MARCO TEORICO:

La coloracin Gram cumple la funcin de la tincin simple y adems, permite la diferenciacin de las bacterias porque usan diferentes
colorantes que se comportan distinto segn el microorganismo en cuestin. La coloracin Gram es la ms usada en bacteriologa. Son
diferenciales, ya que se dividen en Gram positivas y gran negativas. Las primeras se tien de color azul violeta y las segundas adquieren
un color rosado o rojo.

Especiales o Negativa: se usan para objetivar distintas estructuras como la cpsula, el ncleo, los flagelos, los esporos, etc.

Tipo de tincin diferencial

Empleado en microbiologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas, tincin GRAM Debe su nombre al
bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884 este mtodo Se utiliza para referirse a la morfologa celular
bacteriana como para realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana.

BACTERIA GRAM POSITIVA Y NEGATIVA

Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus
paredes celulares.

La pared de la clula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de Peptidoglicano as como algo de cido
teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula gram-positiva es Peptidoglicano.

La pared de la clula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est
rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas.

Slo 10% - 20% de la pared de la clula gram-negativa es peptidoglicano.

Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una solucin de cristal violeta (otros colorantes bsicos no
son tan efectivos) y son lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las clulas, tanto las grampositivas
como las gramnegativas, estn teidas de azul

El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo-yoduro potsico. El ingrediente activo es aqu el I2; el KI simplemente
hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las
clulas grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situacin se llevaran cabo despus la decoloracin,
usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta.

Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen;La diferencia esencial entre
esos dos tipos de clulas est por tanto en su resistencia a la decoloracin; esta resistencia se debe probablemente al hecho de
que en el caso de bacterias gramnegativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la membrana exterior
de la pared de la clula (y tambin puede daar la membrana citoplsmica a la que se une Peptidoglicano).

La delgada capa de Peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la clula se decolora.
 Las clulas grampositivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen ms Peptidoglicano y menos lpido), no son
permeables al disolvente ya que ste deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo as el espacio entre las molculas
y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular.

Despus de la decoloracin las clulas grampositivas son todava azules, pero las gramnegativas son incoloras.

TCNICA DE TINCION GRAM

Existen variaciones de esta tcnica, pero en trminos generales, la tincin Gram involucra estos pasos:

1. Tincin inicial: Las clulas se tien con cristal-violeta. En este paso todas las clulas se tien de morado.

2. Mordiente: Se adiciona yoduro lugol que reacciona con el cristal violeta y forma el complejo: cristal violeta-yoduro. Las clulas
continan moradas.

3. Decoloracin: Se adiciona un solvente no polar, que acta lavando el complejo cristal violeta-yoduro de las clulas Gram negativas
(estas quedan incoloras). Este es el paso crtico, pues si se exagera, decolora las Gram positivas o de lo contrario, no decolora a las
Gram negativas.

4. Contratincin: Se vuelve a teir con Safranina o fucsina, de manera que las bacterias Gram negativas, que haban quedado
incoloras, se tien de rosado a fucsia, en tanto que las Gram positivas no se afectan con la contratincin. Basndonos en la reaccin a
esta tincin de las bacterias, stas se han clasificado, taxonmicamente hablando, en Gram positivas y Gram negativas. Las Gram
negativas son constantes en su reaccin, mientras que las Gram positivas pueden presentar respuestas variables frente a
determinadas condiciones. Para explicar el mecanismo de tincin se han propuesto varias hiptesis, fundadas en la naturaleza
qumica de la pared.
Cuestionario:

2. Que efecto traera reemplazar el lugol con otro agente oxidante

Ninguno ya que cumplira la misma funcin de incrementar la afinidad del colorante primario cristal violeta en la pared celular de la
bacteria formando complejos insolubles con este. El complejo cristal violeta y Yodo (componente del lugol), sirve para intensificar el
color del teido.

El lugol es un agente oxidante as que no se producira un efecto si es remplazado, siempre y cuando cumpla con el efecto que tiene el
lugol de tiene como componente el Yodo que es un acido dbil.

3.- Podra usted variar el colorante primario (cristal violeta) y el contraste (safranina) obteniendo los mismos resultados?

Las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que
posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta que se form previamente, y por lo tanto este
complejo se escapa, perdindose la coloracin azul-violcea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular ms
resistente y con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino que este acta
deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta, y manteniendo la coloracin azul-
violcea.

El colorante de contraste (la safranina) solo puede teir a las clulas vegetativas (decoloradas por el agua).

Si cambiamos el orden del colorante con del contraste por ejemplo de la muestra de Streptococcus sp se obtendran resultado la
coloracin del contraste ya que las bacterias del Streptococcus sp son gran positivas y retendran la primera decoloracin porque
poseer una pared celular ms resistente y con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del solvente
orgnico, sino que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse la primera decoloracin , y
manteniendo la coloracin primaria.
Discusiones
 Un factor que puede influir en que las bacterias Gram positivas se observen parcial o completamente rosadas, es la edad del
cultivo; las clulas viejas tienden a perder su capacidad de retener el complejo cristal violeta-yoduro y por lo tanto las bacterias
no se vern.

Otro factor de variabilidad podra ser las condiciones de estrs durante el cultivo que genera formas Gram negativas no viables,
dentro de un cultivo de bacterias Gram positivas.

Debe prestarse atencin a los lavados que se realizan agregando los diferentes reactivos, si se deja un exceso de agua en la
lmina los reactivos se diluirn, especialmente el yoduro.

Las clulas se tratan con alcohol por consiguiente las Gram positivas retienen el complejo cristal violeta yodo y permanece
azules mientras las clulas Gram negativas se decoloran. Esto puede ser debido a que el alcohol deshidrata la pared rica en
peptidoglucano de la Gram positiva y cierra los poros y no permite la salida del complejo lugol-cristal violeta y en Gram
negativas hay poco peptidoglucano y gran cantidad de lpidos y estos que son disueltos por la acetona lo que permite el
escape del complejo lugol-cristal violeta. Luego se aplica una contra tincin (safranina) de tal manera que las clulas Gram
negativas adquieren un color contraste y las Gram positivas de color violeta.

Bibliografa

Elba Rodrguez Prez. 2006. Manual de microbiologa oral. 2 edicin. Editorial MacGraw- Hill

Gamazo, C.; Lopez-Goi, I.; Daz, R. 2005. Manual prctico de microbiologa.3 edicin. Editorial Masson

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http://tumi.lamolina.edu.pe/bvbe/index.php/bases-de-datos-ban-unalm/Base de Datos Wiley. Identification and Classification of

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Prakash S. Bisen1, Mousumi Debnath2 and Godavarthi B. K. S. Prasad3 .Published Online: 11 JUL 2012.
DOI: 10.1002/9781118311912.ch4.