72 Bloquimica préctica Método : Q Preparacién de la columina. Agite suavemente la resina en HCI 4 mol/I hasta que se hidrate completamente (15—30 ml/g de resina seca). Deje sedimentar laresina y decante el Acido. Repita el lavado con HC10.1 mol/l, resuspendaen esta solucién y prepare la columna como se describié anteriormente. Elucién de aminodcidos. Aplique cuidadosamente 0.2 ml de la mezcla de los aminodcidos en la cima de la columna. Abra el extremo inferior de la colum- na y permita que la mezcla penetre en la resina. Agregue 0.2 ml de HCI 0.1 mol/l, deje que penetre en la resina'y repita el proceso dos veces. Finalmente, aplique 2 ml de HCI 0.1 mol/l encima de la resina y conecte la columna a un recipiente que contenga 500 ml de HCI 0.1 mol/l. Ajuste la altura del recipiente hasta obtener un flujo de aproximadamente 1 ml/min y recoja un total de 40 fracciones de 2 ml. Determine si hay aminodcidos presentes ensayando grupos de cinco tubos por vez, poniendo una muestra pequefia de cada tubo sobre un papel de filtro, sumérjalo en la solucién de ninhidrina en acetona y caliente en un horno a 105°C. La presencia de aminodcidos se mani- fiesta en forma de manchas azulosas sobre el papel de filtro. Cuando haya eluido el primer aminoacido, remueva el recipiente de HCI 0.1 mol/l y-deje que el nivel del dcido baje justamente hasta la superficie de la resina. Pase 2 ml de amortiguador tris-HC1 0.2 mol/I (pH 8.5), luego conecte la columnaa un ‘recipiente que contenga este amortiguador y continwe la eluci6n hasta que el tercer aminoacido salga de la columna. Deteccién de aminodcidos. Ajuste el pH de cada tubo a 5, afiadiendo unas pocas gotas de Acido o Alcali. Agregue 2 ml del reactivo de ninhidrina en amortiguador y caliente durante 15 min en un bafiode agua hirviendo. Enfrie los tubos a temperatura ambiente, agregue 3 ml de 50% v/v de etanol y leala extincién a 570 nm después de dejar reposar los tubos por 10 minutos a temperatura ambiente. Incluya los blancos y patrones apropiados y haga un grafico de la cantidad de aminodcidos en cada fraccién en funcién del volumen de elucién. iEn qué orden se eluyen los aminodcidos y por qué? (tabla 3.5). Cromatografia de particién La separacién de compuestos que son facilmente solubles en liquidos organicos y solo ligeramente solubles en agua se efectita por cromatografia de Tabla3.5 Valores de pK y pH a los que st encuentra carga cero para tres aminodcidos Aminofcido pK, pK, pK, Punto isoinico dcido aspartico 20 39 10.0 29 histidina 18 6.0 92 16 lisina 22 92° 05 100Métodos de sepersclén = 73 adsorcién, mientras que los compuestos ionizables hidrosolubles se separan mejor por cromatografia de intercambio iénico. La cromatografia de particién es intermedia entre cromatografia de adsorcién y de intercambio iénico y los compuestos que sori a la vez hidrosolubles y solubles en solventes organicos, sé separan facilmente por métodos de particién. ‘Cuando se agita un compuesto con dos solventes que nose mezclan, éste se distribuye en las dos fases; y, en equilibrio, la razén de la concentracién del compuesto en los dos solventes es constante y se conoce como el coeficiente de particién (a). _ Concentracién de x en el solvente 1 Concentracién de x en el solvente 2 En la cromatografia de particién uno de los solventes, usualmente el agua, permanece en la fase estacionaria que consiste en una columna o pelicula de material inerte. La otra fase consiste en un liquido orgdnico mévil, saturado con agua, que fluye ert relacién con la fase estacionaria. Los componentes de una mezcla se separan si los coeficientes de particién entre los solventes son suficientemente diferentes (figura 3.16). Teoria de la cromatografia en papel. La celulosa en forma de hojas de papel constituye un medio de soporte muy util, donde el agua es adsorbida entre las fibras de celulosa y forma la fase hidrofilica estacionaria.’E] uso de papel de filtro como base de soporte fue demostrado por Consden, Gordon y Martinen 1941 y desde entonces han aparecido numerosos articulos y libros acerca dela técnica de la cromatografia en papel. Fase sdlida {soporte inerte) Fase liquide mévit (solvente hidrofébico) Soluto (moléculas distribuidas entre las dos fases, qui Fase estacionaria Mquide {capa adsorbida de solvente hidrotlico) Figura 3.16 Fundamento de la cromatografia de particién liquido-liquido74 — Bloquimica practica La mezcla se aplica sobre el papel, se seca y luego se desarrolla el cromatograma dejando que el solvente fluya a lo largo de la hoja. Se marcael frente del solvente y después de secar el papel se visualiza la posicién de los compuestos presentes en la mezcla mediante una reaccién coloreada. La raz6n entre la distancia que ha migrado un compuesto y la distancia recorrida por el solvente, se conoce como el valor Ry y es mas 0 menos constante para un compuesto, sistema de solventes y clase de papel determinados bajo condiciones cuidadosamente controladas de concentracién de soluto, tempe- ratura y pH (figura 3.17). El R; est4 relacionado con el coeficiente de particién a , asi: a-4i(4-1) Ag \Rr : A, es el drea de la seccién transversal de la fase liquida y A,es igual al areade la seccién tranversal de la fase estacionaria. Para una serie homéloga, un grafico de Rj» en funcién del nimero homélogo da una linea recta. Ry =I (= 1) m =tog(>—1). eR, Se presentan excepciones a estas ecuaciones cuando la fase estacionaria no es completamente inerte, pues es posible que junto con la particién ocurra adsorcién y probablemente intercambio iénico. Preparacién de la muestra. Cuando se estén investigando materiales biolégicos es convertiente desalinizar la muestra antes de la cromatografia y esto puede hacerse eficientemente por electrélisis 0 electrodidlisis. El exceso Frente del solvente Origen Figura 3.17 Significado del valor R, de la cromatografia en papelMétodos de sepsracton 75 de sal origina cromatogramas cori manchas de bordes difusos y cambios en los valores de Ry. Puede también afectar la reaccion quimica que se emplea para detectar los compuestos en la mezcla. Las proteinas deben ser removidas antes de la cromatografia por ultrafiltracién o con Sephadex. Se aplica luego la muestra (10-20 #1) al papel usando una micropipeta. Seleccién del papel. El papel més frecuentemente usado para efectos analiticos es el Whatman No. 1. El Whatman 3 MM es un papel grueso y se emplea preferencialmente para separar grandes cantidades de material; sin embargo, la resolucion es inferior a la obtenida con Whatman No. 1. Para una separacién répida, se recomiendan los papeles Whatman Nos. 4y 5, aunqueen este caso las manchas no son tan definidas. En cualquiera de los casos, el flujo es mas rapido en la ‘direccién dela maquina’, la cual se anota normalmenteen la caja que contiene el papel. El papel puede impregnarse con una solucién amortiguadora antes de usarse 0 puede ser modificado quimicamente por acetilacién. También se encuentran en el comercio papeles de intercambio iénico. Para la separacién de Iipidos y otras moléculas hidrofébicas, se venden papeles impregnados en silica. Seleccién del solvente. La seleccién del solvente, como sucede con la seleccién del papel, es bastante empirica y depende de la mezcla que se quiere investigar. Si los compuestos migran hasta muy cerca al frente del solvente A, es porque son muy solubles, mientras que si se agrupan alrededor del origen en el solvente B, entonces noson suficientemente solubles. Se requiere, por lo tanto, buscar las proporciones adecuadas de A y B para que los Ry de los componentes de la mezclase distribuyan a todo lo largo del papel. El pH puede ser también importante en una separacién dada, y muchos solventes contienen acido acético o amoniaco para producir un medio fuertemente Acido o basico. Revelado. Esencialmente, el aparato consiste en una hoja de papel sostenida en un marco de tal manera que uno de los extremos esté en contacto con un recipiente que contiene el solvente. Para cromatografia ascendente, el papel se enrolla en forma de cilindro sostenido con un gancho de oficina (clip) y luego se introduce verticalmente en el solvente. El conjunto se mete a un tanque herméticamente cerrado en el cual se ha colocado papel saturado con el solvente para producir una atmésfera constante, y el proceso se lleva a cabo en un cuarto de temperatura constante. Las variaciones en la temperatura producen migracién dispareja del solvente y pueden alterar los valores Rr (figura 3.18). La cromatografia descendente. Es conveniente para aquellos compuestos que tienen: un valor de Ry semejante, pues el solvente escurre en la parte inferior del papel produciendo as{ una mejor separacién. Es obvio que en este caso no se pueden medir los valores de R, y las sustancias tienen queAscendente Descendente Figura 3.18 Papel de cromatografia ascendente y descendente compararse con la migracién de un compuesto patrén tal como glucosa, por ejemplo, en el caso de los azt¢ares: Distancia de migracién del compuesto x * Distancia de migracién de la glucosa La cromatografia ascendente. Se usa més frecuentemente y tiene la ven- taja de que la separaci6n puede hacerse en dos dimensiones. La mezcla se separa con el primer solvente, que debe ser volatil, luego se deja secar, se gira el papel 90° y se hace la separaci6n con el segundo solvente. Después de localizar los compuestos se obtiene un mapa y los componentes se identifican comparando su posicién con la de un mapa de compuestos conocidos desarro- lados en las mismas condiciones (figura 3.19). Deteccién de los compuestos. La mayoria de los compuestos son incoloros y s6lo se pueden visualizar mediante la ayuda de reactivos especificos. El réactivo de coloracién se disuelve en un solvente volatil y se aplica rociando el papel o sumergiéndolo répidamente en la solucién. También se usa la luz ultravioleta para visualizar algunos compuestos ya que unos la absorben fuertemente, y por lo tanto aparecen como manchas oscuras, mientras otros muestran una fluorescencia caracteristica bajo su irradiacién. EXPERIMENTO 3.10 Identificacién de azticar en la leche por cromatografia de papel “Fundamento La leche es desproteinizada con dcido tricloroacético, centrifugada y el sobre- nadante se usa para cromatografia. La mezcla anilina-difenilamina usada6 Aplique la muestra Resultado T a | t ' ' ' ' ' ' 1 ' Le sotvene2 | | ' ! ' : (i ' : ' ° S 12 ! Dos \ 2 x Gir 80° Separecén nal Figura 3.19 ' Separacion de una mezcla por cromatografia de papelen dos dimensiones para detectar azitcares, da diversos colores con la mayoria de ellos, lo cual permite su identificacién. Materiales 10 * 1. Equipos para cromatografia descendente. 5 2. Papel de cromatografia Whatman No. 1. 10 hojas - 3. Solvente para cromatografia (isopropanol:agua, 4:1). 31 4. Reactivo, de identificacién anilina-difenilamina. (Prepa- =— rese fresco mezclando 5 voliimenes de anilina 10 g/l y 5 yolumentes de difenilamina 10 g/1 en acetona con un volumen de acido fosférico 85%. ;Cuidado: téxico!). 5. Hornosa 100°C. ca 3 6. Soluciones patrones de aziicares (10 g/l en isopropanol 10 ml 10% v/v). Ramnosa, lactosa, ribosa, 4cido glucurénico, ’ xilosa, glucosamina, fructosa, glucosa. 7. Secadores de pelo o.abanicos industriales. 5 8 Atomizadores. ‘ 3 9. Leche. i 50 ml 10. Acido tricloroacético (100 g/1). 50.ml78 — Bloquimica practica Método Desproteinizacién. Mezcle 2 ml de leche y 3 ml de agua destilada, agite fuertemente, agregue 5 ml de Acido tricloroacético (100 g/l) y mezcle. Deje reposar durante unos pocos minutos, remueva el precipitado por centrifuga- cién y use el sobrenadante para cromatografia. Cromatografia. Tome dos hojas de papel de cromatografia Whatman No. 1y trace una raya de aproximadamente 8 cm del borde del papel..A una de las hojas aplique sobre la linea las siguientes muestras a intervalos de aproxi- madamente 4 cm y déjelas secar bajo una corriente de aire caliente. 1. 5yullactosa. 2. 10 ulde extracto de leche. 3. 10 ullactosa (10 g/1). 4, 10 plde extracto de leche +5 ul de lactosa (10 g/l). 5. 5 ulglucosa (10 g/l). 6. 5ylgalactosa (10 g/1). Aplique soluciones patrones sobre la otra hoja y corte los extremos del papel en forma dentada para facilitar que el solvente escurra de la hoja (figura 3.18). Deje que el solvente fluya de un dia para otro a lo largo del papel y ala mafiana siguiente coléquelo en una cmara extractora de gases, s¢quelo con una corriente de aire frio y visualice las manchas atomizando el papel con una solucién de anilina-difenilamina recientemente preparada. Retirelo de la cémara y caliéntelo brevemente a 100° C. Mida las distancias de migracién de los azticares a partir del origen y determine los valores de Ry. Ademas, se sugiere incluir una mezcla problema de dos o tres aziicares junto con el extracto de leche. EXPERIMENTO 3.11 Separacién de aminodcidos por cromatografia de papelen dos dimensiones Fundamento Para los experimentos siguientes con aminodcidos y proteinas'se prepara un mapa en dos dimensiones de las soluciones patrones de aminodacidos. La ninhidrina reacciona con todos los a-aminodcidos dando un color parpura. Algunos otros compuestos también reaccionan y entre ellos se encuentran las aminas alifaticas primarias y secundarias y algunos compuestos no aromaticos heterociclicos de nitrégeno. Los aminodcidos, prolina e hidroxi- prolina reaccionan dando una coloracién amarilla. Materiales 1. Equipos-para cromatografia en dos dimensiones. 2. Papel de cromatografia Whatman No. 1 (20 cm x 20 cm). 3. Solvente 1. (Butanol:acido acético glacial:agua, 12:3:5). 4. Solvente 2. (Fenol-agua). En un frasco mezcle 500 g de 2500 g EselsMétodos de separaciin 78 fenol con 125 ml de agua, tape y deje reposar de un dia para otro. Precaucién: el fenol produce quemaduras en la piel. Antes de usarse agregue al solvente unas pocas gotas de amoniaco 0.88 y mezcle bien. . Reactivo de ninhidrina (disuelva 0.2 g en 100 ml de - acetona antes de usarse). Hornos a 105°C. Patrones de aminodcidos. Prepare voltimenes pequefios 10 ml de soluciones de 10 g/l en isopropanol 10% v/v. Algunas veces se necesita una gota de dcido o dlcali para disolver el compuesto. Alanina, Acido aspartico, cisteina-HCl, cistina, acido glutdmico, glicina, histidina-HCl, hidroxi- prolina, leucina, isoleucina, lisina-HCl, mettonina, ornitina-HCl, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptéfano, tirosina y valina. Método Examine el mapa de aminodcidos suministrado (figura 3.20), escoja cuatro cuyo valor R, difiera bastante, y en un extremo de la hoja de papel de cromatografia Whatman No. 1 aplique 20 ul de cada uno. Seque las manchas en una corriente de aire y coloque la hoja en el soporte metilico. Repita este 2 ne Butanol/écido acético/egua ——~Fenol/agua/emoniaco Figura 3.20 Separacién en dos dimensiones de una mezcla de aminodcidos usando papel Whatman No. 180° Bloquimica practice procedimiento en hojas diferentes hasta que se hayan aplicado ‘todos los aminodcidos y finalmente aplique una mezcla de todos ellos en otro papél. Cada aminodcido debe incluirse en dos mezclas. diferentes para confirmar su , identidad. Sumerija en el solvente el extremo del papel adyacente a la mancha‘de la mezcla y deje corer la cromatografia durante la mayor parte del dia. Por la’ tarde saque el soporte, coléquelo en el extractor de gases y seque el papel ent una corriente de aire frio. Gire el soporte 90° en forma .tal que el otro borde cercano a la muestra se sumerja en.el segundo solvente-y deje correr el cromatograma de un dia para otro (figura 3.19). Seque los papeles como se indicé y separelos del soporte. Rapidamente sumerja cada papel en reactivo de ninhidrina y cuélguelos en el extractor de gases para dejar evaporar la acetona. Desarrolle los colores calentando a 105° C durante 2-3 minutos. Construya un mapa de aminodcidos y compérelo con el de la figura 3.20. Cromatogratia en capa fina Izmailov y Schraiber describieron en 1938 la separacién de extractos de plantas por cromatografia de capa fina en altimina. Pero solamente 20 afios . después se comenzé a vender el equipo para la preparacién de las placas. La separacién de los compuestos en capa fina es semejante en muchos aspectos a la cromatografia en papel, pero tiene la ventaja adicional que se pueden usar medios diferentes de soporte y atin mezclas de los mismos. Se pueden también incluir reactivos fluorescentes en el medio para ayudar ala identificacién de las manchas. La separacién puede hacerse por adsorcién, intercambio iénico, cromatografia de particién ofiltracién en gel, dependien- do de la naturaleza del medio empleado. El método es rapido y se pueden completar varias separaciones en una hora. Las manchas obtenidas son. muy compactas y es posible por lo tanto detectar compuestos en concentraciones mas bajas que sobre papel. Ademés los compuestos separados por cromato- grafia en capa fina pueden detectarse usando materiales corrosivos y elevadas temperaturas, lo cual no es posible con papel. Preparacién de las léminas de capa fina. Para la mayoria de las separaciones se considera apropiado que la capa tenga un espesor de 250 um. Espesores por debajo de 200 um afectan el valor Ry. En él comercio se encuentran aparatos para preparar las léminas que si se usan cuidadosamente pueden producir capas muy parejas, del espesor deseado. Algunas veces se incluye sulfato de calcio en el adsorbente para fijar la capa a la lmina de vidrio y en este casose aconseja trabajar répidamente una vez que el adsorbente se mezcle con agua. El material de capa fina depende de la mezcla que se-estudie, pero se ha comprobado que el gel de silica es muy util para la separacién de una_.gran cantidad de compuestos. Desarrollo. Es necesario que la atmésfera de la cémara de.separacién esté completamente saturada. De otra forma los valores Rr cambian considera-