Poznmky molekulra:

1. Prezentace-obecn, replikace dna

vmna jednoho nukleotidu = snip
variabilita potu kopi segment = CNV
mikrosatelity = STR
lovk m 2000 gen
1 cM = 0,75 Mb (1cM je 1% pravdpodobnost rekombinace)
-D-glykosidick vazba baze-cukr
Fosfodiesterov vazba fosft-cukr
5-konec m voln fosfty
C-G 3 vazby, ostatn 2 vazby
Chargaffovo p. pyrimidin a purin je stejn
vrstven baz pomoc p elektron udruje stabiln
primrn:sekvence, sekundrn:vazby, tercirn:rouben
DNA 2 nm prmr, chromatinov vl. 10 nm -> 30 nm->interf.chromoz. 300nm,
metafaz.chrom.1400nm
hybridizace = spojen dvou rznch vlken DNA
nadroubovicov vinut: slo vinut L= rozdly jsou v topoisomerech
topoisomersa 1: peru 1 vlkno, topoisomersa 2: peru ob-
prokaryota=gyrza (ATP)
blokace topoisomerasy 1=cytostatika topotekan; 2= etoposid, anthracykliny,
chinolony
E.coli-4500 gen-nukleoid
operon: spolen regulovan oblast gen
plazmidy-1-400kb
lidsk genom: 46 (22pr+2gono), 3,2*109 baz, 20 tisc gen
euchromatin=nekondenzovan/heterochr.=kondenzovan
histony:bazick, lysin a arginin, H1,H2A,H2B,H3,H4
nukleosom: oktamer histon (2x od kadho krom H1) + DNA 146pr, 60 pr
spojuje s H1
mitochondriln DNA 36 protein, 5-10 kopi
replikace: iniciace, elongace, terminace
prokaryota: 1 ori, eukaryota: mnoho potk replikace-pouze S fze
primasa: DNA dependentn RNA polymerza: vytvo RNA primer o 11 bazch
DNA polymerasy: syntza polynukleotidovho etzce ve smru 5->3 i
exonukezov aktivita-oprava chyb v obou smrech, prokaryota: DNA polymerza
I zejmna opravy a vmn primer za DNA, III replikace 1000 baz/s; eukaryota:
DNA polymerza alfa: zahjen replikace, delta: replikace, 50 baz/s. Chyba 1/10 9
po oprav
ligasa: spojuje Okazakiho frakgmenty
DNA helikasy: rozvoluj dvouroubovici
DNA topoisomerasy: rozvoluj nadroubovicov vinut
Single Strand Binding proteiny: udruj DNA jednovlknovou
svrac proteiny: soust DNA polymerzy-tvo dvouroubovici
postup: vlkno->topoisomerasa->helikasa->ssb proteiny ->primasa ->dna
polymerza alfa -> dna polymerza delta-> ligasa ->svrac proteiny
vedouc etzec: 5->3 u jeho 3 konce zan 5 konec replikovan DNA a 3
konec postupuje podle replikan vidlice
zpoujc se etzec: 3->5 u replikan vidlice se vytvo primer a 5 konec DNA a
nasyntetizuje se okazakiho fragment. Ligsa je spoj.
 RNA primery jsou nahrazeny DNA
Terminace: setkn dvou vidliek nebo konec molekuly nebo zastavena proteinem,
kontrola etzce, zrove syntza histon
Telomery: koncov repetitivn sekvence, telomerasa e krtk vlkno u 5 tak, e
to s 3 prodlou a okazakiho fragmentem dodl to s 5.
Okazakiho fragmenty: prokaryota 1000-2000, eukaryota 150 baz

2. Prezentace-bunn cyklus, regulace, rakovina

prokaryota: nemaj bunn cyklus
eukaryota: pro vechny stejn. Interfze (duplikace a rst, vtina asu) a
Mitotick fze (dlen)
interfze: G1:po M-fzi, doplnn bu.obsahu, hlavn kontroln uzel, rzn dlka
G0:klidov stav
S:syntza DNA, dlka dan
G2:druh rst, pprava na dlen, kontroln uzel
mitza: rozdlen jdra: profze: kondenzace, tvorba vetnka z mikrotubul,
prometafze: rozpad jadernho obalu, pipojen
chromozom
metafze: pesun chromozom do ekvatoriln roviny
anafze: rozdlen sesterskch chromatid
telofze: dekondenzace chromatinu, vytvoen jadernch
obal
cytokineze: rozdlen cytoplazmy-kontraktiln prstenec: aktinov a myozinov
vlkna
regulace: vnitn DNA, parakrinn, nervov a endokrinn
cyklindependentn kinza(eukar-4 typy): koncentrace stl x cyklin:koncentrace
podle fze b. cyklu.
G1 cyklin, G1/S cyklin, S cyklin, M cyklin
CKI: cyklin inhibin proteiny, inhibice G1/S cdk a S cdk
protein p53 je blokovn ubikvitinem ->pi pokozen fosforylace -> navzn p53
na opertor genu p21 ->exprese p21 ->inhibice cyklin-cdk komplexu ->zstava b.
cyklu
protindorov terapie: protiltky, inhibitory CDK, mTOR inhibitory
p16: inhibitor bunnho cyklu
Apoptza: zena kaspzami, vnj cesta (receptor smrti), vnitn cesta.
Inician=2,8,9,10 aktivace dimerizac a adaptorovma molekulama.
Efektorov=3,7,6 aktivace proteolzou inicianch kaspz.
Vnj cesta: receptory smrti TNF receptory, Fas receptor pro Tc lymfocyty, TRAIL
receptor ->adaptorov proteiny, kaspza 8, Death Inducing Signaling Complex
Cas 8 receptor smrti, Cas 9 mitochondriln pokozen. Cytochrom c se ve na
adaptorov protein
IAP: inhibitory apoptzy, 8 protein, ubikvitin proteazomov systm um niit
kaspzy
Bcl proteiny: modulace apoptzy. Bax, Bad, Puma podporuj x Bcl2, BclX inhibuj
poruchy apoptzy (nedostaten): ndory, autoimunitn onem., alergie,
nedostaten likvidace neutrofil, -//- nakaench bunk
poruchy apoptzy (nadmrn): AIDS, neurodegenerativn onem., rejekce
transplantt, anemie
ndorov terapie: aktivace p53 alkylac/antimetabolity/zstavou mitzy/deprivac
rstovch faktor/TNF alfa/Mapatumumab/Oblimersen
Protoonkogeny: podl se na inhibici apoptzy a uvolnn bunnho cyklu
 Bcl2 prokzan onkogen-inhibice apoptzy, survivin z IAP tak
tumor-supresorov geny: Rb-retinoblastomov protein, p53-pi nefukci vznik
rakovina->aktivace Bcl2, inaktivace Bax.
Jedna mutace v tumorsupresorech nesta k rakovin

3. Prezentace-pokozen a reparace dna

typy poruen: jednoetzcov zlomy, dvouetzcov zlomy, mezietzcov spoje,
dimerizace baz, mismatch, metylace, oxidace, ztrta baz,
poruen dna u nedlcch se bb. ->strnut x u dlcch ->rakovina
inhibice topoisomerz 1(topotekan), 2(podophylotoxiny, anthracykliny)=proti
ndorm
depurinace/depyrimidinace: roztpen N-glykosidick vazby
oxidan stres -> 8-oxoguanin
oxidan deaminace C->U; A->hypoxantin; G->xantin; 5-methylC->T (nejastj)
tranzice: zmna purinu za purin a pyrimidinu za pyrimidin x transverze je
prohozen
alkylace: pomoc S-adenosylmethioninu
vechny mutageny jsou genotoxiny/vechny genotoxiny nejsou mutageny
mutagenn viry: HBV,HCV,EBV,HPV,helicobacter
mutagenn chemiklie: alkylan inidla: cyklofosfamid, cisplatina, yperit, tabkov
kou;
promutageny: v organismu tlo vytvo aktivn sloueninu: polyaromatick
uhovodky, aflatoxin, heterocyklick aminy->cytochrom p450 -> epoxid (reaktivn),
fyzikln vlivy: dimerizace T UV zenm, ionizujc zen->dvouetzcov zlomy
pokozen dna -> senzory -> proximln pevodnky -> distln pevodnky ->
efektory
pm oprava: O-6-methylguanin-DNA methyltransferza, DNA oxidan
demethylasa,
ERB=excisn reparace baz, oprava jednoduchch zmn: oxidovan, deaminovan,
alkylovan
DNA glykosylasou
AP lze= apurinov/apyrimidinov
DNA glykosylasa rozpozn patnou bazi a vystihne ji -> AP lyasy a endonukleasy
vytvo zez odhlen fosftu a OH -> DNA polymerza beta DNA ligasa 3 vytvo
malou zplatu
velk zplata: DNA glykosylasa -> AP endonukleasa -> DNA polymerza delta a
epsilon nahrad 2-13 nukleotid
ERN=excisn reparace nukleotid-oprava rozmrnch lz
(polyarom.,aflatox.,tabk)a dimerizac 22-30 nukleotid, tak reparace
zesovanch etzc (yperit, cisplatina, cyklofosfamid), zablokovan replikan
vidliky
pokozen odhaleno receptory nebo pi transkripci -> heliksa -> endonukleza ->
stabilizace jednovlknov DNA -> DNA polymerza delta nebo epsilon -> DNA
ligasa 3
mismatch opravy: pi replikaci DNA, rozpoznn -> tvorba zezu -> odbourn
exonukleasou -> stabilizace jednovlknov dna -> DNA polymerza delta/epsilon
-> DNA ligasa
dvouetzcov zlomy: nejnebezpenj. Oprava: homologn rekombinace nebo
nehomologn spojovn konc
NHSK: hlavn loha DNA-dependetn proteinkinaza, Artemis, DNA polymerza
lambda ->DNA ligasa
 Homologn rekombinace: fyziologicky crossing-over, oprava zablokovan vidliky,
mezietzcovch spoj; rozpoznn -> vytpen exo a endonukleasami ->
stabilizace j- DNA -> vmna protein BRCA -> invaze do sesterskho
chromozomu a vyhledn homolognho msta -> vznik a stabilizace Hollidayova
spoje -> DNA polymerza delta -> DNA ligasa
Mutace: genov, chromozomov, genomov
tranzice=vmna mezi AG a CT, transverze=vmna mezi druhy baz,
transpozice=vmna sousednch, inverze=vmna mezi etzci
aneuploidie=poetn odchylka +/- u jednotlivch chromozom (nullisomie,
monosomie, trisomie)
polyploidie= zmna potu sad chromozom = nulliploidie, triploidie, tetraploidie
mutace: prav reverze=nvrat k pvodnmu kodonu, operan reverze=nvrat
k pvodn AMK, pseudoreverze=aminokyselina, kter a jin tak nevad

4. Prezentace-exprese gen
modifikace RNA: pseudouridin a ribothimdin v tRNA, dihydrouridin v tRNA, inosin
v antikodonu tRNA (deaminac adenosinu)
rRNA 80%, tRNA 15%, mRNA 5%
snRNA=small nuclear RNA (k prav mRNA); snoRNA=small nucleolar RNA
(prava rRNA)
Regulace pomoc RNA: asRNA (antisense) je komplementrn k templtov RNA,
tim blokuje translaci; siRNA (small interfering) dvouvlknov a ni mRNA; miRNA
(mikro) taky blokuje translaci, komplementrn, 22 nukleotid
RISC=RNA Induced Silencing Complex
Retrotranspozony=sti DNA kter se zesiluj pes RNA
TERC=reverzn transkriptzou pepisovan RNA do telomer
CRISPR=Clustered Regulary Interspaced Short Palindromic Repeats: monost
editace gen, soust imunitnho systmu prokaryot
Transkripce prokaryota: provdna RNA-polymerzou (transkriptzou), RNA se
pepisuje podle antisense (templtovho) (-) vlkna, tak aby sense vlkno bylo a
na U/T stejn
transkripn jednotka: promotor, strukturn geny, termintor
Operon: mezi promotorem a strukturnmi geny je jet opertor
1. iniciace vazbou RNA-polymerzy na promotor -> pohyb RNA-polymerzy od 3
k 5 po templtu (-) DNA tak, aby vznikala RNA od 5 k 3 -> terminace
Promotor: -35 je sekvence TTGACA; -10 je Pribnowv box TATAAT to je konven
sestava, kter m nejvt afinitu k RNA-polymerze
Opertor: ve se na nj represor, me se pekrvat s promotorem, pokud chyb
transkrpice urena pouze afinitiou k promotoru
RNA-polymerza: tvo primrn transkripty, r a t se mus sesthat; pro iniciaci
poteba sigma-faktor; 60 baz/s.
Terminace: vytvoen vlseny nebo navzn rho-faktoru
Shineova-Dalgarnova (S-D)sekvence=AGGA (RNA) u prokaryot mezi promotorem a
1.struktonm genem, ve se na n 30S podjednotka ribozomu; bez n se nepelo
-> t a r RNA
Prokaryotn mRNA: polycistronn (multigenn), za vedouc sekvenc inician kodon
a do stop kodonu, rychle se rozkld ribonuklzami

Transkripce eukaryota:
hlavn je RNA-polymerasa II
hnRNA: heterogenn nukelrn RNA, ta prvn po transkripci, je to pre-mRNA, m
 introny a exony, 3 konec AAUAAA je utpnut a polyadenylovn
RNA-polymerza 1: tvorba rRNA; 2:tvorba hnRNA; 3:tvorba pre-tRNA
Transkripn faktory: bez nich nefunguje trans, obecn (TFIIA,TFIIB)jsou nutn
pro house-keeping geny, speciln ovlivuj trans. specifickch gen
Promotor: TATA box (Hognessv) -34 a -26, CAAT box -75 a -80
chemick modifikace baz: deaminace adenosinu ->inosin; izomerace uridinu ->
pseudouridin; uridin + H2 -> dihydrouridin;
pravy: epika: 7-methylguanosin vazba na fosft 5 konce, tvorba epiky, na
kterou reaguj cap-binding proteiny -> iniciace translace; polyadenylace 3 konce:
navzn 50 a 200 baz A na 3 konec asi 30 baz za AAUAAA-astn se
transportu do cytoplazmy; sesih: eukar. geny jsou sloen z intron a exon.
Intron m na 5 GU a na 3 AG. Sestih je transesterifikace 3 exonem uvnit RNA,
zajituj ho snRNPs, intron+nkolik snRNPs tvo spliceosom
alternativn sestih=jeden gen, vce rznch protein nap. Troponin T
RNA enzymy=ribozymy

5. Prezentace-genetick kd, translace

Genetick kd: pro vechny stejn, uruje jak se pekld RNA do protein, je
degenerovan, nepekryvn, univerzln, te se podle techo rmce
AUG: kduje Met i start
UGA,UAA,UAG=konec (UGA i pro selenocystein)
nkter mutace se neprojev, maj stejn peklad
antikodon je mn ne kodon, protoe nemus mt plnou shodu v provn
s mRNA-wobbling
geny se nepekrvaj (a na vjimku)
Ribozomy: prokaryotn 30+50=70; eukaryotn 40+60=80, mal podjednotka vazba
mRNA a tRNA, velk podjed. syntza peptidovho etzce. 3 vazebn msta: A-
aminoacyl (vazba tRNA), P-peptidov (tvorba peptidovch vazeb), E-exit (vstupn
msto pro tRNA) nen u eukaryot
tRNA: asi 80 nukleotid, obsahuje pseudouridin, inosin a dihydrouridin;
akceptorov rameno obsahuje 3 i 5. AMK se ve na 3 nebo 2 OH skupinu na 3
konci. Pseudouridinov rameno vazba na ribozom, dihydrouridinov rameno
kontakt s aminoacyl-tRNA synthetasou.
aminoacyl-tRNAsynthetasy: kad AMK m jednu synthetasu, ta se vol NE
podle antikodonu ale dihydrouridinovho ramena
prokaryotn Faktory: inician: IF(1,2,3); elongan EF; terminan RF
eukaryotn faktory: 13 eIF, elongace podobn, RF jen jeden
Kozakovovy sekvence je to sam jako D-S sekvence u prokaryot
Energie pro posun u ribozomu je z GTP
100-200amk/min
ATB psobc na ribosomy: tetracykliny, aminoglykosidy, chloramfenikol, makrolidy,
linkosamidy
Posttranslan modifikace: odstrann methioninu, acylace N-konce, disulfidick
mstky, glykosylace, vytpen sti peptidu (B st u inzulinu) , prostetick
skupiny (kovaletn vzan p. Hem), koenzymy (slab vzan CoA,Q10),
hydroxylace prolinu, acetylace lysinu, fosforylace srinu, threoninu, tyrosinu,
ubikvitinace
Tdn protein: podle signlnch sekvenc, cytoplazmatick a sekretorick drha
Ubikvitinace probh na lysinu, E1 aktivuje ubikvitin, ped ho E2, ta se nave na
 E3 se substrtem a ubikvitin se nave na lysin (aspo 4 ubi), um to i SUMO
Bortezomib inhibuje proteazom, kter u ndor ni proapoptotick proteiny

6. Prezentace-izolace a separace NK
elektroforza: katoda (+); anoda (-)
nutn maximln istota, DEPC inhibuje RNAzy
proteinkinza K: rozruuje proteiny a inhibuje DNAzy a RNAzy, tp i histony
Fenolov extrakce: fenol a chloroform oddl od sebe proteiny (organick f.) a
DNA (vodn f.) -> vodn fze + EtOH -80 C =precipitace DNA -> vysuen -> TE
puft
Fenolov extrakce RNA: fenol+chloroform+guanidin isothiokyant=kysel sms ->
DNA pechz do organick f.
Adsorpce na silikt: pouit chaotropnch inidel, metoda v kolonovm proveden
Adsorpce na silikt RNA: nutn pout inhibitory RNAz, DNAzu 1 k znien DNA,
zkoum se mRNA pro cDNA, vyuit poly A konce mRNA magneticky znaenmi
oligo T kulikami
DNA i RNA absorbuje pi 260 nm -> nutnost odstranit druhou sloku
Fluorimetricky: pi velmi malch koncentracch, lze mit ve smsi NK + protein,
ethidium bromid (fluorescenn barvivo, mutagen interkalan), Qubit
Gelov elektroforza: od k +, men uraz del vzdlenost-nezle na sekvenci;
agarzov gel, polyakrylamidov (PAGE) na men steky, m koncentrovanj
gen->vt schopnost odliit mal steky, pulzn elektroforza na cel
chromozomy
SDS elektroforza oddlen podle velikost ne podle nboje
Zkladn enzymy: A) Syntetizujc DNA Na DNA matrici DNA-
polymerzy Bez matrice terminln transferzy Na RNA matrici reverzn
transkriptzy
B) Syntetizujc RNA Na DNA matrici RNA-polymerzy Bez
matrice poly(A)-polymerzy
C) Odbourvajc DNA a RNA Od konce molekuly
exonuklezy Uvnit molekuly endonuklezy Na specifickm mst restrikn
endonuklezy
D) Spojujc DNA Ligzy
E) Modifikujc DNA a RNA Fosfatzy Kinzy Methylzy

DNA polymerza: 5->3 tvorba vazeb a exonuklezov akt. 5->3 i 3->5

(Klenowv fragment nem
5->3 exonuklezovou akt.-vyuit syntza ds cDNA, znaen radioizotopy a
sanger)
Taq DNA polymerza: vydr vysok teploty, nem 3-5 exonukl., rychl, PCR
Pfu DNA polymerza: vysok teploty, m vechny akt., pomal, PCR
Reverzn transkriptza: 5->3, v obou smrech exoribonuklezov akt., syntza
cDNA, p. AMV, MoMLN
Ribonukleza H(RNAza H): nien RNA, u reverzn transkripce
Restrikn endonuklezy: II. Typ tp v palindromu, pesn dan sekvence. Pokud
usthne rovn=tup konec, pokud klikat=lepiv konec
isoschizomery: dv RE, kter tp stejnou sekvenci, ale za jinch reaknch
podmnek
RFLP=restriction fragment length polymophism, vyuit (ne)ptomnosti mst
k tpen -> diagnza cystick fibrzy nebo paternity
 Ligza: spojuje 5 fosft a 3 OH, potebuje ATP a Mg2+
methylace C5 cytosinu funguje jako regulace genov exprese
Nick translace-vytvoen zlomu, nasyntetizovn pes nj nkolika znaench
nukleotid-FISH (fluorescent in situ hybridization)

7. Prezentace-regulace genov exprese

geny: konstitutivn (housekeeping) regulovan silou promotoru; adaptivn
regulovan
Prokaryota: regulace na rovni transkripce
mRNA je polygenn, krtk ivotnost, translace rovnou navazuje
reguluj proteiny a regulan oblasti gen; negativn regultory v na opertor,
pozitivn na promotor
geny kdujc regulan proteiny jsou konstitutivn
regulon=skupina gen/operon zen jednm regulujcm proteinem
Operon=transkripn jednotka, skupina gen zen jednm protomotorem a
opertorem
Promotor=msto, kam se ve RNA-polymerza
Opertor=msto mezi promotorem a strukturnmi geny, kam se ve represor
Induktor=ltka, kter odstran represor z opertoru x korepresor=ltka, kter
navod vazbu represoru
CAP=katabolick aktivan protein, zprostedkovv silnj vazbu RNA-polymerzy
na promotor, aktivuje se pi vysok hladin cAMP (mlo glukzy)
kad gen v rmci operonu se transkribuje jinak efektivn, zvis na konkr. shine-
dalgarnov sekvenci
atenuace=me se u mRNA vytvoit vlsenka, kter zablokuje transkripci
antisense gen=vytv takovou mRNA, kter je komplementrn s mRNA genu, tm
zablokuje jeho transkripci
Eukaryota: transkripce je nejdleitj ale ne jedin msto regulace
dal: regulace sestihu, transportu z jdra, translan, posttranslan
acetylace histon -> m se ve DNA -> lep transkripce a naopak
methylace cytosin (CpG) -> blokuje transkripci
RNA polymerza II potebuje inician faktory, sama nenave, aktivtory maj vt
roli ne represory
spec. transkripn faktory-aktivtory: regulace mnostvm, fosforylac, ligandem
(steroid), inhibitorem
regulan sekvence-na ty se v spec. transkripn faktory. Speciln transkripn
faktory mohou bt ovlivovny pozitivn/negativn i jinou st chromozomu nebo
jinm chormozomem
Cel se to odehrv v okol TATA boxu
Responzivn elementy jsou sti DNA
Alternativn splicing mRNA=z jedn mRNA me vzniknout vce rznch protein
(troponin)
mRNA me bt blokovna proteiny aby se zamezilo translaci (ferritin)
DNA rozpoznvajc protein maj struturu helix, vodkovmi msty a hydrofobnmi
interakcemi rozpoznvaj DNA. Vtinou helix ->otoka -> helix. U eukaryot m
bt i zinc finger,

8. Prezentace - PCR
poteba: DNA, primery, DNA-polymerza, dNTP, Mg2+ ionty, pufr, voda
20-100 mikrol
 DNA: 1-5 ng, sek m 1-2 kb
pozor na kontaminaci, inhibitory polymerzy (hemoglobin, heparin, fenol,
proteinkinza K)
Primery: dva, ohraniuj sekvenci, nesm se jim moc liit Tm, teplota annealingu o
5m ne Tm, nesm tvoit dimer ani vlsenku, 17-30 baz, GC:AT cca stejn
DNA polymerza: optimum 72C
Mg 2+: nutno vdy zjistit, 1,5-6 mmol/l
pufr: 8,3-9 pH Tris HCl
Dal sloky: detergenty, albumin, DMSO nebo glycerol
prbh: denaturace, annealing (hybridizace), extenze
denaturace: 92-95C-rozdlen etzc
annealing: navzn primer, citliv nastaven teploty (pli mal -> navzn i
nekomlementrn x pli vysok -> nenavzn ani na komplementrn) 45-60C,
nutno optimalizovat
extenze: pi 70-80C polymerza navazuje etzce ve smru 5 -> 3 , cca 60
sekund
20-40 opakovn = 220-40 kopi. 1. cyklus nespec. dlka, dal cykly specifick,
Termocyklr a mikrozkumavky, detekce elektroforzou
Riziko kontaminace, prce v laminrnch boxech, piky s filtry, negativn kontrola
slepch vzork
nahrazen zprvu dTTP za dUTP, DNA s dUTP nsledn degradovna-zamezen
kontaminac minulho vzorku
pozitivn kontrola: PCR u jasn pozitivmaterilu -> pokud nevyjde, chyba v PCR
negativn kontrola: PCR u jasn negativnho materilu -> pokud vyjde,
kontaminace
inhibin kontrola: pokud dojde k inhibici standardu, je vzorek inhibovn
touchdown-postupn sniovn teploty; nested-nejdv vt nespec. primery, pak
men spec. primery.; asymetrick-pepisuje se jen jedno vlkno; alelov
specifick-pro zjitn mutac; mulitpex-vce primer; methylation spec.-jen
methylovanou, bisulfit mn C na U; PCR s reverzn transkriptzou
Kvantifikace: end point-po skonen elektroforzou, mn pesn, nron;
realtime-v prbhu cykl, intenzita fluorescence kdy doshne thresholdu.
Ct je poad cyklu kdy dolo k peroen hranice
Florescenn barviva: SYBR green, ethidium bromid-jsou nespecifick sekvenci
TaqMan je oligonukleotid, kter m zi i zhe, pi annealingu exonuklezovou
aktivitou polymerza vytpne 5 se zheem a detekuje se fluorescence.
FRET-dv sondy, kdy jedna je donor a 2. akceptor. Pi navzn (konec annealingu)
zanou si pedvat energii a z

9. Prezentace- klonovn

Pprava insertu: 100-1000 baz, zarovnan nebo lepiv konce,

vektory: plazmidy, bakteriofg, viry pro trans. eukayot, kosmidy,
Y(yeast)A(aritifical)C(chromosomes), BAC, MAC(mammalial)
Plasmidy: kruhov dsDNA, 1-100 poet, 1-200kb, msta pro Restrikn
endonuklezy, p.pUC18
Bakteriofgy: lytick infekce bakteri -> fgov plak, identifikace hybridizac in situ
Viry pro eukaryota: bakuloviry, papovaviry, papilomaviry, adenoviry, herpesviry,
retroviry, vakcinie
Kosmidy: modifikovan plazmidy, maj ori a Ramp, m segment, aby se dostal do
fga, v bakterii se ale mno jako plazmid, vhodn vektory pro eukaryotn geny, po
genov knihovny
Transdukce=penos genetick informace pomoc viru. Lza nebo lysogenn infekce
Transformace (transfekce)=penos bez kontaktu bakterie a viru.
elektroporace: vysokonapov vboj vytvo pry
mikroinjekce DNA: injekce DNA kapilrou
ostelovn bunk: stice Au s DNA za petlaku
CaCl2: zvyuje permeabilitu membrn pro DNA
osmotick ok DMSO
endocytzou: DNA + dextran
lipofekc v liposomech
selekce oznaench bakteri: plazmid s insertem m i kd pro rezistenci vi
antibiotiku, tm lze vytdit
proteiny vnikajc pekladem vloenho vektoru lze identifikovat monoklonlnmi
protiltkami
vznam: amplifikace genov cDNA nebo genomov DNA; tvoba genov knihovny;
hybridizan sondy; kontroln materil; produkce hormon, vakcn,
velikost insert: plazmid <10; kosmid cca 40; YAC cca 100; BAC cca 400; MAC
2000kb

Hybridizace a blotting
Southern blotting: po PCR se na agarzovm gelu rozdl produkty, pes
membrnu se dostanou na nylon a ten se hybridizuje sondami. (northern s RNA a
western s proteiny)
Alelov specifick hybridizace (ASO=dot blotting): navzn ssDNA do specifickho
msta s hybridizan sondou, tch mst je vce, pozorovn mutac, zjednoduen
southern blottingu
podklady pro sondy: celulza, niktrocelulza, nylon, plast, sklo, kemk
Hybridizace koloni: nechaj se na agaru vyrst kolonie, otisknou se na papr,
zabijou se, hybridizujj se radioaktivn sondou
FISH: fluorescenn in situ hybridizace. Pprava prepartu -> denaturace
->hybridizace sond -> odmyt nenavzanch sond -> stabilizace -> pozorovn
pod fluorescennm mikroskopem

Sekvenovn DNA
puriny=pyrimidiny, ale ATGC
hybridizace neuruje primrn strukturu DNA, tu uruje sekvenace
sekvence gen lovka je veejn pstupn
resekvenizace-porovnn sekvence danho lovka s databz
mutace zroden/somatick
sekvenovn PCR, molekulrnch klon, st cDNA, chromosome walking-cel
chromosom po primerech, shotgun-skldn jednotlivch fragment chromosomu
Maxam a Gilbert-degradan sekvenovn: denaturace a fragmentace etzce,
oznaen jednoho, eletroforza, 4 reakce: k. mraven, DMS, hydrazin + NaCl,
hydrazin. Pozitivn reakce ukazuje ptomnost danho nukleotidu, drastick
podmnky, nemonost automatizace

Sanger-enzymatick sekvenovn: denaturace a fragmentace, oznaen

3primerem, tvorba komplementrnho vlkna DNA-polymerzou. Pouit
dideoxynukleotid, 4 reakce, 4 zkumavky. Nov syntetizovan etzce jsou
zakoneny vdy ddNTP, ty pak elektroforzou rozdleny
10.Prezentace-ddin choroby

fap=familirn adenomatzn polypza

hemochromatza=onemocnn jater z pebytku Fe
A1AT=defekt antitrypsinu, postien jater a plic
AD=fam.hypercholesterolemie, huntingtonova chorea, polydaktylie
AR=cystick fibrza, srpkovit anemie, fenylketonurie
GD=X-vzan rachitis, rettv syndrom (postien dvek retardace), incontinetia
pigmenti
GR=hemofilie!!!, Duchenova muskul. dystrofie, daltonismus
Mitochondriln=kardiomyopatie, pearsonv syndrom
Polygenn=diabetes, dna,schizofrenie

Metoda PCR/RFLP: po PCR se DNA nech roztpit restriknmi endonuklezami

v palidromech mutace, pot se provede RFLP (podle fragment se pozn jak
mutace tam je)
Alelov specifick PCR: primer je specifick pro danou alelu, tim se odl wild type
a mutovan (fenylketonurie, hemochromatza)
Nepm vazebn msta: hled se sousedn msto k alele, kter zpsobuje nemoc.
Analza PCR-RFLP, STR(short tandem repeats), VNTR (variable number of tandem
 repeats)-poet tandemovch repetic u nemocnho je stejn jako u pbuznho, u
kterho choroba propukne.
Pm diagnostika: vyeten jedince, zjist se jestli je zdrav homozygot nebo
penae-heterozygot
Nepm diagnostika: vyten cel rodiny, pokud nen znm jasn sekvence

11.Prezentace proteomika
proteom=soubor protein (asem a mstem vyhrazen) kdovan danm
genomem-dynamick
proteiny-60% buky
primrn s.-peptidick vazby, sekundrn s.-vodkov vazby mezi CO a NH2,
supersekundrn s.-tvorba nezvislch domn, tercirn s.-uspodn celho
monomeru, kvartrn s.-uspodn polymeru
kad peloen sekvence zan methioninem (M)
nsobn vt poet protein ne gen (alternativn setih, RNA editace, PTM-post
translan modifikace)
Biologick lba ndor: protiltky se vou na specifick povrchov struktury.
omab=my protiltky
ximab=chimerick
zumab=humanizovan
umab=lidsk
structure based drug design-pprava lk podle struktury, na kterou psob
monoklonln protiltky proti: ndorm, revmatoidn artritis, roztrouen sklerze
ADCC: antibody dependent cellular toxicity
CDC: complement cellular toxicity
biosimilars-lky podobn originlnmu (generika)
enzym konjugovan k Ab: produkt enzymu lze mit spektrofotometricky
ELISA: enzyme linked immuno sorbent assay-navzn antigenu na protiltku
v sorbentu, promyt a reakce s Ab s barvcm enzymem
na Ab me bt fluorescenn barvivo-prtokov cytometrie; radioaktvn ltka;
stice zlata
Separan metody: PAGE-polyakrylamidov gen elektroforza na zklad
molekulov hmotnosti
Chromatografick: na zklad interakce s stacionrn f. HPLC +
MS
SDS elektroforza: proteiny obaleny detergentem, putuj k +,
na zklad. MW
Isoelektrick fokusace: rozdlen na zklad. pI (izoelektrickho
bodu)
dvoudimenzionln elektroforza: 2 gradienty: 1. pH a 2. SDS
elektroforza
Western blot: po SDS PAGE se pes membrnu penesou
proteiny na papr, kde reaguj s protiltkami, stanoven sekundrnmi protiltkami
-> detekce na fotografickm papru

Identifikan metody: Edmanovo odbourvn: chemick odbourvn

jednotlivch AMK pomoc fenyl isothiohyantu -> HPLC, nahraz. MS
Hmotnostn spektrometrie (MS): spotnm MW proteinu
z genov informace a MW zmen lze ovit identitu. MALDI TOF doke urit
identitu mikroorganismu na zklad ionizace/deolarizace a asu letu. Mit lze i
fragmenty po pouit protez (trypsin, kter tp arginin a lysin) -> oven
 vypotanch fragment MS.

12.Prezentace epigenetika
epigenetika ovlivuje jak je projev genotyp ve fenotypu, nen zakdovna
v sekvenci nuleotid
epigenetick znaky nemn sekvenci DNA, jen mn zpsob, jakm buky
vyuvaj jej instrukce
Nutrigenomika: zmna chovn gen jako nsledek vivy ns (naich pedk).
Methylace: k.listov, B12, cholin a betain, epigenetick informace je ddin, ale
ne nezvratn
Monosti modifikace: Acetylace histon, methylace C, miRNA
Modifikace hisotn-posttranslan modifikace-reverzibiln
acetylace-lysin-AKTIVACE (histon acetylasy/deacetylasy)
methylace-methioin/lysin-sp represe
fosforylace-aktivace
ubiquitinace-aktivace i represe
sumoylace-represe
Acetylace zpsobuje zruen + nboje lysinu, tim se neve DNA a histon k sob
tak siln a navc se me lpe dotkat BROMO domn transkripnch faktor.
Deacetylace HDAC (histon deacetylasami) me zpsobit rakovinu. Inhibitory jsou
Vorinostat, Trichostatin A, butyrt, sulforafan, diallyldisulfid

DNA methylace: zpsobuje silencing (vypnn) CpG mlo v genomu, ale hodn
v promotorech. Penos z S-adenosylmethioninu zabezpeuje DNA
methyltransferaza 1: preferuje hemimethylovan etzce. Poet methylovanch
baz se zkoum ve forenzn analze
Methylovan oblasti: heterochromatin (centromery), repetitivn obl., transpozony
methylace je okoprovna pi replikaci ->stejn methylace jako pvodn buka
genomov imprinting: rozdl mezi methylac otce a matky vytv odchylky
v mendelovsk dedinosti
inaktivace x chromozomu
centromery hodn methylovan -> ox. deaminac vznik thymin -> centromery
maj hodn thymin
HELP assay: Hpall a Mspl tp CCGG oblasti, Mspl pokud jsou methylovan, Hpall
naopak, pot porovnn fragment
Detekce DNA methylace: specifick PCR s bisulfitem sodnm
rakovinn buky maj nkter promotory namethylovan -> nkter geny se
nepepisuj
inhibice DNA-methyltransferzy: azacytidin, zebularine, katechiny (zelen aj)
s pibvajcm vkem methylace slbne

MikroDNA: 21-23 nukleotid, pruje se komplementrn s mRNA -> blokace

translace
biogeneze: pepis pi-miRNA (100-1000 nt) ->drosha protein->pre-miRNA (70nt)->
dicer + argonaut-> miRISC(RNA induced silencing complex).
Poruchy u rakoviny, Alzheimera, schizofrenie, KV nemoc
miRNA(miRISC) se ve na UTR oblast ped 3, kde blokuje translaci, me i ped
5
miRNA je pro regulace metabolismu cukr, lipid, insulinu, cholesterol, imunita
exprese je tkov specifick, pouit jako biologickch marker-rakovina prostaty
 1 miRNA reguluje vce mRNA!!
nkter miRNA se zv a nkter sn u rakoviny
miravirsen=mRNA lk proti hepatitis C, blokuje translaci virov DNA mRNA

Genomov imprinting: souboj matinch a otcovch gen, otec i matka maj svj
vlastn methylan vzor, jejich dt vak do gamet d jen ten, kter zskal od rodie
stejnho pohlav.
DNA methylace je dleit ped a pi thotenstn- kyselina listov

Inaktivace chromozomu X, kad buka me mt jen jeden chromozom X, v asn

embryogenezi jeho inaktivace -> kad buka individuln, take eny jsou
mourovan (anhidrotick dermln dysplazie)

Epigenetick reprogramovn: gamety-vysok stupe methylace, paternln

genom aktivn demetylace, maternln pouze pasivn demethyalce, pi
gametogenezi se ve vajku obnov X chromozom, imprinting odstrann

13.Prezentace bioinformatika
FASTA-populrn program pro porovnvn sekvenc a prohledvn databz
BLAST-basic local alignment and search tool, hled podobn sekvence
v databzch
PDB databze: 3D struktura protein