TCNICAS DE SEPARACIN

Y CUANTIFICACIN DE
PROTENAS

Laura Rincn de Pablo

F.E.A de Anlisis Clnicos
Hospital General de Ciudad Real
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PROTENICAS
o Electroforesis: Cuando una mezcla de molculas ionizadas son
colocadas en un campo elctrico, estas experimentan una fuerza de
atraccin hacia el polo que posee carga opuesta, as, las molculas
cargadas positivamente se desplazaran hacia el ctodo (el polo
negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el
nodo (el polo positivo).
o Fue empleado por primera vez por A.Tiselius en 1937.
o El movimiento de las molculas esta gobernado tambin por dos
fuerzas adicionales: la friccin con el solvente dificultar este
movimiento originando una fuerza que se opone y por otro lado las
molculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento
browniano debido a que poseen energa cintica propia denominado
difusin.
o La energa cintica de las molculas aumenta con la temperatura, por
ello a mayor temperatura mayor difusin.
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La suma de todas estas fuerzas provoca que
las molculas no migren de una manera
homognea, sino que comenzaran a moverse
formando un frente cuya anchura aumentara
con el tiempo.

Para reducir la anchura de este frente

podemos reducir el movimiento de las
molculas. Una forma comn de hacer esto es
formar un gel.

El gel consiste de un polmero soluble de

muy alto peso molecular que atrapa molculas
de agua y forma un tamiz que dificulta el
movimiento de los solutos,
consecuentemente, la migracin de las
molculas ser mas lenta, pero el
ensanchamiento del frente se vera reducido.
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o Esta separacin se basa en la diferente velocidad de
migracin de partculas con carga diferente dentro de un
campo elctrico.

V= .E
o La movilidad electrofortica de una partcula depender de
su carga, de su masa, del medio en el que tiene lugar la
separacin y del campo elctrico.

Q
=
6r
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Parmetros que afectan a la : Q

1. Externos : =
6r
o Campo E
o Temperatura : -Aumento de la T descenso aumento
1. Solvente :
o Constante dielctrica (): Aumento aumento
o Viscosidad (): Descenso aumento (por disminuir la resistencia por
friccin).
o Fuerza inica (FI): Aumento FI descenso (intensidad de carga
alrededor del ion central).
o pH: Da el grado de ionizacin de la partcula.
1. Sustancia problema :
o Carga de la partcula: Influenciado por el solvente (por el pH).
o Forma y tamao: aumento de tamao, disminucin de movilidad.
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o En el laboratorio clnico, la aplicacin mas importante de la
electroforesis consiste en separar las protenas presentes en el suero,
orina y otros fluidos biolgicos (LCR, lquido sinovial..).
o La carga de las protenas, por su naturaleza anfoltica, depende del pH
del medio:
o Cuando en un campo elctrico el pH del medio es igual al punto isoelctrico (PI)
de la protena, no hay migracin.
o Para valores de pH por debajo del PI, predominan las cargas positivas y las
protenas migran hacia el ctodo (-).
o Para valores de pH superiores al PI, las protenas estn cargadas negativamente
y migra hacia el nodo (+).
La mayora de las
protenas intracelulares
tienen carga negativa,
ya que su pH
isoelctrico es menor
que el pH fisiolgico
(prox 7)
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o TIPOS DE ELECTROFORESIS:

1. Electroforesis de frente mvil o libre

2. Electroforesis de zona: (convencional)

o En papel
o En acetato de celulosa
o En gel (agarosa, poliacrilamida y almidn)

1. Electroforesis capilar
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1. Electroforesis de frente mvil o libre :

El campo elctrico se aplica a disoluciones o suspensiones.

Histricamente, es el origen de la electroforesis tal y como hoy la
conocemos. Actualmente est en desuso, ya que al ser un fluido el medio
en el que se desarrolla.
Las diferentes protenas se
desplazan a velocidades diferentes
segn sus cargas y coeficientes de
friccin respectivos, formndose
nubes que se van desplazando en la
disolucin tampn y que puede
seguirse con diversos sistemas
pticos, ponindose de manifiesto las
sustancias que se van separando tiene
poco poder de resolucin.
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2. Electroforesis de zona:

La muestra se desplaza sobre un soporte slido.

Fuente de alimentacin: Proporciona el

campo elctrico mediante los dos electrodos,
estableciendo una diferencia de potencial.
Cubeta: Recipiente en cuyos extremos se
sitan los electrodos.
Soporte electrofortico: Es el elemento
fundamental. Debe ser inerte. La pequea
cantidad necesaria de muestra permite que las
molculas migren en discretas zonas o bandas.
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Electroforesis de zona:

Muestra

Equipamiento electrofortico

Separacin

Deteccin y cuantificacin
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Deteccin y cuantificacin de las fracciones separadas :

o Para revelar las protenas separadas por electroforesis, el soporte se

trata con colorantes.
o Las bandas de protenas adsorben el colorante mas intensamente que el
soporte, de forma que se puede eluir el exceso de colorante del soporte
mientras que las protenas quedan teidas con el colorante.
o Se mide densitomtricamente, integrando las reas correspondientes a
cada fraccin proteca y calculando el porcentaje de cada fraccin sobre
el total de protenas.
La sensibilidad analtica alcanzada
vara en funcin del colorante
empleado. De mayor a menor
sensibilidad: violeta cido > azul
comassie > negro amido.
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TIPOS DE SOPORTES:
a. Papel : En desuso
b. Acetato de celulosa: Ventajas: presenta poca adsorcin, necesita
cantidades pequeas de muestra, porosidad uniforme, transparente, sin
contaminantes y resultados precisos. Inconvenientes: dbil resolucin y
electroosmosis. Se ha quedado obsoleta.
c. Gel de agarosa: Es un polisacarido, cuyas disoluciones poseen la
propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 C y formar un gel,
semislido al enfriarse. Este gel est constituido por una matriz o trama
tridimensional de fibras polimricas embebida en gran cantidad de
medio lquido. El tamao de poro no opone impedimento al paso de las
molculas (soporte no restrictivo tipo I). Se usa usualmente para
separar molculas grandes. Ventajas: No presenta fenmenos de
adsorcin, pequea cantidad de muestra, mejor visualizacin y
resolucin. Inconvenientes: electroosmosis.
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d. Gel de poliacrilamida (PAGE):
a. Es un soporte empleado frecuentemente en electroforesis, ya que es con
el que mejor se logra separaciones electroforticas.
o Es qumicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser
preparado de forma rpida y reproducible.
o Forma geles transparentes con estabilidad mecnica, insolubles en agua,
relativamente no inicos y que permite buena visualizacin de las bandas
durante tiempo prolongado.
o Tiene la ventaja que variando la concentracin de polmeros, se puede
modificar de manera controlada el tamao del poro.
o El tamao de poro opone resistencia al paso de las molculas ( soportes
restrictivos tipo II), ya que el tamao del poro es similar al de las
protenas, de tal modo que existe un efecto de tamizado molecular y la
separacin electrofortica depende de la densidad de carga de las
molculas y de su tamao.
o Inconvenientes: Neurotoxicidad
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e. SDS-PAGE:
o Se fundamenta en eliminar las cargas de las protenas por
tratamiento con SDS (sodiododecilsulfato) que las desnaturaliza y se
fijan a el, tomando carga neta negativa.
o La migracin de los derivados protena-SDS hacia el nodo es
inversamente proporcional al logaritmo de su PM. La relacin
carga/masa es aproximadamente igual para todas las protenas de la
muestra, por lo que el tamao de esta es un factor determinante de
la separacin.
o La electroforesis con SDS es un excelente mtodo para identificar y
monitorizar las protenas durante un proceso de purificacin y para
la determinacin del PM de las diferentes subunidades protecas.

La electroforesis convencional ha sido y continua siendo de gran utilidad; sin

embargo este tipo de separacin electrofortica es lenta, laboriosa , poca
reproducibilidad, difcil de automatizar, y adems no proporciona resultados
cuantitativos precisos.
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3. Electroforesis capilar:
Constituye una alternativa electrofortica de creciente implantacin
en los laboratorios clnicos.
Ventajas:
Tcnica automatizada, ofreciendo resultados reproducibles y
precisos.
Separa cualquier tipo de tamao: molculas de alto y bajo PM (al
contrario que la convencional, que solo separa molculas grandes).
Utiliza volmenes muy pequeos de muestra (0.1-10 nL), mientras
que la convencional, utiliza del orden de L.
No requiere el uso de colorantes, ya que las protenas se detectan
directamente por espectrofotometra.
Resolucin muy elevada
La velocidad de separacin es mucho mayor que en la convencional.
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Teora de la electroforesis capilar (EC):
Dos son los factores que causan la movilidad de los solutos:
1. Movilidad electrofortica:
Especfica para cada analito
Dependiente de la relacin carga/tamao
Los cationes migran hacia el ctodo, los aniones al nodo y los compuestos
neutros no se ven afectados por el campo elctrico.
2. Flujo electroendosmtico (FEO):
Mueve el disolvente desde el polo positivo al negativo actuando como una
bomba.
Su causa es la doble capa elctrica que se produce en el interfaz entre slice
y disolucin.
El capilar esta cargado negativamente en su superficie, atrayendo a los
iones positivos del disolvente.
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La EC se realiza en capilares hechos
de slice fundido.

Los grupos silanol (SiO-) cargados

negativamente presentes en este material
dan origen a una carga negativa en la
superficie del capilar y es responsable del
FEO.

Esta carga negativa atrae las especies

catinicas del tampn y la capa inica que
se va formando tiene una densidad de carga
positiva que va decreciendo al aumentar la
distancia a la pared del capilar.

La aplicacin de un campo elctrico produce

un potencial zeta que tiene como resultado
el movimiento de estos cationes unidos mas
debilmente hacia el ctodo, y como estn
hidratados se llevan el agua tras de s.
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o La existencia de este flujo electroendosmtico acta como un
mecanismo bomba que impulsa todas las molculas (catinicas,
neutras y aninicas) hacia el detector con una separacin que
depende finalmente de las diferencias de migracin electrofortica
de los analitos.
o Suponiendo que el FEO sea adecuado y no excesivo, las respectivas
movilidades electroforticas de los analitos llevan a la formcin de
zonas discretas en el momento que pasan por delante del detector.
o Si el FEO es demasiado lento, el fenmeno de difusin se encarga de
que las zonas de los analitos se ensanchen y de que algunos analitos
no alcancen el detector en un intervalo de tiempo razonable (pH
bajos).
o Si el FEO es muy rpido, la separacin sera inadecuada (pH altos)
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Modalidades de EC :
1. Electroforesis capilar de zona (CZE)

2. Cromatografa capilar micelar electrocintica (MEKC)

3. Isoelectroenfoque capilar

4. Electroforesis capilar en gel (CGE)

5. Isotacoforesis capilar (CITP)

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o Electroforesis capilar de zona (CZE)
Es una de las tcnicas mas importantes y mas
utilizada debido probablemente a su
simplicidad y elevado poder de separacin.

Esta basada en la separacin de los analitos

segn su relacin carga/tamao.

Los componentes bsicos incluyen:

Fuente de alimentacin (alto voltaje)

Capilar recubierto de poliimida
(10-50 cm)
2 recipientes para el tampon donde se
acopla el capilar
Los dos electrodos conectados a la
fuente
Detector (espectrofotmetro)
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Parmetros de la separacin en ECZ :
1. Polaridad de los electrodos: La polaridad normal de la EC es del
nodo al ctodo, de esta manera el FEO va hacia el ctodo.
2. Voltaje aplicado: Un incremento en el voltaje provoca varios
efectos: aumenta la migracin de la muestra, el FEO, acorta el
tiempo de anlisis, produce picos mas agudos y mejora la resolucin.
3. Temperatura del capilar: Cuando se aumenta la temperatura
usando el mismo voltaje, la del tampn disminuye y esto lleva a un
aumento de la y a tiempos de separacin mas cortos.
4. Longitud del capilar: Interesa que sean cortos (10-50 cm) para
obtener tiempos breves de anlisis, pero la longitud se puede
aumentar para mejorar la resolucin.
5. Soluciones Tampn: La eleccin del tampn es de gran importancia
para obtener xito en la separacin de los analitos.
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Cuando la luz atraviesa un medio transparente en el que existe
una suspensin de partculas slidas, se dispersa en todas
direcciones y como consecuencia se observa turbia.

La turbidez es la propiedad ptica de una muestra que hace que

la radiacin sea dispersada y absorbida mas que transmitida en
lnea recta a travs de la muestra.

Hay dos mtodos para medir la turbidez de una muestra, la

turbidimetra y la nefelometra. Son dos tcnicas
complementarias que se utilizan para el anlisis cuantitativo de
disoluciones coloidales, emulsiones..
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Turbidimetra:
Se compara la intensidad del rayo de luz que emerge con la del
que llega a la disolucin.
Para determinar la concentracin del analito mediante este
mtodo aplicamos:
T=Transmitancia medida
It= la intensidad de la fuente de radiacin transmitida
Io=Io es la intensidad de la radiacin de la fuente transmitida
T= It/Io por un blanco
La relacin entre T y la concentracin de las partculas
dispersas es similar a la proporcionada por la ley de Beer:
- logT = kbC
Se suele utilizar para soluciones concentradas.
La instrumentacin es un espectrofotmetro UV/Vis.
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Nefelometra :
Es un mtodo para medir la intensidad de una radiacin dispersa en
un ngulo de 90 C con respecto a la fuente.
Se mide en un espectrofluormetro.
KS es una constante emprica del sistema
IS = KSIOCIO es la intensidad de la fuente de radiacin
incidente.
Tipos de Nefelometra:
1. Punto final: Se utiliza un exceso de Ac como reactivo y se aade la
muestra, formndose Ac-Ag hasta llegar al equilibrio, donde se
realiza la medida de la luz dispersada.
2. RATE cintica: Determina la velocidad de formacin de los
complejos, por lo tanto el cambio de velocidad de emisin de la luz
dispersada. Mas sensible
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La eleccin entre turbidimetra y nefelometra viene dada por
dos factores:
1. Cuando la concentracin de partculas dispersantes en la
disolucin es pequea, IT ser muy similar a IO. Por lo que la
mejor eleccin cuando la muestra contiene pocas partculas
dispersantes es la nefelometra. La turbidimetra es una buena
tcnica para cuando las muestras contienen grandes
concentraciones de partculas dispersantes.
2. Tamao de las partculas dispersantes. En la nefelometra la
intensidad de la radiacin dispersada a 90C es mayor si las
partculas son bastante pequeas para que se produzca una
dispersin Rayleigh. Si las partculas son mayores la intensidad
de la dispersin disminuir a 90C.
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BIBLIOGRAFA :
Aplicaciones de la electroforesis capilar en el
diagnstico clnico. Sebia Hispnica
Recomendaciones para el estudio de las gammapatas
monoclonales. Documentos de la SEQC 2009
L. Hernndez, C. Gonzlez, Introduccin al Anlisis
Instrumental. Editorial:Ariel Ciencia (2002)
Tesis doctoral de Silvia MAlbillos Garca Aplicacin
de la electroforesis capilar para el anlisis y
seguimiento del grado de maduracin de quesos de
oveja y mezcla de la provincia de Burgos (2003)
D.A. Skoog, F.J. Holler, T.A. Nieman, Principios de
Anlisis Instrumental 5 edicin. Editorial: Mc Graw
Hill (2000)
MUCHAS GRACIAS