Laboratory of Tropical

Crop Improvement

KATHOLIEKE
UNIVERSITEIT
LEUVEN

Bioluminiscencia en Biotecnologa de Plantas: Las

Bananas resplandecen de luz!

E. Santos, S. Remy, E. Thiry, S. Windelinckx,

R. Swennen and L. Sgi
ACORBAT 2008, 10-14 noviembre
Guayaquil-Ecuador
17 April 2008

1
 Contenido
I. Bananos genticamente modificados

II. Expresin de los genes

III. Genes reporteros

IV. El gen reportero de la luciferasa en biotecnologa

aplicada al banano

V. Caracterizacin y aislamiento de promotores y genes de

banano

VI. Conclusiones y perspectivas

2
 I. Bananos genticamente modificados

Plantas modificadas genticamente

Mejoramiento convencional es un proceso largo y
tedioso especialmente en banano y pltanos. Consiste
en la polinizacin cruzada de una planta con una
especie relacionada. Por tanto, el pool de genes est
limitado a especies compatibles para cruzamiento.
Bananos del subgrupo Cavendish no se pueden
mejorar convencionalmente debido a esterilidad.
Transformacin gentica de plantas permite la
integracin de genes tiles de diferentes organismos a
las plantas.

3
 I. Bananos genticamente modificados

Plantas modificadas genticamente

Transformacin gentica en plantas puede ser
definido como la insercin estable de genes en el
genoma y su expresin en la planta transgnica (o
cisgnica).

Plantas cisgnicas. La introduccin de genes en una

planta, con sus promotores originales, de una planta
compatible de cruzamiento o de la misma planta
(Schouten and Jacobsen, 2006) .

4
 I. Bananos genticamente modificados

Genmica en Banano
Genoma: 500-600 Mbp; 11 chromosomes; ploidia: 2x,
3x, 4x; grupos genmicos (AAA, AAB, ABB )

Herramientas moleculares: Sistemas de

transformacin gentica, Secuencia de datos
limitada (EST, BAC, SAGE libraries), anlisis
protemico, marcadores moleculares,

Revolucin verde a la revolucin de los genes

(transformacin gentica)

5
II. Expresin de los genes

Expresin de genes
Protena

mRNA

DNA
Promotor Gen

+1

Sitio de Inicio
TATA-box de la
Transcripcin 6
- 30 (TSS)
 II. Expresin de los genes

Genes reporteros
Mediciones de la expresin de
genes se realizan generalmente Promotor

a travs de ensayos especficos DNA

Gen reportero
del mRNA, sin embargo
requiere esfuerzo substancial.
Genes reporteros proveen mRNA
informacin anloga ms
eficientemente. Protena
Puede ser detectado mediante reportera
un ensayo visual y simple.
Es usado para confirmar
transformacin gentica
temporal o estable.

7
 III. Genes reporteros

Genes reporteros
Importantes para la prueba de la actividad de
promotores.

Genes reporteros ms usados en biotecnologa

de plantas:
-glucuronidase (GUS)
Protena Fluorescente Verde (GFP)
Luciferasa (LUC)

8
IV. El gen reportero de la luciferasa

Sistema del gen reportero Luciferasa

- Tiempo real
luc - Sensibilidad
luc+

LUC
luciferin + ATP + O2 oxyluciferin + AMP + PPi +
CO2 + light (562 nm)
Sistema de cmara CCD
digital ultrasensible

9
V. Caracterizacin y aislamiento de promotores y genes de banano

Uso de promotores en bananos modificados

genticamente
CaMV35S (derivados), ScBV, TaBV,
Virus
BSV, BBTV

Bacteria nos
Promotores
Recombinante Emu, (ocs)3mas
heterlogos
Arroz: actina
Plant Maz: ubiquitina
Arabidopsis: ubiquitina, tubulina
Promotores
Banano: actina, EFE, ACO1, ACC
nativos

Funcionabilidad/estabilidad, mayor aceptacin por el pblico

Clases de promotores: Constitutivos, regulados de acuerdo al desarrollo de
la planta, tejido especfico, inducibles (estrs biotico/abiotico)
10
V. Caracterizacin y aislamiento de promotores y genes de banano

Aislamiento de promotores

Basados en tcnicas Cantidad de tejido/RNA

de mRNA Alto nivel de expresin de genes

Trampeo de promotores Eficiencia en transformacin gentica

Promoter tagging

11
 V. Caracterizacin y aislamiento de promotores y genes de banano

Aislamiento de promotores en banano

Objetivo. Identificar y caracterizar

promotores de banano para su uso en el
desarrollo de bananos genticamente
modificados.

12
V. Caracterizacin y aislamiento de promotores y genes de banano

Trampeo de promotores a travs de

transformacin con Agrobacterium
T-DNA tagging vector DNA genmico
RB LB

Gen reportero Gene selectivo

Promotor gen

Agrobacterium transformation
Regin 5 Regin 3
RB LB

mRNA

Ensayos en
Protena diferentes 13
reportera condiciones
 V. Caracterizacin y aislamiento de promotores y genes de banano

Trampeo de promotores en banano

Meses despus de
infeccin con 1 2 3 4 5 6 7 8 ...
Agrobacterium

Colonias Induccin de Induccin para

Fase Vitroplantas
celulares embrin regeneracin

Cultivo

400-600/Petri Dish
5,600-8,400/image
Anlisis
3 3 3 3 14
V. Caracterizacin y aislamiento de promotores y genes de banano

Detecin de luciferasa en banano

Colonias celulares Vitroplantas

Live

~42,000

LUC

15
346
V. Caracterizacin y aislamiento de promotores y genes de banano

Deteccin de luciferasa en banano

16
V. Caracterizacin y aislamiento de promotores y genes de banano

Deteccin de luciferasa en condiciones de

baja temperatura en tiempo real
26C 26C Alta
actividad
LUC
8C

Baja
actividad
LUC

17
V. Caracterizacin y aislamiento de promotores y genes de banano

Anlisis de la actividad de LUC durante

regeneracin

18
V. Caracterizacin y aislamiento de promotores y genes de banano

Actividad de promotores
Live LUC
Expresin
constitutiva

Expresin
especfica en
raz

19
V. Caracterizacin y aislamiento de promotores y genes de banano

Actividad de promotores

Expresin
especfica en el
pseudotallo

20
V. Caracterizacin y aislamiento de promotores y genes de banano

TAIL-PCR para el aislamiento de

secuencias en la regin 5
AD RB pETKUL2 LB
+ pe35S-neo-T35S
luc -Tnos
SP1
SP2
SP3

AD2-1 AD2 AD2-1 AD2 AD2

2 3 2 3 M bp 2 3 2 3 M bp 2 3 M bp

1500 1500 1500

1000 1000
1000
800
600
600
400
200
200

21
V. Caracterizacin y aislamiento de promotores y genes de banano

Southern blot

ET2-lines pETKUL2
kb MM Contr. 17 85 123 34 49 82 102 156 1C 5C

21.2

5.2
3.5 Sonda luc+
probe
2.0

Min.# copias T-DNA: 5 3 3 1 4 4 4 5

22
Promedio: 3.6
 V. Caracterizacin y aislamiento de promotores y genes de banano

1 T-DNA

2 T-DNAs

3 T-DNAs
Crptico

.
23
V. Caracterizacin y aislamiento de promotores y genes de banano

Cul es la secuencia con actividad

promotora?
RT-PCR
RB LB
luc+-Tnos pe35S-neo-T35S

Transcripcin
Cap
Poly A mRNA

Sntesis
de cDNA

cDNA

RT-PCR

Producto amplificado

24
 V. Caracterizacin y aislamiento de promotores y genes de banano

Anlisis de la fusin transcripcional, RT-PCR

Pseudostem

Live LUC

Pseudotallo

Cormo

25
V. Caracterizacin y aislamiento de promotores y genes de banano

Son los promotores identificados activos?

Clonacin de promotores en el vector pCAMBIA 1391Z

Banano
26
V. Caracterizacin y aislamiento de promotores y genes de banano

Validacin de promotores identificados

Ubi
+
pLS25 -
Colonia
celular

+ + +++ -

Induccin de
embriones

+ + +++ -
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 V. Caracterizacin y aislamiento de promotores y genes de banano

Actividad de promotores
17-1 17-1 Ubi
Non
85-1
(1.74 kb) (1.35 kb) + (0.60 kb)
pES1 pES2 pLS25 transformed

Colonia
celular

Induccin
embriones

Hoja

Vitro
Pseudotallo
planta

Raz 28
 Agrobacterium-mediated transformation of banana ECS High-through put

Early in vitro development stage and low temperature

Luciferase
screening
Late in vitro development stage and low temperature

Southern blot analysis Isolation of T-DNA

flanking sequences
Molecular
characterization Physical linkage

in silico analysis of banana sequences

Transcriptional
fusion analysis RT-PCR

Back-
Cloning of candidate Back-transformation and
transformation
promoter sequences promoter activity analysis 29
Low-through put
 Conclusiones
Un sistema para la identificacin de promotores en
banano ha sido desarrollado.

El trampeo de promotores a travs del T-DNA es

confiable y reproducible en la caracterizacin y
aislamiento de nuevos promotores en banano.

30
 Perspectivas
Confirmacin de expresin en diferentes
estados de desarrollo de la planta y cultivares
de banano (y pltano).

Utilizacin en generacin de plantas de banano

genticamente modificados (bananos
cisgnicos).

31
 Agradecimientos

VLIR-ESPOL

Centro de Investigaciones Biotecnolgicas del

Ecuador (CIBE) -ESPOL

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View publication stats

Laboratory of Tropical Crop Improvement

KU Leuven

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