UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS ESPE

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA

AGRICULTURA
INGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA

PRACTICA DE LABORATORIO N 2

Nombre: Esparza Carlos, Leiva Luis

Materia: Biologa Molecular
Prctica N: 4 Fecha: 29/06/2017. Curso/NRC: 2362

1. TEMA: CUANTIFICACIN DE DNA

2. OBJETIVOS:
Objetivo general
Realizar la cuantificacin de DNA de las muestras de los estudiantes del NRC: 2362
Objetivos Especficos
Aplicar el procedimiento adecuado para la cuantificacin de DNA
Determinar las absorbancia de las muestras tanto en 260nm y en 280nm.
Identificar la cantidad de cidos nucleicos de las muestras.

3. INTRODUCCIN o MARCO TEORICO:

Segn (Guevara & Campelo Morillo , 2005) se tienen presentes diversos mtodos para la
estimacin de la concentracin de cidos nucleicos de una muestra. Si esta muestra es lo ms pura
(no contiene cantidades significativas de contaminantes como protenas, fenol, agarosa o incluso
otros cidos nucleicos), su medicin mediante espectrofotometra de la luz UV absorbida por las
bases nitrogenadas se presenta como la mejor opcin. Aunque el mtodo es rpido, simple y sin
daos; se ha determinado como una tcnica poco sensible, por lo que en muchos espectrofotmetros
se requiere de concentraciones de DNA de mnimo 1g.mL-1 para una mejor validez en los datos.
Al hablar de espectrofotometra, se emplean diversos tipos de espectrofotmetros de luz UV,
es as que para (Puerta B. & Urea P., 2005) se emplea una onda de 260nm, por lo que las bases
pricas y pirimidnicas del ADN tienen la propiedad de absorber la luz UV con esta longitud de
onda, se emplea una relacin de absorbancias de 260nm y 280nm para determinacin de impurezas;
una preparacin pura de DNA tiene una relacin 260/280nm de 1,8 a 2,0.
El uso de la Luz UV requiere de diluciones as se comenta por parte de (RUZ SESMA, ROJAS
MARTNEZ, & RUZ HERNNDEZ, 2010) que pueden ser diluciones 1/200 a 1/500 en agua
 destilada, para determinacin de absorcin de luz UV a longitudes 230, 260 y 280nm dando las
relaciones: 260/280 y 260/230 para deteccin de contaminantes.
Aunque una presencia de impurezas se encuentre presente dentro de la muestra segn (Prez,
Rodrguez, Langebaek, & Groot, 2016) La cuantificacin de ADN no solo permite inferir en la
autenticidad de las muestras, sino que aporta informacin relevante para la implementacin o
modificacin de protocolos de extraccin y amplificacin acordes con la cantidad del material
gentico disponible.
Un protocolo empleado en cuantificacin puede ser generalizado como se presenta en (Puerta
B. & Urea P., 2005):
1. Diluir el ADN en agua destilada en vf de 1mL para el macromtodo y 100L para
micromtodo. La cantidad de ADN a tomar depender de la banda observada en el gel
de agarosa.
2. Utilizar agua como blanco y realizar las mediciones a 260nm y 280nm, utilizando celda
de cuarzo.
3. Determinar la concentracin teniendo en cuenta la dilucin del ADN.

4. MATERIALES Y METODOLOGA

Materiales Equipos
Calculadora Espectrofotmetro

Paos limpios Celdas

Eppendorf 1,5 ml,
Muestras preparadas que contengan
DNA

Mtodo:
Para cuantificar el DNA a hojas de plantas (Tomate, rbol de mora, espinaca y patata) se
procedi a realizar los siguientes pasos:
1. En los tubos con aproximadamente 30L se realiz la extraccin de 10L
2. Previo encendimos el espectrofotmetro
3. Encendimos el aparato
4. Se realiz la dilucin de 10L de muestra con 490L de agua destilada.
5. Luego de la lectura del blanco se realiz la lectura a 260nm
6. Un segunda lectura a 280nm de la misma muestra se realiz
7. Procedimos a determinar el clculo basado en la disolucin y los radios determinando
as la cantidad de cidos nucleicos.
5. RESULTADOS Y DISCUSIN
Como resultado de la prctica anterior se obtuvieron 3 extractos de DNA debido a que
el mismo presentaba una consistencia viscosa y para asegurarnos se las separ y
realiz la cuantificacin.

Con los extractos de DNA obtenidos a partir de hojas de morera (Morus nigra) se midi a
260 y 280 nm la cantidad de DNA presente en cada muestra utilizando la siguiente ecuacin.

Extracto 1
g A260 50 (factor de dilucin) 10 g/l
[ADN] ( ) =
l 1000

g
[ADN] Ependorf 1 ( ) = 0,240 2,5
l

g g
[ADN] Ependorf 1 ( ) = 0,6
l l

Extracto 2

g g
[ADN] Ependorf 1 ( ) = 0,165
l l

Extracto 3
g g
[ADN] Ependorf 1 ( ) = 0,05
l l

Con estos datos observamos la mayor cantidad de DNA se encuentra presente es el

extracto 1; adems esta concentracin es la ms alta que todos los extractos realizados
por los dos cursos, y esto se representa en la (figura 1 y 2)..

Figura 1 Clculos necesarios para obtener la concentracin de ADN

del NRC 2361 (Foto tomada por David Ordoez)
 Figura 2 Clculos necesarios para obtener la concentracin de ADN por
estudiantes del NRC 2362 (Foto tomada por David Ordoez)

Segn (Puerta B. & Urea P., 2005), el rango normal al dividir la absorbancia a 260/280 nm
para obtener una alta pureza es de 1,2 a 1,8; sin embargo la mayora de los clculos se
encuentran por debajo de la unidad, indicndonos que posiblemente fue una mala manipulacin
del espectrofotmetro o incorrecta extraccin de DNA.
Para (Prez, Rodrguez, Langebaek, & Groot, 2016) el mejor protocolo de extraccin de DNA
del rbol de mora (Morus nigra) es el kit planta DNeasy Mini y as poder tener un DNA ms
puro; sin embargo se realiz la practica con DNA zol, arrojndonos un buen resultado puesto
que la concentracin de uno de los tres extractos correspondientes a la mora fue la ms alta en
comparacin con los dos cursos.

6. CONCLUSIONES

- Se cuantific el DNA por medio de espectrofotometra.

- Se determin la concentracin de DNA por medio del clculo de la absorbancia a
260nm.
- Para calcular la pureza de la muestra se midi la absorbancia a una longitud de onda de
280 nm.
- Se midi el coeficiente de pureza 260 nm/ 280 nm.

7. RECOMENDACIONES

- Las cubetas donde se coloca el DNA diluido deben encontrarse libre de impureza puesto que
esto podra alterar la lectura del espectrofotmetro.
- La precisin en los clculos y la toma de muestra deben ser exactas debido a que no se espera
que haya desperdicio.
- Colocar las cubetas de manera correcta en el espectrofotmetro para evitar alteraciones en la
lectura de las longitudes de ondas.
8. CUESTIONARIO

Describa otro mtodo de cuantificacin de cidos nucleicos (fluorescencia emitida por bromuro
de etidio, fluormetro y nanodrop)
o La fluorescencia es un proceso de emisin en el cual las molculas son excitadas por la absorcin
de radiacin electromagntica, en el caso de pruebas para DNA se emplea Bromuro de etidio.
(Bacic, Cabrera, Zamorano, & Villar, 2014)
o Un fluormetro (Qubit) que permite, mediante la utilizacin de sondas fluorescentes, cuantificar
de forma altamente especfica muestras de DNA, RNA o protenas. (Rodriguez, 2014).
o La muestra NanoDrop microvolumen sistema de retencin (Thermo Cientfico Productos
NanoDrop) funciona mediante la combinacin de la tecnologa de fibra ptica y las propiedades
naturales de la tensin superficial para captar y retener pequeas cantidades de muestra
independiente de los aparatos de contencin tradicionales, tales como cubetas o capilares.
Adems, el sistema cuenta con ms cortos recorridos, que se traducen en un amplio rango de
mediciones de concentracin de cido nucleico, bsicamente eliminando la necesidad de realizar
diluciones. (Desjardins & Conklin, 2010).

Analice una aplicacin prctica para la cuantificacin de cidos nucleicos

- Como nos indica en (MARTNEZ ESTRADA & MOCTEZUMA GONZLEZ, 2006), para
poder determinar la distribucin de una poblacin celular especfica a lo largo de las fases del
ciclo celular y tambin en el diagnstico y valoracin de pacientes con patologas.

Por qu es importante conocer la cantidad de cidos nucleicos con la que se cuenta en una
muestra?
Para (MARTNEZ ESTRADA & MOCTEZUMA GONZLEZ, 2006), en casos clnicos en
tumores slidos permite:
i. Ayudar en el diagnstico de malignidad cuando los cambios morfolgicos son equvocos.
ii. Sub-clasficar las lesiones de baja malignidad ("borderline").
iii. Aportar informacin pronstica de valor independiente al estadio y grado.
iv. Monitorizar la respuesta al tratamiento.
v. Valorar la posibilidad de recidiva.
vi. Establecer el origen sncrono o metcrono de los tumores.
Bibliografa
Bacic, F., Cabrera, P., Zamorano, C., & Villar, J. (2014). Flourescencia. Obtenido de
http://www.scian.cl/portal/globals_file.php?CS=2960&ID=1409836870.8698&D=ON
Desjardins, P., & Conklin, D. (22 de Noviembre de 2010). NanoDrop microvolumen cuantificacin de cidos
nucleicos. Obtenido de https://www.jove.com/video/2565/nanodrop-microvolumen-cuantificacin-de-
cidos-nucleicos?&language=Spanish
Guevara, D., & Campelo Morillo , L. (2005). CIENS.UCV.VE. Obtenido de Manual de Laboratorio:
http://www.ciens.ucv.ve:8080/generador/sites/geneticamolecular/archivos/Manual%20Lab%20Fund%
20Gen%20Mol%20Vers%2020%20mayo%202009.pdf
MARTNEZ ESTRADA, M., & MOCTEZUMA GONZLEZ, C. (30 de mayo de 2006). Universidad Autnoma
de Mxico- Instituto de Biotecnologa. Obtenido de
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/espectrofluorimetria.pdf
Prez, L. A., Rodrguez, F., Langebaek, C. H., & Groot, H. (2016). SCIELO.ORG.co. Obtenido de Cuantificacin
en tiempo real de un conjunto de muestras colombianas de relevancia histrica mediante la deteccin de
un fragmento corto de la regin hipervariable II del ADN mitocondrial:
http://www.scielo.org.co/pdf/bio/v36n3/v36n3a17.pdf
Puerta B., C., & Urea P., C. (2005). Prcticas de Biologa Molecular. Pontificia Universidad Javeriana.
Rodriguez, G. (16 de Julio de 2014). Universidad Auntnoma de Madrid. Obtenido de
https://www.iib.uam.es/portal/documents/76122/76162/CUANTIFICACION+DE+%C3%81CIDOS+N
UCLEICOS+V2.pdf/04333940-c6ff-4419-ad85-cfd1e04dbca8
RUZ SESMA, B., ROJAS MARTNEZ, R., & RUZ HERNNDEZ, H. (20 de Enero de 2010). Nota Tcnica .
Obtenido de Extraccin y cuantificacin de ADN de pajillas de semen bovino criopreservado: Revista
Cientfica UDO Agrcola 10 (1): 103-108. 2010