Protelisis limitada del timidilato bifuncional
Sintasa-dihidrofolato reductasa de Leishmania trpica
(Enzima bifuncional / dominios de la protena / protozoos)
EDWARD P. GARVEY y DANIEL V. SANTI*
Departamentos de Bioqumica y Biofsica y Qumica Farmacutica, Universidad de California, San Francisco, CA 94143
Comunicado por Thomas C. Bruice, 27 de junio de 1985
RESUMEN La estructura y actividad de la estructura bifuncional
Timidilato sintasa-dihidrofolato reductasa (TS-DHFR) del
parsito protozoario Leishmania trpica fue examinado por
protelisis limitada con cinco endopeptidasas diferentes. Cada
reaccin produjo una prdida rpida, dependiente del tiempo,
de la actividad de TS y ningn efecto sobre la actividad de
DHFR. Los productos proteolticos fueron examinados por
NaDodSO4 / PAGE; Cada digestin produjo un fragmento
aparente de Mr35.000, y tres de las cinco digestiones
generaron un fragmento de Mr20.000. Los intentos de separar
los fragmentos en condiciones no desnaturalizantes fracasaron,
Lo que sugiere que la protena proteolizada sigue siendo un
dmero con la estructura bruta de las subunidades ms o menos
inalteradas. Por el contrario, los datos cinticos indican que
algunos aspectos de la estructura de orden superior en la
protena nativa se ven afectadas por la protelisis. Los
fragmentos (Mr 36.600 y 20.000) generados por la proteasa V8
Staphylococcus aureus fueron sometidos a una serie de
anlisis. Mientras que ni la protena nativa ni el fragmento Mr
36.600 produjeron un NH2 - terminal aminocido, se obtuvo la
secuencia de los primeros 28 aminocidos del fragmento Mr
20.000. Esta secuencia dio una fuerte homologa con
secuencias situadas dentro de TS de humano, Lactobacillus
casei, Escherichia coli y el bacterifago T4. Estos y otros datos
indican que el polipptido TS-DHFR consiste en una secuencia
DHFR en la secuencia bloqueada de NH2-terminal y TS en el
extremo terminal COOH de la protena. La zona que es el blanco
de las cinco proteasas corresponde a una regin muy variable
dentro de las secuencias de las otras cuatro TS. Sugerimos que
una insercin se produce dentro de la secuencia TS-DHFR,
posicionado en la superficie de la protena y bastante vulnerable
a la accin de las endopeptidasas.
La timidilato sintasa (5,10-metilenotetrahidrofolato: dUMP C-
metiltransferasa, EC 2.1.1.45) y dihidrofolato reductasa (5,6,7,8-
tetrahidrofolato: NADP 'oxidorreductasa, EC 1.5.1.3) catalizan
reacciones consecutivas en la sntesis de novo De dTMP. En fuentes
tan variadas como bacterifagos, bacterias y vertebrados, estas dos
enzimas existen como enzimas distintas y fcilmente separables (para
revisiones, ver refs. 1 y 2). Por el contrario, se ha identificado una
protena bifuncional, la timidilato sintetizada hidrohidrofolato reductasa
(TS-DHFR), en varios gneros de protozoos que abarcan un grupo
diverso de subquedales (3, 4). Esta protena vara en peso molecular de
aproximadamente 110.000 a 140.000, con subunidades de peso
molecular 55.000-65.000. Como se ha observado (3-5), el tamao de la
subunidad del protozoario TS-DHFR es cercano a la suma de la
subunidad de TS (Mr 35.000) y DHFR (Mr 20.000) encontrada en la
mayora de las otras fuentes, lo que sugiere que el gen La codificacin
de TS-DHFR puede haber resultado de la fusin de genes TS y DHFR
independientes. El TS-DHFR procedente de una lnea celular resistente
al metotrexato del parsito protozoario Leishmania tropical ha sido
Los costes de publicacin de este artculo fueron pagados en parte por
el pago de la carga de la pgina. Por lo tanto, este artculo debe ser
marcado como "anuncio" de acuerdo con 18 U.S.C. 1734 nicamente
para indicar este hecho.
purificado a homogeneidad y se ha encontrado que es un dmero de
subunidades aparentemente idnticas de Mr 56.000 (5). Hasta la fecha,
no ha habido evidencia directa de homologa o falta de homologa entre
L. tropica TS-DHFR y las dos enzimas individuales de cualquier especie
no protozoaria.
La protelisis limitada se ha utilizado para examinar la estructura de una
serie de protenas multifuncionales. Los resultados de estos estudios
han llevado a propuestas para la disposicin de las diversas funciones
sobre el polipptido (6, 7) y han producido evidencia de que muchas
protenas multifuncionales existen como una serie de dominios
independientes e independientes (cada dominio que refleja una funcin)
9). Hemos llevado a cabo la protelisis limitada de L. tropical TS-DHFR
con la esperanza de separar las dos actividades como fragmentos
proteolticos, el tamao de cada aproximacin de sus homlogos no
protozoarios (es decir, un fragmento TS de 35.000 y un fragmento
DHFR de Mr20.000). Presentamos aqu los resultados de la protelisis
limitada de L. tropical TS-DHFR. Se propone una disposicin de las
actividades enzimticas dentro del polipptido TS-DHFR y se sugiere
un modelo estructural de la regin que se escinde selectivamente
mediante cinco endopeptidasas diferentes.
PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES
Enzimas, Antisueros y Medidas de Actividad. El TS-DHFR
bifuncional de L. tropica resistente a 10-propargil-5,8-
dideazafolato (seleccin que se describir en otra parte) se
purific a homogeneidad mediante cromatografa de
metotrexato-Sepharose CL-6B, como se describe (5). Tripsina
tratada con N-ptosil-L-lisina clorometilcetona (TLCK), proteasa
V8 de Staphylococcus aureus, proteasa del tipo XIV de
Streptomyces griseus, elastasa y tripsina de soja Inhibidor se
adquirieron de Sigma. Se obtuvo antisuero de conejo a L.
tropica TS-DHFR despus de inyeccin subcutnea de 150 \ mu
g de TS - DHFR puro mezclado con 1: 1 (vol / vol) con adyuvante
completo de Freund, seguido 3 semanas ms tarde por una
inyeccin de refuerzo de 100 k & g de TS -DHFR mezclado 1: 1
con adyuvante incompleto de Freund. El antisuero de conejo
contra Escherichia coli TS fue proporcionado por F. Maley
(Departamento de Salud del Estado de Nueva York, Albany);
Conejo antisuero contra E. coli RT500 DHFR fue proporcionado
por D. Baccanari (Burroughs Wellcome, Research Triangle
Park, NC). El conjugado de anticuerpo anti-Ig de conejo de
cabra-fosfatasa alcalina procede de Boehringer Mannheim.
La actividad de DHFR (10) y la actividad TS (11) se
determinaron espectrofotomtricamente a 250C. Adems, se
cuantific la DHFR unindose al [3H] metotrexato (1) y TS se
cuantific mediante la unin a 5-fluoro-2'desoxi [3H] uridilato
[3H] -FdUMP y () -5,10-metilenotetrahidrofolato CH2H4-folato)
(12), como se ha descrito anteriormente.
Abreviaturas: TS, timidilato sintasa; DHFR, dihidrofolato reductasa;
FdUMP, 5 - fluoro - 2 '- desoxiuridilato; CH _ {2}, 4 (+) - 5,10 -
metilenotetrahidrofolato.
* A quin deben ser dirigidas las solicitudes de reimpresin.
* Naturaleza de los residuos de aminocidos que donan porciones de carbonilo de bandas de pptidos susceptibles.
+ Determinado por NaDodSO4 / PAGE.
+ Las flechas denotan el fragmento generado a partir del fragmento anterior durante el curso de la reaccin.
Varias bandas no especficas.