Resultados de anlisis microbiolgico de leche agria vacas gordas de la

empresa La Casa de los Alimentos S. A.

Pesaje de la muestra:

1. 11 gramos para las determinaciones de Coliformes totales, Coliformes

termo tolerantes, E. coli y Staphylococcus aeurus.
2. 25 gramos para la determinacin de salmonella.

Recuento de Coliformes totales y termo tolerantes, mediante NMP

(Nmeros ms probables FDA/BAM):

En la etapa presuntiva realizaron diluciones decimales desde 10-1 hasta 10-5

respectivamente, partiendo de la solucin madre, la cual se obtuvo pesando 11
gramos de la muestra (leche agria) en 90 ml de agua peptonada, para obtener una
relacin 1/10. Por cada dilucin se inocularon tres tubos de caldo lauril simple,
agregndole 10 ul, 1ul, 0.1 ul, 0.01 ul de la muestra.correspondientes a cada
dilucin, hasta llegar a 10-5.

Los tubos inoculados fueron incubados a 35C, por 24 horas en bao mara para
posteriormente realizar el anlisis.

Resultados:
 <3 NMP por gramo de muestra

Interpretacin: todos los tubos inoculados con las diferentes diluciones, resultaron
negativas en la prueba presuntiva de Coliformes totales y termo tolerantes, se
puede evidenciar en los tubos la ausencia de turbidez y produccin de gas, lo que
indica que la muestra est en condiciones ptimas de salubridad y es idnea para
el consumo humano. El mtodo NMP es capaz de detectar hasta tres bacterias
presentes en cada gramo de muestra, es por ello que se reporta menor que tres
nmeros ms probables de bacterias por gramo de muestra.

Debido a que las pruebas presuntivas resultaron negativas, no fue necesario

realizar las pruebas confirmatorias en caldo bilis verde brillante para Coliformes
totales y caldo EC para Coliformes termos tolerantes.

Recuento de Escherichia coli en Agar Chromocult FDA BAM:

De la suspensin madre se tomaron 10 ml, 1 ml, 0.1 ml y 0.01 ml, hasta llegar a
10-5 de la dilucin correspondiente. El recuento se realiz por el mtodo de vertido
en placa, donde primeramente se agreg la muestra a cada plato Petri y luego se
le agrego el medio de cultivo chromocult, se homogeneizo y se dej solidificar para
luego incubarse a 37C por 24 horas, para posteriormente realizar el recuento.

Resultado:

No se observ crecimiento microbiano, en las placas de Agar Chromocult, lo que

indica que no hay presencia de E. coli en 11 gramos de muestra.
 Recuento de Staphylococcus aeurus en Agar Baird Parker FDA BAM:

De la muestra madre (11 gr en 90 ml de agua peptonada) se tomaron 10 ml, 1 ml,

0.1 ml y 0.01 ml, hasta llegar a 10 -5 de la dilucin correspondiente. El recuento se
realiz por el mtodo de esparcimiento, donde primeramente se agreg el medio
de cultivo a cada plato Petri y luego se le agrego la muestra, la cual fue esparcida
con el Asa de Drigalsky en movimientos rotatorios, se homogeneizo y se dej
reposar por 5 minutos para luego incubarse a 37C por 24-48 horas, para
posteriormente realizar las dos lecturas correspondientes:

Resultados:

Ausencia de Staphylococcus aeurus en 11 gramos de muestra.

Tras 24 horas de incubacin no se observ crecimiento microbiano, por lo cual se

re incub 24 horas ms. A las 48 horas de incubacin se observ crecimiento
microbiano , sin embargo las colonias no son caracterstica de Staphylococcus
aeurus, las cuales deben ser negras convexas, con doble halo, producto de la
precipitacin de la sales biliares y la reduccin de teluro a telurto por accin de la
lipasa sobre la yema de huevo, probablemente estos microorganismos son partes
de la flora natural de la leche agria, estas colonias no son indicador de
contaminacin o de esterilidad, por lo tanto no se deben tomar en cuenta en los
anlisis rutinarios.
 Deteccin de Salmonella mediante reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR en tiempo real) y aislamiento en Agar Sulfito de bismuto y Hektoen:

La determinacin de salmonella se realiz en tres etapas: pre enriquecimiento,

enriquecimiento selectivo y etapa final de identificacin mediante aislamiento y
PCR. En la primera etapa de pre enriquecimiento se utilizaron 25 gramos de la
muestra de leche agria suspendida en 225 ml de APB (agua peptonada bufferada)
para reconstituir bacterias en estado de estrs o aquellas que hayan sido
maltratadas por algn tratamiento aplicado a la muestra, obteniendo una relacin
1/10, se homogeneizo por 15 minutos y se incubo a 37C por 48 horas.

Transcurridas las 48 horas de incubacin se realiz la segunda etapa de

enriquecimiento selectivo en caldo Rappaport (medio altamente selectivo para
salmonella, el cual inhibe el crecimiento de otras especies microbianas que no son
de inters) donde se tomaron 100 ul de la suspensin madre y se agregaron al
caldo, luego se incubo a 37C por 24 horas.

Tradicionalmente la identificacin de salmonella tarda un periodo de 7 das, sin

embargo con los avances cientficos de las nuevas tcnicas moleculares, el tiempo
se ha reducido a 4 das utilizando la tcnica PCR que consiste en la amplificacin
exponencial de millones y millones de copias de fragmentos de ADN del
microorganismo estudiado utilizando primer especficos y la enzima taq polimerasa
como sintetizadora de ADN.

En la tercera etapa se realiz la extraccin de ADN bacteriano utilizando el Kit de

extraccin QIAGEN partiendo del caldo selectivo Rappaport. Una vez obtenido el
ADN se procedi a la amplificacin en el termociclador, para ello se utilizaron
primer o secuencias de ADN complementarios especficos para una regin muy
conservada de salmonella.

Resultados PCR:

No se realiz amplificacin de ADN, lo que nos indica que la bacteria no se

encuentra presente en la muestra.

Como mtodo de verificacin se realiz el aislamiento en Agar sulfito de bismuto y

Agar Hektoen, los cuales son altamente selectivos para salmonella ya que
contienen inhibidores como metales pesados y sales biliares. Para el aislamiento
se tom una asada partiendo del caldo selectivo Rappaport usando el mtodo de
aislamiento por estras en ambos medios, luego se incubaron a 37C por 24 horas
para su posterior anlisis.
Resultados del Aislamiento:

Ausencia de Salmonella en 25 gramos. No se observ crecimiento microbiano en

los medios selectivos, lo que indica que la bacteria no est presente en la muestra.

Realizado por: ________________

lvaro Obando Brizuela

Microbiologa UNAN-Managua