin)
Crecimiento en caldo tioglicolato
2.2.- Produccin de cido, o cido y gas

Fermentacin de carbohidratos
2.3.- Deteccin de enzimas y vas metablicas

a) RM-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer)
b) Gluconato
c) O.N.P.G. (Orto nitro B-D-galactopiranosico)
d) Esculina
e) Hipurato
3.- Fuente nica de carbono

a) Citrato
b) Malonato
c) Hipurato para coniformes
4.- Utilizacin de compuestos nitrogenados

4.1.- Reduccin de nitrato.
a) asimilacin
b) dentrificacin
4.2.- Descomposicin de carbohidratos aminocidos y otros.

a) Indol
b) H2S
c) Fenilalanina
d) Lisina, arginina, Ornitina
e) Urea
5.- Ensayos combinados

a) TSI (Triple azcar Hierro)
b) LIA (Agar Hierro Lisina)
c) Bilis esculina
6.- Deteccin de exoenzimas

a) Lecitinasa
b) Proteasas, coagulasa
c) Amilasas
d) Celulasas
e) Desoxirribonucleasas
f) Accin de microorganismos sobre la sangre (Hemolisinas)
7.- Miscelneos

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a) KCN
b) Bilis
c) Produccin de pigmentos
8.- Test de crecimiento o inhibicin
A) Temperatura
B) NaC.
C) Antibiticos
3 Realizar el examen macroscpico y microscpico de las bacterias en estudio.
Observar morfologa colonial.

Realizar tincin de gram.
PRUEBAS BIOQUMICAS. (Solo para bacterias Gram negativas)
Inocular con la tcnica de picadura y estra en citrato de Simmons, Kligler y TSI.

Inocular con la tcnica de picadura en LIA y SIM
Inocular por agitacin en UREA.
Incubar a 37 C durante 24 Hrs.
Observar y registrar resultados.
MATERIALES Y REACTIVOS.
MATERIAL
Portaobjetos
Tubos de ensaye 13 x 100
Aplicadores de madera
Mecheros de Bunsen (2)
Asa calibrada
Asa recta (sin calibrar)
Puente y charola para tincin
Cajas petri
Microscopio
REACTIVOS
Colorantes para tincin de Gram

Aceite de inmersin
Agar nutritivo
Agar base sangre
Perxido de Hidrogeno
Sensidiscos para oxidasa
Reactivo de Kovacs
Pruebas bioqumicas
o Citrato de Simmons
o Kligler
o TSI

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o LIA
o SIM
o UREA
INTERPRETACION:
Medios para reacciones bioqumicas:
Su composicin generalmente consta de peptona enriquecida con un azcar al 1%. Se agrega un
indicador, por lo general rojo de fenol, para sealar la acidez producida por la fermentacin del azcar.
Tambin con estos medios puede observarse la formacin de gases en los medios lquidos si se
emplean tubos de Durham invertidos.
Los medios ms usados para las pruebas bioqumicas son los siguientes:
Agar citrato de Simmons: Contiene citrato de sodio como nica fuente de carbono y azul de
timol con indicador. Los microorganismos que pueden utilizar el citrato como fuente de
carbono se desarrollan bien y el indicador se vuelve azul. Los dems microorganismos no
crecen y el medio conserva su color verde.
SIM mdium o medio SIM: Este medio se utiliza para la valoracin de tres reacciones
bioqumicas:
o S: Sulfuro de hidrgeno o 1 Para observar la produccin de este gas a partir de

tiosulfato. El medio contiene adems hierro ferroso que toma un color negro cuando
se produce el H2S.
o I: indol. Para observar la produccin de indol a partir de triptofano o de un aminocido
semejante. Esta prueba debe hacerse despus de valorar la movilidad y la produccin
da H2S, para lo cual es necesario agregar unas gotas de reactivo de Erlich o de
Kovacs a la superficie del medio entubado. En presencia de indol se produce un anillo
rojizo entre el medio y el reactivo.
o M: Motilidad. La movilidad a travs del medio semislido se traduce por diseminacin
de la opacidad bacteriana a partir del trayecto de la picadura de inoculacin.
Agar Kligler: Se le ha incorporado a la sustancia nutritiva: lactosa, dextrosa, tiosulfato de

sodio y rojo de fenol como indicador. Sirve para valorar la fermentacin de estos dos azcares
y tambin para la produccin de sulfuro de hidrgeno.
Agar triple azcar: Semejante al agar Kligler, solo que se le ha adicionado unos terceros
carbohidratos, la sacarosa.
Caldo dextrosado PM: Es un medio compuesto por peptonafosfato de glucosa. Sirve para
efectuar la prueba del rojo de metilo. Al medio inoculado e incubado de 24 a 48 horas se le
agregan cuatro gotas de indicador rojo de metilo. Un color rojo indica una reaccin positiva
(cida).
Caldo dextrosado VP: Se utiliza para valorar la reaccin de VogesProskauer (de las
pruebas IMVIC). Es un caldo idntico al anterior solo que vara en la reaccin final. Se aade
un mililitro de KOH al 10% al caldo inoculado e incubado. Se observa de cuando en cuando
las 24 horas siguientes. Un color rosa de eosina indica una reaccin positiva debida a la
produccin de acetilmetilcarbinol (CH3CO.CHOH.CH3) a partir de glucosa. Se obtiene una
reaccin ms rpida aadiendo huellas de creatinina al medio incubado ms 2.5 ml de NaOH
al 40%. En este caso el color rosa aparece en pocos minutos.
Caldo urea: Contiene extractos de levadura, urea como sustrato, fosfatos y rojo de fenol. Es
til para la observacin de la produccin de ureasa por bacterias del gnero Proteus.
Gelatina: Se emplea este sustrato puro hidratado a una sola dosis apropiada, de tal manera
que solidifique a temperatura de incubacin (37 C). Sirve para observar la licuacin de la
gelatina por accin de las gelatinasas bacterianas producidas por algunas enterobacterias.
Medios con descarboxilasa: Se logra una mejor diferenciacin de las enterobacterias
estudiando la actividad especfica de la descarboxilasa sobre una serie de cidos aminados,

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como lisina, arginina y ornitina. Los medios contienen una base nutritiva, adems de glucosa,
el cido aminado del caso y azul de bromotimol como indicador. Si el cido aminado es
descarboxilado, el pH del medio se vuelve alcalino, a pesar de la fermentacin de la glucosa,
pues los productos de la descarboxilacin son siempre alcalinos. Sin embargo, si esto no
ocurre en el medio permanece cido y conserva su color amarillo.
REPORTE:
1. Dibujar los campos microscpicos de cada placa e indicar la valoracin del grado de
desarrollo bacteriano.
2. Anotar la morfologa macroscopica y microscpica de cada bacteria.
3. Conclusiones de los resultados obtenidos.
4. Representar los campos microscpicos que se hubieran observado. Identificar la

especie o el gnero bacteriano.
Prueba de Catalasa
Introduccin
La catalasa es una enzima que descompone el perxido de hidrgeno en oxgeno y agua.

Qumicamente, la catalasa es una hemoprotena de estructura similar a la de la hemoglobina, excepto
que los 4 tomos de hierro de la molcula estn en estado oxidado (Fe+++) en lugar de reducido (Fe+
+). Excluyendo los estreptococos, la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas
poseen actividad catalasa.
Principio
El perxido de hidrgeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo
oxidativo aerbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular, el perxido de hidrgeno es letal
para las clulas bacterianas. La catalasa transforma el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno de
acuerdo a la siguiente reaccin:
H2O2 H2O + O2 (burbujas de gas)
La prueba de catalasa, llevada a cabo en portaobjetos o en tubos, es comnmente utilizada

para diferenciar estreptococos (negativos) de estafilococos (positivos).
Medios y reactivos
1. Cultivo de 24 horas del microorganismo en un medio no selectivo y que no contenga sangre.

2. Perxido de hidrgeno al 3% (diluir la solucin de 30% con agua destilada).
Procedimiento
Prueba en portaobjetos
1. Transferir, con asa, clulas del centro de una colonia bien aislada, a la superficie de un portaobjetos
en el que se coloco una pequea gota de agua. Emulsionar bien.
2. Aadir 1 o 2 gotas de perxido de hidrgeno al 3%. Se recomienda no aadir el organismo al

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reactivo, especialmente si se utilizan ansas que contengan hierro, ya que se pueden producir falsos
positivos.
Prueba en tubos o placas de agar

Aadir unas gotas de perxido de hidrgeno al 3% directamente sobre la superficie de una placa o
tubo de agar donde se ha desarrollado un cultivo puro del organismo en estudio
Interpretacin
1. Prueba cualitativa: la rpida aparicin y produccin sostenida de burbujas de gas o

efervescencia, indica una prueba positiva. Dado que algunas bacterias pueden poseer
enzimas distintas de la catalasa, capaces de descomponer el perxido de hidrgeno, unas
pocas burbujas diminutas, formadas a los 20 a 30 segundos no se consideran una prueba
positiva.
2. Prueba semicuantitativa: las determinaciones cuantitativas de catalasa se llevan a cabo ms

comnmente en la identificacin de micobacterias. Se mide la altura que alcanza la formacin
de burbujas de gas en el tubo, luego de aadir el perxido de hidrgeno. Una columna de
burbujas de 50 mm o ms, se considera una reaccin fuertemente positiva.
Controles
Staplylococcus aureus: positivo

Streptococcus spp.: negativo
Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayora de
las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepcin es
Streptococcus.
Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes gneros:
Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+).

Bacillus (+) de Clostridium (-).
Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes y
C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-)
Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos
tcnicas:
1. Mtodo del portaobjetos (recomendado):
Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre
un portaobjetos limpio de vidrio.
Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H 2O2 al 30% sobre el microorganismo sin
mezclarlo con el cultivo.

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Observar la formacin inmediata de burbujas (resultado positivo). Desechar el portaobje
PROCEDIMIENTO.
PRUEBA DE CATALASA
1 Realizar la prueba de catalasa a la bacteria a estudiar, de la siguiente manera:
Colocar una gota de peroxido de Hidrgeno (agua oxigenada) en el portaobjetos

Con un aplicador de madera tomar una colonia de la caja con bacterias a identificar y
depositarla sobre la gota de agua oxigenada
Homogenizar y observar a los 30 seg.
Resultados:
Presencia de burbujas, es catalasa positivo

Ausencia de burbujas, es catalasa negativo
PRUEBA DE OXIDASA
2 Realizar la prueba de oxidasa a la bacteria en estudio, de la siguiente manera:
En medio de agar nutritivo con bacterias en estudio, colocar un sensidisco de oxidasa.

Dejar reaccionar un minuto y hacer las observaciones.
tos en un recipiente con desinfectante.

Si se invierte el orden del mtodo (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden
producirse falsos positivos.
2. Mtodo del tubo de ensayo:
Agregar 1ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo puro de agar en slant densamente

inoculado.
Observar la formacin inmediata de burbujas (resultado positivo).
Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la
precaucin de no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del medio
contienen catalasa y su presencia dar un falso resultado positivo.
PRUEBA DE CAMP PARA LA IDENTIFICACION DE S. PYOGENES
Si bien el fenmeno CAMP fue descrito en 1994 por Christie, Atkins y Munich-Peterson
(CAMP), la prueba ha sido solo recientemente utilizada para la identificacin de estreptococos del
grupo B. El factor CAMP es una sustancia extracelular producida por estreptococos del grupo B que
intensifica la lisis de los glbulos rojos producida por la B-lisina estafilococica. La prueba se realiza
estriando una placa de agar sangre con una cepa de estafilococos productora de B-lisina, en forma
perpendicular a la estra de los estreptococos B por investigar. Un rea de hemlisis mas intensa,
detectada por la presencia de una zona de aclaracin en forma de punta de flecha en la interseccin
de ambas estras indica una identificacin positiva de estreptocos del grupo B. Es importante que las
placas no sean incubadas anaerobicamente pues algunas cepas de estreptococos B del grupo A
producen una CAMP positiva en ausencia de oxigeno.

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PRUEBA DE CAMP.
En un medio de cultivo agar sangre, inocular S. auereus en la lnea media.

Inocular S. pyogenes a 3 mm de distancia de la lnea media (donde se ha inoculado S.
aereus); barrer la descarga lateralmente.
Incubar 24 Hrs a 37 C
Observara y registrar resultados.
REPORTE
Anotar los resultados obtenidos de cada bacteria y reportar.

Realizar conclusin.
PRACTICA 9
ACCION DE LOS ANTISEPTICOS Y

DESINFECTANTES In Vitro.
OBJETIVO.
Observar la accin de los agentes qumicos desinfectantes y antispticos a diferentes

concentraciones, sobre especmenes infectantes y saber diferenciar un antisptico de un
desinfectante.
MARCO TEORICO.
Hasta que se supo que los microorganismos provocan enfermedades, no se confiaba en la

necesidad de esterilizacin, desinfeccin, antisepsia y medidas sanitarias. Result necesario crear
instrumentos para observar los microorganismos, estos tuvieron que desarrollarse y estudiarse en
cultivos puros de laboratorio; y hubo que investigar el efecto de diversas sustancias y condiciones
sobre ellos.
En la profesin de la Medicina hay que tener presente que los microorganismos existen
constantemente a menos que se hayan tomado precauciones especiales para matarlos, inhibirlos o
suprimirlos. En la actualidad se procura ensearle al estudiante de Medicina a manejar los llamados
agentes desinfectantes y las sustancias antispticas, que tienen como finalidad matar o destruir las
bacterias patgenas provenientes de los enfermos.
Los desinfectantes son sustancias qumicas de accin fuerte y que pueden ser irritantes para
la piel y mucosas de los enfermos ya que poseen poca toxicidad selectiva: no solo son txicos para
los parsitos microbianos, sino tambin para las clulas huspedes; por lo tanto pueden ser usados
solamente para los enfermos, mesas, cmodos, termmetros, inodoros, etc. pero no pueden
administrarse por va general y no son activos en los tejidos.
Algunos desinfectantes de uso comn son: xido de etileno (gas), formaldehdo 1-10 %,
glutaraldehido acuoso 2 %, compuestos fenolicos 1-3 %, hipoclorito de sodio 1 %, lisol 5 %.

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Los antispticos son sustancias que matan o inhiben las bacterias al igual que los
desinfectantes pero que pueden aplicarse sobre la piel y mucosas sin producir irritacin u otros
efectos sobre los tejidos del husped.
Algunos ejemplos de antispticos son : agua oxigenada; compuestos de amonio cuaternario

como los jabones, detergente y el benzal o cloruro de benzalconio; hexaclorofeno 2%; tintura de yodo
2%; compuestos yodados; agentes oxidantes como el permanganato de potasio; compuestos de
metales pesados como el nitrato de plata 1%, bicloruro de mercurio 0.1% y los compuestos orgnicos
de mercurio.
METODO: DILUCION BACTERIANA EN AGENTES QUIMICOS.
Fenol 5% Tubos 13X100 (10)

Clorox MR Gradilla
Bicloruro de mercurio 0.1% Pipeta pasteur c/ gotero
Benzal 1:1000 y 1:10 000 Pipetas de 5 ml. (10)
Sol. conc. de jabn. Asa calibrada
Tintura de yodo 2% Mechero (2)
Nitrato de plata 1% Suspensin bacteriana
Suero fisiolgico Placas con agar nutritivo (10)
AL DIA SIGUIENTE (opcional): Equipo de gram.
METODO:
1. Rotular los tubos de 13X100 con los nombre de los agentes desinfectantes y de los
antispticos que se proporcionen.
2. Colocar en cada uno de ellos 1ml. Del reactivo con el que se han rotulado.
Usar cubrebocas, cabello recogido, Flama, etc.
3. Agregar a cada uno de los tubos 1 ml. Aproximadamente de la suspensin de bacterias

vas que se le ha proporcionado.
4. USAR UNA PIPETA PASTEUR CON BULBO! NO ASPIRAR CON LA BOCA!
5. Tapar con parafilm cada uno de los tubos y dejarlos en reposo por 15 min.
6. Mientras tanto, disponer las placas de agar nutritivo estril, rotularlas con los nombres de
los agentes qumicos que se estn empleando.
7. De cada tubo de dilucin, tomar un inoculo con el asa y sembrarlo con la tcnica de
estras sectoriales en la placa de agar correspondiente.
8. Marcar cada placa con los datos escolares, llevarlas a la incubadora a 37 C, colocarlas
en posicin invertida. Incubar durante 24 Hrs.
Al da siguiente:

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9. Retirar las placas de la incubadora. Efectuar anlisis microscpico de cada una. Valorar el
grado de desarrollo bacteriano contra la eficacia del agente qumico, tomando como base
el criterio de cruces: (++++), (+++), (++), (+) o (-).
10. Efectuar anlisis microscpicos a criterio.
11. Esterilizar las cajas el autoclave. Lavar. Secar.
REPORTE:
1. Dibujar los campos microscpicos de cada placa e indicar la valoracin del grado de
desarrollo bacteriano.
2. Investigacin bibliogrfica de los mecanismos de accin de los antispticos y de los
desinfectantes.
3. Conclusiones de los resultados obtenidos.
4. Representar los campos microscpicos que se hubieran observado. Identificar la
especie o el gnero bacteriano.

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PRACTICA 10
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD BACTERIANA in vitro A LOS ANTIBIOTICOS
OBJETIVO
Conocer la accin in vitro de los antibiticos y analizar las aplicaciones y limitaciones del
antibiograma.
MARCO TERICO
En el tratamiento de una infeccin, el tratamiento antimicrobiano inicial se escoge en base a la
impresin clnica, despus de que el mdico se convence de que existe una infeccin y ha hecho
un diagnstico etiolgico tentativo en base a la clnica. Bajo esta consideracin puede elegirse un
posible medicamento de eleccin: un antibitico. Es preferible que antes de administrarlo se
tomen muestras de laboratorio para el aislamiento del agente causal. Es posible que los resultados
de estos anlisis hagan necesaria la eleccin de un medicamento diferente. La identificacin de
ciertos microorganismos que son uniformemente sensibles a los medicamentos elimina la
necesidad de nuevas pruebas y permite la eleccin de los medicamentos ptimos nicamente en
base a la experiencia. En otras circunstancias, pueden ser tiles las pruebas de sensibilidad a
medicamentos de los microorganismos aislados.
Las pruebas de laboratorio para determinar la s sensibilidad a los antibiticos se encuentran
indicadas en las siguientes circunstancias:
1.- Cuando el microorganismo aislado es frecuentemente resistente a los medicamentos
antimicrobianos (por ejemplo, bacterias entricas gramnegativas).
2.- Cuando un proceso infeccioso es grave y parece ser mortal menos que sea tratado
especficamente (por ejemplo, meningitis, septicemia).
3.- En ciertas infecciones en las que la erradicacin de los organismos infecciosos requiere del
uso de medicamentos que sean rpidamente bacteriostticos.
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA IN VITRO

La actividad antimicrobiana se mide in Vitro para determinar:
1. La potencia de un agente antimicrobiano en solucin;
2. Su concentracin en los lquidos del cuerpo o en los tejidos,
3. La sensibilidad de un microorganismo dado a concentraciones conocidas de medicamento.
La determinacin de estas cantidades puede realizarse por uno de los siguientes dos
mtodos principales: dilucin difusin.
1. MTODO DE DILUCIN EN TUBO: En este mtodo, la droga probable contra un

germen infeccioso se aade en una serie de diluciones: 1:5, 1:10, 1:20, etc. A tubos que
contienen un medio de cultivo adecuado para la bacteria estudiada. Despus cada tubo
se inocula con el microorganismo cuya existencia se est estudiando. Despus de
incubar todos los tubos se establece comparacin de los crecimientos y se valora la
resistencia del microorganismo investigado para cada droga. Sin embargo, este tipo de
pruebas eran fastidiosas y se emplean poco; por lo que el advenimiento de series

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preparadas con diluciones de caldo para numerosos medicamentos diferentes, en

placas para microtitulacin, ha incrementado y simplificado mucho este mtodo.
2. MTODO DE DIFUSIN EN PLACA: cuando se determina la sensibilidad bacteriana

por este mtodo, la mayor parte de los laboratorios emplean discos de papel filtro
impregnados con antibiticos: unidiscos o multidiscos; los cuales se colocan en un
medio slido en placa que ha sido sembrado en forma abundante con el germen de
prueba. Despus de la incubacin se toma el dimetro de la zona clara de inhibicin
que rodea al depsito del medicamento, como medida del poder inhibidor del antibitico
contra el microorganismo de prueba.
A partir del disco se produce por difusin un gradiente de concentracin del antibitico en el
medio. Como la difusin es un proceso continuo, el gradiente de concentracin nunca es estable
en largo tiempo; sin embargo puede lograrse una estabilizacin permitiendo que la difusin se
inicie antes de que comience el crecimiento bacteriano.
La dificultad principal estriba en las diferentes velocidades del crecimiento para los diversos
microorganismos y deben corregirse variando la densidad del inculo.
El uso de un disco sencillo para cada antibitico con estandarizacin cuidadosa en las
condiciones de la prueba, permite el informe de susceptible o resistente para un microorganismo
al mismo medicamento (mtodo de Kirby Bauer).
Es obvio que este mtodo est sujeto a muchos factores fsicos y qumicos, adems de la
simple interaccin del medicamento y los microorganismos (por ejemplo la naturaleza del medio,
difusibilidad, tamao molecular y estabilidad del medicamento). Sin embargo, la estandarizacin
de estas condiciones permite un ensayo cuantitativo de la potencia del antibitico o de la
sensibilidad del microorganismo.
MTODO: DIFUSIN EN PLACA.
Placas con agar para antibiograma o base de agar sangre o agar soya- T.
Tubo de 13X100 con 2 ml. De caldo nutritivo o BHI con hisopo estril.
Cultivo puro en placa.
Unidiscos de distintos antibiticos.
Estrella con distintos antibiticos.
Asa calibrada, aceite de inmersin, papel seda.
MTODO:
Se recomienda como medida de seguridad usar cubrebocas y gorra. Evitar corrientes de
aire. Mantener la flama cercana a rea de inoculaciones.

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1. De un cultivo puro en placa, inocular por emulsin con asa calibrada el medio de
cultivo lquido contenido en tubo de 13X100. tapar inmediatamente para evitar
contaminacin. Mantenerlo a temperatura ambiente o en incubadora si el
procedimiento no se va a efectuar de inmediato.
2. Disponer de una placa con medio de cultivo estril para antibiograma a temperatura
ambiente.
3. Disponer de un hisopo estril. Introducirlo al caldo que contiene la emulsin
bacteriana motivo del estudio de sensibilidad antibitica. Mantenerla tapada
perfectamente con el tapn de algodn.
4. Usando el hisopo como instrumento de siembra o inoculacin; sembrar la placa de
agar antibiograma de modo de estras cerradas o expansin total, asegurndose de
que los inculos se realicen en toda la superficie de la placa. Evitar que con el
hisopo se derramen gotas de caldo emulsionado sobre la placa para el
antibiograma.
5. Disponer de una pinza de diseccin esterilizada a la flama. Tomar una estrella de
antibiticos y colocarla bien cerrada sobre la placa recin sembrada. Presionar
ligeramente cada sensidisco para asegurar el contacto con la poblacin bacteriana.
6. Si se dispone de unidiscos individuales (sensidiscos), disponer de otra placa de
agar para antibiograma, inocularla de la manera antes descrita y colocar con una
pinza de diseccin esterilizada a la flama los unidiscos uno a uno, procurando que
estos queden separados entre s y de los bordes de la placa unos dos centmetros.
No colocar ms de cinco o seis unidiscos.
7. Sellar las placas. Etiquetar con los datos escolares y de cultivo. Llevarlas a la
incubadora, colocarlas invertidas. Incubar durante 24 hrs. A 37C.
AL DA SIGUIENTE:
8. Retirar las placas de la incubadora. Efectuar anlisis macroscpico para evaluar la

accin antimicrobiana de cada antibitico.
9. Medir con una regla graduada en milmetros el halo de inhibicin que halla
producido cada antibitico: zona circundante al sensidisco con ausencia de
desarroll bacteriano, en contraste con la superficie de mtodo de cultivo que no es
afectada por el medicamento.
10. Anotar los radios de los halos de inhibicin estndar para cada antibitico, que
representan el 100% de susceptibilidad o sensibilidad.
11. Calcular el % de susceptibilidad para cada antibitico utilizado para el antibiograma,
a partir de una relacin simple de los mm. De halo de inhibicin problema.
Considerando que aqullos sensidiscos que no presenten halo reinhibicin se les
asigne el valor de 0% de susceptibilidad y 100% resistente. Aqullos sensidiscos cuyo
halos es igual o mayor que el estndar, se les asigna el valor de 0% resistente y 100%
susceptible.
12. Al trmino de la interpretacin del antibiograma, proceder a disponer las cajas de
Petri para la esterilizacin a la autoclave. Posteriormente lavarlas y secarlas.

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REPORTE:
1. Con los valores estndar y los resultados prcticos, disear una tabla con
columnas que contenga: antibitico, halo de inhibicin prctico, % de
susceptibilidad y % de resistencia.
2. Representar los resultados de cada antibiograma, sealando el nombra del agente
etiolgico motivo de estudio; puede efectuar frotis para microscopa por Gram.
3. Investigacin bibliogrfica sobre los factores que pueden afectar la actividad
antimicrobiana in vitro.

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PRACTICA 11
EXUDADO FARINGEO
PROCESAMIENTO E INTERPRETACIN DE MUESTRAS DE VAS RESPIRATORIAS
SUPERIORES
I. OBJETIVOS
1.- Expresar diferentes tipos de muestras que se pueden obtener en vas respiratorias.
2.- Obtener en forma adecuada la muestra de un exudado farngeo.
3.- Realizar la identificacin de Streptococcus pyogenes beta hemoltico, Staphylococcus aureus y a
nivel de gnero a Neisseria sp.
4.- Enumerar los microorganismos que forman parte de la flora normal de vas respiratorias
superiores.
II. INTRODUCCIN
La obtencin y manejo adecuado de las muestras de vas respiratorias superiores tienen un lugar
importante dentro de los procedimientos para la deteccin e identificacin de Streptococcus pyogenes
beta hemoltico, Neisseria meningitidis, Bordetella pertusis y Corynebacterium diphteriae. Estas
muestras tambin son tiles para detectar los agentes etiolgicos de laringitis, epiglotitis, otitis media,
otitis externa y angina de Vincent y para deteccin de portadores farngeos de Staphylococcus aureus
y Neisseria meningitidis. La causa mas frecuente de faringitis bacteriana es Streptococcus beta
hemoltico del grupo A, pero tambin Streptococcus del grupo C y Arcanobacterium
(Corynebacterium) haemolyticum, se asocia con este cuadro.
Un escaso nmero de Streptococos beta hemoltico del grupo A en una muestra no necesariamente
indica colonizacin y puede representar infeccin. La deteccin de estreptococos beta hemoltico del
grupo A en muestras farngeas es importante debido al resurgimiento de la fiebre reumtica aguda y la
presentacin de un padecimiento parecido al sndrome de choque txico.
Existen en vas respiratorias superiores una variedad de microorganismos que forman parte de la flora
normal transitoria o permanente, entre los cuales podemos mencionar Streptococcus alfa hemoltico,
Branhamella catarrhalis, Staphylococcus coagulasa negativos, Haemophylus influenzae del grupo B,
Klebsiella pneumoniae, Micoplasma pneumoniae, Neisseria meningitidis que pueden encontrarse
transitoria o permanentemente ocasionando o no cuadro clnico.
Las muestras de vas respiratorias superiores incluyen: exudado farngeo, exudado nasal, succin
nasofarngea, exudado nasofarngeo, lavado nasal, aspirado sinusal, entre otros.

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EXUDADO FARNGEO
Un exudado farngeo se debe obtener de la regin de las amgdalas o de la porcin posterior de la
faringe en zonas de abscesos, exudados o inflamacin, evitando tocar lengua, paredes de la boca,
vula. Las muestras deben ser colectadas en ayunas y sin previo aseo bucal y debe ser remitido
principalmente para la deteccin de Streptococcus del grupo A, aunque tambin puede ser til para
detectar Neisseria meningitidis, Haemophylus influenzae, (epiglotitis) y Arcanobacterium
haemolyticum (muy rara).
III.- MATERIAL PARA OBTENER UN EXUDADO FARNGEO
Primera sesin:
Placa de gelosa sangre

Placa de gelosa chocolate
Placa de gelosa sal- manitol
Tubo con medio de Biggy
Hisopos estriles
Abatelenguas estriles
Asas bacteriolgicas
Colorantes para la tincin de Gram
Aceite para inmersin
Papel limpia lentes
Microscopio
Diapositivas
Segunda sesin:
Cultivos de la prctica anterior

Cultivos demostrativos
Preparaciones permanentes
IV.- MTODO

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1. Para realizar el aislamiento de bacterias del exudado farngeo, marcar las zonas de
inoculacin en cada placa de medio de cultivo.
2. Toma de la muestra. Se le pide al paciente que abra bien la boca. Se hace descender
suavemente la lengua con un abatelenguas y se introduce un hisopo estril hacia la
faringe posterior. El hisopo se pasa suavemente y rpido con movimientos hacia arriba y
abajo por detrs de la vula y entre los pilares tonsilares.
3. Rotar el hisopo en cada una de las zonas marcadas de las placas de gelosa chocolate,
gelosa sangre y sal-manitol. Adems frotarlo en la superficie del medio de Biggy y por
ltimo hacer un frote en portaobjeto.
4. Continuar con la distribucin del inculo por estriado en placa con el asa bacteriolgica.
5. Incubar los cultivos a 37 grados centgrados durante 24 hrs.
6. Fijar el frote y teirlo con el mtodo de gram. Hacer la observacin microscpica con el
objetivo de 100X.
INTERPRETACIN (IDENTIFICACIN PRELIMINAR)
Gelosa sangre. Identificar Streptococcus por morfologa colonial y celular. Determinar el tipo de
hemlisis (alfa o beta).
Gelosa chocolate. Identificar Neisseria, por morfologa colonial, celular, y prueba de las oxidasas.
Gelosa sal-manitol. Medio selectivo para Staphylococcus, si hay crecimiento de Staphylococcus
aureus, habr fermentacin del manitol y habr viraje del indicador en el medio de cultivo, tornndose
en color amarillo, en caso negativo no hay cambio de color.
Medio de Biggy. Las colonias que se observan de color caf oscuro a negro corresponden a candida.
Adems podemos realizar:
Prueba de conglutinacin para identificacin de Streptococcus pyogenes beta hemoltico

grupo A.
La diferenciacin de los grupos de Lancefield de estreptococos beta hemoliticos es importante para

orientar el tratamiento y pronstico de estas infecciones.
Los grupos A, ,B, C, D, F Y G son los mas frecuentes y de ellos el que causa patologas mas graves
es el A. La sensibilidad a la bacitracina para la identificacin del grupo A es una prueba presuntiva.
Existen mtodos para su identificacin definitiva como son: inmuelectroforesis, precipitacin,
aglutinacin en ltex y coaglutinacin.
La coaglutinacin es un mtodo simple y rpido que consiste en aglutinar a estreptococos del grupo A
con anticuerpos especficos unidos a estafilococos.

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MATERIAL:
- Reactivo Strip A: anticuerpos especficos de conejo acoplados a Estafilococos no viables. El
acoplamiento se lleva a cabo entre la protena A del estafilococo y la fraccin Fc del
anticuerpo.
- Control negativo: gammaglobulina de conejo no inmunizado acoplada a estafilococos no
viables.
- Colonias aisladas de estreptococo beta hemoltico proveniente del paciente son el antgeno.
MTODO:
1. Colocar una gota de una suspensin de las colonias aisladas en un pozo de un portaobjetos
para aglutinacin
2. Aadir igual cantidad del reactivo Strip A.
3. Mezclar bien y leer a los 2 min contra fondo oscuro.
4. En otro pozo del portaobjetos llevar a cabo la prueba de control negativo.
5. Comparar.
INTERPRETACIN:
La formacin de grumos indica presencia de estreptococos beta hemoltico del grupo A.
Esta prueba puede hacerse directamente a partir de exudado faringeo, lo que permite el diagnstico
rpido; sin embargo los resultados negativos debern ser confirmados por cultivo.
FLUJOGRAMA
OBTENCION DE LA MUESTRA
Con el hisopo estril frotar la parte posterior de la faringe, las amgdalas particularmente, los puntos
blanquecinos as como cualquier rea que presente signos de inflamacin o exudacin, evitando el
contacto con la vula, lengua y saliva.
Identificacin de Staphylococcus
Medio de transporte Biggy Observacin Candida
de la sp. morfologa
colonial, tincin de Gram. y
Colonias caf
fermentacin de manitol. Realizar
oscuro o negras
prueba de coagulasa.
Inocular con el hisopo,
Gelosa sangre
sembrar por estra para Gelosa chocolate
Identificacin de Neisseria
(enriquecido) Gelosa +manitol
Coagulasa coagulasa
aislamiento y Ma.hacer
Profra. Leticia sp.
Garca Gmez
Morfologa colonial
picadura Pg.
en el80/113
medio con Manitol + manitol
Gram, prueba de oxidasas Inocular con el hisopo, estriar
el asa. Incubar a 37 C 24 S. aureus S. epidermidis
para aislamiento; incubar a
hrs 37 C 24 hrs
Identificacin de Streptococcus por su morfologa colonial, forma y agrupamiento, Gram y tipo de

hemlisis.
Streptococcus beta hemoltico
Prueba bacitracina COAGLUTINACIN

Halo de inhibicin; bacitracina Sin halo de inhibicin;
sensible Streptococcus grupo A bacitracina resistente
Streptococcus grupo no A
AUTOEVALUACIN
1. Describa la obtencin de una muestra de exudado farngeo
2. Mencione los tipos de muestras que puede obtener de vas respiratorias superiores
3. Mencione que microorganismos aislara con los diferentes medios de cultivo utilizados en la prctica
4. Seale el fundamento de la prueba de coaglutinacin, sus ventajas y limitaciones.

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PRACTICA No. 12
COPROCULTIVO
INTRODUCCION:
Los cultivos de heces se hacen comnmente para identificar microorganismos parsitos de

enfermedades entricas y virus del tracto intestinal. De todas las muestras recolectadas, las
heces son las que contienen el mayor nmero y la ms amplia variedad de microorganismos.
En un cultivo sistemtico de heces, el exmen se hace para encontrar Salmonella, Shigella,
Campylobacter, Yersinia, E. coli enteropatgena(en el recin nacido) y cultivos puros de
estafilococos.
Un solo cultivo de heces negativo no se debe considerar como confirmacin de que no hay
bacterias infecciosas. Al menos se hacen generalmente tres cultivos si el cuadro del paciente
sugiere alguna bacteria y si los dos primeros cultivos han resultado negativos.
PROCEDIMIENTO PARA LA RECOLECCION:
1.- Debe recogerse las heces en un recipiente seco.

2.- Se prefiere un excremento recientemente eliminado como muestra.
3.- Slo es necesaria una pequea cantidad de excremento. Un trozo del tamao de una nuez
aproximadamente.
4.- Un excremento diarreico suele dar buenos resultados.
5.- No debe usarse para el cultivo el excremento depositado en la tasa del sanitario.
6.- Rotular el frasco con todos los datos del paciente.
7.- Enviar al laboratorio para su proceso.
OBSERVACIONES:
1.- Candida albcans en gran nmero en las heces se considera patgeno en presencia de un
tratamiento anterior con antibiticos. Las alteraciones de la flora normal por los antibiticos
con frecuencia cambian los microorganismos normalmente inocuos en patgenos.
2.- Cryptosporidiosis es causa de diarrea intensa, prolongada en pacientes inmunosuprimidos.

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PRACTICA No. 13
UROCULTIVO
1.- MUJERES:
a) La paciente debe lavarse cuidadosamente las manos con jabn y agua y despus
secarlas con una toalla limpia..
b) Se retira la tapa de un recipiente estril y se coloca con su superficie exterior hacia
abajo sobre un rea limpia.
c) La regin alrededor del meato urinario debe asearse de adelante hacia atrs con una
gasa antisptica.
d) Con una mano, la paciente debe abrirse los labios, dejndolos apartados hasta haber
recolectado la muestra.
e) Despus de limpiarse, la paciente orina. Una vez que han pasado los primeros 25 ml
en el sanitario, la orina se recoge directamente en el recipiente estril. El vaso con que
se recoge debe sostenerse de tal manera que se evite el contacto con las piernas, la
vulva ola ropa. Los dedos deben conservarse apartados del borde y de la superficie
interna del recipiente.
2.- HOMBRES:
a) El paciente debe lavarse cuidadosamente las manos con jabn y agua y despus secarla
con una toalla limpia.
b) Se retrae completamente el prepucio para dejar expuestos los extremos del pene.
c) Se limpia la zona alrededor del meato urinario con gasas antispticas.
d) El paciente desecha la primera porcin de orina directamente al sanitario y despus
recolecta directamente dentro del recipiente estril. No deben recolectarse las ltimas
gotas de orina.
3.- LACTANTES Y NIOS:
En lactantes y nios pequeos, la orina debe recogerse en bolsas de plstico estriles

especiales. Con un aseo previo.
Como la bolsa toca la superficie de la piel y por consiguiente recoge grmenes comensales,
debe analizarse la muestra tan pronto sea posible.

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CULTIVOS DE SANGRE O HEMOCULTIVOS
INTRODUCCION:
La sangre para cultivo es posiblemente la muestra sencilla ms importante sometida al

laboratorio microbiolgico para su exmen. Se recolecta siempre que se sospeche bacteriemia
o septicemia. Aunque una bacteriemia ligera transitoria es un dato frecuente en muchas
enfermedades infecciosas, el tipo persistente continuo o recurrente de bacteriemia es
indicativo de una situacin ms seria.
PROCEDIMIENTO:
1.- Debe frotarse el sitio propuesto para la puncin con un antisptico o alcohol a 70 %.
2.- Deben limpiarse los tapones de los frascos de cultivo con yodo y secar al aire y despus
con alcohol al 70 %.
3.- La venipuncin debe hacerse con una jeringa y aguja estriles, evitando cualquier
contaminacin en el sitio que se ha limpiado.
4.- Se realiza la extraccin de sangre; se desecha la aguja de la jeringa y se sustituye por otra
estril antes de que se inyecte la muestra al frasco de cultivo.
5.- Se recomienda realizar por duplicado el cultivo.
6.- Rotular las muestras con los datos del paciente y la fecha y hora de la toma de muestras.
OBSERVACIONES:
1.- Se debe informar al mdico inmediatamente de los resultados positivos, para que se inicie
el tratamiento adecuado de inmediato.
2.- Se deben realizar reportes parciales de los cultivos negativos a las 24 y 48 hrs., a los 7 y
14 das de incubacin.

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CULTIVO DE ESPUTO O EXPECTORACIN
INTRODUCCIN:
El esputo no es material de la regin posnasal, ni es baba ni saliva. Una muestra de esputo

puede ser expectorado desde el interior profundo de los bronquios.
Los cultivos de esputo son importantes en el diagnstico de:
1.- Neumona bacteriana.
2.- Tuberculosis pulmonar.
3.- Bronquitis crnica.
4.- Bronquiectasia.
5.- Sospecha de infecciones pulmonares micticas.
6.- Infeccin neumnica por micoplasma.
7.- Sospecha de neumona viral.
PROCEDIMIENTO:
Debe instruirse al paciente de que esta prueba requiere esputo traqueobronquial, una sustancia
de los pulmones, obtenida mediante expectoracin profunda.
1.- La muestra debe recolectarse en un frasco estril.

2.- El paciente debe estar en completo ayuno antes de la recoleccin.
3.- El esputo debe ser expectorado de los bronquios
4.- Hay que examinar la muestra antes de enviarla al laboratorio, para saber si es
verdaderamente esputo o slo saliva. (Por lo general es material purulento o mucopurulento).
CONSERVACIN Y ENVO DE LA MUESTRA:
1.- No debe refrigerarse la muestra.

2.- Deben enviarse las muestras al laboratorio rpidamente, de modo que los microorganismos
an sean viables.
3.- Deben etiquetarse las muestras con todos los datos del paciente.

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CULTIVOS DE HERIDAS
INTRODUCCION
El material procedente de heridas infectadas puede revelar una variedad de microorganismos

aerobios y anaerobios. Puesto que los anaerobios son la microflora predominante en seres
humanos y permanentemente se encuentran en vas respiratorias superiores, el aparato
gastrointestinal y el genitourinario tambin pueden invadir con facilidad otras partes del
cuerpo ocasionando infecciones graves y a menudo mortales.
PROCEDIMIENTO:
De preferencia se debe recolectar con ayuda de una jeringa estril.
1.- Aspire el material de 1 a 3 ml. de preferencia.

2.- Rotule la jeringa con todos los datos del paciente, incluya el sitio y las caractersticas
macroscpicas de la herida.
2.- Enve al laboratorio para su proceso.
Procedimiento para la recoleccin usando equipos con hisopos estriles.
1.- Abra el recipiente para la recoleccin, saque el hisopo y tome una muestra aplicando el
hisopo estril directamente sobre la fuente del cultivo.
2.- Inserte el hisopo dentro del medio de transporte o solucin salina estril.
3.- Debe tener cuidado de no tocar el extremo del hisopo.
4.- Si se sospecha infeccin por micobacterias u hongos, debe recogerse el exudado o el tejido
en lugar de usar hisopo.
5.- En caso de cultivo de heridas secas, los hisopos se deben humedecer con solucin salina
estril antes de usarlos.
6.- Rotule la muestra con todos los datos del paciente, incluya el sitio y las caractersticas
macroscpicas de la muestra.
7.- Enve al laboratorio para su proceso.

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SI ES POSIBLE TOMAR UN FROTIS DIRECTO DE LA MUESTRA SERIA DE

GRAN UTILIDAD EL EXMEN MICROSCPICO PARA COMPLEMENTAR EL
ESTUDIO.
LAS MUESTRAS MS TILES PARA EL ANLISIS SON EL PUS O LOS TROZOS

DE TEJIDO. TAMBIEN SON ACEPTABLES LAS CUBIERTAS DE HERIDAS QUE
SUPURAN.
OBSERVACIONES:
1.- El pus de lesiones estrptoccicas es delgado y seroso.

2.- El pus de infecciones estafiloccicas es gelatinosa.
3.- El pus de Pseudomona aeruginosa es azul verdoso.
4.- Las infecciones por actinomicosis muestran grnulos de azufre.

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PRACTICA No. 14
EXUDADO NASAL, TICO Y PTICO.
OBJETIVOS:
o El alumno conocer los principales cultivos a realizar para la identificacin de
microorganismos patgenos.
o Desarrollar las tcnicas para cultivo y el procedimiento para la realizacin del mismo.
o Utilizar las tinciones adecuadas para la identificacin de microorganismos.
MARCO TERICO
TCNICAS DE DIAGNOSTICO.
Para el diagnstico de las enfermedades infecciosas se utilizan seis categoras distintas de pruebas
de laboratorio. Estas incluyen frotis y tinciones, cultivos, inoculacin de animales, biopsias, pruebas
serologicas y pruebas cutneas. A continuacin se describir brevemente algunas de ellas:
El frotis.
El frotis se prepara distribuyendo una pequea cantidad de la muestra en una laminilla. Este
material tambin se puede teir, y generalmente se fija a la laminilla pasndola rpidamente a travs
de la flama de un mechero de Bunsen. Los frotis tambin se pueden fijar con una solucin de metanol
y posteriormente se observan con el microscopio.
La tincin.
Los frotis se observan despus de la tincin con colorantes, que son sales formadas por un
Ion positivo y otro negativo, uno de los cuales tiene color. Las estructuras dela muestra atraen los
colores y as como el microorganismo se puede ver con el microscopio de luz. Existe una tcnica de
tincin, llamada tincin negativa, en la que se colorea la base pero los microorganismos quedan
incoloros y ello permite el estudio de su estructura
Cultivos.
Para preparar un cultivo es necesario estimular la multiplicacin de los microorganismos o
celulas vivas en un medio especial que promueva el crecimiento del material en cuestin. Los cultivos
se guardan en tubos de ensayo, cajas de Petri, botellas de dilucin u otros recipientes. El recipiente
contiene un alimento (llamado medio de cultivo) que puede ser solido, semislido o liquido.
Cada microorganismo tiene sus propios requerimientos para crecer (que consisten en la
combinacin adecuada de ingredientes nutritivos, temperatura y presencia o ausencia de oxgeno). El
cultivo se prepara de acuerdo a las propias necesidades alimenticias y se refrigera o incuba,
dependiendo de la temperatura que precisa cada microorganismo.
TOMA DE MUESTRAS
EXUDADO CUTANEO
Toma: Con un hisopo de algodn se toma una porcin del exudado, evitando que sea muy superficial.
Inmediatamente se siembra en medios de cultivo adecuados (agar sangre, agar chocolate, PAI, etc.) o
se inocula en el medio de transporte de Stuart.
Envo: Las muestras se protegen del calor excesivo con un refrigerante.
EXUDADO FARINGEO

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Toma: Se pide al paciente que se siente y coloque su cabeza hacia atrs. Se ilumina bien la cavidad
orofarngea y con un abatelenguas se empuja la lengua hacia abajo para facilitar el acceso a la parte
posterior de la faringe. Con un hisopo de algodn se hace un raspado de las reas hipermicas,
purulentas o necrticas, as como de las membranas o manchas de Koplic, si es que las presenta.
Envo:
Agentes virales: El hisopo con la muestra se introduce en un tubo de tapn de rosca con 1 a 2 mL de
solucin salina isotnica estril. Se rompe la varilla de madera a la altura del tapn y se tapa
hermticamente.
Agentes bacterianos: El hisopo con la muestra se introduce en un tubo de tapn de rosca con medio
de Amies o de Stuart. Se rompe la varilla de madera a la altura del tapn y se tapa hermticamente.
EXUDADO NASOFARINGEO
Toma: Se pide al paciente que se siente y coloque su cabeza hacia atrs. Se introduce un hisopo de
alginato de calcio, dacrn o nylon (nunca de algodn en caso de sospechar Bordetella) por las fosas
nasales hasta la nasofaringe, sin tocar los cornetes y tratando de producir un acceso de tos. El hisopo
se mantiene in situ de 10-15 segundos durante el acceso de tos, despus de lo cual se retira
rpidamente.
Envo: Si la muestra no se va a procesar de inmediato, el hisopo se mantiene en un medio de
transporte y se enva de inmediato con refrigerante:
Agentes virales: El hisopo con la muestra se introduce en un tubo de tapn de rosca con 0.5 mL de
solucin salina isotnica estril. Se rompe la varilla de madera a la altura del tapn y se tapa
hermticamente.
Agentes bacterianos: El hisopo con la muestra se introduce en un tubo de tapn de rosca con medio
de Amies o de Stuart. Se rompe la varilla de madera a la altura del tapn y se tapa hermticamente.
EXUDADO URETRAL
Toma: Se recomienda al paciente que no orine por lo menos una hora antes de tomar la muestra. En
casos de gonorrea, cuando se produce un exudado abundante, se presiona ligeramente la uretra con
el fin de que lo expulse y ste se recoge con un hisopo de alginato estril el cual se deposita en el
medio de transporte de Stuart. Cuando se sospecha de una infeccin por clamidia, se emplea un
hisopo de alginato de calcio adecuado para toma de muestras en varones, el cual se introduce unos 2
a 4 cm en la uretra y se frotan las paredes haciendo girar el hisopo durante 5 a 10 segundos; con esta
muestra se deben hacer de inmediato frotes en portaobjetos limpios que se fijan con acetona.
Envo: El tubo y las preparaciones se enva lo antes posible de modo que no lleguen al laboratorio
despus de 24 horas.
EXUDADO VAGINAL Y ENDOCERVICAL

Toma: Se utiliza un espejo vaginal para revisar el crvix.
En caso de gonorrea no se hace ningn tipo de limpieza y se recoge una muestra de exudado con
ayuda de un hisopo; la muestra se debe sembrar de inmediato en la placa de agar de Thayer Martin y
slo que sto no sea posible, se puede transportar en medio de Stuart.
Cuando se sospecha de infeccin por clamidias, se limpia el exocrvix con un hisopo de algodn para
eliminar el moco y el exudado, se introduce el hisopo (de alginato de calcio o de dacrn, nunca de
algodn) o el cepillo unos 2 a 4 cm dentro del canal endocervical y se rota cuidadosamente
presionando contra la pared, evitando el contacto con las superficies vaginales. Con esta muestra se
deben hacer de inmediato frotes en portaobjetos limpios que se fijan de inmediato con acetona.
Envo: El tubo con el medio de transporte se enva lo antes posible de modo que no llegue al
laboratorio despus de 24 horas. No es necesario refrigerar la muestra. Las preparaciones se
envuelven individualmente y se envan protegidas de la luz y el calor excesivo.
HEMOCULTIVO
Toma: Se limpia el sitio de la puncin con una torunda de algodn impregnada con etanol al 70% o

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solucin de yodo al 2%. Si se trata de un adulto, se toman de 5 a 8 mL de sangre total, sin

anticoagulante, o de 2 a 3 mL si se trata de un nio, siguiendo las indicaciones que se describen en el
inciso M20. De inmediato la sangre se inyecta a travs del tapn (previamente desinfectado con
alcohol) de un frasco con medio bifsico para hemocultivo.
Envo: El frasco del hemocultivo se empaqueta bien en un recipiente con doble cubierta para evitar su
ruptura. No hay que refrigerarlo.
LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO (LCR):

Toma: La obtencin de la muestra es responsabilidad exclusiva del mdico quien la tomar bajo
rigurosas condiciones de asepsia. Se deben recuperar unos 5 mL los cuales se conservan en tubos de
vidrio estriles con tapn de rosca.
Envo: Cuando se trate de estudios virolgicos, la muestra se enva refrigerada. Si se sospecha de
una infeccin bacteriana, la muestra no debe refrigerarse, ni acompaarse de hielo. Cuando el envo
tarda ms de 24 horas, la muestra debe enviarse inoculada en medios especficos.
MATERIA FECAL
Toma: Las muestras fecales pueden ser obtenidas en recipientes limpios de boca ancha y con tapa
hermtica que permitan su fcil transporte, de preferencia que no sean de vidrio. Las heces obtenidas
del suelo, excusado as como del paal no son satisfactorias, debido a que pueden contaminarse con
material extrao.
Envo: La muestra se debe enviar de inmediato al laboratorio.
Estudios virales: el tiempo de envo debe ser menor a los tres das y en condiciones de refrigeracin,
con la cantidad de 10 gramos. Si se trata de hisopo rectal en solucin salina, sueros y L.C.R. en
envases apropiados correctamente sellados.
Estudios bacteriolgicos: se inocula en un medio de transporte (Cary Blair o Amies) y se enva a
temperatura ambiente
Estudios parasitolgicos: se adiciona formol al 10% v/v neutralizado y se homogeniza bien. El envo se
hace a temperatura ambiente.
Estudios para determinacin de coproantgenos por ELISA: el tamao que se enva ser similar al
tamao de una nuez independientemente de la consistencia.
Estudios parasitoscpicos: tres muestras consecutivas (de diferente da), el envo se hace a
temperatura ambiente. Cuando la muestra presente sangre y/o moco de preferencia mandar de esa
parte.
ORINA
Toma: Se usa un recipiente estril, de boca ancha con tapa de rosca. Aunque el sondeo vesical es la
forma ideal para evitar la contaminacin, debido a la posibilidad de extender la infeccin en el
paciente, se utiliza en casos muy excepcionales en el hospital. Por esto, la miccin espontnea es la
tcnica ms aconsejable: despus de una cuidadosa limpieza de la regin urogenital con agua y jabn
y despus con benzal al 1%, se instruye al paciente para que deseche la primera parte de la miccin y
se colecta el chorro medio. Slo en caso de sospechar parsitos, se usa la primera parte de la
miccin.
Envo: La muestra se debe enviar de inmediato al laboratorio con refrigerante. Estudios virales: el
envo debe tardar menos de un da.
CULTIVOS FARINGEOS. (CON HISOPO O LAVADO)
Valores normales
Negativo: No hay crecimiento.
Explicacin de la prueba.
1.- Los cultivos faringeos son importantes para diagnosticar las siguientes enfermedades:
a).- faringitis estreptoccica

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b).- Difteria: se debe tomar un cultivo faringeo y uno nasofaringeo

c).- Moniliasis
d).- Infeccin viral
e).- Infeccin amigdalina
f).-Faringitis gonoccica
g).- Bordetella pertussis y obtencin de virus.
2.- El cultivo faringeo puede ayudar a establecer el foco infeccioso en casos de:
a).- Escarlatina
b).- Fiebre reumtica
c).- Glomrulo nefritis hemorrgica aguda
3.- El cultivo faringeo se puede utilizar para detectar portadores de microorganismos como:
a).- Estreptococo hemoltico
b).- Neisseria meningitidis
c).- Corynebacterium diphtheriae
d).- Staaphylococcus aereus
INFORMACION PARA EL LABORATORIO MICROBIOLOGICO.
La muestra se debe rotular con los datos personales del paciente y el nombre del mdico.
Incluya lo siguiente:
1.- Fecha y hora de la recoleccin

2.- Sitio donde se tomo la muestra
3.- Tipo de muestra (tejido de granulacin, liquido de un absceso, secrecin de una herida quirrgica)
4.- Estudio que se pide.
5.- Diagnostico del paciente.
6.- Tratamiento actual con antibiticos.
MATERIAL Y REACTIVOS
Medios De cultivo
Hisopos estriles
Solucin fisiolgica
Medio de transporte
Estufa de incubacin
Portaobjetos
Microscopio
Reactivos para tincin de Gram
Equipo para tincin
Mecheros de Bunsen
Asa calibrada

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METODO
Toma de muestra
Stuart
P. fresco
Incubar 30 min. A 37 37 37 C
Tincin de Gram Mc. Conckey
Enterobacterias
Staphylococo Agar Sangre
SM Streptococo Gram
(+)
Sabouroud
Hongos
Agar Chte.
Haemophylus
Incubar durante 24 Hrs a 37 C y observar los resultados

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PRACTICA 2-15
UNIDAD DOS DE MICROBIOLOGIA
EXTRACCION Y MANEJO DE LA SANGRE PARA ANALISIS.
OBJETIVO
Que el alumno aprenda a obtener muestras de sangre con objeto de analizarla y conozca la manera
de tratarla segn el estudio para el que est destinada. Para lo cual deber desarrollar la siguiente
metodologa.
I. MARCO TEORICO.
II. INDICACIONES GENERALES.
III. METODOS:
1) Extraccin de sangre.
2) Obtencin de sangre completa o total.
3) Obtencin de suero sanguneo.
1. MARCO TEORICO:
La sangre es de importancia fundamental en la produccin, transmisin, diagnstico, prevencin y

curacin de enfermedades causadas por microorganismos o sus productos. Con el fin de estudiar
adecuadamente dichos procesos es necesario conocer adems la tcnica correcta de la extraccin,
las tcnicas para el manejo de sangre completa o de sus componentes dependiendo del tipo de
anlisis al que se le vaya a destinar; comnmente sta se maneja para obtener.
A) Sangre completa o total.
B) Suero sanguneo.
Sangre completa o total:
Se conoce como sangre completa o total al tejido sanguneo lquido constituido por la fraccin liquida
que es el plasma y los elementos figurados tales como: eritrocitos, leucocitos y plaquetas. Si se desea
que la sangre extrada se conserve como tal, se debe evitar la coagulacin de la misma, para lo cual
basta aadir un anticoagulante al tubo de
Los anticoagulantes generalmente son soluciones de oxalatos de potasio, de citrato de sodio,
heparina o sales del EDTA (cido etilen diamino tetra actico).
El procedimiento ms sencillo consiste en aadir una gota de la solucin acuosa anticoagulante por
cada 5 mLde sangre. Despus de recibir la sangre en el tubo, se tapa ste y se mezcla suavemente
por inversin para que el anticoagulante se distribuya homogneamente. Esta preparacin se conoce
como sangre total o sangre anticoagulada. Si se desea plasma habr que centrifugar para acelerar la
sedimentacin de los elementos figurados. El plasma deber ser un lquido transparente amarillento
claro. observa este de un color rojizo o francamente rojo, es seal de que hubo hemlisis, lo que
significa que esta muestra sangunea no es idnea para anlisis y deber desecharse y obtenerse una
nueva muestra.
Suero sanguneo:
Se denomina suero sanguneo o simplemente suero al lquido transparente de color pajizo que es el
plasma menos los componentes de la coagulacin.
La coagulacin de la sangre es un fenmeno muy complejo en el cual intervienen por lo menos 15
factores (factores de coagulacin). Este proceso guarda estrecha relacin con la fibrinlisis (un

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sistema que impide la coagulacin dentro de los vasos sanguneos y desintegra los cogulos), por
cuanto el factor contacto o factor XII de coagulacin interviene en iniciacin de ambos procesos.
El plasma sanguneo contiene varias sustancias, como fibringeno (factor I) y otras protenas de la
sangre, que son factores intrnsecos formados principalmente en el hgado; stos hacen que la sangre
se coagule cuando abandona el cuerpo. Dentro del cuerpo algunas sustancias normalmente existen
en el plasma conservan la sangre en estado fluido.
Pero cuando se escapa la sangre, se inicia el mecanismo de coagulacin y tiene lugar la coagulacin
de la misma en un tiempo de dos a seis minutos. Cuando el coagulo se retrae espontneamente o por
centrifugacin, se lleva consigo los glbulos rojos y blancos quedando como sobrenadante el suero.
En condiciones anormales, un suero lechoso o quiloso indica una comida reciente mientras que un
color rojizo o rojo es seal de hemlisis. No es conveniente utilizar muestras en estas condiciones
para ningn tipo de anlisis.
Las causas ms frecuentes de hemlisis son: vaciar la sangre de la jeringa con la aguja puesta,
empujar el mbolo rpidamente, material de vidrio hmedo o caliente o con residuos de substancias
como detergentes, alcohol, etc.
11. INDICACIONES GENERALES:
1) Usar solo material estril para la extraccin de sangre, de preferencia que sea desechable.
2) Tanto el material para extraccin como material de vidrio debern estar perfectamente limpios (sin
residuos de sustancias qumicas o detergentes) y secos.
3) Asegurarse de que todo el material necesario se encuentre disponible ANTES de iniciar la tcnica
de extraccin sangunea.
111. METODOS.
MATERIAL, REACTIVOS y EQUIPO:
Jeringa estril desechable, de 10 mI (1) Aguja hipodrmico # 21

Tubo de goma ltex para ligadura.
Tubos de ensaye 13Xl00 (4)
Gradilla p/tubos 13xl00 (1)
Solucin anticoagulante (EDTA, oxalatos u otro) Torundas con alcohol.
Centrfuga clnica.
1. EXTRACCION DE SANGRE VENOSA.
La extraccin de la sangre se efectuar a un alumno voluntario de cada equipo, al que se le indic con
24 horas de anticipacin que debe de permanecer en ayunas hasta el momento de la extraccin.
1. Hacer un torniquete con la ligadura en un brazo, unos 7 cm. arriba del pliegue del codo.
2. Tratar de localizar y palpar profundidad, una vena fija y de buen calibre.
3. Limpiar la zona de puncin con una torunda con alcohol de uso clnico.
4. Esperar unos segundos para que se evapore el exceso de alcohol.
5. Tomar la jeringa ya provista con la aguja. Retira el protector de la aguja.

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6. Introducir la aguja firmemente en la piel, siempre con la parte bicelada hacia arriba.
7. Si se introdujo correctamente la aguja en la vena, comenzar a fluir la sangre en la

jeringa, en cuyo caso se jalar lentamente el mbolo hasta que se obtenga el volumen de
sangre necesario.
8. Una vez obtenida la sangre, se suelta el torniquete y se retira con cuidado la aguja. Sobre
el punto de entrada de la aguja se coloca una torunda con alcohol y se mantiene el brazo
del donador en posicin estirada por unos cinco minutos.
9. Distribuir la sangre en los recipientes adecuados dependiendo de si se usar para suero o

como sangre completa.
2. OBTENCION DE SANGRE COMPLETA O TOTAL.
Una vez obtenida la sangre, su manejo deber de hacerse con rapidez, para evitar su coagulacin
dentro de la jeringa.
1. Separar la aguja de la jeringa.
2. Disponer de un tubo de 13x100 conteniendo una gota de anticoagulante. Vaciar en

este 5 mL de sangre, presionando suavemente del mbolo de la jeringa.
3. Tapar el tubo y mezclar suavemente por inversin su contenido durante 10 veces.
4. Rotular la muestra con una etiqueta adhesiva que mencione: nombre del donador,
nmero de equipo, facultad y fecha.
Esta muestra de sangre anticoagulada est disponible para ser sometida a anlisis clnica por
ejemplo: Biometra hematica, velocidad de eritrosedimentacin o tipo sanguneo entre otros.
3. OBTENCION DE SUERO SANGUNEO.
1. Separar la aguja de la jeringa.
2. Disponer de un tubo 13x100 (SIN ANTICOAGULANTES). Vaciar en ste 5 mI de la sangre

extrada.
3. Rotular el tubo con una etiqueta adhesiva mencionado: nombre del donador,
4. nmero de equipo, escuela y fecha.
5. Dejarlo en reposo a temperatura ambiente durante algunos minutos (5 a 10 min.) para que
se coagule la sangre.
6. Trascurrido este tiempo, despegar con un aplicador de madera el coagulo, teniendo

cuidado de no retirar fuera del tubo ninguna porcin del coagulo formado.
7. Llevar la muestra a centrifugar a 3,000 rpm durante 10 min.(calibrndolo con otro tubo con
agua).
8. Retirar el tubo de a centrifuga.

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9. Disponer de una pipeta pasteur provista de gotero. Eliminar el aire del bulbo gotero
presionndolo y sin volverlo a soltar introducirlo al tubo sumergindolo solamente en el
seno del suero, sin tocar el paquete globular sedimentado.
10. Quitar la presin manual que se est aplicando al gotero y dejar que se aspire el suero
sanguneo. Pasarlo a un tubo de ensaye 13x100 limpio y seco. Repetir esta operacin
cuantas veces sea necesario para extraer todo el suero.
El suero sanguneo as obtenido puede emplearse de inmediato para su anlisis o bien puede
almacenarse en condiciones aspticas o de ser posible de esterilidad en refrigeraci6n o en
congelaci6n. Los anlisis en los que se utiliza suero son por lo regular: reacciones inmuno16gicas
(reacciones antgeno-Anticuerpo Ag Ab), qumica sangunea, etc.
IV. REPORTE.
1. Representar esquemticamente la secuencia del mtodo para la obtencin de sangre

completa.
2. Representar esquemticamente la secuencia del mtodo para la obtencin de suero

sanguneo.
3. Investigar el manejo de la centrifuga clnica. Representacin esquemas la colocacin

de los tubos etc.
4. Investigar fisiologa del mecanismo de la coagulacin sangunea.

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PRACTICA 2-16
PRUEBA DE PRECIPITINAS (FLOCULACION) I PARA EL DIAGNOSTICO DE LA SFILIS.
OBJETIVO
Conocer la tcnica de la prueba de precipitinas (o floculacin) ms frecuentemente empleada en el

diagnstico serologico (inmunolgico) de la enfermedad llamada sfilis, mediante la siguiente
metodologa:
I. MARCO TEORICO
II. METODOS.
V.D.R.L. Prueba cualitativa
V.D.R.L. Prueba cuantitativa
III. REPORTE.
MARCO TEORICO.
La sfilis es una enfermedad venrea transmisible, causada por una bacteria de la familia de las
espiroquetas:
Treponema pallidum. Se transmite pon contacto sexual directo o por va intrauterina. La bacteria fue
descubierta en 1905 por el cientfico alemn Fritz Richard Schaudinn, analizando las ulceras
primarias (chancros) de personas infectadas con sfilis. Este microorganismo nunca se ha podido
cultivar en medios artificiales
(No vivos) conservando su virulencia, aunque se logran cultivos de espiroquetas no virulentas muy
similares a T. pallidum. Una espiroqueta usualmente muy empleada como fuente de antgeno para
pruebas diagnsticas serolgicas de sfilis es el Treponema de Reiter, otra es el Treponema de
Nichols. El T. pallidum de conservarse vivo y mvil durante cierto tiempo en medios artificiales y en
cultivos de tejidos similares (2 a 2.5 das) pero se multiplica muy poco o nada.
Se espera que la inmunizacin contra la sfilis resulte posible. Sin embargo, la preparacin de la
vacuna depende del cultivo del microorganismo con mtodos todava no conocidos.
Los mtodos de laboratorio para el diagnstico de la sfilis se pueden agrupar en tres categoras:
1. Demostracin de los Treponemas mediante microscopio a travs de frotis de material de lesiones

en: a) tincin negativa, b) impregnacin argntica, c) campo oscuro, d) contraste de fases, e)
microscopia de florescencia.
2. Reacciones inmunolgicas inespecficas, tales como: Pruebas de fijacin del complemento y la

prueba de precipitina o floculacin. Estas ltimas son as llamadas porque en condiciones adecuadas
originan agregados o acumulos visibles en las reacciones positivas. Diversas formas de reacciones
de precipitina llevan los nombres de las personas o los equipos tcnicos que los crearon, Kahn,
Kline, Mazzinni, V.D.R.L. (Venereal Research Laboratory), R.P.R. (Rapid plasma Reagin). Estas
pruebas no son especficas porque ninguno de los antgenos empleados son de origen treponmico.
En el caso de la prueba V.D.R.L., el antgeno es la cardiolipina lecitina purificada, una sustancia de
naturaleza
Qumica compleja pero que fundamentalmente contiene lpidos que no tienen relacin con T.
pallidum pero que por causas desconocidas reaccionan especialmente con sueros de pacientes
sifilticos. En este mtodo no son raras las reacciones positivas falsas en personas normales o en

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pacientes con enfermedad no sifiltica. Se ha comprobado que-en el 70 a 80% de los casos de sfilis
confirmada dan reaccin positiva.
3. Pruebas diagnsticas especficas. Estas pruebas suelen aplicarse cuando existe duda acerca del
resultado de las pruebas inespecficas. Las ms usuales son: a) Prueba de inmovilizacin del
Treponema pallidum, TPI); b) prueba especfica de fijacin del complemento, TPCF; c) Prueba de
fijacin del complemento de Reiter; d) tcnica de anticuerpos fluorescentes.
Equipo para VDRL que contiene:

Antgeno concentrado: cardiolipina lecitina purificada.
Sol. Buffer diluyente para el antgeno.
Pipetas de 0.1 mI (2)
Pipeta de 1.0 mI
Suero sanguneo no bemolizado.
Solucin control negativo.
Placa de aglutinacin.
Pipetas Pasteur con gotero (2)
Bao mara a 60 C.
Microscopio compuesto.
Rotator de Kahn.
1. PRUEBA CUALITATIVA: VDRL
1) Inactivar de 0.5 a 1.0 mL de suero sanguneo; llevar a bao mar1a a 60C el suero en un tubo de
13xl00 durante 3 minutos.
2) Preparar el antgeno de cardiolipina lecitina purificada en un tubo de 13x100 de la siguiente

manera:
2),a) Pipetear 0.1 mL de sol. Buffer (pipeta de 0.l mL)
2),b) Pipetear 0.1 mL de ant1geno concentrado: CLP, (pipeta de 0.1 mL)
2),c) Agitar por golpeteo durante 1 minuto.
2),d) Pipetear 1.0 mI de sol. buffer (pipeta de 1.0 mL)
2),e) Agitar por golpeteo durante 1 minuto.
3) Con una pipeta Pasteur con gotero, depositar una gota del suero inactivado en una excavacin de
la placa de aglutinacin. Este es el ensayo que llamaremos "Problema".
4) En la excavacin siguiente depositar una gota de sol. de control negativa, (por ejemplo: NaCI
O.85%).
5) Con una pipeta Pasteur con gotero, aadir a cada una de las excavaciones una gota de la emulsin
antignica preparada en el paso 2), debidamente agitada antes de usarse.

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6) Mezclar cada ensayo con un aplicador de madera para homogeneizar la reaccin.
7) Trasladar la placa a un agitador de Kahn. Agitar por rotacin a 180 rpm durante 3 minutos.
8) Observar al microscopio con objetivo 10X. Observar.
primero el control negativo y despus el problema.
9) Interpretar el ensayo problema por comparacin con el control negativo; de la siguiente

manera:
a) Control negativo: Se deber observar sin grumos o con leve grado de aspereza,
dado por las partculas de antgeno.
b) Suero problema: Se valora a criterio de la siguiente

- NEGATIVO: si es idntico al control negativo.
- POSITIVO DEBIL: si se observan grumos pequeos.
- POSITIVO FUERTE: si se observan grumos grandes sin partculas.
2. PRUEBA CUANTITATIVA.
Las reacciones cuantitativas se efectan usando una serie de sueros diluidos en solucin salina y
cada dilucin se trata como suero individual y se ensaya de la misma manera que se describe para
la reaccin cualitativa.
1) Disponer una serie de seis tubos de 13x100 o ms si resulta necesario.
2) Pipetear 0.5 mI de solucin salina (NaCl 0.9 %) en cada uno de los tubos.
3) Agregar 0.5 mI del suero inactivado al tubo 1. Mezclar bien por golpeteo.
4) Pasar 0.5 mI de la dilucin anterior al tubo Mezclar bien por golpeteo
5) Se repite esta operacin (paso 4) hasta que el sexto o ltimo tubo contenga 1.0 mI de dilucin.
De esta manera se preparan diluciones al 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32! 1:64, etc.
6) Ensayar cada reaccin serolgica de la misma manera que si fuera el suero sangu1neo para la
reaccin cualitativa.
7) Reportar los resultados en trminos de la mayor dilucin serolgica que produce una reaccin
positiva franca (no positiva dbil).
REPORTE:
1. Representar con esquemas el proceso de inactivacin del suero sanguneo.
2. Representar con esquemas el proceso de presentacin del antgeno CLP o emulsin

antignica.

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3. Representar con esquemas las reacciones antgeno anticuerpo.
4. Representar los campos microsc6picos correspondientes a cada ensayo.
5. Interpretar concretamente (dar resultado) el suero problema analizado.

6. Investigar por lo menos dos de los mtodos de demostracin de treponema pallidum por
microscpica.
7. Investigar por lo menos dos de las pruebas diagnsticas cuantitativa.
8. Representar con esquema el proceso de diluciones para la reaccin cuantitativa.
9. Interpretar concretamente los resultados de las diluciones. Dar el ttulo o valor de la
cuantificacin de los anticuerpos analizadas.

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PRACTICA 217
REACCIONES DE AGLUTINACIN PARA EL DIAGNOSTICO DE REACCIONES FEBRILES.
OBJETIVO:
Que el alumno realice e interprete las reacciones antgeno-anticuerpo de aglutinacin

para el diagnostico de las enfermedades infecciosas fbriles; para lo cual deber desarrollar la
siguiente metodologa.
I. MARCO TEORICO.
II. METODOS.
1. Reaccin cualitativa en placa.
2. Reaccin cuantitativa en placa.
III. REPORTE.
I. MARCO TEORICO.
Las reacciones de aglutinacin son ampliamente usadas como ayuda del diagnostico de
enfermedades como la fiebre tifoidea, fiebre de malta, brucelosis, y tifo.De los seis antgenos que
bsicamente se emplean, en cinco de ellos se utilizan las propias bacterias como antgenos para
demostrar la presencia anticuerpos especficos, con lo cual se deduce el antigeno etiolgico de la
enfermedad. La excepcin es el antgeno de Proteus OX19, que se emplea para detectar mediante
aglutinacin a los antgenos de Rickettsia prowasekii, llamndosele a esta reaccin de Well felix. A la
reaccin con el antgeno de Brucella abortus sele conoce como Reaccin Huddleson; mientras que la
reaccin efectuada con los antgenos de Salmonella se les domina como Reaccin de Widal.
II. METODOS
Equipo de antgenos para reacciones febriles:

Antgeno Proteus OX-19.
Antgeno Brucella abortus.
Antgeno Salmonella typhi O
Antgeno Salmonella typhi H
Antgeno Salmonella paratyphi A
Antgeno Salmonella paratyphi
Suero control negativo (suero fisiolgico)
Suero control positivo.
Placa de aglutinacin (mazzinni)
Pipeta pasteur con gotero.
Suero sanguineo.
Pipetas de 0.1 mL (2).
Microscopio compuesto.
Rotator de Kahn.
1. PRUEBA CUALITATIVA EN PLACA.

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Para este mtodo se realizan reacciones individuales con cada uno de los seis antgenos, debiendo
hacerse la interpretacin microscpico de cada una en forma individual en virtud de que si se analiza
el conjunto de reacciones hasta el final, se lleva el riesgo de que estas se sequen y su valoracin
puede resultar dudosa o falsa.
1. Seleccionar uno de los seis antgenos del equipo de reacciones febriles.
2. Anotar en una hoja de reporte el nombre del antgeno con que se esta trabajando, a fin
de llevar un registro exacto de los resultados de cada uno.
3. Disponer de una placa de aglutinacin perfectamente limpia y seca. Seleccionar una hilera
de tres excavaciones.
4. En la primera excavacin colocar una gota de solucin control positivo debidamente

agitado por inversin y a temperatura ambiente.
5. En la siguiente excavacin colocar una gota de suero sanguneo, a temperatura ambiente.

Este es el ensayo problema.
6. En la tercera excavacin colocar una gota de solucin control negativo, a temperatura

ambiente.
7. Adicionar a cada uno de los ensayos una gota del antgeno seleccionado, debidamente
agitar por inversin y a temperatura ambiente.
8. Mezclar cada uno de los ensayos con un aplicador de madera diferente para cada caso.
9. Trasladar la placa a la maquina rotatora para agitar por rotacin las reacciones a 180 rpm
durante un minuto.
10. Observar los ensayos al microscopio con objetivo 10X, comenzando por el control
positivo, despus el control negativo y finalmente el suero problema.
11. Interpretar el suero problema comparndolo con los controles, a fin de evaluar si este es
positivo, en cuyo caso se deber indicar el grado de aglutinacin, de acuerdo a la
siguiente escala:
Interpretacin macroscopica:
Aglutinacin total o de 100 % (++++)
Aglutinacin parcial de 75% (+++)
Aglutinacin parcial 50% (++)
Aglutinacin negativa 0% (+)
12. Anotar los resultados.
13. Repetir el mismo procedimiento para los cinco restantes.
14. Luego para realizar las reacciones con los seis antgenos se proceden a efectuar el
mtodo cuantitativo con aquellos antgenos que hallan dado reaccin positiva con (++)
o ms.
2. PRUEBA CUANTITATIVA.

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Las reacciones cuantitativas se efectan usando suero individual y en las pruebas

que resultaron positiva, se describe a continuacin:
1. Seleccionar uno de los antgenos que hallan dado la reaccin cualitativa positiva.
2. Anotar en una hoja de reporte el nombre del antgeno seleccionado, a fin de llevar un
registro exacto de los resultados.
3. Disponer una placa de aglutinacin. En cinco excavaciones consecutivas, depositar

respectivamente 0.08, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005 mL de suero problema. Usar una pipeta
de 0.1 mL.
4. Adicionar a cada una de las excavaciones, una gota de antgeno seleccionado,

debidamente agitado por inversin y temperatura ambiente.
5. Mezclar cada una de las reacciones con un aplicador de madera, usando uno
diferente para cada caso.
6. Trasladar la placa a la maquina rotatora de kahn y agitar a 180 rpm durante un minuto.
7. Observar los ensayos al microscopio con objetivo 10X e interpretar cada uno de ellos
comparndolo con las experiencias anteriores de los controles positivo y negativo.
8. Anotar las diluciones en las que dio reaccin positiva (++) o ms, empleando la misma
escala de valoracin de aglutinacin que para la reaccin cualitativa.
9. Reportar el valor o titulo de la reaccin, siendo ste, la reciproca de la ltima dilucin

que nos d reaccin positiva verdadera o sea de (++) o ms.
Se considera que las cantidades de suero empleadas en cada ensayo o reaccin son equivalentes a
cierta dilucin del suero, ya que el diluyente del antgeno acta tambin como diluyente del suero, as
se tiene las siguientes equivalencias:
mL de suero Dilucin Ttulo

0.08 1 / 20 20
0.04 1 / 40 40
0.02 1 / 80 80
0.01 1 / 160 160
0.005 1 / 320 320
De manera que s un suero diera con cierto antgeno todas sus diluciones positivas verdaderas, con (+
+) o ms, le corresponde a un titulo de 320.
10. En caso de tener positividad cualitativa con otros antgenos hacer la titulacin o
reaccin cuantitativa con cada uno de ellos repitiendo exactamente el mtodo anterior.

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ANTIGENO PATOLOGIA TIEMPO DE TITULO TITULO

MAX. SIGNIFICATIVO
Salmonella tiphy O Fiebre tifoidea 3 a 5 semanas 1: 80
Salmonella tiphy H Fiebre tifoidea 4 a 5 semanas 1: 80
S. paratiphy A Fiebre paratifoidea 3 a 5 semanas 1: 80
III. REPORTE
1. Representar los diagramas de las tcnicas realizadas para cada una de las reacciones
Ag- Ab del equipo de reacciones febriles en la prueba cuantitativa.
2. Anotar el resultado obtenido para cada reaccin: Positivo o Negativo y el grado de

aglutinacin con signos de (+) si es que la hubo.
3. Representar con esquemas las pruebas realizadas en forma cuantitativa o titulacin de

las reacciones preliminares que hallan resultado positivas con ms de (++)
4. Representar los campos microsc6picos correspondientes a cada ensayo.
5. Interpretar concretamente (dar resultado) el suero problema analizado.

6. Investigar las caractersticas generales de las bacterias observadas en esta prueba.
7. Mencionar en que formas se puede diagnosticar la bacteria analizada.
NOTA: SIEMPRE que se utilice el mismo mtodo, sino hay modificaciones.

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PRACTICA 2-18
REACCION DE PRECIPITACION PARA LA DETERMINACION DE LA PROTEINA C
REACTIVA
OBJETIVO:
El alumno realizar el mtodo para la analizar la pruebas de Protenas C Reactiva con fines de
diagnstico clnico, en determinacin cualitativa y cuantitativa, desarrollando la siguiente metodologa.
IV. MARCO TEORICO.
II. METODO:
1) Prueba cualitativa
2) Prueba cuantitativa.
III. REPORTE.
1. MARCO TEORICO:
La prote1na C reactiva es una globulina alfa anormal; su nombre proviene de qu puede formar un
precipitado con el polisacrido somtico C de los neumococos. Esta prote1na se encuentra en
personas que sufren de infecciones agudas bacterianas y en trastornos inflamatorios no infecciosos y
ha dado origen a una prueba capilar y a una prueba rpida de precipitacin en placa. La PCR no se
encuentra en sujetos normales y desaparece cuando cura el enfermo.
El mtodo original de Anderson y McCarthy utiliza un tubo capilar que contiene partes iguales de
anti-suero de PCR y de suero del paciente.
Otro mtodo que se utiliza con frecuencia es la prueba de precipitacin en placa de fondo oscuro.
Cuando la prueba resulta positiva es necesario efectuar una cuantificacin, para lo cual se preparan
diluciones progresivas de suero problema y se tratan una a una, de la misma manera que para la
prueba cualitativa.
Equipo de diagnstico para PCR en placa.

Suero sanguneo no hemolizado.
Pipeta Pasteur con gotero.
Maquina rotadora de kahn.
Tubos de ensaye 13x 100 (6)
Gradilla.
l. PRUEBA CUALITATIVA:
La prueba de PCR ltex se basa en una tcnica desarrollada por Senger. Las molculas inertes
biolgicamente de poliestireno ltex no sensibilizadas con anti-PCR (suero obtenido de animales
inmunizados). La PCR presente en el suero del paciente sirve como antgeno que cuando se
mezcla con el ltex sensibilizado produce una precipitacin detectable microscpicamente.
1. Disponer los reactivos del equipo para PCR y el suero sanguneo a temperatura
ambiente. No se deben de usar a temperatura de refrigeracin.
2. Depositar en la seccin.
3. izquierda de la placa de fondo oscuro una gota de la solucin control negativa.

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4. Depositar en la siguiente seccin de la placa una gota del suero del paciente. Debe de
ser fresco, no hemolizado y sin turbidez.
5. Depositar en la seccin derecha de la placa una gota de la solucin control positivo.
6. Mezclar con un aplicador cada uno de los ensayos por separado, evitando que se
mezclen entre s.
7. Trasladar la placa con los ensayos a la maquina de kahn a 180 rpm durante un min.
8. Observar resultados microscpicamente. Interpretar el suero problema por comparacin

con los controles de la siguiente manera:
9. En caso de que el suero problema resulte positivo, proceder a efectuar la prueba

cualitativa.
PRUEBA NEGATIVA:
Se observa una suave y ligera suspensin granular sin precipitacin macroscpica.
PRUEBA POSITIVA:
Deber mostrar una suspensin granular ms fuerte que la prueba negativa. En ocasiones se separan
los grnulos precipitados de la solucin diluyente.
2. PRUEBA CUANTITATIVA:
1. Preparar diluciones del suero sanguneo detectado como positivo, en la proporcin 1:4,
1:8, 1:16, 1:32, etc., empleando como diluyente el buffer contenido en el equipo.
2. Depositar una gota de cada dilucin en secciones sucesivas de la placa de fondo oscuro.
3. Los controles positivo y negativo se incluirn a criterio. No son necesarios puesto que ya
se interpretaron en la prueba cualitativa.
4. Adicionar una cuidadosamente una gota del reactivo de ltex de anti-PCR a cada gota
de las diluciones problema, evitando siempre el contacto entre ambos reactivos.
5. Mezclar cada reaccin con un aplicador de madera.
6. Trasladar la placa a la mquina rotador a 180 rpm durante un minuto.
7. Observar los ensayos macroscpicamente. Interpretar cada uno por comparacin con
los controles positivo y negativo de la misma manera que la prueba cualitativa.
8. Reportar el titulo de la reaccin, recordando que TITULO es la reciproca de la dilucin

ms alta que exhibe reaccin positiva, (o de igual manera, de la ltima dilucin que
exhibe reaccin positiva.
III. REPORTE:
1. Representar cada uno de los pasos de la prueba cualitativa.

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2. Anotar el resultado del suero problema.

3. Representar cada uno del suero problema cuantitativo.
4. Anotar el titulo del suero problema cuantificado.
PRACTICA 2-19
TITULO DE ANTIESTREPTOLlSINAS O
Demostrar la, reaccin inmunolgica de neutralizacin txina-antitxina y el mtodo de

cuantificacin o titulacin de antiestreptolisinas O; para lo cual deber desarrollar la siguiente
metodologa:
I. MARCO TEORICO.
II. METODOS.
II. REPORTE.
I. MARCO TEORICO:
La presente prctica describe la neutralizacin in vitro de una hemolisina bacteriana, la

estreptolisina O, que se maneja en el mtodo como reactivo con funcin de txina o antgeno ser
neutralizado por la concentracin existente de antiestreptolisinas O en el suero sanguneo del
paciente. Esta prueba es til para el diagnsticode la fiebre reumtica, glomrulo nefritis aguada y
otras infecciones por Streptococcus beta hemoliticcus. En estos casos es frecuente que el titulo de
antiestreptolisinas O se encuentre por arriba de los valores normales.
Esta prueba mide la cantidad de antitxina (la antiestreptolisina O) producida por el sistema
inmunolgico del husped como respuesta a la txina (la hemolisina del tipo estreptolisina O) del
Streptococcus beta hemolyticcus.
II. METODOS.
MATERIAL, REACTIVOS y EQUIPO.
Suero sanguneo fresco y sin hemlisis. Sangre anticoagulada (2 mL)

Sol. Buffer para AEO, (50 mL)
Suero fisiolgico, (50 mL)
Reactivo de estreptolisina O.
Agua destilada.
Tubos de 13x100, (12)
Gradilla para 12 tubos.
Tubos cnicos de plstico, (2)
Pipetas de 1.0 mL(4)
Pipetas de 5 mL, (3)
Pipetas de 10 mL, (2)
Bao Mara 37 C.
METODO:
l. PREPARACION DE LAS DILUCIONES PRIMARIAS DE SUERO.
Se preparan originalmente tres diluciones a partir del suero sanguneo problema, sin hemlisis, sin
turbidez y sin Inactivar de la siguiente manera: DILUCION A: 1:10

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a) En un tubo de 13x100 rotulado como "A" depositar con pipeta de 1.0 mL rotulada como A, 0.5 mL
del suero sanguneo.
b) Adicionar con la pipeta de 5.0 mL rotulada como Buffer, 4.5 mL de la solucin de Buffer que se ha
proporcionado en la charola de reactivos.
c) Tapar el tubo con tapn de hule con papel parafilm y mezclar la dilucin por inversin por tres
veces.
d) Conservar sobre la mesa las pipetas que han sido utilizadas, ya que se seguirn usando.
DILUCION B: 1:100
En tubo de ensaye de 13x100 rotular como B depositar con pipeta de 1.0 mL rotulada como B, 0.5
mL de dilucin A
a) Adicionar con la pipeta de buffer, 4.0 mL de la solucin buffer que se esta utilizando.
b) Tapar los tubos con papel parafilm o tapn de hule y mezclar la dilucin por inversin
por tres veces.
c) Conservar sobre la mesa las pipetas que han sido utilizadas, ya que se usarn
posteriormente.
III. PREPARACION DEL REACTIVO ANTIESTREPTOLISINA O.
Este reactivo se proporciona en la charola de reactivos, en un frascompula sellado, en forma

deshidratada e inactivo. Para activarlo se deber agregar hidrosulfito de sodio y agua destilada, de la
siguiente manera.
a) Retirar el sello del frasco mpula de Estreptolisina.

b) Tomar los dos tubos capilares que contienen el hidrosulfito de sodio, abrirlo,
rompiendo un extremo de cada uno de los tubos y vaciar su contenido ntegro al
interior del frasco mpula de estreptolisina o liofilizada.
c) Adicionar al compuesto anterior 10 mL de agua destilada con una pipeta rotulada
como tal.
d) Tapar el frasco mpula y agitar vigorosamente por inversin hasta que el reactivo se
halla disuelto completamente.
e) Rotular una pipeta de 1.0 mL como Estreptolisina O.
III. PREPARACION DE LA SUSPENSION DE GLOBULOS ROJOS 5%
Para este reactivo se pueden emplear glbulos rojos de conejo o humanos de

cualquier tipo, no importa que no provengan del paciente al que se le har el estudio. Las clulas se
debern de lavar tres veces con suero fisiolgico, para finalmente suspender las al 5% en solucin
buffer.
1. En un tubo de centrifuga de plstico, de 15 mI, depositar con una pipeta o por tanteo, 1.0
mI de sangre fresca anticoagulada.
2. Adicionar suero fisiolgico (NaCl 0.85%) hasta la marca de 10 mI del tubo de centrifuga,
con una pipeta de 10 ml rotulada como suero fisiolgico
3. Tapar el tubo con un tapn de hule o con papel "parafilm" y mezclar suavemente (para
evitar hemlisis) por inversin por tres veces .Retirar el tapn.
4. Rotular el tubo con el nmero de equipo y llevar a la centrifuga clnica; que una vez que
estn debidamente colocados los tubos de todos los equipos, centrifugar a 2,500 rpm

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durante 3 minutos.
5. Retirar el tubo de la centrifuga y por decantaci6n o con ayuda de una pipeta de 10 provista
de perilla o de succionador eliminar el liquido sobrenadarte de las clulas rojas. Este es el
primer lavado de los glbulos.
6. Adicionar nuevamente suero fisio16gico hasta la marca de 10 del tubo.
7. Repetir los pasos c, d, e, para efectuar el segundo lavado de los glbulos rojos.
8. Adicionar nuevamente suero fisiolgico hasta la marca de 10 del tubo.
9. Repetir los pasos c,d,e, para efectuar el tercer lavado de las clulas. Conservar el
paquete globular integro, sin residuos desobrenadarte. Preparar con ello la suspensi6n
al 5%
10. Como el tubo de centrifuga est graduado, conservar solamente 0.5 mI de paquete
globular., eliminando por succin con pipeta pasteur si es que el volumen de glbulos es
mayor.
11. Adicionar 9.5 mL de solucin buffer con la pipeta buffer.
12. l)"Tapar el tubo y mezclar suavemente por inversin hasta homogenizar la suspensin de
glbulos rojos al 5 %.
13. Rotular una pipeta de l. O mI como "GR 5%" Y mantenerla dispuesta hasta el momento de
su uso.
IV. METODO: DILUCIONES PARA LA PRUEBA "ASTO".
1. l. Disponer una gradilla con 12 tubos de ensaye de 13 x 100. Rotulados del 1 a 10;
los restantes uno como control positivo otro como control negativo.
2. Efectuar con cada uno de ellos las diluciones y las reacciones de neutralizacin
txina-antitxina de acuerdo a la tabla de titulacin por diluciones impresa en la
pgina siguiente; empleando para ello los reactivos que previamente sean
preparado.
INTERPRETACION
CONTROL POSITIVO: Deber presentar ausencia total de hemlisis, lo cual se manifiesta por la
sedimentacin de los glbulos rojos en el fondo del tubo y el l1quido sobrenadarte totalmente cristalino
e incoloro.
CONTROL NEGATIVO: Deber presentar hemlisis total, lo cual se manifiesta por la destruccin de
los glbulos rojos que al liberar la hemoglobina pigmentan la solucin de color rojo. No deber
presentar glbulos rojos sedimentados.
DILUCIONES PROBLEMA: Son los tubos del 1 al 10. Se comparan contra los controles; as, el tubo
que presenta hemlisis es negativo, mientras el tubo que no presente hemlisis es positivo. El valor de
la prueba se expresa en UNIDADES TODD y representa el titulo de la cuantificacin de
Antiestreptolisinas O y estar determinado por el inverso (o la recproca del valor de la ltima dilucin

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CIFRAS NORMALES:
que presente reaccin positiva.
DILUCION
A A B B B B C C e C + -
REQUERIDA
TUBOS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 + -
UOLUMEN DE CADA
0.8 0.2 1.0 0.6 0.4 0.3 1.0 0.8 0.6 0.4 0 0
DILUCION EN mL
UOLUMEN DE
SOLUCION 0.2 08 0.0 0.4 0.6 0.7 0.0 0.2 0.4 0.6 1.0 1.0
Buffer mL
*AGITAR CAD UNO DE LOS TUBOSPOR GOLPETEO*
VOLUMEN DE
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.0 0.5
ESTREPTOLISINAS
*AGITAR CADA UNO DE LOS TUBOS POR GOLPETEO*

* VOLUMEN DE G.R.
* 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
AL 5 % EN mL
LLEVAR TODOS LOS TUBOS A BAO MARIA DE 37 C DURANTE 15 MIN. * *
*AGITAR CADA UNO DE LOS TUBOS POR GOLPETEO*

** LLEVAR TODOS LOS TUBOS A BAO MARIA DE 37 C DURANTE 45 MIN. * *
TITULO DE LA
REACCION 12 50 100 166 250 333 500 625 833 1250 + -
UNIDADES TODD
***CENTRIFUGAR CADA UNO DE LOS TUBOS A 1,500 rpm DURANTE 1 MIN. * **
CIFRAS NORMALES:
ADULTOS: 0 a 250 Unidades Todd.

NIOS: 0 a 166 Unidades Todd.
REPORTE:
1. Representar grficamente la serie de diluciones con sus correspondientes

reacciones.
2. Anotar el ttulo de la prueba.
3. Establecer pronstico en base a la relacin del valor de la prueba contra los valores
normales.
4. Investigar bibliogrfica del agente etiolgico y de su patogenia.
NOTA: SIEMPRE QUE SE USE ESTE METODO, SINO ANOTAR EL METODO USADO.

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Universidad Autnoma del Estado de Morelos

Profra. Ma. Leticia Garca Gmez

* NO FUMAR, NO CONSUMIR ALIMENTOS NI BEBIDAS, NO RECIBIR AMIGOS, NO JUGAR CON

14. Conservar limpia el rea de trabajo.

Profra. Ma. Leticia Garca Gmez

19. Lavarse las manos con jabn antes de abandonar el laboratorio.

Profra. Ma. Leticia Garca Gmez

La Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-1995, establece los requisitos para la separacin,

Los procedimientos a realizar derivan y se encuentran fundamentados en las siguientes disposiciones

LEY GENERAL DE SALUD: Norma Oficial Mexicana NOM-003-SSA2-1993 para la disposicin de

Profra. Ma. Leticia Garca Gmez

LEY GENERAL DEL EQUILIBRIO ECOLGICO Y LA PROTECCIN AL AMBIENTE: Reglamento

NORMA NOM-CRP-001-ECOL./93, que Establece las Caractersticas de los Residuos Peligrosos, el

PROYECTO DE LA NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-087-7101-T994, que establece los requisitos

LEY GENERAL DE LAS VAS DE COMUNICACIN: Reglamento para el Transporte Terrestre de

NORMA NOM-003-SCT2, Caractersticas de las Etiquetas de Envases y Embalajes destinados al

NORMA NOM-005-SCT2, Informacin de Emergencia de Transportacin para el Transporte Terrestre

NORMA NOM-007-SCT2, -Envases -y - Embalajes destinado al Transporte de Sustancias. y Residuos

Profra. Ma. Leticia Garca Gmez

Biolgico Infeccioso - Sangre

Toxico Peligroso - Medicamento Caduco

Comn basura municipal - Reciclables

Con fundamento en la NOM-O52-ECOL-1993 y la NOM-087-ECOL-1995; los residuos peligrosos

Residuos peligrosos biolgicos - infeccioso:

Fuentes de generacin Clasificacin de residuos

Profra. Ma. Leticia Garca Gmez

GENERALIDADES DE LAS BACTERIAS

Se puede clasificar a las bacterias en dos familias:

Cocos Micrococcaceae Staphylococcus

Cocos Neisseriaceae Neisseria

Profra. Ma. Leticia Garca Gmez

ATRICO Sin flagelos

Profra. Ma. Leticia Garca Gmez

El estudio de las bacterias y de su estructura es particularmente difcil debido al tamao pequesimo

Para poder clasificar un microorganismo hasta su especie, es conveniente estudiar de manera

1).- Morfologas micro y macroscpica:

Refirindose el primer trmino al estudio microscpico (microscopia) descriptivo de la morfologa, tipo

2).- Reacciones bioqumicas:

3).- Inoculacin en animales de experimentacin:

Profra. Ma. Leticia Garca Gmez

4).- Reacciones inmunolgicas:

Profra. Ma. Leticia Garca Gmez

RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL TRABAJO BACTERIOLGICO.

Profra. Ma. Leticia Garca Gmez

I.- MARCO TEORICO:

1.- Resea histrico del microscopio ptico

II.- MEDIDAS DE SEGURIDAD:

1.- Para el transporte del microscopio.

III.- OBSERVACIN DE PREPARACIONES MICROSCPICAS:

1.- Iluminacin del campo microscpico

1.- Citado al final de la prctica

I.- MARCO TEORICO:

1.- Resea histrica del microscopio ptico

Profra. Ma. Leticia Garca Gmez

2.- Conocimiento de sus partes fundamentales:

Sistema ptico (O): Est formado por oculares, objetivos y condensador.

Objetivo 10 X o seco dbil

Profra. Ma. Leticia Garca Gmez

3.- Tipos de microscopios

a).- Microscopios pticos:

Dentro de estos se encuentra el microscopio simple o lupa, el microscopio compuesto, el

b).- Microscopios no pticos:

II.- MEDIDAS DE SEGURIDAD: