72 Bloquimica préctica Método : Q Preparacién de la columina. Agite suavemente la resina en HCI 4 mol/I hasta que se hidrate completamente (15—30 ml/g de resina seca). Deje sedimentar laresina y decante el Acido. Repita el lavado con HC10.1 mol/l, resuspendaen esta solucién y prepare la columna como se describié anteriormente. Elucién de aminodcidos. Aplique cuidadosamente 0.2 ml de la mezcla de los aminodcidos en la cima de la columna. Abra el extremo inferior de la colum- na y permita que la mezcla penetre en la resina. Agregue 0.2 ml de HCI 0.1 mol/l, deje que penetre en la resina'y repita el proceso dos veces. Finalmente, aplique 2 ml de HCI 0.1 mol/l encima de la resina y conecte la columna a un recipiente que contenga 500 ml de HCI 0.1 mol/l. Ajuste la altura del recipiente hasta obtener un flujo de aproximadamente 1 ml/min y recoja un total de 40 fracciones de 2 ml. Determine si hay aminodcidos presentes ensayando grupos de cinco tubos por vez, poniendo una muestra pequefia de cada tubo sobre un papel de filtro, sumérjalo en la solucién de ninhidrina en acetona y caliente en un horno a 105°C. La presencia de aminodcidos se mani- fiesta en forma de manchas azulosas sobre el papel de filtro. Cuando haya eluido el primer aminoacido, remueva el recipiente de HCI 0.1 mol/l y-deje que el nivel del dcido baje justamente hasta la superficie de la resina. Pase 2 ml de amortiguador tris-HC1 0.2 mol/I (pH 8.5), luego conecte la columnaa un ‘recipiente que contenga este amortiguador y continwe la eluci6n hasta que el tercer aminoacido salga de la columna. Deteccién de aminodcidos. Ajuste el pH de cada tubo a 5, afiadiendo unas pocas gotas de Acido o Alcali. Agregue 2 ml del reactivo de ninhidrina en amortiguador y caliente durante 15 min en un bafiode agua hirviendo. Enfrie los tubos a temperatura ambiente, agregue 3 ml de 50% v/v de etanol y leala extincién a 570 nm después de dejar reposar los tubos por 10 minutos a temperatura ambiente. Incluya los blancos y patrones apropiados y haga un grafico de la cantidad de aminodcidos en cada fraccién en funcién del volumen de elucién. iEn qué orden se eluyen los aminodcidos y por qué? (tabla 3.5). Cromatografia de particién La separacién de compuestos que son facilmente solubles en liquidos organicos y solo ligeramente solubles en agua se efectita por cromatografia de Tabla3.5 Valores de pK y pH a los que st encuentra carga cero para tres aminodcidos Aminofcido pK, pK, pK, Punto isoinico dcido aspartico 20 39 10.0 29 histidina 18 6.0 92 16 lisina 22 92° 05 100Métodos de sepersclén = 73 adsorcién, mientras que los compuestos ionizables hidrosolubles se separan mejor por cromatografia de intercambio iénico. La cromatografia de particién es intermedia entre cromatografia de adsorcién y de intercambio iénico y los compuestos que sori a la vez hidrosolubles y solubles en solventes organicos, sé separan facilmente por métodos de particién. ‘Cuando se agita un compuesto con dos solventes que nose mezclan, éste se distribuye en las dos fases; y, en equilibrio, la razén de la concentracién del compuesto en los dos solventes es constante y se conoce como el coeficiente de particién (a). _ Concentracién de x en el solvente 1 Concentracién de x en el solvente 2 En la cromatografia de particién uno de los solventes, usualmente el agua, permanece en la fase estacionaria que consiste en una columna o pelicula de material inerte. La otra fase consiste en un liquido orgdnico mévil, saturado con agua, que fluye ert relacién con la fase estacionaria. Los componentes de una mezcla se separan si los coeficientes de particién entre los solventes son suficientemente diferentes (figura 3.16). Teoria de la cromatografia en papel. La celulosa en forma de hojas de papel constituye un medio de soporte muy util, donde el agua es adsorbida entre las fibras de celulosa y forma la fase hidrofilica estacionaria.’E] uso de papel de filtro como base de soporte fue demostrado por Consden, Gordon y Martinen 1941 y desde entonces han aparecido numerosos articulos y libros acerca dela técnica de la cromatografia en papel. Fase sdlida {soporte inerte) Fase liquide mévit (solvente hidrofébico) Soluto (moléculas distribuidas entre las dos fases, qui Fase estacionaria Mquide {capa adsorbida de solvente hidrotlico) Figura 3.16 Fundamento de la cromatografia de particién liquido-liquido74 — Bloquimica practica La mezcla se aplica sobre el papel, se seca y luego se desarrolla el cromatograma dejando que el solvente fluya a lo largo de la hoja. Se marcael frente del solvente y después de secar el papel se visualiza la posicién de los compuestos presentes en la mezcla mediante una reaccién coloreada. La raz6n entre la distancia que ha migrado un compuesto y la distancia recorrida por el solvente, se conoce como el valor Ry y es mas 0 menos constante para un compuesto, sistema de solventes y clase de papel determinados bajo condiciones cuidadosamente controladas de concentracién de soluto, tempe- ratura y pH (figura 3.17). El R; est4 relacionado con el coeficiente de particién a , asi: a-4i(4-1) Ag \Rr : A, es el drea de la seccién transversal de la fase liquida y A,es igual al areade la seccién tranversal de la fase estacionaria. Para una serie homéloga, un grafico de Rj» en funcién del nimero homélogo da una linea recta. Ry =I (= 1) m =tog(>—1). eR, Se presentan excepciones a estas ecuaciones cuando la fase estacionaria no es completamente inerte, pues es posible que junto con la particién ocurra adsorcién y probablemente intercambio iénico. Preparacién de la muestra. Cuando se estén investigando materiales biolégicos es convertiente desalinizar la muestra antes de la cromatografia y esto puede hacerse eficientemente por electrélisis 0 electrodidlisis. El exceso Frente del solvente Origen Figura 3.17 Significado del valor R, de la cromatografia en papelMétodos de sepsracton 75 de sal origina cromatogramas cori manchas de bordes difusos y cambios en los valores de Ry. Puede también afectar la reaccion quimica que se emplea para detectar los compuestos en la mezcla. Las proteinas deben ser removidas antes de la cromatografia por ultrafiltracién o con Sephadex. Se aplica luego la muestra (10-20 #1) al papel usando una micropipeta. Seleccién del papel. El papel més frecuentemente usado para efectos analiticos es el Whatman No. 1. El Whatman 3 MM es un papel grueso y se emplea preferencialmente para separar grandes cantidades de material; sin embargo, la resolucion es inferior a la obtenida con Whatman No. 1. Para una separacién répida, se recomiendan los papeles Whatman Nos. 4y 5, aunqueen este caso las manchas no son tan definidas. En cualquiera de los casos, el flujo es mas rapido en la ‘direccién dela maquina’, la cual se anota normalmenteen la caja que contiene el papel. El papel puede impregnarse con una solucién amortiguadora antes de usarse 0 puede ser modificado quimicamente por acetilacién. También se encuentran en el comercio papeles de intercambio iénico. Para la separacién de Iipidos y otras moléculas hidrofébicas, se venden papeles impregnados en silica. Seleccién del solvente. La seleccién del solvente, como sucede con la seleccién del papel, es bastante empirica y depende de la mezcla que se quiere investigar. Si los compuestos migran hasta muy cerca al frente del solvente A, es porque son muy solubles, mientras que si se agrupan alrededor del origen en el solvente B, entonces noson suficientemente solubles. Se requiere, por lo tanto, buscar las proporciones adecuadas de A y B para que los Ry de los componentes de la mezclase distribuyan a todo lo largo del papel. El pH puede ser también importante en una separacién dada, y muchos solventes contienen acido acético o amoniaco para producir un medio fuertemente Acido o basico. Revelado. Esencialmente, el aparato consiste en una hoja de papel sostenida en un marco de tal manera que uno de los extremos esté en contacto con un recipiente que contiene el solvente. Para cromatografia ascendente, el papel se enrolla en forma de cilindro sostenido con un gancho de oficina (clip) y luego se introduce verticalmente en el solvente. El conjunto se mete a un tanque herméticamente cerrado en el cual se ha colocado papel saturado con el solvente para producir una atmésfera constante, y el proceso se lleva a cabo en un cuarto de temperatura constante. Las variaciones en la temperatura producen migracién dispareja del solvente y pueden alterar los valores Rr (figura 3.18). La cromatografia descendente. Es conveniente para aquellos compuestos que tienen: un valor de Ry semejante, pues el solvente escurre en la parte inferior del papel produciendo as{ una mejor separacién. Es obvio que en este caso no se pueden medir los valores de R, y las sustancias tienen queAscendente Descendente Figura 3.18 Papel de cromatografia ascendente y descendente compararse con la migracién de un compuesto patrén tal como glucosa, por ejemplo, en el caso de los azt¢ares: Distancia de migracién del compuesto x * Distancia de migracién de la glucosa La cromatografia ascendente. Se usa més frecuentemente y tiene la ven- taja de que la separaci6n puede hacerse en dos dimensiones. La mezcla se separa con el primer solvente, que debe ser volatil, luego se deja secar, se gira el papel 90° y se hace la separaci6n con el segundo solvente. Después de localizar los compuestos se obtiene un mapa y los componentes se identifican comparando su posicién con la de un mapa de compuestos conocidos desarro- lados en las mismas condiciones (figura 3.19). Deteccién de los compuestos. La mayoria de los compuestos son incoloros y s6lo se pueden visualizar mediante la ayuda de reactivos especificos. El réactivo de coloracién se disuelve en un solvente volatil y se aplica rociando el papel o sumergiéndolo répidamente en la solucién. También se usa la luz ultravioleta para visualizar algunos compuestos ya que unos la absorben fuertemente, y por lo tanto aparecen como manchas oscuras, mientras otros muestran una fluorescencia caracteristica bajo su irradiacién. EXPERIMENTO 3.10 Identificacién de azticar en la leche por cromatografia de papel “Fundamento La leche es desproteinizada con dcido tricloroacético, centrifugada y el sobre- nadante se usa para cromatografia. La mezcla anilina-difenilamina usada6 Aplique la muestra Resultado T a | t ' ' ' ' ' ' 1 ' Le sotvene2 | | ' ! ' : (i ' : ' ° S 12 ! Dos \ 2 x Gir 80° Separecén nal Figura 3.19 ' Separacion de una mezcla por cromatografia de papelen dos dimensiones para detectar azitcares, da diversos colores con la mayoria de ellos, lo cual permite su identificacién. Materiales 10 * 1. Equipos para cromatografia descendente. 5 2. Papel de cromatografia Whatman No. 1. 10 hojas - 3. Solvente para cromatografia (isopropanol:agua, 4:1). 31 4. Reactivo, de identificacién anilina-difenilamina. (Prepa- =— rese fresco mezclando 5 voliimenes de anilina 10 g/l y 5 yolumentes de difenilamina 10 g/1 en acetona con un volumen de acido fosférico 85%. ;Cuidado: téxico!). 5. Hornosa 100°C. ca 3 6. Soluciones patrones de aziicares (10 g/l en isopropanol 10 ml 10% v/v). Ramnosa, lactosa, ribosa, 4cido glucurénico, ’ xilosa, glucosamina, fructosa, glucosa. 7. Secadores de pelo o.abanicos industriales. 5 8 Atomizadores. ‘ 3 9. Leche. i 50 ml 10. Acido tricloroacético (100 g/1). 50.ml78 — Bloquimica practica Método Desproteinizacién. Mezcle 2 ml de leche y 3 ml de agua destilada, agite fuertemente, agregue 5 ml de Acido tricloroacético (100 g/l) y mezcle. Deje reposar durante unos pocos minutos, remueva el precipitado por centrifuga- cién y use el sobrenadante para cromatografia. Cromatografia. Tome dos hojas de papel de cromatografia Whatman No. 1y trace una raya de aproximadamente 8 cm del borde del papel..A una de las hojas aplique sobre la linea las siguientes muestras a intervalos de aproxi- madamente 4 cm y déjelas secar bajo una corriente de aire caliente. 1. 5yullactosa. 2. 10 ulde extracto de leche. 3. 10 ullactosa (10 g/1). 4, 10 plde extracto de leche +5 ul de lactosa (10 g/l). 5. 5 ulglucosa (10 g/l). 6. 5ylgalactosa (10 g/1). Aplique soluciones patrones sobre la otra hoja y corte los extremos del papel en forma dentada para facilitar que el solvente escurra de la hoja (figura 3.18). Deje que el solvente fluya de un dia para otro a lo largo del papel y ala mafiana siguiente coléquelo en una cmara extractora de gases, s¢quelo con una corriente de aire frio y visualice las manchas atomizando el papel con una solucién de anilina-difenilamina recientemente preparada. Retirelo de la cémara y caliéntelo brevemente a 100° C. Mida las distancias de migracién de los azticares a partir del origen y determine los valores de Ry. Ademas, se sugiere incluir una mezcla problema de dos o tres aziicares junto con el extracto de leche. EXPERIMENTO 3.11 Separacién de aminodcidos por cromatografia de papelen dos dimensiones Fundamento Para los experimentos siguientes con aminodcidos y proteinas'se prepara un mapa en dos dimensiones de las soluciones patrones de aminodacidos. La ninhidrina reacciona con todos los a-aminodcidos dando un color parpura. Algunos otros compuestos también reaccionan y entre ellos se encuentran las aminas alifaticas primarias y secundarias y algunos compuestos no aromaticos heterociclicos de nitrégeno. Los aminodcidos, prolina e hidroxi- prolina reaccionan dando una coloracién amarilla. Materiales 1. Equipos-para cromatografia en dos dimensiones. 2. Papel de cromatografia Whatman No. 1 (20 cm x 20 cm). 3. Solvente 1. (Butanol:acido acético glacial:agua, 12:3:5). 4. Solvente 2. (Fenol-agua). En un frasco mezcle 500 g de 2500 g EselsMétodos de separaciin 78 fenol con 125 ml de agua, tape y deje reposar de un dia para otro. Precaucién: el fenol produce quemaduras en la piel. Antes de usarse agregue al solvente unas pocas gotas de amoniaco 0.88 y mezcle bien. . Reactivo de ninhidrina (disuelva 0.2 g en 100 ml de - acetona antes de usarse). Hornos a 105°C. Patrones de aminodcidos. Prepare voltimenes pequefios 10 ml de soluciones de 10 g/l en isopropanol 10% v/v. Algunas veces se necesita una gota de dcido o dlcali para disolver el compuesto. Alanina, Acido aspartico, cisteina-HCl, cistina, acido glutdmico, glicina, histidina-HCl, hidroxi- prolina, leucina, isoleucina, lisina-HCl, mettonina, ornitina-HCl, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptéfano, tirosina y valina. Método Examine el mapa de aminodcidos suministrado (figura 3.20), escoja cuatro cuyo valor R, difiera bastante, y en un extremo de la hoja de papel de cromatografia Whatman No. 1 aplique 20 ul de cada uno. Seque las manchas en una corriente de aire y coloque la hoja en el soporte metilico. Repita este 2 ne Butanol/écido acético/egua ——~Fenol/agua/emoniaco Figura 3.20 Separacién en dos dimensiones de una mezcla de aminodcidos usando papel Whatman No. 180° Bloquimica practice procedimiento en hojas diferentes hasta que se hayan aplicado ‘todos los aminodcidos y finalmente aplique una mezcla de todos ellos en otro papél. Cada aminodcido debe incluirse en dos mezclas. diferentes para confirmar su , identidad. Sumerija en el solvente el extremo del papel adyacente a la mancha‘de la mezcla y deje corer la cromatografia durante la mayor parte del dia. Por la’ tarde saque el soporte, coléquelo en el extractor de gases y seque el papel ent una corriente de aire frio. Gire el soporte 90° en forma .tal que el otro borde cercano a la muestra se sumerja en.el segundo solvente-y deje correr el cromatograma de un dia para otro (figura 3.19). Seque los papeles como se indicé y separelos del soporte. Rapidamente sumerja cada papel en reactivo de ninhidrina y cuélguelos en el extractor de gases para dejar evaporar la acetona. Desarrolle los colores calentando a 105° C durante 2-3 minutos. Construya un mapa de aminodcidos y compérelo con el de la figura 3.20. Cromatogratia en capa fina Izmailov y Schraiber describieron en 1938 la separacién de extractos de plantas por cromatografia de capa fina en altimina. Pero solamente 20 afios . después se comenzé a vender el equipo para la preparacién de las placas. La separacién de los compuestos en capa fina es semejante en muchos aspectos a la cromatografia en papel, pero tiene la ventaja adicional que se pueden usar medios diferentes de soporte y atin mezclas de los mismos. Se pueden también incluir reactivos fluorescentes en el medio para ayudar ala identificacién de las manchas. La separacién puede hacerse por adsorcién, intercambio iénico, cromatografia de particién ofiltracién en gel, dependien- do de la naturaleza del medio empleado. El método es rapido y se pueden completar varias separaciones en una hora. Las manchas obtenidas son. muy compactas y es posible por lo tanto detectar compuestos en concentraciones mas bajas que sobre papel. Ademés los compuestos separados por cromato- grafia en capa fina pueden detectarse usando materiales corrosivos y elevadas temperaturas, lo cual no es posible con papel. Preparacién de las léminas de capa fina. Para la mayoria de las separaciones se considera apropiado que la capa tenga un espesor de 250 um. Espesores por debajo de 200 um afectan el valor Ry. En él comercio se encuentran aparatos para preparar las léminas que si se usan cuidadosamente pueden producir capas muy parejas, del espesor deseado. Algunas veces se incluye sulfato de calcio en el adsorbente para fijar la capa a la lmina de vidrio y en este casose aconseja trabajar répidamente una vez que el adsorbente se mezcle con agua. El material de capa fina depende de la mezcla que se-estudie, pero se ha comprobado que el gel de silica es muy util para la separacién de una_.gran cantidad de compuestos. Desarrollo. Es necesario que la atmésfera de la cémara de.separacién esté completamente saturada. De otra forma los valores Rr cambian considera-Métodos de separacion = 81 blemente de un tanque a otro. Esto puede hacerse usando un tanque tan pequefio como sea posible y cubriendo las paredes con papel empapado en el solvente. E] desarrollo de la placa se hace generalmente por la técnica ascen- dente y es muy répido. Localizacién. Los compuestos se localizan tal como en el caso de la cromato- grafia de papel por atomizacién con el reactive apropiado o mediante rastreo (scanning), en el caso de las sustancias radioactivas. EXPERIMENTO 3.12 Identificacién de aziicares en jugos de frutas usando cromatografia de capa fina Materiales 10 1, L&mina de silica gel G para capa fina (prepare una 10 suspensién de silica gel G en acetato de sodio 0.02 mol/I y prepare las laminas de 250 um de espesor. Activelas antes de usarlas calenténdolas a 105° C por 30 min). 2. Camaras de separacién. 5 3. Solvente (acetato de etilo:isopropanol:agua:piridina, 5 veces el 26:14:7:2). volumen del tanque * 4. Jugos de frutas frescas (limén, naranja, toronja, pifia). 5 ml 5. Alcohol absoluto. 100 ml 6. Reactivo de identificacién como en el experimento 3.10. = 7. Hornos a 105°C. 3 "8. Secadores de pelo. 5 9. Atomizadores. 5 10. Soluciones patrones de azticares como en el experi- 2 mento 3.10. Método A 1 ml de jugo de fruta agregue 3 ml de etanol y centrifugue para remover la proteina desnaturalizada. Aplique cuidadosamente alfcuotas muy pequefias del sobrenadante sobre una lamina de cromatografia junto con algunas de las soluciones patrones de azucares. Coloque la lamina en una cémara que contenga solvente en el fondo y que haya sido saturada previamente; desarrolle la lamina hasta cuando el frente del solvente haya migrado casi hasta el extremo. Marque con una linea de lado a lado el frente de migracién del solvente, seque la lamina en una corriente de aire seco y localice los azticares tal como en el experimento 3.10. Observe el color de cada patrén y, selo junto con el valor R, para identificar los aztcares presentes en los jugos de frutas.82 Bloquimica préctica EXPERIMENTO 3.13 Separacién de lipidos por cromatografia en capa fina Fundamento Los lipidos en los materiales biolégicos se hallan formando una mezcla compleja y deben primero fraccionarse mediante extracciones con solventes. La separacion de los compuestos presentes en cada grupo puede hacerse por | eromatografia en capa fina. El solvente se selecciona de acuerdo a los lipidos que se investigan, pero, generalmente, los lipides neutros se separan con * solventes no polares y los lfpidos cargados con solventes-polares. Existen varios medios de soporte para el fraccionamiento de los Ifpidos y la escogencia del adsorbente depende del grupo de lipido y del solvente que se emplee. El gel de sflica se ha usado extensamente y la separacién en este, material se efectiia no solo por adsorcién sino por particién. En los experimentos siguientes se separan los lipidos en varios grupos de acuerdo a su polaridad y de cada grupo se incluyen ejemplos como patrones representativos. Algunos aceites y grasas de comin ocurrencia en la natura- leza son estudiados para examinar si contienen las clases de lipidos considera- dos. Materiales ' “10 1, Laminas de sflica gel G para capa fina. 10 2. Camaras de separacién. 5 3. Solvente (éter de petréleo, p.e. 60-70° C:dietiléter: 5 veces la 4cido acético glacial, 80:20:1). capacidad del tanque 4, Hidrocarburos (n-hexadecano y n-octadecano). 5 ml 5. Esteres de colesterol (acetato de colesterol, oleato de 5 ml colesterol y estearato de colesterol). 6. Esteres de vitamina A (palmitato de vitamina A) 5 ml 7. Triacilgliceroles (trioleato de glicerol, triestearato de . 5ml glicerol y tripalmitato de glicerol). 8. Acidos grasos libres (4cido oleico, écido palmitico y 5 ml Acido estedrico). 9, Esteroles (colesterol). 5 ml 10, Aceites naturales (aceite de oliva y aceite de higado 5 ml de bacalao.) 11, 2’, 7-Diclorofluoresceina (2 g/l en 95% etanol v/v). 200 ml ‘42. Acido sulfirico (50% v/v). 200 ml 13. Hornos a 110° C. 3 14. Lamparas ultravioletas. 3 étodo | Limpie las laminas de vidrio con etanol, luego extienda el gel hasta obtener una superficie de 2504 m de espesor. Active las laminas calentando a 110°C por 1h y deje enfriar. Teniendo cuidado que las manchas no se extiendanMétodos de separacion mucho, coloque 20-50 yl de una solucién de cada lipido aproximadamente 1%: p/v, y deje que el solvente corra a lo largo de la placa comose indicé anterior- mente. Deje secar, localice los lipidos por atomizacion con la solucién de diclorofluoresceina y examine las placas bajo la lampara de luz ultravioleta (270 nm). Los lipidos aparecen como manchas verdes fluorescentes mientras que el resto de la placa permanece oscura. Las manchas pueden también visualizarse rociando las placas con Acido sulfdrico 50% v/v y calentando el horno a 110° C durante 10 min. Debe tenerse mucho cuidado con el acido sulfurico. «En qué orden se separan los lipidos y por qué? \ ELECTROFORESIS Teoria Muchas moléculas biolégicas poseen carga eléctrica, la magnitud de la cual depende de la molécula, del pH y de la composicién del medio en quese halle. Si a una solucién de moléculas cargadas se le aplica un campo eléctrico, las moléculas migran a los electrodos de polaridad opuesta. Este principio se usa en electroforesis para separar moléculas que poseen cargas diferentes. Si una molécula de carga q se encuentra en un campo eléctrico de fuerza z, entonces la fuerza que causa la aceleracién de la particula es gx. Esta fuerza es contrarrestada por la resistencia friccional f dando una velocidad total v: Qr= fu. Aplicando las leyes de Stokes para una molécula esférica de radio r que se mueve a través de un medio de viscosidad 7, tenemos, f= 6nnr. A partir de estas ecuaciones se obtiene: Qz = 6rnrv. La movilidad electroforética v de una molécula se define como la migra-- cién por unidad de campo de fuerza, asi que, D= v/x = 4/6rnr. Por consiguiente, la movilidad de las moléculas depende de la viscosidad del medio (7), del tamafio, de la forma (r) y de la carga de la molécula(q). La movilidad electroforética depende principalmente de los grupos ionizables presentes en la superficie de la particula, y el signoy lamagnitud de84 —_Bloquimica préctica la carga que poseen los grupos ionizables dependen de la fuerza idnica y del pH del medio. Por lo tanto la separacién éptima de las moléculas se puede efectuar seleccionando condiciones apropiadas: Practica Electroforesis de frente mévil. Esta técnica fue usada por primera vez hace aproximadamente 40 afios por el bioquimico sueco Tiselius. La solucién de proteina es dializada primero en contra de una solucién amortiguadora y luego se coloca en un tubo en U cubriendo cuidadosamente ambas ramas con amortiguador en forma tal que la interfase entre el amortiguador y la solucién de proteina quede perfectamente definida. Se lleva a cabo la électroforesis y se sigue el movimiento de las proteinas hacia las dos interfases examinando el indice de refraccién de la solucién. El método de Tiselius es especialmente valioso cuando se trata de examinar las diferencias en movilidad de las proteinas, producidas por cambios en las propiedades fisicas del medio, pero no se puede obtener separacién completa de las proteinas puesto que la migracién de las bandas se ve afectada por la conveccién y por la gravedad. Electroforesis de zona. El efecto de conveccién puede reducirse a un minimo si la electroforesis se efecttia usando un medio de soporte impregnado con solucién amortiguadora. Con este método se puede obtener separacién completa de una mezcla en zonas bien definidas y por lo tanto esta técnica ha reemplazado al método clasico de electroforesis libre. Algunos de los medios de soporte mas usados se consideran a continuacién. Papel. El papel de filtro es barato y facil de usar y constituye un medio aceptable para esta clase de experimentos. Fue el primer material usado, pero ha sido ampliamente reemplazado por otros métodos de soporte. La principal desventaja del papel es que la celulosa puede adsorber las moléculas produ- ciendo bandas no definidas. : ‘Acetato de celulosa. Este material presenta adsorcién minima y permite una clara separacién de las bandas; por lo tanto, los compuestos pueden eluirse de las tiras con una recuperacién bastante alta. Se necesitan muy pocas cantidades de material para la separacién y esta puede hacerse en solo una hora comparada con més de doce horas necesarias para electroferesis de papel. El acetato de celulosa es, sin embargo, un poco més caro que el papel. Gel de Agar. Este medio es transparente, por lo cual puede usarse cuando se requieren determinaciones fotométricas. El agar es el material preferido para inmunoelectroforesis, y en este caso se prepara en laminas de microsco- pio. el agar es barato y facil de conseguir. Gel de almidén. Los granos de almidén se hinchan en agua al calentarlosy se hidrolizan parcialmente formando un gel. El tamafio del gel depende de laMétodos de separacion 85 forma de preparacién, del almidén, del pH y de la clase de solucién amortiguadora. El didmetro de los poros del gel de almidén es tal que las moléculas se separan no sélo en base a su carga, sino a su tamafio. Este efecto de ultrafiltracién permite una mejor separacién de mezclas complejas hasta el punto tal, que las proteinas del plasma pueden separarse en gran numero de bandas, Sin embargo, se usan cantidades més grandes de gel que enel caso del agar y la preparacién de un buen gel requiere cierta practica. Para obtener resultados reproducibles, es conveniente preparar el gel a partir de almidén parcialmente hidrolizado el cual puede obtenerse comercialmente. (Starch- hydrolized, Connaught Laboratories, Toronto.) Sin embargo, si se usa este material es muy dificil eluir los compuestos y las bandas deben localizarse tifiendo cortes del gel. Granos de almidén. Este medio se prepara usando un molde en el cual se comprimen granos completos de almidén en solucién amortiguadora. Por este medio pueden ser separadas moléculas grandes que no migran en el gel de almidén. Este método de electroforesis es ideal para trabajos en que la muestra es muy grande como en la separacién y purificacién de isoenzimas. Gel de poliacrilamida. Recientemente se ha popularizado el uso de este material para electroforesis. Tiene la ventaja sobre el gel de almidén de ser transparente y por lo tanto puede examinarse por medio de luz visible o ultra- violeta. Ademés, dado que es posible controlar el tamafio de los poros, la separacién se hace en base no solo a la carga sino al tamafio y la forma de las moléculas y asi se puede-obtener una mejor resolucién. Solucién amortiguadora. El medio de suspensién debe seleccionarse cuida- dosamente pues algunos iones de la solucién amortiguadora reaccionan con los compuestos que se estudian; por ejemplo el borato forma complejos con los azucares. La seleccién del pH depende de la sustancia a investigarse, pero usual- mente se obtiene maxima separaci6n en el punto isoeléctrico de uno de los compuestos. E] pH escogido no debe ocasionar cambios quimicos o desnatu- ralizacién de las moléculas que se estudian. La fuerza idnica del amortiguador debe estar en el intervalo de 0.05-0.15y es una transaccién entre dos extremos. A fuerzas iénicas bajas hay migracion rapida y poca produccién de calor pero ocurre marcada difusién. Por otra parte, a fuerzas iénicas altas se obtienen bandas bien definidas, pero hay una mayor produccién de calor y la migracién es menor. Campo eléctrico. Se necesita una fuente de poder que origine un voltaje 0 corriente constante. Un campo eléctrico de 2.8 V/cm de longitud se considera adecuado para la mayoria de las separaciones a temperatura ambiente. Sila fuerza del campo es mayor de 10 V/cm, el efecto del calor estal, que se produ- ce una evaporacién excesiva de agua. Por consiguiente, habré un flujo del amortiguador del tanque para reemplazar el agua perdida, originando un86 —_Bloquimica practica desplazamiento de las bandas. Si el calor es excesivo, los compuestos pueden desnaturalizarse. Existen métodos para enfriamiento del medio de separa- cién que permiten usar hasta 100 V/cm; pero para trabajar a voltajes tan altos se necesita un equipo especial con aditamentos a prueba de errores, La ventaja de la electroforesis de alto voltaje es que la separacién se efecttia muy rapido. Ordinariamente los compuestos de peso molecular bajo adolecen de un exceso de difusién y el mejor medio de separarlos es por electroforesis de alto voltaje. Los aminodcidos y péptidos de hidrolizados de proteina pueden separarse répidamente bajo estas condiciones obteniéndose manchas com- pactas comparables con las que se logran en papel. Aparato de electroforesis. El aparato de electroforesis consta de un medio de separacién conectado por un papel de filtro o un pedazo de gasa a dos tanques que contienen los electrodos. Los tanques estén separados en dos comparti- mientos conectados por lana de algodén o pabilos de asbesto; una parte contiene el electrodo de platino y la otra esta en contacto con el medio de electroforesis. En la regién de los electrodos ocurren cambios en el pH aun usando soluciones amortiguadoras, y la divisién de los tanques en los dos compartimientos minimiza los cambios en la fase contigua ala del soporte. La conexién entre esta fase y la solucién amortiguadora se hace por varias capas de papel Whatman 3 MM o gasa de hospital saturada con solucién amortigua- dora. La conexién debe hacerse’en forma tal, que se produzca una caida de potencial minima a través de ella. En la figura 3.21 se muestra un diagrama de un tanque modelo para separacién horizontal. EXPERIMENTO 3.14 Separacién de aminodcidos por electroforesis en papel Fundamento La carga de una molécula depende del pH del medio y esto se demuestra para el caso de tres aminodcidos: Acido aspartico, histidina y lisina. Debido a la difusién que se produce, la electroforesis a bajo voltaje nose usa generalmen- te para separar compuestos de bajo peso molecular, pero la usamos aqui, pues Lamina de acetato de weeteidea olulose © papel Amoriguador Cros d plistico | [4 Compartimiento de los electrodes —Pedazo de tela o algodén Figura 3.21 Aparato para electroforesis en un plano horizontales mas facil ilustrar la relacién entre carga y pH con aminodcidos que con. Métodos de separaciéh 67 proteinas u otras macromoléculas. A pH 766 la histidina tiene carga ‘total cero, el 4cido aspartico esters * cargado negativamente y la lisina tendré una carga positiva (tabla 3.5). Por lo tanto estos tres aminodcidos pueden ser separados facilmente por electroforesis. En la mezcla se incluye una molécula no cargada tal como glucosa para verificar si hay movimiento de moléculas debido a electro- NH} pet t000" coo" NH} HNN bu, (Gta) H-NH} ‘H—-NH3 ' 0" o- Aminoécido: histidina ‘Acido aspértico Lisina Carga a pH 7.6: 0 7 + ésmosis. Materiales 1 2. 3. 2 Ae 9. Aparatos de electroforesis horizontal. Fuentes de poder. ‘Aminodcidos (Acido aspartico, histidina, lisina, y una mezcla de los tres en amortiguador de tris-acetato que contenga 10 g/l de glucosa). Amortiguador de tris-acetato (0.07 mol/1, pH 7.6). . Reactivo de ninhidrina. (Disuelva 0.2 g en 100 ml de acetona antes de usarse.) . Tiras de papel (10 cm x 2.5 cm). - Reactivo de anilina-difenilamina tal como en el experi- mento 3.10. , Amortiguador de citrato (0.07 mol/l, pH 3.0). Hornos a 110° C. Método Llene hasta el mismo nivel las dos partes de los compartimientos de los electrodos con solucién amortiguadora; verifique si estén nivelados comuni- cdndolos mediante un sif6n. Remueva el sifn, coloque 5 tiras de papel de filtro como se muestra en la figura 321 y a dos de ellas aplique cuidadosamente en una banda delgada un poco de la mezcla de aminodcidos ools 10 ml 5 veces la capacidad del tanque 60 5 veces la capacidad del tanque 588 —_Bioquimica practica evitando tocar el borde del papel. Aplique a cada una de las otras tres tiras de papel una solucién diferente de un aminodcido y proceda a efectuar la electroforesis para las cinco tiras juntas. ‘Moje los extremos de las tiras de papel y deje que el resto se humedezca por accién capilar. Inmediatamente conecte la corriente. En esta forma la muestra no se extiende mucho. Deje transcurrir la electroforesis durante 3h a8 V/cm, retire las tiras y sequeen un horno a 110° C. Coloree una de las tiras que contiene glucosa en la forma indicada en el experimento 3.10 y sumerja rdpidamente las cuatro tiras restantes en solucién de ninhidrina fresca. Deje que se evapore al aire la acetona y caliente en el horno durante 10 minutos hasta que aparezca el color. Identifique los aminodcidos examinando si se ha producido electro-ésmosis. Repita el experimento con amortiguador de citrato 0.07 mol/1, pH 3.0 y explique los resultados usando los datos que se han dado en la tabla 3.5. EXPERIMENTO 3.15 Separacién de proteinas séricas por electroforesis en acetato de celulosa. Fundamento La electroforesis es muy usada en medicina y bioquimica clinica, especial- mente para medir cambio? ocurridos en las proteinas séricas a causa de las enfermedades. La electroforesis en acetato de celulosa, que se ilustra en el siguiente experimento, es un método rdpido y apropiado para el efecto. Materiales 10 1. Aparatos para electroforesis horizontal. 5 2. Fuentes de poder. 5 3. Amortiguadores de barbitona (0.07 mol/l, pH. 8.6). 5 veces la capacidad del tanque 4. Colorante para proteina Ponceau S (2 g/l en TCA 21 30 g/l). 5. Acido acético (5% v/v). 21 6. Suero. 5ml 7. Tiras de acetato de celulosa (Oxoid Ltd.) 10 8. Papel Whatman 3 MM. 10 9. Metanol:agua (3:2). 50 ml 10. Amortiguador de citrato (0.1 mol/l, pH 6.8). 20 ml Método Humedezca una tira de acetato de celulosa (10 cm x 2.5 cm) dejandola flotar sobre la superficie del amortiguador y permitiendo que el amortiguador sea absorbido por debajo. Sumerja completamente la tira agitando suavemente el recipiente del amortiguador. Retfrela usando forceps. Seque ligeramente la tira, coléquela en el aparato cuidando de que sus extremos se hallen dentro