DEJAN GOEVAC, IHTM-centar za hemiju, Beograd, (dgodjevchem.bg.ac.
yu)
NOVIJE TEHNIKE U MASENOJ SPEKTROMETRIJI (I DEO)
NOVI NAINI JONIZACIJE
UVOD
Od svog poetka, pre stotinak godina, masena
spektrometrija postala je sveprisutno istraiva-
ko orue bez kojeg se ne moe zamisliti savremena
nauka i struka: otkrie izotopa, tano odreivae
atomskih masa, kvantitativna gasna analiza, brza
identifikacija tragova zagaivaa i mnoge druge
stvari savremene hemije. Ve pedeset godina spek-
trometrija masa je nezameniva u organskoj hemiji
zbog kunog doprinosa odreivau strukture mo-
lekula. Posle prvog zamaha, due vremena je tehni-
ka masene spektrometrije stagnirala, zato to je u
tom trenutku bilo nemogue analizirati molekule
relativne molekulske mase vee od 1000. Zahvau-
jui novim tehnikama koje su prevazile ta ograni-
ea, masena spektrometrija se zadih godina sve
vie primeuje u biohemiji za prouavae bioma-
kromolekula. Na slici 1 su u vidu blok eme prika-
zani osnovni delovi masenog spektrometra.
Da bi bilo analiziralo u masenom spektrome-
tru, jediee mora biti naelektrisano. Poto su
veina organskih jediea neutralni molekuli, ne-
ophodno ih je jonizovati u jonskom izvoru. Pored do-
bijaa jednog ili vie naelektrisaa po jednom
molekulu, pri ovom procesu se esto deava frag-
mentacija jona na nove jone, radikale i neutralne
fragmente. Nadae, joni se putem zagrevaa, de-
sorpcije1 ili desolvatacije (a uz pomo snanog va-
kuum sistema) prevode u gasnu fazu. Poto se ovaj
lanak bavi novijim nainima jonizacije, vratie-
mo se detanije ovome kasnije.
Jone nastale takvim naina potrebno je anali-
zirati prema odnosu masa/naelektrisae (m/z) u ma-
senom analizatoru. Postoji vie naina da se to
uradi. Kod klasinog masenog analizatora joni se
najpre ubrzaju u elektrinom pou, a zatim usmere
kroz homogeno magnetno poe. Lorencova sila ih
primorava da skrenu sa pravolinijskog puta. Skre-
tae e biti vee ukoliko je masa jona maa, a nae-
lektrisae vee. Na izlazu iz magnetnog poa po-
staven je prorez kroz koji mogu proi samo joni sa
tano definisanim odnosom m/z. Da bi se dobio ma-
seni spektar2 potrebno je postepeno meati jainu
magnetnog poa, tako da se po redu, svi joni (dakle i
Slika 1. Osnovni delovi masenog spektrometra
1 Uzorak moe biti adsorbovan na vrstom nosau
2 U masenom spektru je na apscisi m/z vrednost,a na ordinati obilnost jona
12 Hemijski pregled
oni sa drugim vrednostima m/z) takoe proli kroz
prorez i zatim bili detektovani.
Na osnovu prouavaa ponaaa naelektri-
sanih estica u promenivom elektrinom i mag-
netnom pou konstruisano je nekoliko tipova mase-
nih analizatora: najpre kvadrupolni analizator, a u
novije vreme jon-trap 1 i analizator jon-ciklo-
tron rezonancije (detanije videti u drugom delu
lanka). Postoji i maseni analizator koji ne kori-
sti nikakvo magnetno poe, ve funkcionie na
osnovu razliite brzine preleta jona od jonskog iz-
vora do detektora (TOF = time of flight detektor).
On je jednostavne konstrukcije i sastoji se iz elek-
trinog poa gde se ubrzavaju joni i jedne evakui-
sane cevi kroz koju se kreu ravnomerno pravoli-
nijski. Do detektora u ovakvim instrumentima naj-
pre stiu joni mae mase, dok tei, poto se kreu
maom brzinom, dolaze kasnije.
Pokazalo se da su izvesni jonski izvori kompa-
tibilni sa tano odreenim analizatorom. Zbog to-
ga pored vie tipova masenih analizatora, postoji
i vie naina jonizacije. Izbor jonskog izvora za-
visi i od prirode uzorka i vrste informacija koje
se ele dobiti. Najee se koriste sledei:
elektronski udar (EI )
hemijska jonizacija (CI)
desorpcija poem (FD)
bombardovae brzim atomima (FAB)
matrix assisted laser desorption (MALDI)
elektrosprej jonizacija (ESI)
Metoda jonizacije elektronskim udarom spada u
tzv. tvrde metode zato to se molekul uzorka jako
fragmentie.U ovom jonskom izvoru se brzi elek-
troni sudaraju sa molekulima uzorka pri emu izbi-
jaju jedan elektron iz elektronskog omotaa (dobije
se radikal-katjon), a viak prenete energije se ko-
risti za fragmentaciju. esto se dobiju spektri u
kojima izostaje molekulski jon, pa je za veinu or-
ganskih molekula nemogue na ovaj nain odrediti
molekulsku masu. Neto meka je metoda hemij-
ske jonizacije (vidi sliku 2). Kod ove tehnike nae-
lektrisae se prenosi posredno reakcijom sa joni-
zovanim gasom. Meutim sa poveaem molekulske
mase ispitivane supstance sve je tee dobiti mole-
kulski jon.
 u komplikovane smee, a ne ista jediea, tada
se kolona visokoefikasne tene hromatografije
(HPLC) direktno povezuje sa sa ESI jonskim izvorom.
Rastvor koji treba analizirati ubrizgava se u
metalnu kapilaru koja se nalazi pod naponom od 2-5
kV u odnosu na cilindrinu elektrodu (slika 3). Ra-
stvor unutar kapilare postaje naelektrisan, pa se
na izlazu iz kapilare raspruje u sitne kapi usled
odbijaa istoimenih naelektrisaa. Kapice sa-
dre kako molekule rastvaraa, tako i molekule
ispitivane supstance. Usled isparavaa rastvara-
a, potpomognutog strujom azota, kapice postaju
sve mae, a koncentracija istoimenog naelektri-
saa na povrini kapice sve vea. Kada Kulonove
odbojne sile prevagnu nad povrinskim naponom,
kapica se raspri (eksplodira). Ova Kulonska
eksplozija pravi seriju maih, a jo uvek jako nae-
lektrisanih kapica. Proces isparavaa i eksplo-
zija se ponava sve dok se analizirani molekul pot-
puno ne oslobodi od molekula rastvaraa i postane
(najee) viestruko naelektrisan jon.

Slika 2. Maseni spektri 1-dekanola dobijeni

elektronskim udarom (EI), gore, i hemijskom joni-
zacijom (CI), dole

ELEKTROSPREJ JONIZACIJA (ESI)

Jediea sa velikom molekulskom masom, koja
teko isparavaju ili se raspadaju na povienoj
temperaturi nemogue je analizirati primenom EI
ili CI jonizacije.Tako se za analizu biomolekula
moraju koristiti jo meke metode, u prvom redu
MALDI i elektrosprej jonizacija. Prednost ESI je u Slika 3. ema elektrosprej jonskog izvora
tome to je pogodna za povezivae sa tenom hroma-
tografijom, pa se sa velikom uspenou analizi- Joni koje treba analizirati prolaze kroz mali
raju i jako komplikovane smee. otvor i preko komore u kojoj vlada visoki vakuum
ulaze u maseni analizator.
Prve eksperimente sa tehnikom elektrosprej
jonizacije izveo je epman (Chapman) 1937. godine
2, dok je Doul (Dole) 1968. prvi put primenio za ma- ANALIZA ESI MASENOG SPEKTRA
senu spektrometriju.3 Meutim , pravi razvoj ESI- MIOGLOBINA
MS tehnike otpoie osamdesetih godina prolog
ESI je najmeka metoda jonizacije koja se danas
veka radovima Fena (Fenn) i Mana (Mann).4 Oni su
koristi. Prvi spektri makromolekula dobijeni
uspeno primenili ovu tehniku za jonizaciju veoma
ovom tehnikom su jako zbuivali naunike. Bio je
velikih molekula. Danas istraivi koristei ESI
prisutan veliki broj pikova, a ova meka metoda
mogu jonizovati proteinske komplekse, ribozome,
nije trebala da proizvede mnogo raznovrsnih frag-
pa ak i itave viruse.5 Zbog velikih zasluga za
mentacionih jona. Ubrzo je razjaeno da ustvari
razvitak elektrosprej jonizacije, Fen je 2002. godi-
mnotvo pikova ne potie od fragmenata razlii-
ne bio jedan od trojice dobitnika Nobelove nagrade
te mase, ve od molekulskog jona sa razliitim bro-
za hemiju.
jem naelektrisaa.6 Raznovrsnost i koliina na-
PRINCIP RADA ELEKTROSPREJ stalih jona zavisi od kiselo-baznih osobina mole-
JONIZACIJE kula ispitivane supstance i rastvaraa koji se ko-
risti za pripremae uzorka. Naelektrisae moe
Uzorak za analizu se u ESI jonski izvor uvek nastati protonovaem, deprotonovaem ili dodat-
unosi rastvoren u pogodnom polarnom rastvarau, kom drugog jona (najee Na +, K+, Li + koji mogu bi-
smei rastvaraa ili puferu. Ovo je posebno po- ti prisutni u rastvarau-puferu i staklenm delo-
godno za biomolekule, jer nema potrebe za mukotrp- vima aparature). Tako je i sa spektrom proteina mi-
nim izolovaem iz vodenog rastvora. Ako su u pita- oglobina 7, prikazanom na slici 4:

Godi{te 44. broj 6 (2003) 13

 ovaj eksperiment prvi put napraven, bilo je teh-
niki nemogue registrovati masu reda veliine
miliona daltona, jer je to daleko prevazilazilo
merni opseg instrumenta. Tek je 2000. godine razvi-
jena tehnika po kojoj se mogu registrovati joni sa ja-
ko velikim masama i brojem naelektrisaa. Po toj
metodi istovremeno se meri naelektrisae i odnos
masa/naelektrisae za svaki jon.9
Na sledee dve slike prikazani su u vidu histo-
grama raspodele broja naelektrisaa i maseni
spektar pomenutog virusa. Joni virusa poseduju 300
do 1000 pozitivnih naelektrisaa nastalih proto-
novaem baznih mesta.

Slika 4. ESI maseni spektar mioglobina

Svi prisutni pikovi potiu od viestruko na-
elektrisanog molekulskog jona, a ne od fragmenata.
Molekul mioglobina se lako protonuje u prisustvu
kiselog pufera pri emu nastaje serija viestruko
pozitivno naelektrisanih jona. Dakle, nemogue je
oitati masu molekula direktno iz spektra (jer ne
znamo koliko naelektrisaa odgovara kojem piku),
ali se moe izraunati. Izabere se bilo koji pik i
oznai se kao (M+n)/n. U brojiocu je masa jona, odno-
sno masa molekula M uveana za masu protona n, dok
u imeniocu n predstava naelektrisae jona. Su- Slika 5. Histogram koji prikazuje raspodelu
sedni pik sa maim odnosom m/z odgovara jonu sa broja naelektrisaa TMV-a koji je proao kroz
jednim naelektrisaem vie i masom uveanom za ESI-MS
jednu jedinicu, pa se oznaava kao (M+n+1)/(n+1). Na Maseni spektar TMV dao je mase izmeu 39 i 42
primer: miliona dalton, to je bilo u dobrom slagau sa
M+n izraunatom molekulskom masom koja iznosi 40,5
1131,3 = miliona daltona. Jo uvek se radi na poboau
n
tanosti merea.
M + n +1
1060, 7 =
n +1
Reavaem ove dve jednaine dobije se da je mo-
lekulska masa 16954,5, a broj naelektrisaa za odgo-
varajui pik je n=15. Da bi se izraunala jo tani-
ja masa sline jednaine se mogu postaviti za svaki
pik, a od dobijenih rezultata se rauna sreda vred-
nost.

MASENA SPEKTROMETRIJA VIRUSA

Razvoj elektrosprej jonizacije je znatno proi-
rio ulogu masene spektrometrije u raznim oblasti-
ma hemije i biohemije. Na primer, omogueno je pro-
uavae nekovalentnih interakcija izmeu makro-
molekula, prouavae uvijaa proteina i kao i in-
terakcija izmeu proteina i virusnog proteina.
Jedna grupa naunika je 1996. godine uspela da
virus koji izaziva mozainu bolest duvana (TMV)
propusti kroz maseni spektrometar sa ESI izvorom.
TMV je sastaven od oko 2140 identinih protein-
skih subjedinica uvijenih u 300 nm dugu spiralu
prenika 17 nm. U centralnom, cilindrinom delu
nalazi se lanac RNK od 6395 nukleotida. Dakle, i-
tav virus je bio jonizovan i, kao takav, proao kroz
analizator pod visokim vakuumom. Iznenaujue, na
izlazu aparata virus je sakupen neoteen, i
uspeno korien da zarazi list duvana.8 Kada je
Slika 6. Histogram koji prikazuje maseni
spektar TMV (na apscisi su mase u milionima
daltona )
Ovi rezultati otvaraju itav niz mogunosti za
primenu ESI-MS za detekciju i identifikaciju vi-
rusa, ihove strukture i funkcije, pa i kliniku
primenu.
LITERATURA
1. D. Godjevac, Hemijski pregled, 44 (1), 2003, 2-6
2. S. Chapman, Physical Review, 10, 1937, pp184-190
3. M. Dole, L.L. Mack, R.L Hines, Journal of Chemical
Physics, 49, 1968, pp2240-2249

14 Hemijski pregled
4. M. Yamashita, J.B Fenn, Journal of Physical Chemi-
stry, 88, 1984, pp4451-4459
5. Schweizerische Chemische Gesellschaft, Chimia, 57,
2003, 7373
6. J.B. Fenn, M. Mann, C.K. Meng, S.F. Wong, and C.M.
Whitehouse, Science 246, 1989, 64
7. Methods in Enzymology, 193 , 1990, pp 422
8. G. Siuzdak, B. Bothner, M. Yeager, C. Brugidou, C.M
Fauquet, K. Hoey, C.M Chang, Mass Spectrometry and
Viral Analysis, Chemistry & Biology, 1996, 3, p.45
9. S. Fuerstenau, W. Benner, J. Thomas, C Brugidou, B
Bothner, G. Siuzdak, Angew. Chem. Int. Ed., 2001, 40,
No. 3

VESTI iz KOLE
VESTI za KOLE

IANA ITI, Osnovna kola "Slobodan Sekuli", Uice

SCENARIO ZA REALIZACIJU ASA: BAZE (HIDROKSIDI)

ije su formule date u jednokisele, dvokisele i tro-

Razred: VII
Tip asa: Obrada novog gradiva
Cievi asa:
1. Da uenici koristei prethodno znae i isku-
stvo i kroz jednostavne oglede naue svojstva,
podelu i dobijae baza.
2. Da uenici samostalno sastavaju formule ba-
za i da uoavaju po emu se baze razlikuju od dru-
gih neorganskih jediea.
Materijal:
Kartice za podelu uenika u grupe (asocija-
cije sa pojmovima vezanim za temu asa)
Papiri veeg formata (10 komada)
Nastavni listii sa zadacima
Posue, pribor i supstance
Glavni koraci:
Formirae grupa i rad u grupama
Izvetavae grupa
Formirae ekspertskih timova
Rad u grupama
Izvetavae grupa i izvoee zakuaka
Tok rada:
Korak 1. Uenici se dele u pet grupa izvlae-
em kartica sa pojmovima koji se odnose na temu a-
sa (1. formula baza / OH- , 2. podela baza / Mg, 3. ra-
stvorivost baza / Ca, 4. svojstva baza / Na, 5. amoni-
jak / NH3). Grupe dobijaju razliite zadatke:
I grupa (formula baza) uenici imaju zadatak
da na osnovu opte formule baza i objaea da-
tog na nastavnom listiu sastave formule baza iji
su nazivi dati i da daju nazive bazama na osnovu za-
datih formula;
II grupa (podela baza) uenici imaju zadatak da
na osnovu uputstva na nastavnom listiu o podeli
baza prema broju hidroksidnih grupa, svrstaju baze
kisele i da to prikau tabelarno;
III grupa (rastvorivost baza) uenici imaju
zadatak da na osnovu ogleda i uputstva na nastavnom
listiu izvedu zakuak o podeli baza prema ra-
stvorivosti (NaOH, Ca(OH)2, Fe(OH)3 );
IV grupa (svojstva baza) uenici dobijaju tri
epruvete sa rastvorom natrijum -hidrokisda i zada-
tak da ispitaju i ematski prikau promenu boje
sledeih indikatora u baznoj sredini: crveni lak-
mus, metil-otan i fenol-ftalein;
V grupa (amonijak) uenici imaju zadatak da
putem ogleda ispitaju kako se mea boja indikatora
u rastvoru amonijaka, da izvedu zakuak zato je
amonijak svrstan u baze i da prikau hemijskim jed-
nainama dobijae amonijaka i egovu reakciju sa
vodom.
Korak 2. Na osnovu izvedenih zakuaka ueni-
ci pripremaju izvetaje na velikim papirima. Po-
tom predstavnici grupa lepe izvetaje na tablu, sa-
optavaju rezultate rada ostalim grupama i odgova-
raju na ihova pitaa.
Korak 3. Formirae ekspertskih timova.
Korak 4. Grupe dobijaju razliite eksperimen-
talne zadatke:
I grupa (Na) uenici na osnovu ogleda (reakci-
ja izmeu natrijuma i vode) treba da izvedu zaku-
ak o nainu dobijaa baza i da reakciju prikau
hemijskom jednainom;
II grupa (Ca) uenici na osnovu ogleda (reakci-
ja izmeu kalcijum-oksida i vode) treba da izvedu
zakuak o nainu dobijaa baza iz ihovih anhi-
drida i da reakciju prikau hemijskom jednainom;
III grupa (Mg) - uenici na osnovu ogleda (sago-
revae magnezijuma i reakcija izmeu nastalogpro-
izvoda i vode) treba da izvedu zakuak o vezi metal
bazni oksid baza i da reakcije predstave hemij-
skim jednainama;
IV grupa (NH3) - uenici na osnovu ogleda (reak-
cija izmeu gvoe(III)-hlorida i natrijum-hidrok-
sida) treba da izvedu zakuak o nainu dobijaa

Godi{te 44. broj 6 (2003) 15