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ESTABLECIMIENTO DEL
CULTIVO DE TEJIDOS
Equipo
Jose Rafael Ramirez Magaa
Jose Domingo Chi Moo
Ruben Israel Ek May
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5. ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO DE TEJIDOS.
5.1.2. Multiplicacin.
5.1.3. Enraizamiento.
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encuentren de nuevo en el medio natural. La induccin de estas races se produce
modificando ligeramente las caractersticas del medio de cultivo adecundolas
para la generacin de races.
5.1.4 Adaptacin.
Esta fase consiste en el paso de las plantas del cultivo al medio natural. Este es
un paso extremadamente importante, ya que si no se realiza cuidadosamente se
pueden perder gran nmero de plantas. Las plantas en condiciones de cultivo
estn en una atmsfera con alta humedad y baja intensidad luminosa, por tanto el
tejido epitelial se caracterizar por tener menos ceras que protejan a las plantas
contra la deshidratacin. El acondicionamiento de nuevo al medio exterior se
efectuar por tanto cuidadosamente, utilizando para ello invernaderos.
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5.2. Seleccin de la planta madre.
La planta donante debe elegirse en base a una seleccin masal positiva para las
caractersticas agronmicas deseables. Una vez seleccionados los individuos, es
preciso definir el tipo de explanto a establecer en condiciones in vitro. En general,
los rganos jvenes o bien rejuvenecidos son los que tienen mejor respuesta en el
establecimiento que los obtenidos a partir de materiales adultos. El empleo de
explantos que se encuentran expuestos a bajos niveles de patgenos puede
resolver el problema de la contaminacin por hongos y bacterias durante el
establecimiento del cultivo in vitro. Se recomienda colectar explantos primarios a
campo durante la estacin primaveral y estival, cuando existe una brotacin activa
de las yemas, ya que el empleo de yemas en estado de dormicin ocasiona serios
problemas de contaminacin. A fin de lograr explantos de ptima calidad es
conveniente hacer crecer las plantas donantes por un tiempo mnimo en
condiciones de invernculo. De esta forma es posible incidir directamente sobre el
estado sanitario y la calidad de los explantos mediante el control de la intensidad
lumnica, temperatura y reguladores de crecimiento. Para especies ornamentales
tropicales y subtropicales se recomienda mantener las plantas donantes en
condiciones de alta temperatura (25C) y baja humedad relativa (75%) a fin de
reducir la proliferacin de patgenos.
5.2.1. Genotipo
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5.2.2. Fitosanidad.
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cientfica que expliquen el mecanismo de accin de los contaminantes, que los
hacen perjudiciales para las plantas in vitro.
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contaminacin a travs del uso de sustancias antimicrobianas y el cultivo de
meristemos.
La edad es un factor importante ya que los tejidos juveniles poseen un alto grado
de actividad meristematica y tienden a tener mas plasticidad in vitro que los
adultos, como es el caso de la respuesta de cotiledones, hipoctilos y hojas
aisladas de material juvenil que son usadas para micropropagacion. Los tejidos
juveniles presentan una mayor capacidad morfogenetica, la cual se manifiesta en
respuesta de crecimiento, proliferacin y enraizamiento, a diferencia de un tejido
maduro el cual es mas difcil de desdiferenciar e inducir a la produccin de races
y brotes.
Es mucho ms difcil propagar material adulto que juvenil ya que los primeros son
recalcitrantes, es decir, difciles de regenerar. Sin embargo, an en estos casos es
posible extraer explantos de mayor capacidad regenerativa mediante dos formas:
Para seleccionar el material ms juvenil en una planta adulta hay que considerar el
fenmeno de topfisis. Este es un proceso por el cual el tipo de crecimiento de un
nuevo individuo est determinado por la posicin que ocupaba en la planta adulta.
Esto es ocasionado por efecto del envejecimiento fisiolgico e implica que los
explantos ms reactivos in vitro se encuentran en las yemas de las reas basales
del tronco y races.
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desarrollo tanto de especies de climas templados como de plantas tropicales. Es
de destacar que durante el perodo iluminado, la temperatura en el interior de los
frascos de cultivo es 1-2C superior a la de la cmara, debido al efecto
invernadero; se crea as un termoperodo suave. La velocidad de sntesis y de
degradacin de distintos compuestos y por ende el nivel de produccin y
acumulacin de metabolitos tambin es influenciado por la temperatura. En cuanto
a la humedad relativa, sta se mantiene en alrededor del 70 % en las condiciones
en las que se realizan habitualmente los cultivos, aunque vara con la temperatura
de la cmara y el tipo y cierre de los recipientes. El porcentaje de humedad
relativa no es reportado en la mayora de los trabajos sobre cultivo in vitro de
vegetales.
Gran parte del cultivo de tejidos, esta en la edad del explante que va ser utilizado
para los trabajos. La edad de la planta y el grado de diferenciacin del tejido
muchas veces etas interrelacionados y pueden producir efectos interactivos se
cultivan in vitro. Por ejemplo, segn los experimentos realizados por Toivonenn y
Kartha en 1988, quienes trabajaron con Pinus glauca, descubrieron que las
plntulas a las que se les extirpo los cotiledones 7 a 8 das luego de ser plantadas,
formaban las primeras yemas adventicias antes que plntulas cuyas yemas fueron
extirpadas luego de los 8 dias. Asi tambin de yemas adventicias en explantes de
hojas de Cucumis melo, mostraron mayor produccin en los explantes que tenan
un tamao entre 0.3 y 0.5 mm los cuales tenan 14 das de plantados. Esta
propiedad no tenia aquellos explantes que tenan ms de 21 das. La edad del
explante puede clasificarse en cuatro clases:
5.3 Explante.
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individuales (como en el caso de los protoplastos). Con excepcin de los vulos y
el polen, los explantes estn constituidos por tejidos y/o clulas somticos. El
nombre explante es una versin castellanizada del vocablo ingls explant;
acuado especialmente para identificar a los tejidos vegetales cultivados in vitro y
sin otro significado. La seleccin del explante es un aspecto clave para tener xito
en el cultivo de tejidos, ya que dependiendo de su ubicacin en la planta, del tipo
de tejido que contiene, de su edad cronolgica y fisiolgica, de su contenido
endgeno de hormonas, entre otros, se comportar de una manera o de otra.
El material vegetal con el que se inicia un cultivo in vitro puede ser cualquier
clula, tejido u rgano de la planta (explante). Comnmente se seleccionan
aquellas partes de la planta que se encuentran en divisin activa, como las
regiones meristemtica:
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5.3.2. Posicin del explante.
Una vez que se ha obtenido el explante, este debe ser correctamente desinfectado
para evitar la proliferacin de contaminantes biolgicos (bacterias, hongos y
levaduras principalmente) en el medio, los cuales afectan el crecimiento y
desarrollo del explante (Fontrbel 2001) y compiten con el mismo deteriorndolo y
hacindolo inservible para cultivo (Kyte & Kleyn 1996). Los explantes
desinfectados son trasladados a una cmara de flujo laminar (con aire filtrado,
libre de microorganismos) donde se realizar la transferencia a un medio de
cultivo apropiado (Kyte & Kleyn 1996) al tipo de especie y las necesidades del
cultivo. Una vez que el explante est en el medio, se sella el rasco de cultivo y se
traslada a una cmara de crecimiento con condiciones de humedad, temperatura y
fotoperiodo controladas para su desarrollo. Una vez que los explantes luego de
algunas semanas en la cmara de crecimiento han desarrollado algunas races y
hojas, es el momento de realizar el traspaso al invernadero. Este es uno de los
pasos ms difciles de la tcnica, ya que los explantes in vitro se encuentran en
condiciones ambientales muy diferentes y se alimentan de manera heterotrfica
(del medio de cultivo) y el estrs de adaptacin a las condiciones de vivero es muy
fuerte (Kyte & Kleyn 1996, Fossard 1999). Un porcentaje de las plntulas
clonadas in vitro no sobrevive al invernadero, pero la parte que si sobrevive crece
ya en condiciones normales y al cabo de unas semanas est lista para ser
trasladada al campo de cultivo.
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Realizar una adecuada preparacin de la planta dadora de explantes,
cultivndola preferentemente en invernaderos tratadas con productos qumicos
que eliminen patgenos y eventuales microorganismos endfitos.
Los explantos deben ser esterilizados antes de ser establecidos en condiciones de
cultivo. Protocolo del tipo de esterilizacin superficial de material vegetal son:
Cultivar los explantes en una cmara de transferencia con aire estril (gabinete
de flujo laminar), localizada en un ambiente limpio y no expuesta a corrientes de
aire. De no disponer este equipamiento, se pueden sustituir con cuartos
esterilizados previamente con luz ultravioleta (nunca exponerse a la luz UV en
forma directa). La mesada de trabajo y las paredes del gabinete deben ser
desinfectadas previamente con etanol al 70%. De la misma manera deben ser
desinfectados exteriormente todos los recipientes (conteniendo medios de cultivo,
agua, etc.) que ingresen en el rea del aire estril. Los operarios constituyen
frecuentemente una importante fuente primaria de contaminacin, porque es
recomendable que, antes de comenzar a trabajar laven sus manos y antebrazos
con abundante agua y jabn y se des infecten con etanol al 70 %. La utilizacin
de guardapolvos, guantes y mscaras protectoras de la boca y de la nariz,
as como los gorros protectores de los cabellos, ayudan a reducir sensiblemente
los niveles de contaminacin. Los instrumentos de trabajo (pinzas, pipetas, tijeras,
agujas, cpsulas de Petri) deben ser esterilizados antes de su uso. Muchos de
estos instrumentos pueden ser colocados en etanol al 95% y, antes de ser
usados, se deben flamear cuidadosamente en la llama de un mechero.
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5.4.3. Siembra en diferentes medios: slidos y lquidos.
Induccin de embriognesis
Cultivo de protoplastos
Cultivo de suspensiones celulares
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Factores relacionados con el ambiente de incubacin
Luz, obscuridad o fotoperiodo
Tipo de luz
Temperatura
5.5.1. Fotoperiodo.
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La cantidad de luz: LA IRRADIACIN . La irradiancia puede ser expresada
en funcin de la energa por unidad de superficie W/m2
5.5.3. Temperatura.
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BIBLIOGRAFIA.
Regato S., Gonzlez A., Huarte M. Produccin de plntulas por sistema autotrfico
hidropnico.
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