David Morales Gutirrez 341546 19/Abril/2017

Biologa Molecular

Universidad Autnoma de Baja California

Facultad de Ingeniera, Arquitectura y
Diseo

Bioingeniera

Materia: Biologa Molecular

Nombre del Alumno: David Morales Gutirrez

Tarea: Ensayos de Artculo 3

Nombre del Maestro: Dante Alberto Magdaleno Moncayo

Ensenada B. C. a 19 de abril de 2017

David Morales Gutirrez 341546 19/Abril/2017
Biologa Molecular

Ensayo: Tuning Promoter Strength through RNA Polymerase Binding Site Design in
Escherichia coli
Robert C. Brewster, Daniel L. Jones, Rob Phillips
Como ya se ha visto en el curso la expresin gnica (expresin del cdigo gentico a
protenas) es la forma en que las clulas respondes a su entorno. La separacin de la
maquinaria que controla la expresin y construccin es una de las tareas actuales para poder
manipular o regular esta parte de la biologa. Ya que el camino que sigue la expresin gnica
desde el DNA hasta protena se puede llevar por varios caminos, pudiendo controlar las
variables como, fuerzas de sitios de unin, fuerza de unin del RNApol, la resistencia de
sitios de unin ribosmicos (RBS) y tasas de degradacin de productos proteicos en un gen
de inters. El artculo cita a Salis et. Al. Que hizo un modelo que describa la energa de
interaccin entre el sitio de unin ribosmico de un transcrito de mRNA y la subunidad
ribosomal 30s. Y se dieron cuenta que si usaban ese modelo, la expresin gnica se poda
predecir de cierta manera, modulando la eficacia de la traduccin de un gen. Cuando se inicia
la traduccin se sintoniza mediante la eleccin de secuencias de RBS con la energa de
interaccin que se desea. Otro factor que influye en la expresin de protenas es la tasa de
degradacin de protenas y esta se puede modular usando etiquetas d degradacin aadidas
al dominio C- terminal de cada protena. Por otro lado la manipulacin de la tasa de
desintegracin de la transcripcin de la protena permite la modulacin del estado
estacionario del nmero de copias de material gentico. En este artculo se centran
bsicamente en 2 conjuntos de parmetros transcripcionales: que es, la fuerza con la que la
polimerasa se une al promotor, y el nmero de factores de transcripcin presentes cuando el
promotor es controlado por la represin.
Empiezan centrndose en el caso ms simple en el que no hay protenas represoras presentes
en la clula. El inters en estos promotores "constitutivos" (aquellos no regulados por factores
de transcripcin) se deriva de la meta de crear un conjunto de promotores en los que podemos
variar sistemticamente tanto la media como el ruido para probar modelos recientes de
cintica transcripcional. Entonces se plantea la idea de que la medida y el ruido en la
transcripcin son afectadas por la arquitectura del promotor.
El modelado fsico preciso de las energas de interaccin protena-DNA es un problema
difcil que implica muchos grados de libertad. Por lo tanto, el control preciso de la unin
protena-ADN es un requisito previo esencial para el control de la transcripcin. Pero aunque
es complejo debido a los numerosos mecanismos moleculares implicados en la transcripcin,
segn entiendo, los autores lo manejan como un simple modelo lineal de la secuencia
dependiente de las energas de enlace y con ello es suficiente para describir las interacciones
de factores de transcripcin (TFs) o RNAP con DNA. Un "modelo lineal" trata cada base a
lo largo del sitio de unin como contribuyendo independientemente una cantidad definida a
la energa de unin total. Se menciona que en un estudio reciente, a grandes rasgos definieron
una matriz de 4x41 parmetros que describen la interaccin de la holoenzima (RNAp-70)
con el DNA. En esta matriz Mi,j. i representa la base (A,C,T,G) y j la posicin del par de
bases a lo largo de un sitio de unin. A partir de estas matrices de energa y con el modelo
propuesto se puede decir que la energa total de la secuencia en cuestin se definir por:
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Que es la sumatoria de las energas de cada base a lo largo del sitio de unin.
Entonces el modelo termodinmico de transcripcin presentado nos dice que la actividad
transcripcional es proporcional a la probabilidad de encontrar el RNAP unido en el promotor,
con precisin predice la escala de la expresin con RNAP vinculante energa. Las mediciones
permitieron determinar la proporcionalidad entre la probabilidad vinculante de RNAP y
transcripcional de salida del gen de inters. Y as ya pueden hacer las predicciones para la
produccin transcripcional de los promotores diseados bajo otras condiciones reguladoras.
Algo importante es que al hacer la matriz de energa para los sitios de unin se encontr (as
como habamos visto en clase) que los pares de bases ms influyentes de energa se
encontraron en la regin -10 y -35, que interactan directamente con 70.
Siguiendo la investigacin se disearon conjunto de sitios de RNAp nicos con energas de
enlace especificas separados por aproximadamente 0.5 kBT. Tomando como punto de
partida los promotores lac y lacUV5 de tipo salvaje, y con el modelo de la matriz de energa
eligieron mutaciones apropiadas de pares de bases( concentradas en -10 y -35 ya que es el
sitio de union mas significante) que dan los niveles de energa deseados. Las 18 cepas
diseadas por este proceso tienen energas de unin que abarcan aproximadamente 6kBT y
niveles de expresin gnica constitutiva de aproximadamente 50 veces menos a 10 veces
mayor que la del opern lac de tipo salvaje. Basado en los modelos termodinmicos de
regulacin de la transcripcin, se esperaba que el nivel de expresin de un promotor dado
escalara con la probabilidad de que RNAP est vinculado a ese promotor. Se utiliz una sola
clula de hibridacin de mRNA de fluorescencia in situ (mRNA FISH) y un ensayo
enzimtico colorimtrico para medir, para cada constructo, el promedio de mRNA y nmero
de copias de protenas por clula del reportero LacZ. Dado que la expresin gnica es
(suponiendo) proporcional a und (promotor ligado), se lleg a la expresin:

Donde 0 es una constante desconocida de proporcionalidad relacionada con el nmero de

mRNA o protenas esperadas de un promotor.
Para probar qu tan predictivo es el modelo de energa de unin, se midi la expresin de
protenas y el nmero de copias de mRNA para la expresin constitutiva de cada uno de
nuestros promotores nicos. Basndose en la ecuacin de arriba, un grfico semi-logartmico
de estos datos frente a sus respectivas energas de unin previstas en unidades de kBT debera
caer a lo largo de una lnea recta con una pendiente igual a -1, consistente con la escala de
Boltzmann. Concluyendo que el proceso de diseo predice con exactitud la expresin dentro
de un factor de 1 3sobre casi tres rdenes de magnitud.
Dado que el ARNm y la protena estn unidos por la traduccin, sus niveles para un promotor
dado deben estar relacionados. Los ARNm individuales se pueden traducir varias veces y se
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ha demostrado que el nmero de traducciones por ARNm est bien descrito por una
distribucin exponencial con la media b, conocida como el tamao de la rfaga de protena,
que es el nmero medio de protenas producidas por ARNm. Hasta este punto el
comportamiento de los promotores diseados se basa en la ausencia de una regulacin. Pero
en E. Coli que fue el bacteria que usaron hay muchos genes regulados que implican represin
simple, para estos solo hay un sitio de unin para la protena represora que reduce la
expresin del gen de inters. Entonces a la formula se le agrega un trmino que es la
probabilidad de unin del represor y haciendo que el promotor no est disponible para la
polimerasa.
En el lmite del promotor dbil se puede simplificar la expresin

Tenemos entonces una prediccin absoluta para el nivel de expresin gnica en las
mediciones LacZ. El prefactor 0 exp ( ) es un prefactor constante para todos
los valores de R (a una fuerza de promotor dada) y, por lo tanto, el modelo predice que
cualquier discrepancia entre las energas de enlace RNAP predichas y medidas ser heredada
a travs de todas las concentraciones de represor. En cada una de las cepas, el sitio de unin
LacI O2 est presente cerca del promotor. Las concentraciones especficas de LacI se
obtienen mediante la modulacin de la secuencia de unin ribosmica del gen LacI. Usando
este proceso se crearon 5 cepas nicas con nmeros de copias LacI promedio entre 10 y 140
represores por clula. Utilizando la ecuacin anterior, se puede hacer predicciones sin
parmetros para el nivel global de expresin gnica en funcin de la fuerza del promotor, la
fuerza de unin del represor y el nmero de copias del represor para la arquitectura de
represin simple.
Para la represin simple y la expresin constitutiva, tanto los resultados presentados por el
modelo creado as como los resultados experimentales se puede ver en las grficas del
articulo (figuras 5, 6,7) son muy similares entre s, por lo que este modelo puede ser utilizado
para ajustar de forma predictiva las interacciones protena-ADN para producir una salida
deseada de un gen con alta precisin. Con esto se cree que la ingeniera predictiva basada en
modelos de promotores representa una mejora tcnica significativa sobre la mutagnesis
aleatoria. Se demostr la validez de nuestro enfoque al variar simultneamente RNAP-
promotor fuerza de unin y el nmero de copias de un factor de transcripcin que reprime
estos promotores. Se ve que s e pudo predecir el nivel de expresin gnica en funcin de la
concentracin del factor de transcripcin. Los efectos ms notables sern evidentemente en
los sitios -10 y -35 pero si se hacen modificaciones en otros sitios la funcin energtica no
se podr describir tan bien con este modelo, as que lo podemos ver como una pequea
limitacin, que hay que resolver.
Referencia:
Brewster RC, Jones DL, Phillips R (2012) Tuning Promoter Strength through RNA
Polymerase Binding Site Design in Escherichia coli. PLoS Comput Biol 8(12): e1002811.
doi:10.1371/journal.pcbi.1002811