Micropropagacin

micropropagacin de cultivares de Rosa mediante tcnicas de cultivo in vitro.

Micropropagacin es el conjunto de tcnicas y mtodos de cultivo de tejidos utilizados para

multiplicar plantas asexualmente en forma rpida, eficiente y en grandes cantidades.1 La
micropropagacin se utiliza para multiplicar o propagar plantas nuevas, tales como aquellas
creadas por ingeniera gentica, mutagnesis o mejora gentica. Se utiliza tambin la
micropropagacion para obtener plantas libres de enfermedades (tales como virosis) u obtener
grandes cantidades de plantas que no se propagan eficientemente.

1Generalidades sobre los mtodos

2Fases del proceso de micropropagacin
o 2.1Preparacin de la planta madre
o 2.2Desinfeccin del material vegetal
o 2.3Introduccin del material in vitro
o 2.4Multiplicacin de los brotes
o 2.5Eleccin de un medio de enraizamiento de los explantos
o 2.6Aclimatacin de los explantos enraizados
3Referencias
4Enlaces externos

Generalidades sobre los mtodos[editar]

En la micropropagacin, a partir de un fragmento (explanto) de una planta seleccionada
(llamada planta madre), se obtiene una descendencia uniforme, con plantas genticamente
idnticas, denominadas clones. El explanto ms usado para los procesos de propagacin in
vitro son las yemas vegetativas de las plantas. Los frascos que contienen las plantas se
ubican en estanteras con luz artificial dentro de la cmara de crecimiento, donde se fija la
temperatura en valores que oscilan entre los 21 y 23 C, adems de controlar la cantidad de
horas de luz. Por su parte, el medio de cultivo se compone de una mezcla de sales minerales,
vitaminas y reguladores de crecimiento, azcar, agua y agar. La composicin del medio
depende de la especie vegetal y de la etapa del proceso de micropropagacin.
Fases del proceso de micropropagacin[editar]
Dentro del proceso de micropropagacin se pueden diferenciar varias fases o etapas:

1: Desinfeccin de las yemas de la planta y/o desinfeccin de semillas

2: Introduccin del material seleccionado in vitro
3: Multiplicacin de brotes
4: Enraizamiento
5: Aclimatacin
Esta secuencia de etapas abarca el ciclo completo de la multiplicacin de plantas in vitro y
puede ser aplicada a diferentes especies vegetales.
Preparacin de la planta madre[editar]
Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantos con
un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para obtener estos explantos es
recomendable mantener a las plantas madre, es decir la planta donante de yemas, durante un
perodo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses en un invernadero bajo
condiciones controladas. En ese ambiente se cultiva la planta en condiciones sanitarias
ptimas y con un control de la nutricin y riego adecuados para permitir un crecimiento
vigoroso y libre de enfermedades.2
Desinfeccin del material vegetal[editar]
Una vez elegida la planta madre, se extraern los fragmentos a partir de los cuales se
obtendrn los explantos. Los explantos pueden ser yemas, trozos de hojas, porciones de
races o semillas. Antes de extraer los explantos se har una desinfeccin de los fragmentos
de planta madre para eliminar los contaminantes externos. Los contaminantes ms comunes
son los hongos y las bacterias que habitan en forma natural en el ambiente. Una vez
desinfectado el material vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia. A efectos de
obtener tales condiciones, se trabaja en cabinas de flujo laminar para extraer los explantos a
partir del material vegetal. Estos explantes se introducirn en un tubo de cultivo conteniendo
medio de cultivo para poder controlar la sanidad y la viabilidad, luego de realizar la
desinfeccin del material con hipoclorito de sodio (agua clorada comercial), pura o diluida
durante un perodo de 5 a 15 minutos, seguido por 3 a 4 enjuagues en agua esterilizada.
Introduccin del material in vitro[editar]
Luego de la desinfeccin superficial, las semillas o las yemas dependiendo del material
seleccionado, se ponen en medio de cultivo estril. En un perodo de una semana o quince
das, comienza el proceso de germinacin o regeneracin de nuevos tejidos vegetales,
iniciando el ciclo de cultivo in vitro.
Multiplicacin de los brotes[editar]
Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron las fases anteriores originen
brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varias hojas. En la base de cada hoja hay una
yema que se desarrollar luego de ser puesta en contacto con el medio de cultivo.
Peridicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante
divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones
se realizan en la bolsa de flujo laminar o en un lugar aislado que nos permita mantener las
condiciones de asepsia. De esta forma aumenta el nmero de plantas en cada repique o
divisin de las plantas. El nmero de plantas que se obtiene depender de la especie vegetal
y de las condiciones del medio de cultivo. El nmero de plantas que se obtiene por la va de la
micropropagacin permite alcanzar incrementos exponenciales, considerando que todos los
factores que afectan el crecimiento hayan sido optimizados.
Eleccin de un medio de enraizamiento de los explantos[editar]
Para enraizar los explantos se utilizan principalmente plantines individuales de un tamao
aproximado de 2 cm. Los brotes obtenidos durante la fase de multiplicacin se transfieren a un
medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga hormonas del tipo de
las auxinas. Algunas especies de plantas no necesitan pasar por esta etapa y emiten sus
races en el mismo medio de cultivo donde desarrollan yemas nuevas, por lo tanto el proceso
de multiplicacin y enraizamiento transcurren en forma simultnea.
Aclimatacin de los explantos enraizados[editar]
Los explantos recin enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera
que el xito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatacin. En esta etapa las
plantas sufrirn cambios de diferente tipo que permitirn la adaptacin de las mismas a vivir
en condiciones naturales. En el momento en que se extraen los explantos o plantines
enraizados de los frascos, estn poco adaptados a crecer en un invernculo, ya que estos
explantes han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y
generalmente tienen estomas (estructuras responsables de regular la transpiracin y prdida
de agua en la planta) que no son completamente funcionales frente a descensos de la
humedad relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la desecacin del explante. Por
otra parte, crecer en ambientes tan hmedos tambin suele implicar la falta de una cutcula
con cera bien desarrollada, que representa la barrera fsica para evitar la prdida de agua a lo
largo de toda la superficie de la planta. Los plantines enraizados, deben ser aclimatados a las
condiciones de humedad del invernadero disminuyendo progresivamente la humedad relativa
e incrementando progresivamente la intensidad de luz. Estos plantines se plantarn en
contenedores (almacigueras) cubiertos por un plstico, para mantener la humedad relativa
elevada. La eleccin de un sustrato con buenas caractersticas fsicas, es clave para el xito
de esta etapa. Para el trasplante, elegimos un sustrato suelto, poroso, con mezcla de arena
turba, cscara de arroz quemado , para permitir un desarrollo y crecimiento de races muy
rpido. Las mezclas son diferentes y muy variadas de acuerdo a la especie con la que
estamos trabajando. Luego de retirar cuidadosamente el agar de las races para evitar
daarlas, los plantines se enjuagan y se colocan en almacigueras con la mezcla de sustratos
seleccionada y cubiertos con nylon. Todos los das se debe controlar el nivel de humedad en
las almacigueras. Si es necesario, se aplica un riego con una pulverizadora manual, para
mantener un ambiente hmedo a nivel del sustrato. A los 15 das del trasplante, se puede
comenzar a levantar la cobertura de nylon en las horas de menor calor( temprano en la
maana o en la ltima hora de la tarde). Al comienzo las plantas se dejan media hora por da
destapadas. A la semana siguiente se dejan destapadas durante una hora. Al mes del
trasplante, se dejan tapadas durante la noche y si hay crecimiento de nuevas hojas, las
plantas pueden permanecer destapadas. Las condiciones del cultivo in vitro , generan cambios
en algunos aspectos anatmicos y fisiolgicos de las plantas, por esta causa, durante la
aclimatacin, los cambios deben ser muy graduales, para minimizar el estrs y tener mayor
tasa de sobrevivencia.
 MICROPROPAGACION VEGETAL
Micropropagacin Vegetal

Ingeniero Agrnomo Jorge J. Namur

Auxiliar Docente de la Ctedra de Caa de Azcar

Laboratorio de Cultivo de Tejido Vegetal

Ctedra caa de azcar

FAZ- UNT

Como la etimologa de su nombre lo indica, consiste en la multiplicacin vegetal a partir de

pequeas porciones de tejido, incluso partiendo tambin de clulas aisladas, alude adems al
reducido espacio necesario para su prctica; mientras que la denominacin de Cultivo in
vitro hace referencia en forma ms amplia al cultivo en medio nutritivo, en recipientes de vidrio,
bajo condiciones estriles, de plantas, semillas, embriones, rganos, tejidos, clulas y protoplastos
de plantas superiores (pero tambin de clulas y tejidos animales). Cualquiera de estas porciones
de tejidos antes citadas a las que podemos agregar semillas, vulos y anteras, reciben el genrico
denominativo de explantes.

Cultivo de tejido vegetal: se refiere al cultivo in vitro de partes de la planta (tejidos o

frecuentemente rganos)

A travs de la micropropagacin, a partir de un fragmento (explanto) de una planta madre, se

obtiene una descendencia uniforme en condiciones de asepsia.

Este proceso de micropropagacin incluye cinco fases:

Fase 0) Preparacin de la planta madre (La fase 0 reviste gran importancia puesto que implica una
cuarentena para determinar el grado de sanidad de las plantas donantes. En esta etapa se realizan estudios
mediante pruebas serolgicas debido a que pueden ser portadoras de enfermedades endfitas que pasando
desapercibidas, se vuelven un problema en la etapa de la multiplicacin. Tambin es fundamental el
conocimiento cierto de su identidad gentica como as mismo su vigor: sanidad, identidad y vigor son
requisitos bsicos para la obtencin de cultivares confiables.)

Fase 1) Establecimiento del cultivo en condiciones de asepsia

Fase 2) Multiplicacin de brotes

Fase 3) Enraizamiento

Fase 4) Aclimatacin
 En 1974 Murashige defini cuatro fases dentro del cultivo in vitro:
Establecimiento del cultivo:
El cultivo de tejidos comienza a partir de trozos extrados de la planta
madre. Estos pequeos rganos o trozos de tejido se llaman explantos.
Las plantas que crecen en el medio natural estn contaminadas por
microorganismos (bacterias y hongos). Los explantos antes de ser
introducidos en el medio de cultivo han de ser esterilizados.
Posteriormente se introducirn en el medio a su vez estril y se
mantendrn all en condiciones aspticas.
Multiplicacin:
Una vez que la primera fase se ha completado con xito, comienza la
multiplicacin de los explantos. El explanto encuentra en el medio de
cultivo todo aquello que necesita para su crecimiento y desarrollo (agua,
elementos minerales, azcares, hormonas, etc.). Tras un perodo de
crecimiento (4-8 semanas) es necesario el subcultivo y paso a un nuevo
medio. Es en este paso donde se produce la multiplicacin de las plantas.
Enraizamiento:
Antes de llevar las nuevas plantas al exterior es necesario
proporcionarles una raz con la que sean capaces de realizar sus
actividades vitales una vez que se encuentren de nuevo en el medio
natural. La induccin de estas races se produce modificando ligeramente
las caractersticas del medio de cultivo adecundolas para la generacin
de races.
Aclimatacin: esta fase consiste en el paso de las plantas del cultivo al
medio natural. Este es un paso extremadamente importante, ya que si no
se realiza cuidadosamente se pueden perder gran nmero de plantas. Las
plantas en condiciones de cultivo estn en una atmsfera con alta
humedad y baja intensidad luminosa, por tanto el tejido epitelial se
caracterizar por tener menos ceras que protejan a las plantas contra la
deshidratacin. El acondicionamiento de nuevo al medio exterior se
efectuar por tanto cuidadosamente, utililizando para ello invernaderos.

 Historia

El fisilogo vegetal alemn Haberlandt dej sentadas las bases para el desarrollo de la
micropropagacin en 1902 al enunciar su teora de la toti potencialidad celular, la que dice que:
cualquier clula vegetal lleva intrnseca la potencialidad de reproducir a partir de s un individuo
idntico a aquel que le dio origen, lo que podra ocurrir a partir de una clula y an ms, aunque
esta proviniera de la raz por ejemplo, incluso granos de polen, llegaran a posteriori de sucesivas
divisiones bajo cultivo a reorganizar un individuo completo e idntico a aquel del cual proviene la
clula donante, salvo que tratndose de clulas sexuales como en el ltimo de los ejemplos citados,
la descendencia sera haploide por provenir de clulas sexuales. Hecho que reviste importancia en
el proceso de mejoramiento por la obtencin de individuos genticamente modificados.

En 1922 Knudson obtuvo la germinacin de simientes de orqudeas en medios sintticos

(cultivo asimbitico). Morel en 1960 sent las bases de lo que hoy se conoce como clonacin al
lograr sanear meristemas de Cymbidium (Orquidceas) contaminados de virus logrando a partir de
los mismos la proliferacin de masas de protocormos, los que pueden ser divididos y vueltos a
cultivar para regenerar nuevas plantas. Esto dio un gran impulso al cultivo de las mismas ya que los
sistemas tradicionales de multiplicacin vegetativa son extremadamente lentos.

Definicin
Se puede definir a la micropropagacin como: un conjunto de tcnicas heterogneas que
consiste en aislar y cultivar en medios de composicin conocida y en condiciones de asepsia un
explanto bajo temperatura, humedad y luz controladas.

Usos

La propagacin rpida en masa de clones (mejoramiento gentico)

El desarrollo, mantenimiento y distribucin de clones especficos probados para organismos

patgenos.

Es una herramienta imprescindible para la obtencin de individuos transgnicos.

Saneamiento y regeneracin de cultivares perennes(caa de azcar, ctricos, papa)

Etctera.

Desventajas
 Alto costo de instalaciones.

Necesidad de mano de obra altamente especializada y capacitada

Aparicin de mutaciones desapercibidas que podran multiplicarse a una escala elevada en corto
tiempo.

Tipos de regeneracin

Alargamiento de puntas de meristemticas

Produccin axilar de ramas

Iniciacin adventicia de ramas

Organognesis

Embriognesis

Instalaciones y equipamiento

Existen diferentes tipos de instalaciones de acuerdo a su propsito: podra tratarse de un

laboratorio de investigacin sobre la micropropagacin, lo que exige una importante inversin en
instrumental y tecnologa. O bien de un laboratorio con fines de multiplicacin comercial a gran
escala (se habla de fbricas de plantas o biofbricas) o bien de un pequeo laboratorio con fines
comerciales o de investigacin.

Pero bsicamente se necesitan para las operaciones de cultivo en cualquiera de los casos, tres y
hasta cuatro sectores si se incluye el de aclimatacin: rea de preparacin, rea de transferencia,
rea de cultivo y rea de aclimatacin.

rea de preparacin

Es en esencia una cocina donde:

Se limpian objetos de vidrio

Se preparan y esterilizan los medios de cultivo

Se almacenan y suministran los materiales de vidrio.

Debera contar con: refrigerador para conservacin de sustancias qumicas en especial hormonas
o reguladores de crecimiento, vitaminas y pequeas cantidades de medios de cultivo. Balanza
 analtica. Autoclave. Pehachmetro. Calentadores de gas o elctricos. Filtros para depuracin de
sustancias termolbiles. Destilador para provisin de agua.

rea de transferencia

Ambiente estril donde se realizan las operaciones para introducir los explantes en los medios de
cultivo. Al propsito, la Cmara de Flujo Laminar filtra el aire hasta eliminar sus impurezas y logra
un rea de trabajo asptica. Generalmente se utiliza luz ultravioleta para la esterilizacin del aire
del lugar de trabajo.

rea de crecimiento

Con control luminoso tanto de la intensidad (alrededor de 1000 lux de luz fra) como de la duracin
del fotoperiodo (generalmente de 16 horas). Control de la temperatura de cultivo que est en
general alrededor de los 25 C. Y la humedad ambiente en el interior de la cmara superior al 50%.
Se pueden usar tambin shaker o agitadores para la aireacin de los medios durante el cultivo en
medios lquidos.

rea de aclimatacin

Los nuevos individuos regenerados en el cultivo in vitro tendrn en un cierto tiempo el tamao
adecuado para abandonar esta etapa de cultivo y pasar a posteriori a condiciones de cultivo
normal de campo o in vivo. Pero durante la fase del CV las mismas estuvieron siendo tratadas casi
como organismos hetertrofos al suministrarles de manera exgena como constituyentes de los
medios de cultivo los hidratos de carbono que en condiciones naturales hubiera producido per se al
ser auttrofas. La luz no se suprime totalmente en esa fase para que la clula diferenciada no pierda
su capacidad fotosinttica.

Pero aclimatarlas presupone un desafo al tener que enfrentar condiciones de humedad muy
inferiores a las que existan en el interior de los vidrios donde era del 100 %, de temperaturas
variables diferentes a las constantes e ideales para el funcionamiento celular que era de 25C, y una
luminosidad muchas veces mayor a las que vena recibiendo.

Para este propsito la lgica nos lleva a suponer que debe haber un perodo de aclimatacin o
adaptacin hasta que los nuevos ejemplares acepten condiciones de cultivo estresantes.

Una instalacin para cumplir con este propsito ser un invernadero donde se pueda lograr
temperaturas controladas, humedecimiento por medio de un sistema de niebla automatizado y
 luminosidad que permita ir varindola desde un 10% al 100% de luz solar directa en forma creciente
y paulatinamente.

Equipamiento

Se habl de la cmara de flujo laminar, del autoclave, de balanza analtica, peachmetro, adems
son necesario los vidrios del tipo de instrumental de laboratorio para las mediciones de precisin
al elaborar los medios de cultivo y los botes propiamente dichos al que deben su nombre el sistema
de cultivo. Adems de la dotacin de drogas necesarias para suplir la necesidades en la preparacin
de los medios. Debe tenerse en cuenta que tambin como parte de este equipamiento se puede
incluir aire acondicionado para las cmaras de cultivo tanto como para el rea de transferencia que
debe tener una atmosfera lo ms aislada posible de las condiciones externas en las que la presin
de los inoculo de potenciales contaminantes del cultivo es muy elevada, como as tambin para el
mantenimiento de la temperatura en el rea de incubacin. Los sistemas de iluminacin de luz fra
llevan temporizadores automatizados.

MEDIO DE CULTIVO

Es la combinacin slida o lquida de nutrientes y agua. Incluye sales inorgnicas,

carbohidratos, vitaminas y aminocidos. Se le denomina Medio Basal y puede ser suplementado
con algn regulador de crecimiento y ocasionalmente con otras sustancias, segn las necesidades
de la etapa de cultivo.

Los nutrientes son esenciales para el crecimiento y desarrollo de la planta: sin agua y nutrientes
minerales una planta no puede vivir ni in vitro ni in vivo. Tambin se debe aadir azcares al
medio de cultivo, ya que las plantas (o sus fragmentos) no son completamente autotrficas
cuando se desarrollan en estas condiciones

Agua

Sustancias orgnicas: Azcares, Aminocidos, Vitaminas, Auxinas, Cito

quininas, Giberelinas, Acido abcsico

Macro elementos: N, P, K, Ca, S, Mg.

Micro elementos: Fe, Zn, B, Mn, Cu, Ni, Co, Al, Mo, I.
 Mezclas de sustancias:

Algunos compuestos empleados son sustancias orgnicas de composicin compleja tal es el

caso de: Extracto de levadura, leche de coco, extractos vegetales, hidrolizados de casena,
peptona y triptona

El medio MS, o de Murashige y Skoog (1962), es muy usado, particularmente para regenerar
plantas; existen numerosas variaciones comerciales de este medio a estas se las denomina con el
nombre de sus creadores y el agregado de modificado y el ao de creacin de esa modificacin.

El medio WPM (1980) de menor concentracin de sales est especialmente indicado para
especies leosas. Existen numerosos medios con variados propsitos.

Tipos de medios de Cultivo

Medio slido: es todo aquel que contiene un agente gelificante. La dureza del medio depende
de 2 factores:

PH

Composicin qumica del medio

El gelificante ms usados en el cultivo in vitro es el agar: Es una mezcla de polisacridos

extrados de un alga marina. La planta no puede digerirlo ni adsorberlo, y no interacta con los
componentes nutritivos del medio. El agar se funde a altas T (96 0C), solidifica alrededor de los
400C y no se degrada con la luz. Generalmente se utiliza a una concentracin de 0,6 - 1%. El
principal problema es su elevado costo

Medio lquido: sin adicionado de ningn gelificante.

Su uso ofrece las siguientes ventajas e inconvenientes respecto al uso de medio slido:

Facilita la absorcin de nutrientes por el explanto.

Es ms fcil la manipulacin para cambiar medios.

Cualquier exudado de la planta se diluye con mayor facilidad.

Algunas especies que crecen mal en medio lquido.

 Si resulta posible el cultivo en medio lquido, se debe considerar el problema de la aireacin. Se
puede cultivar el explanto parcialmente sumergido, y si se necesita una inmersin total se debe
utilizar un agitador.

El control del PH inicial del medio y de su dinmica durante el cultivo tiene una gran importancia
en el desarrollo de cualquier proyecto de cultivo in vitro.

A pesar de su importancia, en muchos experimentos este control se limita a fijar su valor inicial
sin reparar en los posibles efectos de su dinmica.

Tipos de cultivo in vitro

Las condiciones de cultivo pueden ocasionar la proliferacin desorganizada de las clulas del
explanto hasta dar lugar a un callo o incluso a un cultivo de clulas cuando se separan stas del
callo.

Si se elimina la pared celular de las clulas se obtiene un cultivo de protoplastos.

En otros casos se puede pretender la regeneracin de la planta completa (morfognesis)

mediante la formacin de races (rizo gnesis) y/o de tallos.

La morfognesis se produce a partir del explanto inicial mediante la formacin de races y/o
tallos en posicin normal o en posicin no normal (adventicias/os).

En estas etapas es comn el uso de hormonas vegetales o de reguladores de crecimiento.

La morfognesis puede ser:

morfognesis indirecta: se produce despus de la formacin de un callo

ste es un conjunto de clulas indiferenciadas. Recin a partir de ellas se regenera la nueva

planta.

morfognesis directa: se produce directamente del explanto sin que este pase por una fase de
callo

Embriones somticos: Surgen cuando en el explanto se producen unas estructuras bipolares que
presentan las propiedades morfolgicas de los embriones zigticos.
 Segn que estos embriones somticos surjan directamente del explanto o bien de un callo se
habla de embriognesis directa o indirecta, respectivamente.

Reguladores de Crecimiento, Hormonas vegetales

Se entiende por hormonas vegetales
aquellas substancias que son sintetizadas en un determinado lugar de la planta
y se translocan a otro, donde actan a muy bajas concentraciones, regulando
el crecimiento, desarrollo metabolismo del vegetal. El trmino "substancias
reguladoras del crecimiento" es ms general y abarca a las substancias
tanto de origen natural como sintetizadas en laboratorio que determinan respuestas
a nivel de crecimiento, metabolismo desarrollo en la planta.Las hormonas vegetales se clasifican en
cinco grupos:
1 Auxinas
2 Citokininas
3 Giberelinas
4 Etileno
5 Acido abcsico

Su empleo se realiza a veces de a una o en otros casos en una relacin variable segn la etapa
del cultivo

Eleccin del explanto

Se deben obtener explantes con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado para lo
cual es recomendable mantener a las plantas madre un perodo de tiempo que puede oscilar
entre unas semanas o varios meses, en un invernadero, en que se va a cultivar la planta en
condiciones sanitarias ptimas y con un control de la nutricin, del fotoperiodo y de la irradiacin
recibida. A estas plantas se las denomina plantas donantes.

Escogida la planta madre o donante, se extraern los fragmentos, los cuales son desinfectados
para luego obtener los explantes.

En condiciones de asepsia (en cabinas de flujo laminar) se extraern los explantes del material
vegetal y se pondrn en cultivo en un medio de iniciacin dentro de un tubo de cultivo, para poder
controlar la sanidad y la viabilidad de los explantes
 un cdigLa razn principal por la cual las clulas meristemticas son indemnes a los virus es que
el meristemo carece de tejidos vasculares, que es por donde se propagan los virus que van
contaminando a la planta. Existen otros factores:

El meristemo apical tiene una > velocidad de crecimiento y en consecuencia el virus "no
alcanza" al meristemo.

En una clula meristemtica el virus tiene > dificultad de acoplamiento con los ribosomas,
debido a que ests clulas tienen o de trabajo muy definido.

Cultivo de meristemas

Se usa principalmente con el fin de limpiar o liberar de virus cultivares afectados por
enfermedades virsicas.

Es el cultivo in vitro del meristema apical que como media mide 100x100 m ms los primeros
primordios foliares.

El cultivo de meristemas es un mtodo efectivo para la eliminacin de infecciones virales y es

el material preferido para la conservacin de germoplasma

La razn principal por la cual las clulas meristemticas son indemnes a los virus es que el
meristema carece de tejidos vasculares, que es por donde se propagan mediante el flujo de la
savia vegetal los virus que van contaminando a la planta. Existen otros factores que han intentado
explicar los mecanismos por los cuales la metodologa sirve para la liberacin de virus:

El meristema apical tiene una mayor velocidad de crecimiento en relacin a la eficiencia de

propagacin del virus y en consecuencia este "no alcanza" al mismo.
 En una clula meristemtica el virus tiene mayor dificultad de acoplamiento con los ribosomas,
debido a que ests clulas tienen un cdigo de trabajo muy definido.

Desinfeccin de explantes

Comienza generalmente con una inmersin o una aspersin con alcohol 70%, luego con un
lavado con detergente, una inmersin en hipoclorito de Na al 20 o 30 % para eliminar as los
patgenos superficiales. El tratamiento con el hipoclorito puede necesitar de unos treinta minutos
de inmersin con agitacin. Luego de remover algunas partes y ya en el interior del flujo laminar
se procede a despejar el explanto propiamente dicho que consiste en una porcin mnima de
tejido y se pasa ste por una segunda inmersin en hipoclorito al 5 % unos 10. Finalmente se
lavan con agua estril antes de colocarse en el medio de cultivo y comenzar su incubacin.

Siembra en Cmara de Flujo laminar

Consiste en una unidad de filtrado del aire al que expele por la presin producida por

un motor.

Ejemplos de inters agronmico

Aunque cualquier cultivo puede tener inters por diversas razones, en especial la de
mejoramiento gentico y tambin las de ingeniera gentica, pero es en especial en aquellos
cultivos perennes y de propagacin vegetativa en donde es de mayor importancia puesto que la
propagacin de enfermedades en estos casos es mayor. Tal es el caso de la caa de azcar, papa,
bananero, ajo, batata, orqudeas y muchos otros. En el caso de caa de azcar el declina miento
del cultivar se relaciona con los sistemas de cosecha que propagan las enfermedades virales y
bacterianas con las herramientas de corte y cosecha. La papa encuentra inconvenientes en la
presencia de insectos vectores o fidos que son los que propagan los virus en la plantacin y al
ser usadas luego como plantas semillas su multiplicacin se ve potenciada.
Consideraciones sobre la FASE 4: RUSTICACIN

Rusticacin

Segn la real academia espaola, rusticacin es el acto de rusticar, definiendo rusticar por:
 Salir al campo, habitar en l, sea por distraccin o recreo, sea por recobrar o fortalecer la salud.

En tanto que por Aclimatacin se acepta en un trmino ms amplio como un proceso por el cual
un organismo se adapta fisiolgicamente a los cambios en su medio ambiente, que en general
tienen relacin directa con el clima. Se suele usar este trmino para referirse a procesos que ocurren
durante un perodo corto, como la vida de un organismo individual o grupo. En algunos organismos
la aclimatacin ocurre en ciclos peridicos, como el crecimiento del pelo que experimentan algunos
mamferos durante el invierno. Algunos distinguen entre aclimatacin y aclimacin, entendiendo
que esta ltima hace referencia a un proceso forzado de adaptacin por medios artificiales. Por
ejemplo: el oso empieza en invernacin y se adapta al cambio de temperatura y debido a eso le
crece el pelo para mantenerse caliente todo el invierno y en primavera se le cae algo de ese pelo
para no calentarse mucho.

Por lo que al hablar de este proceso es ms preciso referirla al trmino rusticacin.

Por complejo que parezca lo relativo al cultivo in vitro, respecto a las condiciones de asepsia y
ambientales controladas en las que se realiza, muchas veces resulta fcil frente al desafo que pre
supone la llamada rusticacin.

Esta ltima etapa del proceso de multiplicacin in vitro consiste en adaptar plantas cultivadas por
perodo prolongados (entre seis meses a dos y ms aos) en cmaras de cultivo con condiciones
ambientales controladas, para RUSTICACION de por medio, lograr que se adapten a
tolerar condiciones ambientales estresantes. El proceso no puede realizarse bruscamente, sino que
por el contrario debe ser paulatino, so pena de perder todo el trabajo previo.

Plantas que venan al 10 % de la luz solar directa convendra pasarlas a un 20 % por un perodo de
entre quince das y un mes, o ms dependiendo de la especie, luego pasarlas a un 50 % de luz solar
por otro perodo de tiempo similar para finalmente llegar a exponerlas a pleno sol.

El tiempo ser variable, segn las especies cultivadas.

Durante el proceso de cultivo en cmaras de incubacin, las plantas son tratadas en contra de su
naturaleza auttrofa, alimentndoles con sacarosa en los medios de cultivo, o sea tratndolas como
hetertrofas. Al suministrarle sacarosa al medio de cultivo, la planta la tomar va celular
directamente del medio y respecto a la irradiacin lumnica que reciben, se reducen a apenas un 10
% de la existente en la atmsfera, tan solo como para que las plantas no pierdan su facultad
autotrfica ya que el resto de sus necesidades energticas las suple con la disponibilidad de sacarosa
 antes mencionada. Tambin el control del perodo luminoso en estas condiciones permite llevar a
diez y seis horas luz diarios continuo.

La humedad en interior de los frascos de cultivo est al lmite de la humedad de saturacin. Se

presupone que al noventa y nueve por ciento.

El proceso de rusticacin debe tener en cuenta que haremos el pasaje de plantas cultivadas en
condiciones artificiales estables y asepsia total a condiciones naturales variables y contaminantes
potenciales presentes.
Aclimatacin o Rusticacin

Plantas cultivadas in vitro Plantas rusticadas

Iluminacin

10 % luz solar directa 50 % a 100% de luz solar

Modo de alimentacin

Casi HETERTROFO AUTTROFO

Temperaturas de mantenimiento

25 C (+o - 2C) entre 0 y 40 C

Humedad relativa del aire

99 % 20% y 99 %

Sanidad de los medios de Cultivo

ESTERIL Altamente CONTAMINANTE

De hecho que un cambio drstico en las condiciones de cultivo ocasionara cuantiosas prdidas
y/o retrasos en el crecimiento de las plantas.

Por lo antes expuesto, se impone realizar el pasaje en forma gradual hasta que la planta se adapte
a las nuevas condiciones ex vitro.

El proceso de rusticacin debe comenzar con un sombreado en el invernadero del 80 %. Y la

introduccin de las mismas en una cmara hmeda al 99 % de humedad relativa con una
 temperatura sostenida mnima de 10 a doce grados centgrados, en especial si cultivamos plantas
de origen tropical (caa de azcar, orqudeas, cedros, etc.)

La presencia de riegos de ultra bajo volumen (tipo niebla) es recomendable para automatizar el
sistema con sensores de humedad para activar el riego.

Telas media sombra, cmaras hmedas tipo caja Ward. Calefaccin para el caso de especies
tropicales

La temperatura debe sostenerse para que no caiga por debajo de los diez grados en especies de
origen tropical como Caa de azcar ( Saccharum officinarum ) u orqudeas de invernadero clido,
Ejemplo: Phalaenopsis

Si la aclimatacin se ensaya en una cmara hmeda en el interior de un invernadero, las

oscilaciones trmicas se ven disminuidas en el interior de dicha cmara.

Es preciso abrir todos los das las cmaras hmedas para que se aireen y disminuya la humedad
en el interior.

Estos tiempos de exposicin tambin tienen que ser crecientes para ir logrando un
endurecimiento de los tejidos cultivados previamente in vitro.

Los medios de cultivo deben esterilizarse para disminuir la exposicin a posibles patgenos o
contaminantes.

Tambin el uso de fungicidas de suelos como el sulfato neutro de oxiquinolena, mantiene la

sanidad en los cultivos, an en medios de cultivos orgnicos.

Para indicacin general baste repetir que la rusticacin es un proceso gradual y paulatino, nunca
rpido, para lograr que plantas que estuvieron bajo condiciones controladas pasen a soportar las
condiciones variables de la atmsfera.