EFECTOS DE LA LUZ EN EL CULTIVO FOTOMIXOTRFICO DE LA PIA

EN BIORREACTORES DE INMERSIN TEMPORAL.

Luis A. Molina El Hage1, Maritza Escalona2, Romelio Rodrguez2, Abdulnour Jihad3;
Desjardins Yves3, Justo L. Gonzlez-Olmedo2
1
CEASE, Santa Cruz de la Sierra, Bolivia.
2
Centro de Bioplantas, UNICA, Ciego de Avila, Cuba.
3
ENVIROTROM, Laval University, Quebec, Canad.
Luis A. Molina El Hage
chichimolina@hotmail.com
Telef. 591 3 3561170
Movil: 591 71644049
http://chichimolina.wordpress.com/
Santa Cruz - Bolivia
Resumen:

La pia es una importante especie vegetal cultivada en muchos pases de Centro y Sur Amrica, as como de la regin Asia-
Pacfico. El desarrollo de la biotecnologa de la pia, como el de cualquier otra especie, depende de la disponibilidad de
mtodos eficientes para la propagacin in vitro y de un nmero de herramientas moleculares. El empleo de los Biorreactores
de Inmersin Temporal (BIT) genera mayor calidad en las plantas que los mtodos tradicionales de micropropagacin,
debido al mejor manejo de los ambientes in vitro y de la nutricin. Sin embargo las condiciones en los BIT pueden ser
mejoradas aun ms, esto se logra por ejemplo al favorecerse el fotomixotrofismo como un eslabn intermedio al
crecimiento fotoautotrfico que caracteriza la aclimatizacin ex vitro, siendo estos los objetivos de este trabajo. Los efectos
de la luz sobre la evolucin de CO2 se evaluaron en los frascos de cultivo, mostrando una reduccin durante la etapa
luminosa del fotoperiodo y un incremento en la oscuridad, cuando se compararon los segundos ciclos de inmersiones bajo
dos condiciones de luz. Los brotes de pia alcanzaron valores de fotosntesis neta (Fn) superiores a 1,30 mol CO2.s-1 .10
cm-2, pero sin diferencias estadsticas entre ambas intensidades lumnicas, por lo que se presume que ellos utilizan ms los
nutrientes del medio de cultivo que sus propios fotosintatos para elaborar sus reservas. La luz tambin increment la
calidad de las plantas. Durante la aclimatizacin ex vitro, al inicio las plntulas redujeron la Fn, pero luego de dos semanas
la incrementaron. La Fn se redujo de nuevo a los 21 das de transferidas las plantas a exteriores, quizs por insuficientes
estmulos ambientales.

Palabras claves: evolucin de CO2, fotosntesis, aclimatizacin.

Effects of light on photomixotrophic culture in Temporary Immersion Bioreactores of pineapple plantlets.

Abstract:

Pineapple is an important crop for many countries in Central and South America as well as the Asia-Pacific region. The
development of pineapple biotechnology, as with any other crop, is dependent on the availability of a number of efficient
methods for in vitro propagation and molecular tools. The use of Temporary Immersion Biorreactors (TIB) generates higher
plant quality than the traditional micropropagation methods, due to the better in vitro environment and nutrition handling.
However, even the TIB conditions can be improved, by favoring the photomixotrophism as an intermediate link of the
photoautotrophic growing, which is characteristic of the ex vitro acclimatization, and these are the objectives of this
research. The effects of light on the CO2 evolution in the culture flasks were evaluated, showing a reduction in the light and
a rising in the dark, when it were compared the second cycles of the immersions under both conditions. Pineapple shoots
recorded values of Pn higher than 1,30 mol CO2.s-1 .10 cm-2 but without statistical differences among both light intensities,
then it is presumably that the pineapple shoots seem to utilize more the culture medium nutrients than their own
photosynthates to elaborate the reserve substances. Also light increased the plant quality. During ex vitro acclimatization
plantlets reduced Pn at the beginning, later two weeks increased it. Pn was reduced again on 21day after of transfer, perhaps
for insufficient environmental stimulation.

Key words: CO2 evolution, photosynthesis, acclimatization.

Introduccin:

La pia es uno de los cultivos ms importantes en Centro- y Sud-Amrica as como la regin del Asia-Pacifico. A pesar de
que el cultivo se remonta a la poca pre-colombina existen muy pocas variedades comerciales, y slo el cultivar Cayena lisa
domina la produccin comercial. La mejora gentica de variedades es muy difcil en pia y se ha avanzado muy poco en
comparacin con otras importantes especies como trigo o arroz. Esta caracterstica hace a la pia especialmente idnea para
la aplicacin de ingeniera gentica que permite incorporar caractersticas especificas de otras especies sin cambiar el
conjunto del genoma (Botella y Fairbairn, 2002), entre ellas mecanismos de resistencia a estrs biticos y abiticos,
eficiencia metablica, que las haga competentes en programas de seguridad alimentaria.

La pia es la segunda fruta tropical ms importante al nivel mundial en cuanto a volumen de produccin, en el 2000 sta
ascendi a 13,7 millones de toneladas, para ocupar el 23% del total de la comercializacin de frutas tropicales. Se reconoce
que el 70% se consume en los propios pases productores y los restantes 4,1 millones de toneladas se comercializan como
frutos frescos, conservas y zumos directos o concentrados (FAO, 2001, http://www.pineapleinn.com/reviews.html). Estas
altas tasas de produccin y consumo justifican investigaciones que traten de mejorar el material vegetal y los sistemas de
propagacin empleados.

La micropropagacin de la pia incluye la secuencia de cultivos en medio lquido para la multiplicacin de meristemos y
yemas axilares mediante la llamada micropropagacin convencional (Firoozabady et al., 1997; Daquinta y Benega, 1997),
la cual est muy limitada para lograr la cantidad de plantas requeridas anualmente para iniciar nuevas plantaciones. El
cultivo en biorreactores de inmersin temporal (BIT) supera el nmero de plantas con mayor calidad y abarata los costos de
produccin (Escalona et al., 1999).

Las investigaciones en el cultivo in vitro de plantas se han enfocado fundamentalmente en las respuestas fisiolgicas,
bioqumicas y moleculares debidas a la composicin del medio de cultivo. En los ltimos aos un significativo nmero de
trabajos se realizan sobre los efectos ambientales sobre el crecimiento de las plntulas (Nguyen y Kozai, 1998; Gonzlez-
Olmedo et al., 2001). En pia Gonzlez-Olmedo et al. (2002) informaron incrementos en la calidad de los brotes por
manejos de los BIT con aire enriquecido con CO2, dos concentraciones de sacarosa en el medio de cultivo y dos niveles de
flujo de fotones fotosintticos (FFF).

La luz es un determinante componente del sistema de propagacin. El crecimiento de las plntulas in vitro se estimul en
muchas especies por incremento en la fotosntesis, debida a mayor nmero de intercambios gaseosos (Kozai y Sekimoto,
1988), aire enriquecido con CO2 (Desjardins et al., 1988; Kirdmanee et al., 1995 a,b), reduccin de sacarosa en el medio de
cultivo (Hdider y Desjardins, 1995) y manejo de la luz (Hayashi et al., 1993). Kitaya et al. (1995) tambin destacan el papel
de la luz y su calidad en la propagacin in vitro de plntulas de papa. De igual modo en este trabajo se evalan los efectos
de dos niveles de FFF sobre los brotes de pia cultivados en BIT enriquecidos con CO 2.

Materiales y Mtodos:

Propagacin del material vegetal: Los brotes de pia (Ananas comosus L. Merr) del cultivar Cayena lisa se cultivaron en
Biorreactores de Inmersin Temporal (BIT) segn describen Escalona et al.,1999, con las modificaciones impuestas por los
tratamientos: luz (FFF= 80 y 275 mol m-2s-1), y aire enriquecido con CO2 (2000mol.mol-1). Cada tratamiento const de
tres repeticiones.

Determinacin de la concentracin de CO2: Los contenidos de CO2 se midieron en un cromatgrafo gaseoso, modelo
Perkin Elmer 8500, dotado con un detector de ionizacin de llama, con columna Poropak Q y un integrador modelo
HP3393A. Como gas transportador se emple He con un flujo de 30 psi.

Determinacin de la fotosntesis neta: Al final del experimento in vitro y cada siete y hasta 21 das durante la
aclimatizacin, diez plantas completas se utilizaron para medir sus capacidades fotosintticas. La Fn fue calculada a partir
de la tasa de asimilacin neta de CO2 por el rea foliar total de cada planta colocada en cmara para hojas de conferas
acoplada a un analizador infrarrojo de gases (IRGA) modelo LI- 6400, porttil. El PAR de saturacin para la pia fue
prximo a 600 mol m-2s-1.

Variables de crecimiento: Al final del experimento in vitro se cosecharon todas las plntulas, se contaron y se determin las
masas frescas por pesada en balanza analtica.

Condiciones de aclimatizacin: Las plntulas de cada tratamiento fueron transferidas a casas de cultivos con las siguientes
condiciones ambientales, todas medidas a las 12m: FFF= 150 mol m-2s-1; HR= 95 1%; Temperatura: 25 1C.
Como sustrato se emple turba y el riego fue por nebulizadores areos bajo control automatizado para garantizar la HR
antes referida.

Resultados y Discusin:
La luz es uno de los aspectos ms crticos en la produccin de plantas. Muchas investigaciones han evaluado los efectos de
la intensidad de la luz, su espectro de distribucin y su ciclo, pero comparativamente poco se ha hecho sobre el efecto en la
evolucin del CO2 en los frascos de cultivo.
En la figura 1 se comparan las dinmicas de evolucin del CO 2 durante el segundo ciclo de inmersiones bajo condiciones de
luz y oscuridad segn el fotoperodo, para ambos tratamientos de FFF.

Figura 1.

En la oscuridad, la acumulacin de CO2 en el interior de los frascos de cultivo sometidos a FFF= 275 mol m-2s-1 super en
ms del doble la concentracin del aire enriquecido, cuando fue de mil unidades ms que la mxima concentracin
determinada en los frascos del tratamiento con menor FFF, en ambos casos al final del segundo ciclo de inmersin a la
oscuridad. Por otra parte este comportamiento se invierte durante la fase iluminada del fotoperodo.

Cuando las plantas estn iluminadas los contenidos de CO2 en los frascos de cultivo de los BIT decrecieron durante el
segundo ciclo de inmersin. La reduccin fue ms intensa en el tratamiento con mayor intensidad lumnica, particularmente
en la primera hora siguiente a la inmersin.

Un significativo consumo de CO2 tiene lugar tan pronto como las plntulas son iluminadas, cuando crecen bajo condiciones
caracterizadas por microambientes enriquecidos con CO 2 y mayores FFF. Esta intensa tasa de asimilacin puede agotar el
CO2 disponible en el interior de los frascos debido al crecimiento vigoroso de los brotes (Kitaya et al., 1996).

En correspondencia con esta valoracin se aprecian los efectos de ambos tratamientos sobre las variables de crecimiento en
la tabla 1.

Tabla 1.
Los suplementos de CO2 al aire que alimenta los BIT mejoraron las condiciones para el crecimiento fotomixotrfico de los
brotes de pia. La mayor intensidad lumnica favoreci la fijacin del gas por las plntulas incrementando
significativamente la calidad de las mismas expresada en su masa fresca. Es importante recordar que en esta fase se trata de
mejorar la calidad de los brotes y no el nmero de ellos, para favorecer su aclimatizacin ex vitro.

Las plantas CAM entre las que como se conoce se encuentra la pia, tienen mecanismos para la separacin temporal de CO 2
por fijacin y reduccin respectivamente. En la oscuridad se fija CO2 como malato y en la luz se libera para ser reducido por
la Rubisco en fotosntesis. Las plantas del tipo CAM toman este CO 2 atmosfrico cuando los estomas estn abiertos
(Winter, 1985) al final de la fase iluminada del fotoperodo. As el comportamiento antes descrito no se corresponde con los
resultados de este estudio, de modo que se supone operaron ms los mecanismos de plantas C 3, dadas por las condiciones
del cultivo en los BIT.

Independientemente de las rutas metablicas seguidas, en las plntulas propagadas bajo mayor FFF se mejor la calidad de
ellas con ligeros incrementos en la actividad fotosinttica al final del cultivo in vitro o momento de transferencia a las casas
de cultivo (figura 2).

Figura 2.

Los brotes de pia redujeron la actividad fotosinttica al ser transferidos a condiciones ex vitro, cualquiera hubieran sido las
intensidades de luz con las que fueron propagados, aunque resultaron ms marcadas en las de mayor FFF. Son reconocidos
los cambios bioqumicos y fisiolgicos que ocurren en las plntulas de la inmensa mayora de las especies durante este
trnsito, con ellas se atenan los efectos estresantes impuestas por las drsticas variaciones ambientales (Van Huylenbroeck
et al., 1998;Pospisilova et al., 1999).
Los mximos porcentajes de supervivencia en ambos grupos de plantas tambin demuestran que la acumulacin de
sustancias de reservas se debi ms a movilizaciones desde el medio de cultivo que a partir de los propios fotosintatos. La
recuperacin parece iniciarse luego de dos semanas en las casas de cultivo, con ligera tasa de incremento superior para las
plantas provenientes de mayores intensidades lumnicas, tal vez mejores adaptadas para el cultivo fotoautotrfico. Sin
embargo una semana despus de nuevo la Fn se redujo en ambos grupos, presumiblemente por los insuficientes estmulos
ambientales, entre ellos la luz que nunca rebas 150 mol m-2s-1.
Yanes et al. (2001) describieron las exigencias de luz para la aclimatizacin y dinmico crecimiento de las plntulas de pia
propagadas en BIT, las que son muy superiores a las logradas en las casas de cultivo que se emplearon en este experimento,
que pudieron limitar las posibilidades de las plantas objeto de estudio. Ellas debieron estar en este caso mejor preparadas
para el cambio, en correspondencia con las conclusiones de Kadlecek et al. (2001) sobre la eficiencia de pretratamientos in
vitro para la supervivencia y crecimiento de las plantas durante la aclimatizacin ex vitro.
Bibliografa:

Botella, J. L., Fairbairn. D. J. 2002. Present and future potential of pineapple biotechnology. Fourth Int. Pinapple Symp.
Biotech. 2.0
Daquinta, M., Benegas, R. 1997. Brief Review Of Tissue Culture Of Pineapple. Pineapple News. 3: 7-9.
Escalona, M., Lorenzo, J. C., Gonzalez, B., Daquinta, M., Gonzalez, J., Borroto, C., Desjardins, Y. 1999. Pineapple
(Ananas Comosus L. Merr) Plant Propagation In Temporary Immersion System. Plant Cell Report 18(9): 743-748.
Firoozabady, E., Nicholas J., Gutterson, N. 1997. In Vitro Plant Regeneration And Advanced Propagation Methods For
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Kadlecek, P., Ticha, I., Haisel, D., Capkova, V., Schaffer, Ch. 2001. Importance Of In Vitro Pretreatment For Ex Vitro
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Gonzlez-Olmedo, J. L., Escalona, M., Abdulnour, J., Desjardins, Y. 2001. Cultivo fotomixotrfico de la pia (Ananas
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Hayashi, M., Kozai, T., Tateno, M., Fujiwara, K., Kitaya, Y. 1993. Effects of the lighting cycle on the growth and
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Hdider, C., Desjardins, Y. 1995. Reduction Of Ribulose 1-5 Bisphosphate Carboxilase/Oxigenase Efficiency By The
Presence Of Sucrose During The Tissue Culture Of Strawberry Plantlets . In Vitro Cell. Dev. Biol-Plant 31: 165-170.
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Kozai, T., Sekimoto, K., 1988. Effects of number of air exchange per hour of the closed vessel and photosynthetic
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Winter, K. 1985. Crassulacean Acid Metabolism. In: Baker, J., Baker, N.R. (Ed) Photosynthetic Mechanisms And The
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(Ananas Comosus (L.) Merr.) Cv. Cayena Lisa 'Serrana' Vitroplants. No. 7 Newsletter Of The Pineapple Working
Group, International Society For Horticultural Science.
 5000
mol m s
-2 -1

CO2 (mol mol-1) 4000 80

275 mol m-2s-1
3000
2000
1000
0
10 21 32 4 5 6 7
0 81 92 horas
Oscuridad Luz

Figura1. Diferencias en la evolucin del CO2 durante el segundo ciclo de inmersiones en el cultivo de pia en
BIT bajo dos intensidades de luz.

Tabla 1. Efectos de la intensidad de la luz sobre la cantidad y calidad de los brotes de pia propagados en BIT
enriquecidos con CO2.

Tratamiento FFF mol m-2s-1 Masa fresca (g) Nmero de brotes

80 15,2 21,5
275 23,1 16,5
ES x 0,38 4,24
Significacin * ns
ANOVA, test de rangos mltiples de Duncan para p 0,05%, n= 15 y 3 para mf y nmero de brotes
respectivamente.

2
80 mol m-
1,5
Fn (mol CO2 10

2 -1
275 s
1 mol m-
2 -1
s
0,5
cm-2s-1

0
0 7 14 21 Das

Figura 2. Comportamiento de la Fn en los primeros 21 das de la aclimatizacin de las plntulas de pia propagadas
en BIT bajo dos FFF.