MICROBIOLÓGICO DE AMBIENTES, SUPERFICIES, OPERARIOS Y EQUIPOS
_____________________________________________________________________________ 1. PREPRARACION DE LA PRACTICA manos del estudiante, primero en las palmas, luego en los bordes de los dedos y sus comisuras, Para la preparación de esta práctica previamente finalmente en el borde de la uñas y por debajo de la técnica del laboratorio deberá asignar a los las mismas. Posteriormente se siembra en agar monitorios la preparación de los medios a MacConkey, se lleva a incubación a 35 ºC por 24 realizar, enfatizando en los reactivos y las horas. Se realiza lectura de coliformes y se cantidades de medios a preparar. reporta como coliforme en manos.
Los medios y materiales a preparar incluyen: 4. FROTIS DE GARGANTA
Agar Casoy® para control de ambientes Agar Sabouraud® para control de Con un baja lengua y un hisopo estéril ambientes. humedecido en agua peptonada 0.1% tomar la muestra de la parte posterior de la faringe, Agar McConkey para frotis de manos sembrar en agar sangre, incubar a 37 ºC por 24 a Agar Sangre para frotis de gargarganta 48 horas. Realizar lectura de colonias de Agua peptonada 0.1% para Streptococcus β-hemolíticos. Si se da crecimiento enriquecimiento de frotis de equipos y de colonia realizar coloración de Gram y prueba superficies. de catalasa. Hisopos estériles en 2 mL de agua COLORACION DE GRAM: peptonada 0,1% o caldo Casoy® para En un portaobjeto, con la ayuda de un asa se toma de muestra de equipos, realiza el extendido con una porción de la colonia superficies, garganta y manos. seleccionada, se adiciona una pequeña gota de Bajalenguas estériles para ayuda en la agua estéril o caldo si es necesario y después se toma de muestra de garganta. hace la fijación al mechero.
Se cubre la película con la solución de cristal
2. EJECUCIÓN DE LA PRÁCTICA violeta y se deja actuar por un minuto. Luego se lava el exceso de colorante con agua. 2.1. CONTROL DE AMBIENTE Se cubre la película con solución de yodo (lugol) y 2.1.1 RECUENTO DE BACTERIAS DEL AMBIENTE se deja por un minuto. Luego se lava el exceso de Abrir una caja de petri que contenga agar Casoy colorante con agua. en el lugar indicado del laboratorio, dejar abierto Se decolora con una mezcla alcohol-acetona por por 20 minutos, llevar a incubación a 35 y 37 ºC 10 o 15 segundos y se enjuaga con agua por unos por 24 a 48 horas; luego de las cuales observar e segundos para detener la acción del colorante. informar el número de colonias bacterianas Se cubre con safranina y se deja actuar por un presentes. minuto. Finalmente se lava con agua y se deja secar. 2.1.2 RECUENTO DE HONGOS DEL AMBIENTE Se realiza la lectura en microscopio a 40X y 100X Abrir una caja de petri que contenga agar usando aceite de inmersión. Sabouraud en el lugar indicado del laboratorio, dejar abierto por 20 minutos, llevar a incubación PRUEBA DE CATALASA: Se realiza trasladando a temperatura ambiente por 3-5 días; luego de una porción de la colonia a un portaobjeto y las cuales observar y se informa el número de sobre ella se adicionan unas gotas de solución de mohos y levaduras presentes. H2O2 al 3%. Lectura: La aparición de burbujas confirma la 3. FROTIS DE MANOS presencia de catalasa.
Con la ayuda de un hisopo estéril humedecido en
agua peptonada 0.1% se realiza un frotis en las
Código: PrCI-CM-DF-008 Fecha de Emisión: 28-03-2011
Versión: 01 PROTOCOLO CONTROL DE AMBIENTES MICROBIOLÓGICO DE AMBIENTES, SUPERFICIES, OPERARIOS Y EQUIPOS _____________________________________________________________________________ 5. CONTROL EQUIPOS esterilizar en autoclave a 121°C y 20 libras de presión por 15 minutos. En un equipo previamente determinado realizar Dispensar cajas de petri alrededor de un frotis dentro del equipo con un hispo 15ml de agar. humedecido en agua peptonada, llevar al tubo de ensayo que contiene 9mL agua peptonada, Agar sangre: Disolver 40 gr en 1 litro de esperar 15 minutos. Tomar una alícuota de 1ml y agua destilada, (realizar cálculos en caso disponer en una caja de petri, adicionar 15 ml de de requerir menor cantidad de Agar) y agar Casoy a 43 ºC (siembra en profundidad – caliente hasta ebullición. Luego requiera agar caliente-), incubar de 35 y 37 ºC por esterilizar en autoclave a 121°C y 20 48 a 72 horas. Contar las colonias y reportar. libras de presión por 15 minutos. Dejar enfriar a 45-50 °C, incorporar 5 a 8% de 4. CONTROL DE SUPERFICIES Delimitar un cuadrado de 10 cm en la superficie sangre desfibrinada. Dispensar en cajas de un equipo realizar un frotis con un hispo de petri alrededor de 15ml de agar. humedecido en agua peptonada, llevar a un tubo Agua peptonada 0.1%: Suspender 25 gr de ensayo con 9mL de agua peptonada, esperar en 1 litro de agua destilada (realizar 15 minutos tomar una alícuota de 1ml y disponer cálculos en caso de requerir menor en una caja de petri, adicionar 15 ml de agar cantidad) distribuir en tubos y esterilizar Casoy a 43 ºC (siembra en profundidad –requiere agar caliente-), incubar de 35 y 37 ºC por 48 a 72 en autoclave. horas. Contar las colonias y reportar.
PREPARACIÓN DE LA PRÁCTICA POR LOS
MONITORES
Agar Casoy®: Disolver 40g de Agar Casoy
en un litro de agua desmineralizada (realizar cálculos en caso de requerir menor cantidad de agar) y caliente hasta ebullición. Luego esterilizar en autoclave a 121°C y 20 libras de presión por 15 minutos. Dispensar cajas de petri alrededor de 15ml de agar. Agar Sabouraud®: Disolver 65g de Agar Sabouraud en un litro de agua desmineralizada (realizar cálculos en caso de requerir menor cantidad de agar) y caliente hasta ebullición. Luego esterilizar en autoclave a 121°C y 20 libras de presión por 15 minutos. Dispensar cajas de petri alrededor de 15ml de agar. Agar MacCONKEY®: Disolver 50g de Agar MacCONKEY en un litro de agua desmineralizada (realizar cálculos en caso de requerir menor cantidad de Agar) y caliente hasta ebullición. Luego
Código: PrCI-CM-DF-008 Fecha de Emisión: 28-03-2011
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RESUMEN DE MATERIALES Y CANTIDADES NECESARIAS PARA LA PRÁCTICA
CANTIDAD CANTIDAD POR MATERIAL ADICIONAL
CANTIDAD POR MATERIAL POR EQUIPO GRUPOS TOTALES QUE DEBE SER GRUPO (2 personas) (9 equipos de trabajo) LABORATORIO ENTREGADO Y UBICACION (5 grupos de laboratorio) (no está en puestos de trabajo) PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO MATERIALES Tubos de vidrio 16 x 160 mm En los cajones de vidriería del 2 18 90 material microbiológico con tapa Cajas de Petri En los cajones de vidriería del 6 60 300 material microbiológico Hisopos estériles En los cajones de vidriería del 2 18 90 material microbiológico Erlenmeyer de 1000 ml 2 2 2 Almacén de vidriería Erlenmeyer de 250 ml 1 11 11 Puestos de trabajo estudiantes Erlenmeyer de 100ml 1 5 5 Almacén de vidriería Agitadores 1 9 9 Puestos de trabajo estudiantes Guantes de carnaza 1 2 2 Puesto de monitores Pipetas volumétricas de 1 ml Estufa de esterilización (Área de 1 9 45 microbiología) Espátula 1 9 9 Puestos de trabajo estudiantes Frasco lavador 1 9 9 Puestos de trabajo estudiantes REACTIVOS Agar Casoy 1.92 g 19.2 g 96 g Nevera de medios de cultivo Agar Sabouraud 1.04 g 10.4 g 52 g Nevera de medios de cultivo Agar MacConkey 0.8 g 8g 40 g Nevera de medios de cultivo Agar sangre 0.72 6.4 32 Cajón de medios de cultivo Agua peptonada. 0.25 2.25 11.25 Nevera de medios de cultivo Sangre desfibrinada 1.6ml 14ml 70 ml Nevera de medios de cultivo EQUIPOS Balanza analítica 1 2 2 Esta en área de balanzas Planchas de calentamiento 1 2 2 Mesa 1 del laboratorio Balanza electrónica 1 2 2 Área microbiológica Autoclave 1 2 2 Zona de equipos Incubadora 1 1 1 Área microbiológica Estufa de esterilización 1 1 1 Área microbiológica Nevera 1 1 1 Área de equipos
Código: PrCI-CM-DF-008 Fecha de Emisión: 28-03-2011