ESPECTROFOTOMETRA

Diversos mtodos de anlisis de material biolgico se basan en hacer reaccionar la

sustancia, que se ha de analizar, con otras sustancias (reactivos) para producir una
solucin coloreada, de tal manera que la intensidad del color pueda utilizarse como una
medida de la concentracin de dicha sustancia.

Este mtodo de anlisis cuantitativo se denomina Espectrofotometra y se basa en la

capacidad de las sustancias de absorber luz, a una longitud de onda () determinada, en
proporcin directa a la cantidad de materia presente.

Fundamento:

Los qumicos pueden utilizar virtualmente todos los tipos de radiacin electromagntica
para analizar materiales. En algunas tcnicas la radiacin es reflejada por las superficies;
en otras, la radiacin es transmitida y la radiacin remanente es absorbida. (Fig. N1)

La espectrofotometra se fundamenta en la relacin que existe entre la absorcin de luz

por parte de un compuesto y su concentracin. Cuando se hace incidir luz monocromtica
sobre un medio homogneo, una parte de la luz incidente es absorbida por el medio y
otra transmitida, como consecuencia de que la intensidad del rayo luminoso es atenuada
desde I0 a I, siendo I0 la intensidad de luz incidente y It la intensidad del rayo de luz
transmitido. Dependiendo del compuesto y el tipo de absorcin a medir, la muestra puede
estar en fase lquida, slida o gaseosa. En las regiones visible y ultravioleta del espectro, la
muestra es generalmente disuelta para formar una solucin.
 Fig N1 Absorcin de la energa radiante

Nota:

Cada sustancia tiene su propio espectro de absorcin, el cual es una curva que muestra la
cantidad de energa radiante absorbida, Absorbancia, por la sustancia en cada longitud de
onda del espectro electromagntico, es decir que a una determinada longitud de onda de
la energa radiante, cada sustancia absorbe una cantidad de radiacin que es distinta a la
que absorbe otro compuesto.

Fig N2 Espectro de absorcin de dos compuestos diferentes

Leyes fundamentales de la absorcin

1. Ley de Lambert:
Segn este fsico, la propiedad de ser ms o menos transparente para una
radiacin determinada es caracterstica de cada sustancia y depende de su
naturaleza. Se puede afirmar que para cada longitud de onda, la transparencia
(It/I0) es constante, siempre que la luz atraviese el mismo espesor de sustancia.
Es decir, esta ley establece que cuando pasa luz monocromtica por un medio
homogneo, la disminucin de la intensidad del haz de luz incidente es
proporcional al espesor del medio, lo que equivale a decir que la intensidad de la
luz transmitida disminuye exponencialmente al aumentar aritmticamente el
espesor del medio absorbente.
 I0 It

Fig N3 Esquema de la Ley de Lambert

Esta ley est representada por la siguiente frmula:

It/I0 = e-kb
Donde:

I0: intensidad de luz incidente

It: intensidad de luz transmitida

b: espesor del medio absorbente

K: constante cuyo valor depende de la naturaleza del soluto, de la longitud de onda

de la luz incidente, del espesor del medio absorbente y de la naturaleza del medio.

2. Ley de Beer:
La ley de Beer se enuncia diciendo que para una radiacin determinada, la
cantidad de luz absorbida es la misma cuando el producto de la concentracin por
el espesor permanece constante. Por tanto, la intensidad de un haz de luz
monocromtica disminuye exponencialmente al aumentar aritmticamente la
concentracin de la sustancia absorbente, cuando este haz pasa a travs de un haz
homogneo.
 I0 It

Fig N4 Esquema de la Ley de Beer

La relacin matemtica que verifica esta ley es:

It/I0 = e-kc
Donde:

I0: Intensidad de luz incidente

It: Intensidad de luz transmitida

C: concentracin de la solucin

K: constante cuyo valor depende de la naturaleza del soluto, de la longitud de

onda de la luz incidente, de la concentracin de la solucin, y frecuentemente
de la naturaleza del medio

Ambas leyes se combinan en una sola generando la Ley de Lambert-Beer.

Log (It/I0) = a.b.c A = a.b.c

Donde:

a: Absortividad

b: Longitud o espesor del medio (ancho de la cubeta)

 c: concentracin de la solucin

Finalmente, la cantidad de luz absorbida por la muestra es directamente

proporcional a la concentracin de la muestra (a mayor concentracin mayor
absorcin y menor transmisin) y al espesor del cuerpo atravesado por el haz
(ancho de la cubeta) (Fig N5). Dado que el coeficiente de extincin molar, , es
una constante para cada sustancia, y la longitud es tambin fija, la absorbancia
depende directamente de la sustancia. Esto se conoce como la ley de Beer y
Lambert.

Fig N5 Luz que atraviesa una cubeta

Nota:

Esta ley se cumple solo entre ciertos rangos de concentracin, que varan de una
sustancia a otra, por lo que debe comprobarse su aplicacin para cada
metodologa que se utilice. As por ejemplo, en una determinacin sangunea, la
ley de Beer y Lambert se cumple hasta una concentracin de 600 mg/dL de
glucosa, mientras que en la determinacin sangunea de triglicridos esta ley se
cumple hasta una concentracin de 1000 mg/dL de triglicridos.
El Espectrofotmetro

Mediante el espectrofotmetro se obtiene una medida del valor de la absorbancia de una

muestra a determinada longitud de onda. Los espectrofotmetros presentan cinco
componentes bsicos:

1. Fuente de luz:
Que puede ser tungsteno, infrarroja o de luz ultravioleta, dependiendo del
espectro en que se trabajar (visible, infrarrojo o ultravioleta, respectivamente). La
lmpara comn de filamento de tungsteno emite una luz que al pasar por un
prisma, se descompone en varios colores. Cada color transmite o refleja una
longitud de onda; el conjunto de todas estas es el espectro de luz visible que va de
380 nm a 700 nm.
2. Monocromador:
Para la seleccin de la longitud de onda que incidir sobre la muestra.
3. Celda o cubeta:
4. Detector:
Para medir la intensidad de la luz transmitida (porcentaje de tramitancia, %T) o
absorbida (absorbancia, A)
5. Sistema de lectura
Bibliografa

1. Silvia Quezada Mora. Manual de experimentos de laboratorio para bioqumica.

Primera Edicin. Costa Rica: Editorial Universidad estatal a distancia San Jos;
2007.
2. Poggio Mesorana. Espectrofotometra Aplicada a la Medicina. 1 Edicin.
Madrid: Real Academia de Medicina.
3. Armas Ramrez CE, Armas Romero CE, Das Camacho J. Tcnicas experimentales
Ciencia qumica. 1 Edicin. Per: Editorial Libertad EIRL; 1996