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MONOGRAFÍA SOBRE Phytophthora infestans

(MONT) DE BARY

S O N I A JA R A M I L L O V I L L E G A S

Facultad de Ciencias Agropecuarias


Medellín, 2003
Tabla de Contenido

INTRODUCCIÓN ________________________________________________________ 1
CAPÍTULO I _____________________________________________________________ 4
TAXONOMÍA Y CLASIFICACIÓN _________________________________________ 4
1. POSICIÓN TAXONÓMICA DENTRO DE LOS ORGANISMOS VIVOS _________ 4
2. MORFOLOGÍA E IDENTIFICACIÓN DE LAS ESPECIES DE Phytophthora ______ 5
2.1. Micelio _____________________________________________________________ 6
2.2. Esporangios y Zoosporas _______________________________________________ 7
Morfología de las Zoosporas ________________________________________________ 8
2.3. Presencia de Clamidosporas _____________________________________________ 8
2.4. Órganos Sexuales _____________________________________________________ 8
3. FACTORES DEL AMBIENTE QUE INCIDEN EN LA CLASIFICACIÓN DE
LAS ESPECIES ___________________________________________________________ 8
4. TÉCNICAS MOLECULARES PARA DIFERENCIAR ESPECIES _______________ 9
5. CRITERIOS ÚTILES PARA DESCRIBIR O IDENTIFICAR ESPECIES DE
PHYTOPHTHORA _________________________________________________________ 9
CAPITULO II ___________________________________________________________ 11
ORIGEN Y MIGRACIONES DEL PATOSISTEMA Phytophthora infestans/ Solanum
tuberosum _______________________________________________________________ 11
1. ORIGEN DEL PATÓGENO Phytophthora infestans (MONT) DE BARY _________ 11
2. ORIGEN DE LA PAPA CULTIVADA (Solanum tuberosum) __________________ 12
3. MIGRACIONES Y EVOLUCIÓN DE LA PAPA CULTIVADA _______________ 12
4. ANTECEDENTES HISTÓRICOS DEL ORIGEN Y MIGRACIONES DEL
PATÓGENO P. infestans ___________________________________________________ 14
4.1. Teoría de Berkely (1845) y de Bary (1861). Origen en los Andes de Sur América. _ 14
4.2. Origen en el Centro de México. _________________________________________ 14
4.3. Evidencias que Soportan el Origen P. infestans en Papa en los Andes Suramericanos
_______________________________________________________________________ 15
4.4. Evidencias que Soportan la Teoría del Origen de P. infestans en el Centro de México
_______________________________________________________________________ 17
4.5. Teoría de las Migraciones Fry et al. (1992-93) y Goodwin et al. (1994) a Estados
Unidos y Europa. _________________________________________________________ 18
4.6. Teoría de las Migraciones de Bourke (1964), Tooley et al., (1989) y Andrivon (1996)
_______________________________________________________________________ 18
4.7. Migraciones Posteriores a 1970 _________________________________________ 19
4.8. Las Migraciones de 1980’s: México, Estados Unidos y Canadá________________ 20
4.9. Migraciones al Este de Asia ____________________________________________ 21
4.10. Migraciones en Sur América___________________________________________ 21
4.11. Una Nueva Migración de Colombia al Ecuador ____________________________ 21
CAPÍTULO III___________________________________________________________ 22
CARACTERIZACIÓN POBLACIONAL_____________________________________ 22
1. Tipo de apareamiento __________________________________________________ 23
2. Razas Fisiológicas_____________________________________________________ 25
3. Métodos Moleculares para la Caracterización de las Poblaciones ________________ 30
3.1. Patrones de Electroforesis de Proteínas Totales ____________________________ 30
3.2. Patrones isoenzimáticos (Aloenzimas) ___________________________________ 31
3.3. Análisis del Producto de la Trascripción (Northern blot) y la Traducción (Southern
blot)____________________________________________________________________ 33
3.4. Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción RFLPs para análisis de
los genomas nuclear y mitocondrial ___________________________________________ 34
3.5. Haplotipos Mitocondriales (RFLP-PCR)__________________________________ 35
3.6. Método AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) __________________ 41
3.7. Marcadores Microsatélites _____________________________________________ 42
3.8. ITS Regiones espaciadoras transcritas ____________________________________ 43
3.9. Nuevos cebadores (primers) para la detección de Phytophthora infestans por PCR_ 43
3.10. Marcadores de polimorfismo del DNA amplificado al azar ( Random amplified
polymorphic DNA, RAPD) _________________________________________________ 44
POBLACIONES DE P. INFESTANS REPORTADAS A NIVEL MUNDIAL ________ 44
CAPÍTULO IV ___________________________________________________________ 55
BIOLOGÍA DE PHYTOPHTHORA INFESTANS_______________________________ 55
1. Reproducción asexual __________________________________________________ 57
2. Reproducción sexual ___________________________________________________ 58
3. Ciclo de Vida de Phytophthora infestans ___________________________________ 61
CAPÍTULO V____________________________________________________________ 63
FUENTES GENÉTICAS DE RESISTENCIA A LA GOTA CAUSADA POR P.
INFESTANS _____________________________________________________________ 63
1. Resistencia Específica a Razas de P. infestans _______________________________ 65
2. Resistencia Parcial o Cuantitativa (Resistencia de Campo) _____________________ 68
3. Resistencia Sistémica Adquirida (SAR) ____________________________________ 72
4. Factores Posiblemente Involucrados en la Pérdida de la Resistencia de las Plantas a la
Gota____________________________________________________________________ 74
CAPÍTULO VI ___________________________________________________________ 76
PATOGENICIDAD ______________________________________________________ 76
1. Interacción de P. infestans con Plantas Altamente Susceptibles _________________ 81
2. Interacción de P. infestans con Plantas Altamente Resistentes y con Resistencia
Intermedia _______________________________________________________________ 82
3. Interacción de P. infestans con Plantas que Presentan Resistencia de Campo (sin genes
R) _____________________________________________________________________ 82
4. Desarrollo de la Interacción de P. infestans con Plantas no Huéspedes de P. infestans 83
5. Cómo Estimar la Resistencia de las Plantas a P. infestans? _____________________ 83
5.1. Pruebas moleculares para la detección de resistencia ________________________ 84
5.2. Pruebas de selección y evaluación de resistencia en plántulas bajo condiciones
controladas. ______________________________________________________________ 85
5.3. Preparación de las suspensiones de zoosporangios para la inoculación __________ 86
5.4. Pruebas de evaluación de resistencia en plantas bajo condiciones de campo ______ 87
Parámetros para estimar la resistencia de las plantas en el campo __________________ 88
CAPÍTULO VII __________________________________________________________ 92
CONTROL DE LA GOTA (TIZÓN TARDÍO) CAUSADA POR Phytophthora infestans
_______________________________________________________________________ 92
ELEMENTOS PARA EL MANEJO INTEGRADO DE LA GOTA DE LA PAPA ____ 93
1. Control Biológico _____________________________________________________ 93
2. Saneamiento _________________________________________________________ 93
3. Escape ______________________________________________________________ 94
4. Predicción ___________________________________________________________ 94
5. Otras prácticas de control cultural ________________________________________ 95
6. Control químico ______________________________________________________ 96
6.1. Normatividad para el Registro de Productos con Acción Fungicida _____________ 97
6.2. Fungicidas utilizados para el Control Químico de la Gota (tizón tardío) _________ 98
6.2.1. Protectantes _______________________________________________________ 98
6.2.1.1. Ditiocarbamatos __________________________________________________ 98
6.2.1.2. Phthalamidas ____________________________________________________ 98
6.2.1.3. Piridineaminas ___________________________________________________ 98
6.2.1.4. Compuestos trifeniltinas ___________________________________________ 99
6.2.2. Fungicidas Sistémicos_______________________________________________ 99
6.2.2.1. Carbamatos_____________________________________________________ 100
6.2.2.2. Derivados del Ácido Cinámico _____________________________________ 100
6.2.2.3. Cianoacetamidas-oximes (CYMOXANIL) ____________________________ 100
6.2.2.4. Fosfonatos _____________________________________________________ 101
6.2.2.5. Fenilamidas (METALAXYL) ______________________________________ 101
RESISTENCIA A FUNGICIDAS SISTÉMICOS CON ÉNFASIS EN LAS
FENILAMIDAS _________________________________________________________ 102
MÉTODOS PARA EL MONITOREO DE LA RESISTENCIA___________________ 106
1. Evaluación en discos de tubérculo (Tomado de Sedegui, et al., 1999 y basado en la
técnica de Kadish y Cohen, 1988). ___________________________________________ 106
2. Evaluación con discos de hoja flotando en la solución fungicida (Tomado de Sedegui,
et al.,1999 y Basado en la técnica descrita por Kadish et al., 1990). ________________ 106
3. Evaluación con hoja flotando en la solución fungicida (Tomado de Sedegui, et al, 1999
y Basado en la técnica descrita por Goth y Kean, 1997). __________________________ 107
ESTRATEGIAS PARA EVITAR RESISTENCIA A FENILAMIDAS_____________ 108
SINERGISMO ENTRE DIFERENTES FUNGICIDAS PARA EL CONTROL DEL
TIZÓN TARDÍO ________________________________________________________ 108
UN PROGRAMA PARA EL CONTROL QUÍMICO DE LA GOTA O TIZÓN TARDÍO
DE LA PAPA Y EL TOMATE _____________________________________________ 110
1. Efectividad de los productos fenilamidas/mancozeb (Inóculo natural) ___________ 110
2. Efectividad del control con propamocarb (Inóculo artificial)___________________ 110
3. Efectividad del control con Dimetomorf (Inóculo Natural) ____________________ 111
4. Efectividad del control con Fluazinam a intervalos de 10 días__________________ 111
5. Efectividad del control con Fluazinam a intervalos de 7 y 10 días_______________ 111
MEZCLAS DE FUNGICIDAS DE USO COMÚN PARA EL CONTROL DE LA GOTA
EN PAPA Y TOMATE EN COLOMBIA._____________________________________ 111
SISTEMAS EXITOSOS DE CONTROL QUÍMICO DE LA GOTA DE LA PAPA. __ 112
CONDICIONES PARA UNA ADECUADA APLICACIÓN DE FUNGICIDAS _____ 115
CAPÍTULO VIII ________________________________________________________ 116
PRONÓSTICO DE LA GOTA CAUSADA POR P. INFESTANS_________________ 116
BIBLIOGRAFIA ________________________________________________________ 120
MONOGRAFÍA SOBRE Phytophthora infestans
(MONT) DE BARY

Sonia Jaramillo Villegas I. A., M. Sc.


Profesora Asociada
Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín.
Departamento de Ciencias Agronómicas.
E mail: sjaramal@perseus.unalmed.edu.co

INTRODUCCIÓN

El Oomycete Phytophthora infestans, agente causante de la gota (tizón tardío) de la papa, ha


sido reconocido desde las épocas precolombinas, pero sólo a partir de 1845, se tomó conciencia
de su magnitud, dado que arrasó los cultivos que eran la base de la alimentación del pueblo
Irlandés, causando una gran hambruna que desencadenó en la muerte y la migración de una
cuarta parte de la población.

El control químico de la gota tiene efectos significativos en la rentabilidad del cultivo y la


contaminación del medio ambiente. Sin embargo, hasta el presente, es una de las herramientas
mas utilizadas y estratégicas, pues no se han establecido otros sistemas de control eficaces, ya
que la resistencia genética de las variedades de papa mas cultivadas comercialmente, no ha sido
estable y el patógeno evoluciona permanentemente, hacia poblaciones cada vez mas agresivas y
resistentes a los fungicidas de tipo sistémicos.

Es posible que su ubicación dentro del reino de los hongos, durante tantos años, haya retrazado
el proceso del conocimiento de la biología y el diseño de productos químicos mas apropiados
para el control de los oomycetes. Por otro lado, a partir de los años 1950’s, se estableció el Valle
de Toluca (México), como centro de origen del patosistema P. infestans / S. tuberosum, dado que
allí se reportó inicialmente la presencia de los dos tipos de apareamiento A1 y A2, lo cual permite
la propagación sexual y conduce a una mayor diversidad genética de P. infestans. Fue así como
México se constituyó en el centro de atención de los investigadores, descuidando el estudio de
este limitante patógeno en otros ecosistemas y cultivos.

A partir de los años 1980’s, el programa de tizón tardío de la papa (gota) del CIP (Centro
Internacional de la Papa), inició actividades de investigación en los Andes Suramericanos. Allí
se encontró gran cantidad de huéspedes en el Perú, (Abad, 1983), Ecuador (Ordoñez, 2000) y una
gran diversidad y agresividad del patógeno en Rionegro, Colombia, razón por la cual, se
consideró este lugar como el segundo sitio de diversidad de P. infestans, trasladando al Centro
Regional de Investigación “La Selva” del ICA, el programa de evaluación de los clones obtenidos
por los mejoradores de dicho centro.

1
El hallazgo reciente del tipo de apareamiento A2 de P. infestans, en especies silvestres de
solanáceas, en papa en Bolivia y ambos tipos de apareamiento en pepino (Solanum muricatum
(Alder et al. 2002) en el Ecuador, da indicios de que tanto el patógeno como las especies
huéspedes han coevolucionado en los Andes Suramericanos, razón por la cual es importante
hacer estudios detallados de aislamientos y caracterización de P. infestans procedentes de
diferentes zonas ecológicas y huéspedes, dado el amplio rango de adaptación de las especies
Solanum, donde la reproducción sexual pudiera ser parte importante del ciclo de vida en el
ecosistema andino.

Existe una gran preocupación mundial por el resurgimiento de nuevas poblaciones de P.


infestans, por el desconocimiento de los agricultores sobre las estrategias del control integrado y
la inestabilidad de la resistencia de las variedades, que podría conducir a epidemias de mayor
magnitud incluso que la de Irlanda. Esto es especialmente cierto para los países en desarrollo,
por lo que Turkensteen y Flier (2002) expresaron que tanto el Centro Internacional de la Papa
(CIP), como la comunidad Internacional que investiga en el tizón tardío, representada por el
GILB (Global Inititive on Late Blight) deberían realizar acciones que mejoren las estrategias de
manejo integrado del tizón tardío y faciliten los esfuerzos de los mejoradores, para en un futuro
contar con nuevas variedades, que tengan altos niveles de resistencia estables, que puedan
contrarrestar el incremento de los niveles de patogenicidad exhibidos por P. infestans.

Entre los componentes epidemiológicos se destaca el abandono de campos de cultivos sin


cosechar, lo cual se da por bajos rendimientos ocasionados por diferentes factores, las pilas de
tubérculos abandonados a la intemperie en vecindades a los campos de cultivos de papa, al igual
que los campos de cultivos de papa orgánica, como lo indican Zwankhuizen et al., (1998), con un
menor grado para los tubérculos-semilla y las socas o tubérculos que quedan en el campo. Sin
embargo, la dinámica de la gota de la papa y el tomate en las zonas templadas, es muy diferente a
la de las regiones paperas y/o tomateras en los países tropicales, razón por la cual se hace
necesario la investigación a nivel de ecoregiones.

Los cultivos de papa y tomate son muy importantes para Colombia, no sólo por lo que
representan para la seguridad alimentaria del país, ya que son básicos en la canasta familiar, sino
por la generación de mano de obra para las labores del cultivo, transporte, comercialización y
transformación industrial, que se traduce en mejor calidad de vida para las personas vinculadas de
manera directa o indirecta a dichas actividades y mayor desarrollo de los municipios, ya que
ambos cultivos hacen parte de las cadenas agroalimentarias (papa y hortalizas respectivamente),
lo que amerita todos los esfuerzos encaminados a entender la biología y el control del patógeno
P. infestans, que causa la principal enfermedad de estos cultivos, gota o tizón tardío, entre otras
denominaciones regionales.

Los avances en los conocimientos de la bioquímica, fisiología y morfología de las plantas


huéspedes y los estudios genéticos y moleculares del patógeno, han proporcionado una
información sobre las relaciones huésped-patógeno en este patosistema, especialmente en lo
relacionado con la identificación de genes elicitores y el establecimiento de rutas metabólicas
involucradas en las reacciones de defensa de las plantas al ataque de P. infestans, dando la
oportunidad según Kamoun (2002), de entrar a la era posgenómica, para ligar una secuencia
genética a un fenotipo, usando herramientas computacionales, para planear ensayos con alta
efectividad, que permitan el uso de nuevos genes de Phytophthora que disparen una variedad de
respuestas celulares y moleculares en las plantas y se empiece a establecer conexiones
funcionales, entre los genes de Phytophthora y sus procesos en las plantas.
2
En tal sentido es necesario impulsar la investigación sobre la interacción huésped-patógeno, que
incluyan tanto los huéspedes de uso comercial, como los alternos (Alder et al., 2002) en
diferentes zonas ecológicas, para entender los mecanismos involucrados en dicha relación e
interpretar el comportamiento del patógeno en el campo, a su vez con el análisis de los factores
epidemiológicos, con el fin de desarrollar programas de manejo integrado de la gota de la papa, el
tomate, el lulo y el pepino, en las diferentes regiones donde se cultivan para evitar el desarrollo
de las epidemias.

El presente trabajo es producto de la investigación que se ha venido realizando en la


universidad por mas de ocho años y una amplia revisión bibliográfica de las investigaciones que
se han venido realizando a nivel nacional e internacional. Se expresa los agradecimientos por los
aportes financieros a la Universidad Nacional de Colombia, COLCIENCIAS, FEDEPAPA,
CORPOICA, CIBA GEIGY (hoy SYNGENTA) y CEVIPAPA. Se destaca la asesoria de
investigadores del programa de fitopatología del Centro Internacional de la Papa (CIP) y el apoyo
de profesores y estudiantes de la Universidad Nacional de Colombia y de la Universidad de
Antioquia, en la ejecución de sus trabajos de grado y tesis, algunos de los cuales han sido objeto
de reconocimiento por la Asociación de Fitopatología Colombiana (ASCOLFI).

3
CAPÍTULO I

TAXONOMÍA Y CLASIFICACIÓN

1. POSICIÓN TAXONÓMICA DENTRO DE LOS ORGANISMOS VIVOS

En la presente sesión me permito presentar una discusión basada en los textos preparados por
Raven, Evert y Eichhorm (1999) y Erwin y Ribeiro (1996), con la siguiente ubicación:

REINO Cromista (grupo Stramenophyle)

PHYLUM Oomycota

CLASE Oomycete

SUBCLASE Peronosporomycetidae

ORDEN Pythiales

FAMILIA Pythiaceae

GÉNERO Phytophthora

ESPECIE infestans

El Phyllum Oomycota, perteneciente al reino Cromista, comprende mas de 700 especies, las
cuales no tienen pigmentos fotosintéticos, poseen dos flagelos en las zoosporas y los gametos
masculinos, con paredes formadas por celulosa o polímeros similares a celulosa y tienen hábitos
acuáticos y terrestres, aunque siempre necesitan la presencia del agua.

Por sus formas filamentosas parecidas a hifas, se agruparon originalmente como hongos.
(Raven, Evert y Eichhorm, 1999), lo que luego fue confirmado por las filogenias moleculares,
basadas en las secuencias del RNA ribosomal, datos de los aminoácidos compilados para las
proteínas de la mitocondria y cuatro proteínas que codifican para los genes cromosómicos,
evidenciando que los Oomycetes adquirieron la habilidad de infectar las plantas de manera
independiente de los hongos verdaderos (Kamoun, 2002).

Los Oomycetes, están mas relacionados con las algas, dado que presentan meiosis en los
gametangios, por lo tanto sus núcleos vegetativos son de naturaleza diploide. Son conocidos
como organismos “heterocontes”, lo que significa que poseen flagelos en las zoosporas con
longitud y ornamentación diferente. Los flagelos se presentan en pares, un flagelo largo y
adornado con nastigonemas (pelos) distintivos (plumosos) y un flagelo mas corto, delgado,
cilíndrico y en forma de látigo o flecha.

Las características que diferencian el género Phytophthora de los hongos se basan en la


morfología de las crestas mitocondriales (tubulares) y la bioquímica de las paredes celulares, las

4
cuales contienen microfibrillas de celulosa con una matriz amorfa de B’ 1-3 glucano en vez de
quitina, carencia de hipoxidación del esqualene a esteroles y diferencias en las vías metabólicas,
como resultado de un sistema genético único (Griffith et al. 1992, cit. por Erwin y Ribeiro, 1996).

Los análisis de las secuencias moleculares de la subunidad 18S del rDNA (ribosomal) han
confirmado que los Oomycetes, están estrechamente relacionados con las Crhysophytas,
Diatomeas y algas cafés, pero se separaron relativamente temprano de las formas pigmentadas.
(Raven, Evert y Eichhorm, 1999). Foster (1990) observó que las secuencias de la subunidad 18S
del rDNA son similares entre las algas fotosíntéticas heterocontes y miembros del género
Phytophthora. Al comparar las secuencias de la subunidad 28S rDNA, encontraron poca
sustitución de nucleótidos entre los seis grupos de Phytophthora, mostrando gran homogeneidad
y por lo tanto poca utilidad de esta región para los análisis filogenéticos. (Briand, 1995, citado
por Smart et al., 2000).

Al analizar el gen de la familia actina Bhattacharia y Stickel (1994) citados por Smart et al.,
(2000), encontraron que todos los miembros de Oomycota contienen dos tipos de actina, los
cuales probablemente surgieron por una duplicación del gen, que ocurrió después de la
divergencia de los Oomycetes y las algas cromofitas.

La mayoría de las especies de Oomycetes se reproducen sexual y asexualmente: la


reproducción asexual, es por medio de las zoosporas móviles cuyos flagelos son característicos y
distintivos de las especies. La reproducción sexual es oogámica. El gameto femenino (oogonio)
es relativamente grande, en forma de huevo no flagelado y es fecundado por el gameto masculino
(anteridio) que es notablemente mas pequeño y flagelado.

En los Oomycetes, uno o muchos huevos se producen en una estructura denominada Oogonio.
El anteridio contiene numerosos núcleos masculinos. La fertilización resulta en la formación de
un zigoto con paredes gruesas (la Oospora, que le da el nombre al Phyllum Oomycota) que
puede entrar en estado de reposo y tolerar condiciones de estrés, permaneciendo inactiva o en
reposo, cuando las condiciones no son favorables para la germinación.

Las esporas asexuales (zoosporas) son producidas en el “esporangio”, de manera mas precisa el
zoosporangio. Los esporangios se desarrollan sobre los esporangióforos, los cuales son similares
en diámetro a las hifas. En algunas especies emergen nuevos esporangióforos a través de las
bases de esporangióforos viejos, de las cuales se han liberado zoosporas uninucleadas.

Un grupo grande de este Phyllum son acuáticos, algunos saprófitos y otros son parásitos, que
causan enfermedades en peces y sus huevos. Otros son terrestres como los géneros Phytophthora
y Pythium estrechamente relacionados y pertenecen a la familia Pythiaceae, los cuales causan
enfermedades en las plantas, pero requieren del agua líquida para la movilidad de las zoosporas
en el suelo o en el follaje.

2. MORFOLOGÍA E IDENTIFICACIÓN DE LAS ESPECIES DE Phytophthora

La identificación de algunas especies de Phytophthora, parece ser relativamente simple, pero


las diferencias morfológicas con otras especies del mismo género son tan pequeñas y algunas
características tan variables, que incluso los expertos consideran que el género es difícil de
clasificar, mas aún para los que no están relacionados con la taxonomía de este grupo. Por esta

5
razón es necesario acudir a las técnicas de patrones isoenzimáticos y RFLPs de DNA nuclear y
mitocondrial, para diferenciar las especies. (Waterhuose et al. 1983, citado por Erwin y Ribeiro,
1996).

Rosenbaum (1917) citado por Erwin y Ribeiro (1996), estableció una primera clave para
separar 11 especies de Phytophthora, utilizando características como el tipo de anteridio, la
prominencia de las papilas sobre el esporangio, el tamaño y la relación longitud y ancho del
esporangio, la presencia y tamaño de las clamidosporas y el tamaño y abundancia de las
oosporas: El tamaño de los esporangios no parece ser relevante, dado que éste varía con las
condiciones de crecimiento (Leonian y Geer,1929, citados por Erwin y Ribeiro,1996).

Tucker, 1930, (Citado por Erwin y Ribeiro, 1996), además de la morfología, utilizó la fisiología
y la patología, en las que incluyó la habilidad para crecer en ciertos medios, el tipo de anteridio,
la presencia o ausencia de órganos sexuales, la naturaleza de las papilas (especie de trompo
compuesto de un material hidratado, con un índice de refracción diferente al material de la pared
celular de las hifas), la presencia de clamidosporas, la patogenicidad, el tamaño de la oospora, la
presencia de hinchamientos hifales, las temperaturas mínima, óptima, y máxima para el
crecimiento y la especificidad patogénica.

Posteriormente, se publicaron muchas otras claves sobre especies de Phytophthora, pero la


clave taxonómica producida por Waterhouse (1963) (citado por Erwin y Ribeiro, 1996), fue la
primera en ubicar las categorías de las especies en grupos morfológicos y parámetros
fisiológicos, lo que significó un gran avance en la taxonomía de Phytophthora, la cual es muy útil
y aún aceptada.

Dichos parámetros incluyeron patrones de ramificación de los esporangióforos; ápice del


esporangio; abundancia de esporangios sobre medio sólido; la caducidad del esporangio; la
proliferación interna de esporangios; la producción de oogonios y oosporas en un solo cultivo
(homotálico) o en diferentes cultivos (heterotálico); naturaleza del anteridio; abundancia o
ausencia de oosporas en los tejidos huéspedes o en el cultivo y para ciertas especies, forma del
esporangio y sus dimensiones. Otras características incluidas en la identificación de ciertas
especies son: relación longitud-ancho, esporangióforos, hinchamientos hifales, presencia o
ausencia de clamidosporas, tamaño del oogonio, ornamentación de la pared del oogonio,
especificidad del huésped y rangos de temperatura mínima, óptima y máxima para el crecimiento.

2.1. Micelio

Las estructuras somáticas (talos) de Phytophthora son llamadas micelio y están compuestos de
filamentos, “hialinos” (hifas) ramificados y cenocíticos (no septados), excepto en cultivos viejos,
en los cuales algunas veces se pueden observar septas. En cultivos jóvenes, el citoplasma fluye
libremente dentro del micelio. El diámetro del micelio (5-8 micras) es variable y depende de la
naturaleza física y química del medio y de si el micelio está sobre la superficie aérea, sumergido
o dentro de las células huéspedes. En ocasiones el micelio se esponja, se vuelve nudoso o
tuberculado y raras veces crece simétricamente (Erwin y Ribeiro, 1996).

Las hifas se ramifican en ángulos aproximados de 90 grados y algunas veces se constriñen en la


base. Aunque hay especies que tienen patrones de micelio característicos, éstos no son lo

6
suficientemente útiles para diferenciar especies; como tampoco lo son el crecimiento y la forma
de la colonia y el hinchamiento de las hifas (Erwin y Ribeiro, 1996).

2.2. Esporangios y Zoosporas

Los esporagios son esporas asexuales que se producen sobre pedúnculos llamados
esporangióforos, los cuales difieren ligeramente de las hifas vegetativas, su desarrollo es
indeterminado y se ramifican simpodialmente, lo cual es propio de Phytophthora infestans. Los
esporangios se diferencian porque en Phytophthora cada uno tiene un pedúnculo, cuya longitud
varía con la especie, en rangos de medio a corto como en P. infestans, en el cual pueden liberar
hasta 36 zoosporas (Sansome 1976, citado por Abad, 1983).

Los esporangios varían en forma y tamaño. Las formas son algo diferentes para una especie en
particular, pero son a menudo variables en el rango: De esféricas, subesféricas, ovoides,
ovalovoides, elipsoides, limoniformes (P. infestans), periformes, obperiformes (en forma de pera
invertida), turbinadas (como un trompo), obturbinadas (trompo invertido). La diferencia de
tamaño puede estar afectada por la luz, los esteroles y los medios nutritivos. Los esporangios
miden entre 29x19 a 59x31 micras (Waterhause, 1963, citado por Erwin y Ribeiro, 1996).

El patógeno P. infestans, produce hinchamientos característicos arriba de la zona donde se


desprende el esporangio. En algunas especies el esporangióforo reinicia el crecimiento a través
de la base de los esporangios evacuados; el nuevo esporangio puede proliferar adentro de las
paredes de uno vacío (proliferación interna) o el esporangióforo puede crecer hacia afuera y salir
por el poro de esporangios anteriores y formar el próximo esporangio a alguna distancia del
último (proliferación extendida).

El engrosamiento apical sobre el esporangio, el cual tiene forma de limón, se denomina papila,
de cuyo extremo emergen las zoosporas. El espesor de esta estructura varía entre especies. La
especie P. infestans es semipapilada o sea con una cavidad superficial, cuyo poro es
generalmente estrecho.

Es difícil interpretar la diferencia entre un esporangio semipapilado de uno no papilado. Los


esporangios coloreados con azul de algodón (0.01%) en lactofenol, o rojo de bengala (50 mg/ml)
podrían diferenciar el engrosamiento apical del protoplasma. Las coloraciones basadas en
lactofenol son utilizadas debido a la conservación de los montajes que pueden ser preservados en
un herbario para futuros estudios, pero a menudo se encogen los protoplasmas que están dentro
de los esporangios, lo que puede evitarse por el uso de azul de algodón o azul-tripano en cloruro
de sodio al 0.85%; sin embargo, estas coloraciones no preservan el espécimen (Erwin y Ribeiro,
1996).

Los eventos de una secuencia básica que conduce a una formación de zoosporas dentro del
esporangio y la disolución de la boca apical, antes de la emisión de las zoosporas a partir de los
esporangios, es igual para todas las especies. La caducidad del esporangio y la longitud del
pedicelo son factores importantes y únicos para ciertas especies. Las especies no papiladas no
son caducas o deciduas (Erwin y Ribeiro, 1996).

P. infestans y P. phaseoli son las únicas especies con esporangios que se desprenden y son
arrastrados por el aire o el agua. En el aire seco los esporangióforos de P. infestans, se retuercen

7
y doblan, para descargar los esporangios en el aire, como sucede con los esporangios de
Peronospora, lo que les da una ventaja epidemiológica.

Morfología de las Zoosporas

El aparato flagelar típico de las zoosporas posee dos flagelos uno en forma de látigo y el otro en
forma de pluma. La zoospora está conformada por varias partes: el kinetosoma (cuerpo basal de
la zoospora), la zona de transición que une el flagelo con el kinetosoma, y el sistema del
microtúbulo, que permite anclar el flagelo a la zoospora.

Los anclajes (como raicillas) de los flagelos de P.infestans, son significativamente diferentes,
pues sólo tiene cinco “raicillas”, mientras que otras especies tienen seis. Una de las “raicillas” de
las zoosporas de P. infestans contiene seis microtúbulos en comparación con otras especies que
sólo presentan cuatro. Esta característica podría ser útil para diferenciar P. infestans, ya que
parece ser única en el género (Erwin y Ribeiro,1996).

2.3. Presencia de Clamidosporas

Muchas especies no producen clamidosporas, incluyendo P. infestans. Además la morfología


de la clamidospora no es muy útil para diferenciar especies, por lo tanto, no es una característica
importante, excepto en P. macrochlamydospora, en la cual las clamidosporas son grandes y
características (Erwin y Ribeiro, 1996).

2.4. Órganos Sexuales

Los procesos sexuales involucran la producción del oogonio y el anteridio, los cuales surgen de
las puntas del micelio que se contactan. Si el oogonio crece sobre el anteridio, éste se denomina
anfiginio y si el anteridio rodea al oogonio, en su parte basal cerca al pedicelo, se conoce como
paraginio. En Pythium el anteridio rodea completamente el oogonio. La posición del anteridio
(paraginio o anfiginio) es una característica importante de diagnóstico. En Phytophthora
infestans el anteridio es anfiginio (Erwin y Ribeiro, 1996).

3. FACTORES DEL AMBIENTE QUE INCIDEN EN LA CLASIFICACIÓN DE


LAS ESPECIES

Dentro de los factores fisiológicos la temperatura, la humedad relativa y la luz son importantes
para diferenciar ciertas especies de Phytophthora, entre las cuales está incluida P. infestans, que
crece bien a temperaturas promedio de 18 ºC, con 1.300 microwatios por cm2 de luz en medio
agar-centeno y alta humedad relativa. En general se ha reportado que la radiación solar es el
factor que mas afecta la germinación de los esporangios, posiblemente por los efectos de la luz
ultravioleta (Erwin y Ribeiro , 1996; Sunseri y Johnson, 2002).

8
4. TÉCNICAS MOLECULARES PARA DIFERENCIAR ESPECIES

La adaptación de la tecnología de biología molecular, se ha constituido en una herramienta


importante para confirmar la validez de las especies determinadas utilizando características
morfológicas porque permiten detectar posibles diferencias genéticas que se desarrollan por la
evolución relativamente rápida del patógeno, debido a la eficacia patogénica en muchos
huéspedes, que en ocasiones no son acompañadas de cambios morfológicos.

Al comparar las secuencias de los ITSI e ITSII (regiones espaciadoras internas transcritas) de
los seis grupos morfológicos descritos por Waterhouse en 1993, se demuestra que el
agrupamiento propuesto, coincide con las características morfológicas establecidas (Cooke y
Duncan,1997, citados por Smart et al, 2002). Sin embargo, dentro de un mismo grupo, como es
el caso del grupo IV, las especies P. infestans, P. mirabilis y P. phaseoli son indiferenciables por
la técnica de los ITSII, pero sí por análisis de haplotipos mitocondriales. Los otros miembros del
grupo: P. elicis, P. colocasiae y P. hibernalis se pueden diferenciar directamente utilizando
marcadores ITS (Tooley et al, 1998, citados por Smart, 2002).

5. CRITERIOS ÚTILES PARA DESCRIBIR O IDENTIFICAR ESPECIES DE


PHYTOPHTHORA

Los criterios que se citan a continuación han sido tomados casi textualmente de Erwin y
Ribeiro, 1996, por considerarlos de gran utilidad en la presente monografía.

Esporangios: no papilados, semipapilados ( P. infestans) o papilados.

El ancho del poro de salida sobre el esporangio.

La persistencia o caducidad (P. infestans) del esporangio y la longitud del pedicelo corto
(menos de 5 micras) para P. infestans.

Forma y tamaño del esporangio.

La relación longitud-ancho del esporangio.

El esporangióforo: no ramificado, irregularmente ramificado, en un simpodio simple (con


ramificación compuesta simpodial nudoso; Ho 1992; Ho et al.1995 para P. infestans, citados por
Erwin y Ribeiro, 1996) complejo o en umbela; Se forman nuevos esporangios internamente
(proliferan).

Oogonio: tamaño y forma.

Oogonio: ornamentación de la pared.

Oosporas: diámetro y espesor de la pared celular.

Oosporas: pleróticas o apleróticas.

Anteridio: Anfiginio, paraginio o ambos.

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Anteridio: unicelular y/o bicelular.

Anteridio: tamaño y forma.

Homotálico: produce oosporas en un solo cultivo.

Heterotálico: produce oosporas solamente o principalmente cuando se une con un tipo de


apareamiento opuesto, tipo de apareamiento A1 o A2 (P. infestans).

Temperaturas adecuadas para el crecimiento: óptima, mínima y máxima (por debajo de 30


grados centígrados).

Hinchamiento hifal: simple, catenulado o closterado.

Clamidosporas: terminal, intercalar, lateral o sésil.

Patrón de crecimiento en cultivo con agar: petaloide, arrosetado, en estrella,irregular, denso o


ligero.

Hifas: lisas, onduladas, enrolladas o coraloides.

Sistema de ramificación hifal (Ho, 1978, citado por Erwin y Ribeiro, 1996).

Producción de pigmentos. En un medio con caseína tirosina-hidrolizada (Sheperd, 1976, citado


por Erwin y Rtibeiro, 1996).

Patogenicidad: un solo huésped o muchos huéspedes.

Perfiles de proteína (Gill y Zentmyer, 1878; Erselius y Shaw, 1982; Erselius y de Vallavielle,
1984; citados por Erwin y Ribeiro, 1996). No reportado para P. infestans

Patrones isoenzimáticos: para P. infestans (Spielman et al., 1989, 1991, citados por Erwin y
Ribeiro, 1996).

Patrones de Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) del DNA.


Para P. infestans (Goodwin, 1990, 1992, citado por Erwin y Ribeiro, 1996).

10
CAPITULO II

ORIGEN Y MIGRACIONES DEL PATOSISTEMA Phytophthora infestans/


Solanum tuberosum

1. ORIGEN DEL PATÓGENO Phytophthora infestans (MONT) DE BARY

Phytophthora significa “destructor de plantas” y la especie infestans, es el agente que causa el


tizón tardío (gota) de la papa, el cual tiene varios sinónimos. Erwin y Ribeiro (1996), hacen una
amplia discusión sobre la historia de este patógeno y la enfermedad que afecta la papa.

Según los autores antes indicados, Matius de Prusia en 1842, lo llamó Gangraena tuberum
solani, cuando por primera vez describió el hongo que causó la enfermedad que devastó el follaje
y los tubérculos de papa en casi toda Europa. Informa Bourke, 1993 (citado por Peterson, 1995)
que los reportes de Matius de Prusia fueron considerados como “una herejía” y que el Reverendo
Berkeley de Inglaterra interesado en el estudio de la patología de las plantas, revisó el reporte
inicial de Prusia, lo tradujo y lo publicó en el “Gardener’s Chronicle”, dado que sus estudios
coincidieron con el punto de vista de dicho investigador.

Según Bourke (1991) citado por Erwin y Ribeiro (1996), hubo muchas teorías para explicar la
nueva enfermedad que apareció en la papa en Europa Continental, las islas Británicas, pero la
mayoría de los comentarios se basaban en el mal clima (tiempo lluvioso y polución industrial).
Hacia 1845, Morren de Bélgica escribió varias cartas en las que sostenía que un hongo era la
causa del tizón en la papa, teoría fuertemente controvertida.

Después de algunas dudas Montagne aceptó la teoría de Morren y con la información que tenía
decribió el género Botrytis infestans, el cual conocemos hoy como Phytophthora infestans, que
fue confirmada posteriormente por Antony de Bary 1876. (Erwin y Ribeiro, 1996).

Los europeos ya conocían otros “males” que afectaban la producción de la papa


(encrespamientos y pudriciones secas) desde 1760’s, que los condujo a reemplazar las semillas
degeneradas, introduciendo nuevos materiales importados por distintos puertos de manera oficial
o extraoficial, ingresando nuevas variedades de Norte y Sur América, utilizadas en ensayos de
campo entre 1843-1845, posibilitando el ingreso del agente causal de la gota, enfermedad
observada en dichos campos (Daly, 1996).

P. infestans es la especie mas conocida por causar la enfermedad denominada como tizón tardío
(gota) que produjo una tremenda destrucción de los cultivos de papa en Irlanda hacia los años
1840s, con efectos inmediatos de pobreza y hambruna, que condujeron a profundos cambios
sociales y económicos en ese país, a la reducción de la cuarta parte de su población por la muerte
de un millón de personas y la migración de otro tanto. Ninguna otra enfermedad de plantas ha
causado tan amplia dispersión humana e impacto social (Erwin y Ribeiro, 1996; Daly, 1996).

Desde entonces se han propuesto varias teorías en torno al origen del patógeno P. infestans,
puesto que la gota fue observado por primera vez en cultivos de papa cerca a Filadelfia alrededor

11
de 1843 y para 1845 estaba esparcido por casi todo el noreste de Norte América y en el verano de
ese año apareció en el noroeste de Europa (Daly, 1996).

Dado que el patógeno fue asociado inicialmente con la papa, cultivo básico en la alimentación a
escala mundial, tomó gran importancia el estudio del patosistema Phytophthora infestans/
Solanum tuberosum, dentro de un contexto de coevolución.

2. ORIGEN DE LA PAPA CULTIVADA (Solanum tuberosum)

El antropólogo Engel (1964) citado por Estrada (2000) encontró fósiles de papa con una
antiguedad verificada de aproximadamente 10.000 años, al sureste de Perú y noroeste de Bolivia,
alrededor del Lago Titicaca, coincidiendo con la conclusión de Hawkes, sobre su domesticación
en dicha región a partir de Solanum leptophyes, que originó la primera especie cultivada Solanum
stenotomum (2x=2n) diploide.

Luján (1996) afirma que la papa se originó a 3.800 msnm, 17º 94’ de latitud sur y 68º 03’ de
longitud oeste. Las condiciones climáticas actuales corresponden a un clima seco con
deficiencias de lluvia en todas las estaciones. Temperatura promedio de 13,1 ºC. Precipitación
promedio (seis años) anual de 376,1 mm. Alta luminosidad a cualquier hora del día,
especialmente en las tardes cuando soplan vientos fuertes y helados.

Dichas condiciones son desfavorables para el desarrollo del patógeno P. infestans causante de
la enfermedad, conocida como tizón tardío o gota de la papa, especialmente por la alta
lumimosidad, puesto que se ha encontrado que los esporangios reducen en un 95% la
germinación, con una hora de exposición a alta intensidad de la luz solar (Sunseri y Johnson,
2002).

Según Hawkes, citado por Estrada (2000), otras papas silvestres comenzaron a evolucionar en
México, y algunas migraron a Suramérica cuando se formó el puente terrestre en la época
geológica del plioceno, hace tres millones de años. Luego ocurrieron migraciones de regreso a
México en forma de grupos de especies tetraploides (2n=4x=48) y hexaploides (2n=6x=72).

3. MIGRACIONES Y EVOLUCIÓN DE LA PAPA CULTIVADA

Dado que la migración de la papa está asociada a la posible migración del patógeno P.
infestans, se ha considerado importante, presentar las rutas de migración de dicho tubérculo.

Hawakes y Ortega (1992), citados por Estrada (2000), indican que el primer registro de
exportación de papa a Europa fue encontrado en Sevilla (España), el cual indica que la papa
llegó en 1570, procedente de tubérculos de la subespecie andigena, recolectados en la parte
central de Colombia (Bogotá o páramos cercanos) y transportados por el Río Magdalena hasta
Cartagena y de allí a las Islas Canarias. Se compraba en el mercado de Sevilla en 1580 y fue
llevada por Drake o Roberg a Inglaterra en 1590.

Según Robertson (1991, citado por Abad y Abad (1995), la papa fue introducida a
Norteamérica a través de las Islas Bermudas en 1663, en tubérculos procedentes de Inglaterra,
pero sólo se volvió cultivo importante en 1718 con la llegada de los irlandeses presbiterianos.
Hay reportes sobre su cultivo en la India en 1772-1775 (Mc Intosh, 1927) en Formosa en 1650 y
12
en China en 1700 (Laufer, 1938). Inicialmente se introdujo la subespecie Solanum tuberosum
ssp. andigena, la cual sólo tuberiza en días cortos, condición que se presenta al final del año en
Europa (Abad y Abad, 1995).

Entre el descubrimiento, la introducción y el cultivo de la papa en Europa, pasaron por lo


menos dos siglos a través de los cuales, se desarrolló la subespecie Solanum tuberosum ssp.
tuberosum, adaptada a las condiciones de la zona templada de Europa, caracterizadas por días
largos en el verano, con altas temperaturas e intensidades luminosas y días cortos en el otoños
con bajas temperaturas que favorecen el proceso de tuberización. Hoy se sabe que con los
métodos genéticos modernos, es posible lograr el cambio de una subespecie a otra en pocos años
(Estrada, 2000).

Las diferencias entre las dos subespecies condujeron recientemente a conformar dos especies:
S. tuberosum y S. andigena, separadas geográficamente por latitud y altitud, diferencias
morfológicas de los tallos (menor número de brotes secundarios, el tamaño y número de los
estolones en S. tuberosum) y follaje (reducción de la disección foliar) y diferencias fisiológicas,
en cuanto a fotoperíodo y temperatura. La especie tuberosum posee, además, por lo menos siete
factores de esterilidad citoplasmática (Estrada, 2000).

Daly (1996) indica que hubo movimientos de semilla entre los países europeos e importaciones
de norte y sur América alrededor de 1840’s, para reemplazar los materiales que estaban
presentando reducción en las producciones. Grun et al. (1977), citados por Estrada (2000) tienen
evidencia de que los clones cultivados en América del Norte y Europa, descendieron de nuevas
importaciones de Solanum tuberosum de Chile, en los cuales ocurrió el cambio de los materiales
movilizados por las civilizaciones indígenas de los Andes hacia el Sur de Chile. Dichas
importaciones se realizaron debido a la pérdida de materiales de papa como consecuencia de la
epidemia de tizón tardío (gota) que se presentó en Europa entre 1843-1845.

Una nueva fuente de diversidad genética se presentó en Europa por la posterior introducción de
la especie Solanum demissum, por su resistencia a la gota y porque produce mayores
rendimientos, cuando se cruza con S. phureja. Cerca del 83% de las variedades alemanas tienen
genes de S. demissum y 26% de otras especies silvestres. Igualmente el Reino Unido, Escocia y
Estados Unidos hicieron cruces con S. demissum (Estrada,2000).

La aparición de nuevas razas de P. infestans que vencieron la resistencia conferida por Solanum
demissum, condujo a la búsqueda de nuevas fuentes de resistencia, con énfasis en resistencia de
campo (por genes menores o cuantitativa) proporcionada por especies silvestres o nativas de la
zona andina. La variedad Monserrate, obtenida por los doctores Julia Guzmán y Nelson Estrada
en 1955, por un cruzamiento entre un cultivar de S tuberosum y S. andigena, es uno de los casos
mas representativos y de gran importancia a nivel mundial.

Estrada (2000) opina que “la contribución de las especies de papas silvestres procedentes de
Colombia, Venezuela, América Central y México a la evolución de las papas cultivadas fue
menor, por la escasa resistencia al tizón tardío (Phytophtora infestans) y a la marchites bacteriana
(Pseudomonas solanacearum hoy ubicada en el género Ralstonia) del material suramericano”.
Esto da indicios de que el origen del patógeno puede ubicarse en especies solanáceas, originadas
en zonas ecológicas diferentes a la zona de domesticación de la papa.

13
Sin embargo, Abad et al. (1995) consideran que un alto número de formas de papas de la
especie Solanum andigena ssp andigena del Perú han sido utilizadas para obtener resistencia
durable, al igual que otras especies con resistencia parcial como S. phureja, S. stenotomun,
S.acaule, S. Bukasovii. Además con resistencia vertical se han reportado las siguientes especies
silvestres del género Solanum: S. chiquidenum, S. chomatofillum, S. irosinum, S.leptophyes,
S.marinasense, S. mochiquence, S. piurae, S. paucissectum, S. sparcipilum. Igualmente reportan
resistencia parcial en varias especies de tomates silvestres, originarias del Perú.

Se han reportado mas de 200 especies silvestres de papa, de las cuales por lo menos 140
pertenecen a Sur América. Estas con sus variantes y clones de cada una, constituyen mas de
2.105 clones. El Centro Internacional de la Papa (CIP) conserva mas de 5.000 variedades nativas
y 1.500 colecciones de papas silvestres, y todas se pueden cruzar con las ocho especies
cultivadas, debido a que no tienen diferencias básicas estructurales en los cromosomas y las
convierten en un reservorio de genes de valor incalculable por su resistencia y adaptación a
factores bióticos y abióticos (Estrada, 2000; Abad et al., 1995).

4. ANTECEDENTES HISTÓRICOS DEL ORIGEN Y MIGRACIONES DEL


PATÓGENO P. infestans

4.1. Teoría de Berkely (1845) y de Bary (1861). Origen en los Andes de


Sur América.

Esta teoría supone que el patógeno se había originado en los Andes como centro de origen de la
papa y desde allí fue introducido a Europa. Esta teoría se basó en los documentos del Padre
Jesuita José Acosta en 1590, quien en su libro “Historia Natural y Moral de las Indias”, se refirió
al término añublo (brand melthaw) de las papas en las montañas de Perú y Bolivia.

Abad y Abad (1995) señalan que el coronel Acosta (1845) en carta a Boussingault, indica que
“las papas son nativas de los Andes, pero jamás los indios se alarmaron con los daños causados
por el mal de la papa, el cual se presenta en la sabana de Bogotá en los años lluviosos, y es una
especie de champiñón que se desarrolla en diferentes puntos y que corroe mas o menos
profundamente los tubérculos, reduciendo la producción en un 8% y la pérdida de un 33% en el
almacenamiento por un rápido contagio. Dicho mal, es endémico en las cordilleras”.

La teoría es reforzada desde 1995-2002 por Abad y el grupo de trabajo en tizón tardío (gota) de
la papa del CIP, gracias a las investigaciones bibliográficas y de campo que empezaron a realizar
a partir de 1977. En estos trabajos se reportaba un incremento en el número de especies (106)
afectadas por dicho patógeno de manera natural o artificial (por inoculaciones), las cuales tienen
su origen en los Andes del Perú y pertenecen principalmente a los géneros Solanum y
Lycopersicon de la familia Solanaceae (Abad, 1983; Abad et al., 1995).

4.2. Origen en el Centro de México.

Según Abad y Abad (1995), Reddick (1928), cuestionó la veracidad de los registros históricos
arriba señalados, basado en la carencia de términos técnicos y por ende en la posible confusión
generada en la interpretación de la palabra “añublo”, especialmente por parte de Acosta Coronel
de la Armada. A su vez Andrivon (1996), considera que hay muchos factores que interactúan y
14
que pueden presentarse síntomas de pudriciones de tubérculos o muerte del follaje, en los cuales
la gota es apenas un componente de los diversos factores complejos.

Abad y Abad, (1995), señalan que el primer reporte de gota en Sur América se hizo en Solanum
muricatum (pepino) por Lagerhein (1890) en el Ecuador, situación interpretada como una
introducción de Europa, puesto que no se conocían reportes de la enfermedad en esta zona. Esta
enfermedad fue observada en dicho país, en ese mismo año en Solanum caripense y Petunia
hybrida. Luego Pachano (1919-1920) la reportó en papa y pepino.

Esta teoría ha sido ampliamente apoyada por varios grupos de trabajo destacados a nivel
mundial en la investigación de este patógeno, que incluye las Universidades de Cornell,
Washington, Wageningen, Sunchon, la USDA_ARS y el Instituto de Investigaciones de la papa
en Polonia, quienes de manera conjunta prepararon el documento “Historical and Recent
Migrations of Phytophthora infestans Chronology, Pathhways, and Implications” (Fry et al.
1993).

La primera evidencia cronológica reportada en el Noreste de Estados Unidos en 1843 y los


datos genéticos de las poblaciones son consistentes con la hipótesis de que P. infestans sufrió el
fenómeno genético denominado “cuello de botella” al pasar de México a Estados Unidos y de allí
hacia Europa, generándose poblaciones muy simples dominadas prácticamente por un solo linaje
clonal, aunque en Estados Unidos se han reportado varios linajes clonales después de los años
1990’s.

Los estudios del grupo de Niederhauser en los años 1950’s, registraron la reproducción sexual
en las zonas altas del Centro de México, al descubrir una nueva forma del patógeno que la
denominaron A2, la cual se podía aparear con la forma A1 originalmente conocida. Hacia los
años 1980’s se reportó la forma A2 en Suiza y posteriormente en varios países de Europa y otros
continentes, posiblemente introducida desde México en un cargamento de 25.000 toneladas de
papa en 1976 (Fry y Goodwin,1995).

4.3. Evidencias que Soportan el Origen P. infestans en Papa en los Andes


Suramericanos

Según Abad (1983); Abad y Abad (1995), dicha enfermedad fue observada durante la
dominación española en 1762-1767 de acuerdo con el reporte “Trasactions of the Viceroy of
Santafé de Bogotá”, reportado a la Asociación Americana de Agricultura, en The Gardner’s
Chronicle,1847. Posteriormente informado por el Consul Pazos de Bolivia en Londres en
comunicación a la Academy of Royal Society of Bruxelles, indica que las fuertes lluvias
provocan en las plantas una sustancia parásita, que según él, es un hongo o animal o zoofito, pero
que mantiene los síntomas idénticos a los observados en Europa en ese año y que causan el
decrecimiento de las plantas.

D’ Orbigny explorador en Suramérica en comunicación a The Society Centrale d’Agriculture


de France (Roze, 1898) dice que los Aymaras que viven en la vecindad de La Paz, conocen desde
tiempos remotos la enfermedad que atacó las papas en el año de 1845. En 1878, García Merino
reportó que una gran “epidemia de hielo”, había afectado los cultivos de papa, tomate y pepino de
agua en los valles costeros de Lima y Lurín, en 1868, la cual había sido observada en años
anteriores sin causar daños severos. (Abad y Abad, 1995)

15
Luján (1996) indica que el agricultor Pedro Pardo informó en 1861, que los tubérculos de la
variedad tuquerreña, nativa de Colombia, fueron afectados con gota, en Chipaque Cundinamarca.
En 1864 se observó por primera vez un campo de papa criolla (Solanum phureja) devastado por
la gota antes de floración; y en 1865 la enfermedad se difundió a toda Cundinamarca de manera
agresiva, excepto en Usme (con alturas superiores a 3.000 msnm).

Tales observaciones coinciden con Acosta (1845) citado por Abad y Abad (1995) quien indica
que los cultivos de papa se realizan en las partes altas de los Andes, donde se practica el
principio de “escape” a la enfermedad. Es posible que esta condición hubiese demorado las
apariciones de esta enfermedad en los tiempos de la conquista y la colonización española.

Se decía que la gota había llegado a Colombia en 1861 con un material introducido de Holanda,
y de allí había pasado a Ecuador en 1865 y a Perú y Bolivia en 1947. Esta creencia desconoce los
registros históricos de la enfermedad en Sur América y las descripciones realizadas por indígenas
“Aymarás”, los cuales son conocidos como los domesticadores de la papa en las montañas
peruano-bolivianas.

Abad (1983) observó que 17 (de los 19) cultivares de papa del Perú evaluados, fueron
extremadamente susceptibles a P. infestans, los dos restantes presentaron alta susceptibilidad a
cuatro aislamientos, mientras que la variedades Mexicanas Rosita y Atzimba, presentaron alta
resistencia a todos los aislamientos.

El pepino (Solanum muricatum) presentó la raza 1,4,10,11 de P. infestans, la cual fue detectada
posteriormente en cuatro aislamientos colectados en papa a la par con las razas 0, 10,11; 1,3,7 y
1,4,11 (no patogénicas a pepino) pero se desconocen las causas de tal variación (Abad,1983,
Abad et al., 1995).

Marín y Mira 1998 y Jaramillo et al. (1998), observaron gran diversidad de razas en los
aislamientos procedentes de plantas de pepino (Solanum muricatum), tomate (Lycopersicum
esculentum), papa criolla (Solanum phureja) que crecían de manera silvestre en las orillas de los
caminos o en huertas caseras en el departamento de Antioquia, Colombia. Cada aislamiento
constituía una raza, poco compleja (con pocos diferenciales afectados), mientras que aislamientos
procedentes de monocultivos de papa, en zonas frecuentemente cultivadas, presentaron pocas
razas, pero mas complejas (véase tablas 1 y 2 mas adelante).

Phytophthora infestans ha sido endémico de las zonas paperas de los Andes Suramericanos por
miles de años, y la confusión se debe a la semántica de los nombres locales. Se encontró una
gran variabilidad del patógeno en la Sierra del Perú, posiblemente debida a cambios somáticos
generados por parasexualidad, puesto que solo encontraron el tipo A2 en dos aislamientos. Dado
que la papa, el pepino, posiblemente el tomate y muchas solanáceas silvestres tuberíferas tienen
su origen en el Perú, el origen de este patógeno debe estar en algún lugar de los Andes Peruanos
(Abad, 1983) o suramericanos puesto que en Ecuador se han reportado nuevas poblaciones en
otras solanáceas silvestres (Oyarzún et al., 1998).

Por otro lado Abad et al., 1995, indican que de las seis formas de DNA mitocondrial
reportadas, la forma C sólo ha sido observada en un aislamiento del Perú, el cual corresponde al
haplotipo denominado I-c por Ordoñez et al., (2000) en el Ecuador y se presenta en la población
EC-3 de S. betaceum (tomate de árbol).

16
Los aislamientos peruanos son muy simples en diversidad de marcadores moleculares
incluyendo aloenzimas (Gpi 86/100, Pep 92/100) y “finger printing” (huellas dactilares) del DNA
nuclear (25 loci), similares a las poblaciones viejas de Europa y Estados Unidos. Igualmente los
aislamientos colectados en 1983 y 1987 (26 en el Norte, 33 en el Sur) presentaron pocas razas
patogénicas con predominio de la raza cero (r0) en las partes altas del sur en ambos años, lo que
indica la ausencia de genes de resistencia de la especie S. demissum en las variedades de papa
nativas de dicha zona.

Sólo dos aislamientos del Norte de los Andes se autofertilizaron. La rareza del tipo de
apareamiento A2 en el Perú, puede ser explicada por la “selección estabilizante” que es
favorecida por un balance perfecto entre el huésped y el patógeno en los Andes. (Abad et al.,
1995).

Puesto que la aparición de ambos tipos de apareamiento, se reportaron en Japón desde 1937, Ko
(1994) citado por Abad et al., (1995), sugiere que la aparición del tipo A2 en diferentes países, se
puede deber a que un aislamiento tipo A1 que emigró, puede autorevertirse a A2 para producir
una oospora, o por un cambio de su forma original A1 a la forma A2, inducida por el
envejecimiento, exposición a fungicidas o por estrés del medio ambiente.

4.4. Evidencias que Soportan la Teoría del Origen de P. infestans en el


Centro de México

Fry y Goodwin (1995), Andrivon (1996) presentan un resumen crítico sobre la historia y
evidencias científicas que apoyan el origen de dicho patógeno en el Centro de México.

La aparición de la forma sexual del patógeno, reportada por Niederhauser en 1953, la cual no
había sido observada en ningún otro lugar. (En Japón en 1937, Ko citado por Abad et al., 1995).

La presencia de las dos formas A1 y A2 en igual frecuencia.

La población del patógeno, especialmente en el Valle de Toluca México, presenta diversas


características de virulencia.

Se han detectado todos los alelos enzimáticos conocidos hasta el presente

Las poblaciones de dicha localidad contienen todas las bandas de finger printing del DNA

Los genes de resistencia específicos a razas son más frecuentes en el Centro de México que en
los Andes de Suramérica, ejemplo que se presenta en Solanum demisum.

Según Fry et al. 1993, Matuszac y su grupo de trabajo, en 1988, observaron que aislamientos
procedentes de folíolos de papas sin asperjar con fungicidas, en el Valle de Toluca México,
tenían un 50% de individuos con genotipos únicos, a pesar de la predominancia de la
reproducción asexual durante la epidemia. Sin embargo, Abad (1983) encontró 15 razas
diferentes en aislamientos procedentes de papas cultivadas en Perú, de los cuales 13 procedían de
la Sierra, cuatro de San Ramón (pie de la cordillera) y cinco de la Costa. El 55% de los 47
aislamientos fueron patogénicos a tomate y 15% a pepino.

17
El Centro de México, es el segundo lugar en diversidad de especies del género Solanum,
muchas de las cuales son endémicas y tuberizan, mientras que la papa (S. tuberosum ssp
tuberosum), solo se cultiva de manera intensiva en dicha zona a partir de los años 1950’s (Fry et
al., 1993). Esto sería una evidencia de que la papa no es la planta en la cual se pudo originar el
patosistema con Phytophthora infestans, pues además las condiciones climáticas señaladas por
Viet (1997) en la zona de origen de la papa cultivada hace 10.000 años, época de domesticación
de esta especie, al parecer eran adversas al desarrollo del patógeno.

4.5. Teoría de las Migraciones Fry et al. (1992-93) y Goodwin et al.


(1994) a Estados Unidos y Europa.

La teoría de las migraciones considera que P. infestans pudo haber sido transportado de
México a Estados Unidos y de allí a Europa, o que fue llevado directamente de México a Europa,
y una vez introducido allí, fue dispersado por el resto del mundo con los tubérculos-semilla,
indicando que al menos hubo tres eventos de migración.

La primera migración ocurrió cerca de 1840, presentándose un primer reporte en Filadelfia


USA en 1843, luego en localidades distantes de ese sitio, reportándose en la provincia marítima
de Canadá, en la parte Noreste de Estados Unidos y luego en el medio Oeste de dicho país.

Los primeros reportes en Europa se hicieron en Bélgica (junio de 1845). A mediados de


octubre se presentó en Irlanda y luego se esparció por el Oeste de Alemania. Bourke citado por
Daly (1996), indica que lo mas probable fue que P. infestans llegó a Europa en un embarque de
papas importadas a Bélgica a finales de 1843 o comienzos de 1844, para restablecer las
existencias de papas que habían sido afectadas por enfermedades virales y pudrición seca por
Fusarium. Pero no se registra el origen de dichos materiales. Es posible que hubiesen sido
llevados de Norte y Sur América (Andrivon, 1996, Daly,1996).

4.6. Teoría de las Migraciones de Bourke (1964), Tooley et al., (1989) y


Andrivon (1996)

Esta teoría postula la migración también en tres pasos. Primero de México a Sur América, de
ahí a Norte América y de este lugar a Europa.

Teniendo en cuenta varios acontecimientos históricos y la presencia de genes específicos a


razas de. P infestans en especies de papas silvestres de los Andes, indican que la introducción fue
por lo menos varios siglos atrás, desde su lugar de origen en el Centro de México, causada por
varias migraciones humanas antes y después de la conquista y desde el Norte hacia el Sur.
Además es posible que P. infestans hubiese sido introducido con otras especies de plantas
diferentes a papa, aunque no se ha obtenido ninguna evidencia arqueológica o histórica
(Andrivon, 1996).

Una vez introducidas las poblaciones de P. infestans a Sur América, prácticamente


evolucionaron aisladamente a pesar de que las comunicaciones y el intercambio han sido activos,
encontrándose el predominio del Linaje Clonal US-1, el cual fue ampliamente distribuido en todo
el mundo, facilitado por el comercio del guano, lo que conduce a un flujo limitado de genes de

18
las poblaciones andinas, o que la introducción original fue limitada a unos cuantos genotipos
(Andrivon, 1996).

Según Andrivon (1996) la base genética estrecha del patógeno, combinada con la frecuencia
reducida de la incidencia de tizón tardío en ciertas regiones de los Andes, redujo el tamaño
absoluto de las poblaciones, y con las altas tasas de extinción observadas, en los “linajes” de P.
infestans, se llegó a la fijación rápida de un sólo linaje clonal, el US-1, el cual posiblemente
migró de Sur América a Estados Unidos y Europa en la década de 1840.

4.7. Migraciones Posteriores a 1970

Durante el largo intervalo de 1840’s-1970’s no se encontraron evidencias de migraciones, dado


que los datos de evaluación de las poblaciones de P. infestans, fueron consistentes con un solo
linaje clonal, el US-1 introducido por migración de localidades de mayor diversidad a zonas de
menor diversidad. Por ejemplo, de México a Estados Unidos y de allí a Europa y de este
continente a Asia, Africa y Sur América (Fry et al., 1993, Goodwin et al.,1994).

Al parecer grandes cantidades de papa para el consumo doméstico fueron llevadas de México al
Oeste de Europa a finales de los años 1970’s. De una pila de compost o de algunos tubérculos
que fueron almacenados y luego sembrados en el campo, pudo escaparse el patógeno P. infestans,
el cual habría podido sobrevivir el invierno sobre los tubérculos, de los cuales surgieron las hojas
en la primavera, donde creció el patógeno y se pudo dispersar a plantas de papa y de tomate, en
campos vecinos, muchos posiblemente destinados a la producción de “semilla” (Fry et al .,1993).

La “semilla” de papa es una fuente permanente de comercio a lo largo y ancho del mundo, con
la cual se pudieron haber transportado nuevas poblaciones del patógeno que incluían el tipo de
apareamiento A2, el cual aún no está reportado en algunos países como Colombia, Filipinas,
Taiwán y Perú, pero se teme su dispersión con el comercio de los tubérculos “semillas”, pues
para 1987, ya estaba presente en Pensilvania (US-7 en papa) y en 1989 en Columbia Británica
(US-8 en papa y tomate), posiblemente procedentes de papas del Este de Washington o tomates
de la Florida (Fry et al., 1993; 1995).

Las nuevas poblaciones desplazaron a las viejas, puesto que no se han descubierto
recombinaciones de genotipos nuevos y viejos; y los alelos aloenzimáticos característicos de los
linajes viejos, están ausentes en las poblaciones presentes actualmente: Esto indica que las
poblaciones que llegaron recientemente están mas adaptadas, pues mostraron una mayor
agresividad, en Europa Central durante la década de 1980 (Fry et al.,1993).

Según el grupo de Fry et al.(1993), la selección por genes de resistencia (R), no es una
explicación satisfactoria para indicar el desplazamiento de esta población por las siguientes
razones:

La mayoría de las variedades de papa de Europa Occidental no contienen genes R.

Existió una virulencia adecuada en las poblaciones viejas.

No ha habido cambios mayores en al composición de los genes R de las variedades Europeas


que coincidan con el desplazamiento

19
Además, el desplazamiento de P. infestans también ocurrió en otros continentes: en Japón se
redujo la frecuencia del linaje clonal viejo; y la representatividad de nuevas poblaciones de P.
infestans, predominó en las colecciones recientes en diferentes áreas de Corea.

Una implicación práctica de la migración puede estar relacionada con la sensibilidad o


resistencia del patógeno al fungicida específico de Oomycetes, Metelaxyl, cuya resistencia no fue
ampliamente distribuida entre los aislamientos que pertenecían a las poblaciones viejas,
indicando que el problema se debió a la migración y selección de individuos resistentes, o por
una mutación y selección de novo (Fry et al., 1993).

Estas observaciones son confirmadas por la FRAC (2002) que indica que al comienzo de la
estación en Europa, los aislamientos sensibles al fungicida son mas abundantes, con un cambio
significativo al final de la estación donde predominan los aislamientos resistentes. Igualmente en
Colombia se ha observado una mayor frecuencia de aislamientos resistentes a dicho fungicida en
los aislamientos de zonas con monocultivos de papa de variedades con un reducido número de
genes R.

4.8. Las Migraciones de 1980’s: México, Estados Unidos y Canadá

Según Fry y Goodwin (1995) hasta finales de los 1980s y comienzos de los 1990s, las
poblaciones de P. infestans en Estados Unidos constaban de un solo linaje clonal antiguo (US-1)
con el tipo de apareamiento A1 y unos pocos diferentes (US-6), pero la situación fue cambiante
puesto que se encontraron poblaciones con el tipo de Apareamiento A2, en Pensilvania en 1987
y en Columbia Británica en 1989, procedentes de tomate de la Florida, papa y tomate del Oeste
de Washington, y papa del Este de Washington con linajes clonales antes no observados en
Estados Unidos o en Canadá, los cuales se denominaron US-7 altamente patogénico en papa y
tomate y US-8 especialmente patogénico en papa.

Para 1994 el genotipo US-8 de P. infetans fue el predominante en amplias zonas de cultivos de
papa en Estados Unidos y Canadá, causando una de las epidemias mas severas en dicha región,
por ser resistente al fungicida Metalaxyl, al igual que los genotipos US-6 y US-7, los cuales
fueron producto de una migración clonal, dado que fueron inicialmente detectados en el Norte de
México y su resistencia al fungicida fue previamente detectada en dicha zona. (Fry y Goodwin,
1995).

Para desarrollar una estrategia de manejo del patógeno, es necesario tener en cuenta la
capacidad de migración de manera rápida a grandes distancias, como se observa por la presencia
de un solo clon en los extremos continentales de Estados Unidos. Es posible que operen varios
mecanismos de migración, pero se sugiere que la nueva población llegó del Noroeste Pacífico de
México sobre tomates sembrados en la zona o en frutos de tomate infectados, los cuales fueron
comercializados en la zona continental de Estados Unidos.

La amplia y rápida distribución de P. infestans, junto con el desarrollo de la resistencia al


Metalaxyl en dichas poblaciones, y los mecanismos diversos para el proceso de dispersión,
indican que para hacer un control eficiente se debe establecer un sistema de alerta, que permita
conocer de manera oportuna, las condiciones favorables para el desarrollo de epidemias.

20
4.9. Migraciones al Este de Asia

Fry y Goodwin (1995) opinan que las migraciones al Asia tuvieron características diferentes a
las migraciones a Europa, por cuanto sólo se detectaron aislamientos de P. infestans con el tipo
de apareamiento A2 en 1989 en Japón y Korea, con un genotipo aloenzimático y finger printing
del DNA, distintas a las de la población nativa y con marcada resistencia al metalaxyl, la cual ha
venido sustituyendo a la población originalmente establecida en dicha zona.

Según Fry y Goodwin (1995) la población nativa caracterizada por el tipo de apareamiento A1
y susceptible al metalaxyl, produjo oosporas con los aislamientos A2 introducidos bajo las
condiciones de laboratorio, las cuales no germinaron fácilmente, razón por la cual se considera
que la reproducción sexual, ha tenido muy poco efecto sobre la estructura genética de P. infestans
en el Este del Asia y por que no decirlo a nivel mundial.

4.10. Migraciones en Sur América

Las colecciones en el Perú realizadas por Abad (1983-1985) presentaron el linaje clonal
predominante a nivel mundial hasta entonces (US-1) con el tipo de apareamiento A1, con un
amplio rango de especies huéspedes (107) que son afectadas de manera natural o artificial. Las
colecciones de Bolivia han sido reportadas como tipo A2 y con un solo linaje clonal, mientras en
Brasil se han detectado dos clones con tipo de Apareamiento A1 y A2 respectivamente y en
Argentina se descubrieron aislamientos con el tipo de apareamiento A2 ( Fry y Goodwin, 1995).

4.11. Una Nueva Migración de Colombia al Ecuador

Reportes recientes de Forbes et al. 1997, indican que la estructura poblacional del patógeno P.
infestans en cultivos de papa en el Ecuador, está conformada principalmente (mas del 95%) por
un solo linaje clonal, EC-1, definido por análisis de marcadores como las isoenzimas glucosa
fosfato isomerasa (Gpi 90/100) y peptidasa (Pep 96/100), el tipo de apareamiento A1 y una
dactiloscopia del DNA nuclear no reportada previamente.

Tales observaciones condujeron al grupo de Forbes a sugerir una hipótesis sobre la introducción
reciente de un nuevo linaje clonal al Ecuador, que se estableció y desplazó el antiguo US-1(Gpi
86/100 y Pep 92/100), dando la idea de que esta población procedía de Colombia, refutando la
hipótesis de que existía una barrera dentro del Ecuador, entre las poblaciones peruanas US-1
evaluadas en 1980’s y una población diferente que había sido detectada posteriormente en
Colombia (Forbes et al., 1997). Posteriormente detectaron las poblaciones EC-2, EC-2.1 y EC-3
en especies solanáceas silvestres las primeras y la última.

El grupo de investigación del patosistema Phytophthora/Solanum de la Universidad Nacional


de Colombia, ha encontrado que los aislamientos colectados y evaluados entre 1995-2002,
exhiben características de las poblaciones EC-1 descritas por Forbes et al., 1997, como tipo de
apareamiento A1, los fenotipos de las isoenzimas Pep (96/100) y Gpi (90/100), resistencia al
fungicida Metalaxyl y los haplotipos mitocondriales II-a con mayor frecuencia en papa y I-b en
tomate.

21
CAPÍTULO III

CARACTERIZACIÓN POBLACIONAL

Los estudios poblacionales de Phytophthora infestans se iniciaron casi paralelamente con los
programas de mejoramiento de la papa, para buscar e incorporar la resistencia a este patógeno.
Existen marcadores moleculares, bioquímicos y fenotípicos que han posibilitado la identificación
de aislamientos distintos en una población, producto de un organismo que tiene la posibilidad de
reproducirse sexual y asexualmente, conduciendo a cambios en las poblaciones que pueden ser
introducidas a otras regiones por procesos de migración.

Desde que se reportó el tipo de apareamiento A2 en el Oeste de Europa en 1984, se esperaba un


dramático desarrollo de nuevas poblaciones del patógeno, lo que condujo a los patólogos a
realizar análisis locales de las poblaciones, dado que el tipo A1 era el único tipo de apareamiento
reportado fuera de México, considerado como el centro de origen de P. infestans (Fry et al.,
1993).

Una población se refiere a un grupo de individuos (aislamientos) de una misma especie que se
encuentra estructurada o delimitada por barreras geográficas, por lo tanto, el primer indicio de
cambios importantes en la población lo constituyó la presencia del tipo de apareamiento A2. La
determinación de los alelos isoenzimáticos de glucosa-6- fosfato isomerasa (Gpi), enzima málica
(Me) y peptidasa (Pep) proporcionaron la primera evidencia genética de la diploidía de P.
infestans y permitió hacer las primeras comparaciones de las poblaciones. Mas recientemente se
establecieron marcadores como la sonda G57 para huella del DNA nuclear y cebadores
específicos para la amplificación del DNA mitocondrial.

Al comparar las poblaciones de Polonia de 1985-1991, con los 153 aislamientos colectados en
Holanda en 1989, se observaron diferentes, aunque tuvieron en común muchos alelos
isoenzimaticos y similitud en el perfil electroforético del DNA nuclear. En contraste los
aislamientos de Rusia fueron muy similares a los de Polonia y Alemania, lo que indica que la
población fundadora de Polonia migró con los vientos predominantes de Oeste a Este a través de
Europa. Dicha población tuvo mayor eficacia biológica, rompiendo la resistencia a genes
específicos de una variedad local (Bronka), debido posiblemente a la recombinación sexual, que
favoreció el desarrollo de los experimentos, patogénicamente mas agresivos.

En las dos últimas décadas se han estudiado las poblaciones alrededor del mundo, para lo cual
se han evaluado miles de aislamientos, utilizando características fenotípicas (tipo de
apareamiento, virulencia/agresividad de razas y sensibilidad a Metalaxyl), marcadores
bioquímicos (isoenzimas Gpi y Pep) y moleculares (RFLPs nuclear y mitocondrial y el análisis
de finger printing usando la sonda RG57, PCR específico para detectar el tipo de apareamiento
A1 con un cebador específico para A1 y análisis de ITS y microsatélites.

En algunas poblaciones de P. infestans, se pueden encontrar aislamientos diploides y


poliploides; por lo tanto los aislamientos diploides en su estado vegetativo, podrían presentar
factores heterocigóticos que gobiernan la expresión fenotípica, de tal forma que en los
cromosomas homólogos se pueden presentar alelos dominantes y recesivos en un solo gen. Esto
22
explica por qué en ciertas mutaciones que generan resistencia a un fungicida, (Metalxyl), la
expresión de la resistencia está condicionada por uno o dos genes (ver texto de la FRAC, GISI
2002) con dominancia incompleta.

La utilización de marcadores de resistencia a fungicidas permite determinar si se da o no una


recombinación de factores genéticos, que puede resultar de la ocurrencia de procesos sexuales
que involucra cambios en el DNA nuclear o a nivel del DNA mitocondrial en el caso de la
reproducción asexual.

1. Tipo de apareamiento

Ha sido un factor importante en la variación de las poblaciones, aunque el tipo de apareamiento


y sus marcadores no presentan una segregación mendeliana, es posible establecer los del tipo A1
por la técnica basada en PCR con un “primer específico”, la cual establece una región S1
adyacente al locus del tipo de apareamiento A1 (Lee et al, 1997).

El tipo de apareamiento A2 tiene gran tendencia a la autofertilización (96%, n=47), mientras


que A1 es escasa ( 6%, n=69). Smarth, (2002). Pérez et al., (1997-1998) evaluaron 287
aislamientos de Puno y Cusco en el Perú, observando que ninguno presentaba el tipo de
apareamiento A2, tanto por ausencia de oosporas en cruces con un aislamiento testigo
previamente caracterizado como A1, como por la técnica de PCR con primers específicos, la cual
puede estar relacionada como un signo o consecuencia de anormalidades estructurales
adicionales, cercanas a dicha región y que podrían ser responsables de la segregación no
mendeliana del tipo de apareamiento ( Judelson, 1996).

El locus S1 fue previamente identificado por Judelson et al ., (1995) muestra una secuencia
monomérica de 1,35 Kb que evolucionó por repeticiones sucesivas a 300 Kb y que es bien
conservada en el estado hemicigótico del tipo A1: Esta técnica ha sido utilizada por Gilchrist
(2001) y Calderón y Castro (2002) para la determinación del tipo de apareamiento de
aislamientos colombianos de P. infestans.

Varios investigadores han venido evaluando los tipos de apareamiento presentes en diferentes
países. Shaw et al. (1985), opinan que el tipo de apareamiento A2 pudo haber estado presente,
pero no se detectaba por bajas frecuencias, en diferentes países por fuera de México durante
varios años. García et al., (2000) encontraron al noroeste de México que el tipo de apareamiento
predominante en 1994-1995 fue el A2, el cual estaba prácticamente desaparecido en 1996-1997.
La presencia de ambos tipos de apareamiento de manera simultánea sólo se observó en unos
pocos campos donde crecían simultáneamente papa y tomate.

Spielman et al., (1991) caracterizaron por diferentes juegos de alelos los aislamientos de los
países que tenían estrictamente el tipo de apareamiento A1 y los que incluían ambos tipos de
apareamiento. En las colecciones estrictamente A1, se encontraron los alelos Gpi (86 y 100) y
Pep ( 92 y 100), las cuales fueron procedentes de Estados Unidos/Canadá, Holanda entre 1951-
1978, Polonia entre 1985-1987, Perú 1989, dos aislamientos de Suiza, cinco de UK y fueron
designados como genotipos viejos.

En las colecciones con ambos tipos de apareamiento (excepto Japón) no se observaron los
alelos Gpi 86 y Pep 92 o fueron menos frecuentes, pero se presentaron dos alelos adicionales Gpi

23
90 y Pep 83, cuyos genotipos fueron Gpi 90/100 o 100/100 y Pep 83/100 o 100/100 o en
combinación con los genotipos del primer grupo. La reproducción fue predominantemente
asexual en dichas poblaciones.

En el Japón cada tipo de apareamiento estuvo fuertemente asociado con un genotipo diferente,
el A1 con condiciones heterocigotas: Gpi 86/100 y Pep 92/100 y el A2 homocigoto con Gpi:
100/100 y Pep 100/100, aunque la muestra no fue representativa, pero parece que está
conformada por individuos de nuevas y viejas poblaciones.

Es así como en Estados Unidos y Canadá, se tomaron aislamientos de campos de cultivos de


papa y tomate entre 1983-1989 a los cuales se les determinó el tipo de apareamiento por cruces
en medios de habas, avena y granos de arroz. Se cruzaron consigo mismos y con aislamientos ya
conocidos como del tipo de apareamiento A1, procedentes de México (A1 y A2), Estados Unidos
y Europa. Un aislamiento A2 de México, junto con un aislamiento de Vancouver (A1) y otro de
Pensilvania (A1), presentaron formación de oosporas en 15 días. Las pruebas de patogenicidad
mostraron que dichos aislamientos producían síntomas típicos de tizón tardío en hojas y tallos,
con virulencia similar a la de los aislamientos con tipo de apareamiento A1. Al mezclar
esporangios de A1+A2 produjeron oosporas en los tejidos del huésped de color marrón más
oscuro que las formadas in vitro, lo que sugiere la posibilidad de formación de oosporas en el
campo. (Dehal, et al.,1991).

Drenth (1994) señala la presencia del tipo de apareamiento A2 en 22 países incluido México
país en el cual se reportó desde 1956. Fry et al., (1993), señalan la presencia del tipo de
apareamiento A2 en Colombia, en 1990. Sin embargo, en las evaluaciones que se han realizado
por los grupos de investigación de la Universidad Nacional de Colombia sedes Bogotá y
Medellín, sobre este patógeno, no se ha detectado la presencia del tipo A2, lo cual no es
descartable si se amplía el muestreo a otras especies y zonas ecológicas.

Sujkouski, et al., (1994) evaluaron los cambios genéticos en la población de P. infestans de


Polonia entre 1985-1990 y encontraron que los aislamientos colectados entre 1985-87,
presentaban sólo el tipo de apareamiento A1, que constaba de un sólo linaje clonal dominado por
el genotipo PO-1, basados en las aloenzimas y las huellas del DNA determinadas por la sonda
RG57, con genotipos idénticos a los de la población predominante en 1980’s, en los diferentes
países por fuera de México, pero la cual desapareció después de 1988, como un posible resultado
de la introducción inicial de P. infestans a Europa en 1845.

La aparición del tipo A2 en Polonia, se detectó a partir de 1988, con un nuevo genotipo (PO-4),
posiblemente introducido por una migración y se incrementó la frecuencia hasta 1990,
alcanzando casi el 50% de los aislamientos colectados. Para 1991, el genotipo PO-4 sólo
representaba el 12%. Sin embargo, a partir de los años 1990’s se presentó una gran diversidad de
genotipos únicos (69%) que correspondían al 39% de la población muestreada, lo que indica el
aporte de la recombinación genética, debido a la posible reproducción sexual, pero no hubo
diferencia genética entre los aislamientos A1 y A2 (Sujkouski, et al., 1994).

En las oosporas obtenidas por cruces A1xA2 in vitro, en japón y Korea (Fry y Goodwin, 1995),
se han tenido dificultades para hacerlas germinar y las que lo han logrado como se observó en el
Ecuador, no fueron patogénicas al huésped parental ( Oliva, et al 2002), lo que indica que la
reproducción sexual, no es un mecanismo impórtate en la patogenicidad de P. infestans.

24
Por otro lado, Miller y Johnson (2000), al inocular y llevar al campo plantas de papa, con la
misma cantidad de lesiones de tizón producidas por US-1 y US-8, no encontraron oosporas en los
tejidos lesionados, las cuales sí fueron observadas en cruzamientos en el laboratorio, pero no
detectaron evidencia de recombinación de genotipos, por el sistema de huellas digitales por
RFLP, manteniéndose la diferencia de cuatro bandas entre el genotipo US-8 y US-1.

Sin embargo, observaron cambios a nivel de isoenzimas, los cuales no siempre se presentan
(Shattock, et al.,1987, citados por Miller y Johnson, 2000), que sugieren la posibilidad de una
recombinación meiótica por autofertilización de US-8 inducida por la cercanía de US-1, dando
origen a una solo oospora que puede continuar su multiplicación asexual.

Las poblaciones viejas del Noroeste y Este de Europa han sido desplazadas por la diversidad
genética derivada de la reproducción sexual de P. infestans, evidenciada por la mezcla de
poblaciones A1/A2, también presentes en importantes regiones productivas de papa y tomate en
Asia y posiblemente en África y Sur América (Flier, et al. 2002).

No ha sido posible responder si las viejas poblaciones vienen siendo reemplazadas por las
nuevas, debido a una migración (Fry et al., 1993, citado por Knapova, et al.,2002) o por la
ocurrencia local de la recombinación sexual (Drenth et al ,1994, cit por Knapova et al, 2002), la
cual algunos investigadores han tenido dificultad de obtener en condiciones in vitro y otros bajo
condiciones de campo. Miller y Johnson (2000) indujeron más fácilmente la formación de
oosporas en el laboratorio que en el campo al igual que Oliva et al., (2002)

En el Perú no ha sido reportado el tipo de apareamiento A2, aunque, Pérez et al., (1997-1998),
reportan cinco poblaciones, incluida la US-1, la cual es la mas antigua con distribución mundial.
Esto indica que el cambio de las poblaciones no se debe a la recombinación sexual, pues en el
Ecuador, donde existen ambos tipos de apareamiento, Oliva et al., (2002) no lograron la
formación de oosporas patogénicas a las especies parentales de los aislamientos A1 vs. A2.

Oyarzún et al., (1998) opinan que en el Ecuador las poblaciones están separadas por huéspedes
y en Colombia Gilchrist (2001) observó diferencias por haplotipos mitocondriales, en los
aislamientos procedentes de papa frente a los aislamientos de tomados en otras especies
huéspedes.

2. Razas Fisiológicas

El desarrollo de patotipos o razas fisiológicas, fue posible a partir de los años 1950’s, cuando
Black et al, (1953) desarrollaron una serie de clones de papa diferenciales a partir de la especie
mexicana Solanum demissum con genes de resistencia vertical a Phytophthora infestans, los
cuales son utilizados mundialmente para la caracterización de las razas y la determinación de los
genes que confieren la resistencia, con base en la respuesta de compatibilidad de los aislamientos
con los clones diferenciales.

Abad, (1983) encontró la mayor especialización de razas del patógeno y alta frecuencia de
patotipos no sólo en papa, sino en tomate y pepino en los cuales determinó los genes para
virulencia 1,2,3,4,7,10 y 11, en las razas 1.3.7 y 2.4.10.11 y Turkesteen (1997) señaló que el
pepino es portador de la raza especializada 1.4.10.11, la cual es altamente patogénica a papa,
mientras que la raza 0, no esporula en dicha especie.

25
Pérez et al., (1997-1998) evaluaron 114 aislamientos procedentes de Puno y Cusco al sur de
Perú y encontraron un aislamiento que infectaba 10 clones diferenciales, excepto el R9. En
Colombia en el oriente de Antioquia, se han evaluado aislamientos con igual cantidad de
diferenciales afectados, excepto el R5. Esto demuestra la complejidad de virulencia de los
aislamientos en ambos países, la cual se ha venido incrementando, pues según Abad en 1983, la
raza mas compleja afectaba 7 diferenciales.

En Colombia, para 1995 (Mazo y Patiño, 1995) reportaron que el 57% de la población evaluada
infectaba 7 clones diferenciales (tabla 1), mientras que para la colección realizada en 1997-98,
(Marín y Mira,1998), reportaron la mayor frecuencia de los aislamientos colectados con 10 genes
de virulencia (tabla 2).

Gisi et al., (1995) en Suiza, encontraron 11 patotipos (razas fisiológicas) con 3,4,5,6,7 y 8
genes de virulencia. El 65% de los aislamientos evaluados, presentaron los genes de virulencia
1,3,4,7,10 y 11. Se observó que los aislamientos con menos genes de virulencia (5 y 6)
presentaron el mayor porcentaje de resistencia a las fenilamidas, lo que indica que no hay una
relación directa entre la resistencia a fenilamidas y la complejidad del patógeno, mientras que
Pérez et al., (1998) en el Perú observaron mayor resistencia en los aislamientos con mas genes de
virulencia.

Tabla 1. Frecuencia de razas fisiológicas de Phytophthora infestans colectadas en el


departamento de Antioquia, Colombia, entre 1994-1995. Mazo y Patiño,1995, López et al,1997.

Aislamiento Factores de Frecuencia


Patotipo Nº octal
P. infestans virulencia (%)
U1, U2, C4, G5 1-2-3-4-7-10-11 7446 7 55.5
E9, E10, SP11, SP12, ER13,
1-3-4-7-10-11 5446 6 15
SR14, SR15, UN6, SS16, SS17
U3, UN3, UN8 1-2-3-4-7-8-10-11 7466 8 15
SV7 1-2-3-4-6-7-10-11 7546 8 5
P18 3-4-7-10-11 1446 5 5
T19 1-2-3-7-10-11 7046 6 5
P= pepino (Solanum muricatum), T = tomate (Lycopersicon esculentum). U,G,SP,C,ER;SS, UN,SV,E= papa
distintas variedades

La variedad mas cultivada Bintje fue la mas muestreada y la vez la que presentó el mayor
número de patotipos (9 de los 11 presentes). Los genes de virulencia mas frecuentes fueron de
mayor a menor frecuencia: 4; 1=3; 7=10=11; 6; 8; 2 y 5. El gen de virulencia expresado en el
diferencial R4 estuvo presente y en el R4 siempre estuvo ausente. Cabe resaltar que Bintje es una
variedad susceptible en la cual se observó que aislamientos simples (IPO-O raza 0) y complejos
(90128, raza compleja) rápidamente mostraron una reacción biotrófica (Vleehouwers et al, 2000).

Sujkowski et al., (1994) señalan que antes de los 1970’s, las poblaciones de P. infestans
desarrollaron poca virulencia para las variedades de papa que poseían los genes R7, R10 y R11,
lo cual fue muy común, luego de los años 1980’s. Spielman et al., (1990), evaluaron el efecto de
la descendencia F1 del patógeno frente a los genes R2 y R4 de la papa y observaron que la
virulencia contra R2 está controlada por un solo locus, mientras que la virulencia contra el R4,
puede estar determinada por uno o dos locus.

26
Según Schöber-Butin, et al., (1995), en Alemania se observó que para los 1950’s solo se
presentaban dos patotipos de P. infestans denominados como 0 y 1, para los 20 años siguientes se
presentaron los patotipos 0, 1, 4, 1.4, 1.2.3.4 y 1.3.4 presentándose hasta 4 genes de virulencia.
Aunque Spielman et al., (1991) indican que los cultivares habían tenido los mismos genes R1,
R3, R4 y R10 durante dicho período.

En los años 1980’s se presentaron 7 razas una de las cuales presentó 7 genes de virulencia y en
todas se destaca la presencia del gen 1 y prevalecía los genes 3 y 4, lo que demuestra el
incremento en la complejidad del patógeno a través del tiempo en Alemania, lo que condujo a
evaluaciones mas frecuentes. A partir de los años 1985, se notó un incremento en el número y
complejidad de patotipos del patógeno (20), llegándose a observar un patotipo con nueve genes
de virulencia, con ausencia de los genes 6 y 9 (Schöber-Butin, et al.,1995).

Condiciones similares han sido observadas en aislamientos procedentes del Departamento de


Antioquia Colombia, (Mazo y Patiño, 1995; López et al.,1997) en donde sólo han estado ausentes
los genes 5 y 9, tabla 1. El patotipo mas frecuente (55.5%) según la nomenclatura octal
(Goodwin et al., 1995) fue el 7446 con 7 genes de virulencia.

En los 20 aislamientos evaluados por Mazo y Patiño (1995) siempre se presentaron los genes de
virulencia 10 y 11, el gen 6 sólo se presentó en un patoptipo de los seis establecidos, los cuales
presentaron entre 5 y 8 factores de virulencia (tabla 1), con un promedio de 6.6, valor superior a
los registrados en el mundo, según Fry y Spielman (1991), que en orden descendente
corresponden al valle de Toluca, México con 5,6 factores de virulencia, como promedio de 16
aislamientos evaluados, Holanda con 4,1/14, Reino Unido 3,7/61, Perú 1,0/33 y USA-Canadá
1,9/14. El denominador indica el número de aislamientos evaluados.

Los aislamientos colectados dos años después mostraron una mayor complejidad en zonas con
monocultivos de papa, presentando sólo ausencia del gen 5, mientras que en zonas de mayor
diversificación de cultivos o especies silvestres, se presentaba un mayor número de razas
fisiológicas, pero menos complejas o virulentas por el menor número de genes compatibles con
los clones diferenciales, como en el tomate según se muestra en la tabla 2 (Marín y Mira, 1998).

En dicha investigación se detectó el gen de virulencia 9 que no había sido detectado en los
aislamientos evaluados por Mazo y Patiño (1995) y el 38% de los patotipos correspondieron a la
mayor complejidad (10 y 9 genes de virulencia) tomados de papa y pepino de agua, mientras que
los aislamientos procedentes de tomate, pimentón, papa criolla y uno de papa Diacol Capiro,
presentaron 5 o menos factores de virulencia, incluso un aislamiento de tomate sólo presentaron
compatibilidad con la variedad Alfa de papa, que no presenta genes mayores de resistencia al
patógeno.

27
Tabla 2. Frecuencia de razas fisiológicas de Phytophthora infestans colectadas en el
departamento de Antioquia, Colombia, entre 1997-1998. Marin y Mira, 1998.

Aislamiento Factores de Frecuencia


Patotipo Nº octal
P. infestans virulencia (%)
A13, B12, B14 1-2-3-4-6-7-8-9-10-11 7576 10 20.7
B21, D22, 20E, A3, B6, D9 1-2-3-4-7-8-9-10-11 7476 9 17.24
B11, D23, A7, B13 1-2-3-4-7-8-9-10 7474 8 6.9
A1 1-3-4-7-8-9 5470 6 3.44
A5 1-2-3-4-6-7-8-9-10 7574 9 3.44
B1 1-3-7-9-11 5052 5 3.44
B4 3-4-6-7-9-10-11 1556 7 3.44
B7 3-4-7 1410 3 3.44
B9 3-7 1040 2 3.44
B15 1-2-3-4-6-7-8-10-11 7566 9 3.44
B16 3-4-7-10-11 1446 5 3.44
B18 1-3-4-6-7-10-11 5546 7 3.44
B19 3-4-6-7-8-9-10 1574 7 3.44
C2 3-7-10-11 1046 4 3.44
D3 1-3-4-6-7-8-9-10-11 5576 9 3.44
D26 0 0000 0 3.44
D11 3-9 1010 2 3.44
E4 1-3-4-7 5440 4 3.44
D19 1-2-3-4-7-8-10-11 7466 8 3.44
B1=Pimentón (Capsicum sp.) C2, D26, D11=Tomate(Lycopersicon esculentum) D3 D22=Pepino (Solanum
muricatum). Las restantes son diferentes variedades de papa.

Foriseková et al (2002) evaluaron la presencia de razas de P. infestans en el laboratorio y


campo, observando el incremento en los factores de virulencia, a medida que va pasando el
tiempo, pues para los años de 1996-1997 los aislamientos tuvieron máximo 6 factores de
virulencia, con ausencia de respuesta compatible en los diferenciales R2; R5 y R11. Para 1999-
2000, se confirmó la presencia de aislamientos con compatibilidad hasta con 10 diferenciales,
especialmente al final del periodo vegetativo, al igual que las observaciones de Mazo y Patiño
(1995), Marín y Mira (1997), Jaramillo y Gilchrist (2002) en Antioquia Colombia. Dichos
investigadores, no han observado el diferencial R5 afectado en invernadero y/o campo y con
compatibilidad pero poco agresiva sobre el R9.

La variedad ALVA altamente resistente a gota, fue completamente destruida en 1999, cuando el
gen presente en el diferencial R2 apareció al comienzo de la estación, pero cuando surgió al final
de la estación, la variedad permaneció sana hasta ese momento. Los investigadores opinan que
dicho gen (R2) puede estar asociado con la pérdida de la resistencia en la variedad Alva a través
del tiempo (Foriseková et al., 2002).

En Bangladesh, Hossain et al., (2002) observaron que de un alto número de progenies y


variedades de papa evaluadas, sólo tres clones del CIP (CIP-607, CIP -272 y CIP-616) mostraron
tolerancia al tizón tardío y se identificaron 18 razas simples y complejas del patógeno con
frecuencia variable, siendo el gen R2 el de mayor ocurrencia. A la vez observaron aislamientos
de P. infestans con resistencia al metalaxyl, razón por la cual recomiendan hacer mezclas con
28
otros fungicidas y otras prácticas culturales que conduzcan a evitar el desarrollo de dicha
resistencia. Resaltan la eficacia de las escuelas de campo.

Abad (1983) encontró la mayor diversidad de razas (13) en la Sierra Peruana, donde existe la
mas alta complejidad de especies huéspedes de P. infestans, mientras en la Costa (5 razas) y la
Ceja de Selva (4 razas) la cantidad de razas fue mucho menor y son las zonas donde se hace una
producción mas intensiva de la papa, con pocas variedades. En el muestreo realizado por Pérez
et al., (1997-98) en Puno y Cusco, encontraron 18 razas diferentes, con alta frecuencia de
patotipos mas complejos (mayor número de clones diferenciales afectados) agrupados en 5
linajes clonales, mayor agresividad patogénica y resistencia a Metalaxyl.

Esto da indicios de los mecanismos de variación del patógeno (parasexualidad, heterocariosis,


mutaciones puntuales) cuando se somete a fuertes aplicaciones de fungicidas, poca diversidad de
especies huéspedes, cultivos permanentes de papa en el campo con variedades cuya resistencia se
ha venido perdiendo, lo que se considera (Van der Plank, 1968, citado por Abad, 1983), la
“selección estabilizante” del patógeno.

Vale la pena destacar que en tomate variedad chonto procedente del Peñol a 1.900 msnm, la
cual es una zona dedicada al cultivo del tomate y el pimentón, se observó una reacción de
hipersensibilidad para los diferenciales R4 y R1, lo que indica una típica reacción de resistencia
como lo expresa Vleehouwers, et al. (1999) y una compatibilidad con la variedad Alfa, la cual
no posee genes de resistencia al patógeno. Se colectaron 12 muestras con síntomas similares a
los de gota en folíolos de pimentón (Capsicum annum), pero sólo el aislamiento B1 procedente
de plantas de esta especie cultivadas en Marinilla a 2.105 msnm, esporularon en rodajas de papa
y se reconocieron con 5 clones diferenciales de papa, correspondientes a los genes R1, R3, R7,
R9 y R11.

Hasta el presente sólo se ha reportado gota en las hojas del pimentón rojo en Estados Unidos
(Cox, 1948, citado por Erwin y Ribeiro, 1996). Es conveniente hacer un seguimiento cuidadoso a
los cultivos de esta especie en la zona, dado que los agricultores vienen aplicando moléculas
activas como Clorotalonil, Metalaxyl y Mancozeb, contra dicho patógeno, lo que da indicio de
que pueda existir ésta u otra especie de Phytophthora como P. capsici, P. cactorum,
P.citrophthora o P. palmivora, reportadas en otros países como patógenas del pimentón, porque
afectan las plántulas y los frutos pero ninguna de las cuales se ha registrado en dicha zona.

Según Smart et al., 2000, han sido mapeados varios genes R en S. demissum. Así R-1 en el
cromosoma 5; R-2 en el cromosoma 4; R-3; R-6; R-7 en el cromosoma 11 y recientemente se ha
encontrado un nuevo gen R en Solanum berthaultii en el cromosoma 10. En tomate se encontró
el gen Ph-1 en el cromosoma 7 y Ph-2 en el brazo largo del cromosoma 10. Los mapas genéticos
de papa y tomate son colineales

La región del cromosoma de P. infestans que contiene el grupo de genes Avr (avirulencia) está
presente en un estado hemicigótico, al igual que el locus para el tipo de apareamiento y otros loci
del genoma. Las regiones hemicigóticas incrementan variabilidad y pueden conducir a la pérdida
espontánea de caracteres fenotípicos particulares, como lo observó Al kherb et al., (1995) (cit por
Van der Lee et al., 2001a), quien descubrió un cambio repentino en la virulencia de la raza 1.4 a
1.3.4.7.11 en uno de los parentales luego del almacenamiento en nitrógeno líquido.

29
Abad (1983) observó que algunos aislamientos de papa con razas 1.3.7, 10.11, 1.11 y 0 al ser
pasados por pepino, tomaron la raza 1.4.11, 1.2.4.11, 1.4.10.11 y 1.4.11, pero no se manifestaron
los genes 3 y 7, mientras que los patotipos de papa se adaptaron mas rápidamente en pepino,
presentando razas complejas al igual que para papa, dando indicios de la adaptación del patógeno
no sólo para atacar un huésped, sino para originar nuevas razas más complejas. Sin embargo, en
tomate y S. dulcamera, fue necesario realizar varias inoculaciones sucesivas o transferencias (al
menos 3-4) para lograr la adaptación y esporulación del patógeno.

Esto podría deberse a deleciones espontáneas de los genes Avr. Además en aislamientos del
linaje clonal US-1, se encontraron deleciones en el locus M 5.1, lo que soporta la hipótesis de la
inestabilidad de dicha región. La posición del telómero, el estado hemicigótico y el alto número
de fragmentos repetidos en el cromosoma, puede resultar en la tasa mas alta de mutaciones, para
los genes localizados en esta región. (Van der Lee et al, 2001a)

3. Métodos Moleculares para la Caracterización de las Poblaciones

Hasta el presente se han desarrollado varios métodos moleculares para la caracterización de los
aislamientos de Phytophthora infestans, con diferentes grados de polimorfismo, los cuales se han
ido desarrollando y cada vez presentan una mayor posibilidad de discriminar los cambios en los
aislamientos por pequeños que sean.

Los marcadores moleculares son herramientas útiles para establecer o confirmar las hipótesis de
que las migraciones de P. infestans en el último cuarto de siglo, fueron las responsables de
desbordar los problemas de gota (tizón tardío) en muchas partes del mundo, por la resistencia al
metalaxyl, entre otros factores (Fry y Goodwin,1997a, citado por Smart et al., 2002).

Los estudios que involucran marcadores moleculares, han dado la posibilidad de detectar
nuevos tipos de especialización patogénica y han sido de gran ayuda para una mejor definición
del concepto de “linaje clonal”, el cual se refiere a un grupo de individuos descendientes
asexualmente de un ancestro común, pero los cuales pueden diferir entre si debido a la ocurrencia
de mutaciones. (Anderson y Kohn, 1995 cit Smart, et al 2002).

Los individuos dentro de un linaje clonal son probablemente mas parecidos que los no
relacionados, cuyas poblaciones son simples y clonales, con preferencia por un huésped (Smart,
et al 2000), situación observada en las investigaciones del Laboratorio de Estudios Moleculares
de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín. (Botero y Gilchrist, 1998; Jaramillo y
Gilchrist, 2002).

3.1. Patrones de Electroforesis de Proteínas Totales

Las proteínas extraídas del micelio de los aislamientos de Phytophthora se mueven a diferente
velocidad, a través de la matriz de un gel de almidones o poliacrilamida en un campo eléctrico.
Se utilizan como evidencia de una especie, pero dependen de condiciones del ambiente o del
control del desarrollo, razón por la cual no son necesariamente constantes.

Según Spielman et al., (1990) citado por Erwin y Ribeiro (1996), se han probado alrededor de
50 sistemas de enzimas diferentes en P. infestans, utilizando diferentes métodos de extracción,

30
buffers, condiciones de corrido y coloración, para lograr las máximas resoluciones de las cuales
11 enzimas resultaron monomórficas y 18 polimórficas, la mayoría ha presentado resolución muy
pobre o genéticamente tan complejas, no es posible deducir los genotipos de los patrones
electroforéticos observados

3.2. Patrones isoenzimáticos (Aloenzimas)

La isoenzima es una variante de una enzima que comparte la misma función catalítica en el
metaolismo celular. Las aloenzimas, son isoenzimas cuyas variantes son codificadas en el mismo
locus. Las aloenzimas también son alélicas, por lo tanto son ideales para investigar poblaciones,
porque los mejores métodos analíticos dependen del conocimiento de las frecuencias y
distribuciones alélicas (Spielman 1991, citado por Erwin y Ribeiro 1996).

Las isoenzimas se utilizan para identificar la diversidad genética dentro de poblaciones de


organismos: Se considera que los patrones de bandas isoenzimáticas son menos complejos que
los de proteínas totales y se pueden diferenciar e interpretar mas rápidamente, además son
estables, codominantes y generalmente están bajo control genético simple.

En el estudio de poblaciones normalmente se utilizan enzimas monoméricas o diméricas, ya


que las poliméricas, son difíciles de observar en cruces, puede haber mas de un locus que codifica
para la enzima y no se puede determinar que alelo pertenece a cual locus. En el caso de las
enzimas monoméricas, el producto genético es la unidad de la enzima activa, así que las
homocigotas presentan una banda y las heterocigotas presentan dos bandas.

En las enzimas diméricas, los productos genéticos iniciales son inactivos. La actividad
enzimática solo se presenta, cuando se unen dos productos o subunidades de un solo gen. Las
subunidades se combinan al azar, si se presentan dos clases diferentes, como podría ser el caso en
heterocigotas, se forman tres clases de moléculas enzimáticas activas: dos homodímeros
diferentes y un heterodímero. Así que las homocigotas tienen una sola banda pero las
heterocigotas poseen tres bandas.

Solo se ha presentado buena resolución para las isoenzimas glucosa fosfato isomerasa (Gpi) y
peptidasa (Pep), las cuales tienen control genético simple, con alelos mendelianos y fueron
polimórficas para las poblaciones que se reproducen sexual y asexualmente (Tooley, et al., 1995).
Tanto Gpi (siete alelos) como Pep (cinco alelos), producen patrones de bandas sobre geles típicos
de enzimas diméricas y si se cruzan parentales diferentes con una solo banda (homocigota), se
obtiene una progenie con tres bandas heterocigotas. Si dos heterocigotos idénticos se cruzan, se
observan tres clases de progenie (1 homocigota: 2 heterocigota: 1 homocigota). Si una
heterocigota es cruzada con una homocigota, se presentan los mismos dos genotipos en la
progenie en igual proporción. Algunas veces ocurren clases inesperadas en baja frecuencia por
autocruzamiento. (Spielman et al., 1990).

Castañeda y Morales (1996) evaluaron varios aislamientos madres y sus monospóricos


procedentes de cultivos de papa ubicados en el departamento de Antioquia, Colombia para Pep,
en el buffer de Robinson para la extracción y un buffer de electrodo tris-borato a pH 9, sin
observar polimorfismos, lo que indica la homogeneidad de estos aislamientos a este nivel.

31
En una investigación preliminar (Castañeda y Morales,1996) se observó que la £ y ß Esterasa
mostraron polimorfismo en dos aislamientos de Phytophthora infestans tomados de pepino
(colectado en Rionegro, Antioquia), la variedad ICA Cumanday de papa (San Pedro, Antioquia),
en comparación con uno de P. parasitica de tabaco (Nicotiana tabacum) proporcionado por el
Centro de Investigación y Desarrollo Tecnológico de COLTABACO, Colombia, lo que indica
que puede ser útil en estudios de caracterización inter e intraespecíficos.

Benavides et al, 2002, en una investigación realizada en el laboratorio de Estudios Moleculares


y repetida en El CIP, sede Quito, evaluaron 54 aislamientos colectados en cultivos de papa, de
diferentes municipios del departamento de Nariño (al sur de Colombia), en los límites con
Ecuador para le enzima Pep (peptidasa) en un gel de poliacrilamida, observando que al igual que
los aislamientos del departamento de Antioquia y los aislamientos testigo del Ecuador ( EC-1),
presentaban tres bandas, que representaban los alelos 96 y 100, correspondientes a una población
monomórfica heterocigota, con un genotipo 96/100 .

González y García (1998) evaluaron 84 aislamientos procedentes del altiplano Cundiboyacense,


los cuales presentaron el tipo de apareamiento A1, con fuerte heterotalismo y ninguno presentó
autofertilidad. Los valores para la Ec50 fueron mayores a 200 ppm, lo que indica una fuerte
presión de selección posiblemente por el uso inadecuado de los fungicidas. Al parecer hay
posible efecto de selección sobre el tipo de variedad y las cepas del patógeno, dado que se
observó una asociación de la variedad con la sensibilidad del patógeno al metalaxyl. Resultados
similares fueron observados por Argel (2002) con la evaluación de aislamientos procedentes de
dicha zona, colectados dos años después, los cuales presentaron una mayor proporción de
resistentes, frente a los de sensibilidad intermedia y sensibles.

Shattock et al. 1986 a,b citados por Erwin y Ribeiro 1996, determinaron que las características
isoenzimáticas, fueron inherentes a la progenie de oosporas del cruce sexual entre parentales
A1xA2 y la ocurrencia de la hibridación. Spielman et al,1989, 1990, 1991, utilizaron las
isoenzimas como marcadores de la distribución geográfica de tipos de P. infestans y encontraron
que los alelos Gpi 83, Gpi 98 y Pep 83, se presentaron únicamente en aislamientos del Centro de
México, y en frecuencias bajas a moderadas. Los alelos Gpi 90, Gpi 111 y Pep 96, se
encontraron en aislamientos de fuera del Centro de México.

García et al., (2000) encontraron en el Valle del fuerte noroeste de México que los aislamientos
de 1995, presentaron preferencialmente el apareamiento A2 y los patrones aloenzimáticos Gpi
100/111 y 100/100 y Pep 100/100 en todos los casos encontrados tanto en papa como en tomate.
Para 1996 la población muestreada fue prácticamente A1, con los patrones aloezimáticos Gpi
100/111, 100/122 y 111/122 y para Pep 100/100 excepto uno con 92/100. En 1997 sólo se
detectaron A1 con patrones isoenzimáticos Gpi 100/122 y 100/100 y papa Pep 100/100 y 92/100,
con respuestas variables frente al metalaxyl. La reproducción fue básicamente asexual y las
variaciones se debieron a la introducción con los tubérculos de papa.

Los 26 aislamientos de P. infestans colectados en Ecuador en S. brevifolium y S. tetrapetalum,


caracterizados como pertenecientes al tipo de apareamiento A2 (Ordoñez et al, 1998) y unos
pocos patogénicos de papa y tomate, presentaron un patrón de bandas Pep de 83/100, el cual fue
diferente al de los aislamientos tomados de tomate 92/100 y papa 96/100. Para Gpi todos los
aislamientos presentaron un patrón de 100/100 , mientras que en los de tomate fue de 86/100, con
un haplotipo I-b y un tipo de apareamiento A1 (Oyarzún et al.,1997).

32
En 1990, Spielman et al., citado por Erwin y Ribeiro,1996, encontraron que los aislamientos de
P. infestans pudieron haberse caracterizado por aloenzimas como las poblaciones “viejas” (antes
de que se hubiese encontrado el tipo de apareamiento A2 por fuera de México) y las “nuevas”
poblaciones, (después de que A2 se reportó por fuera de México). Cada población fue única para
los alelos aloenzimáticos y genotipos. Concluyeron que el cambio de la población en Europa, fue
probablemente el resultado de la migración de nuevos biotipos y no de una mutación. Se han
realizado varios estudios de migración de poblaciones desde México a otras partes del mundo,
utilizando las características isoenzimáticas (Fry et al.,1991, Goodwin et al., 1994, Fry y
Goodwin, 1995).

3.3. Análisis del Producto de la Trascripción (Northern blot) y la


Traducción (Southern blot)

Estos sistemas son utilizados para determinar la resistencia que puede ser transmitida a las
plantas por los genes R, mediante la extracción del DNA de hojas de plantas solanaceas digeridos
con la enzima EcoV5 seguida por la electroforesis, cuyo producto fue transferido a una
membrana Hybon-N+ para la hibridación con varias sondas.

Para el análisis de expresión, la tercera, cuarta y quinta hojas completamente desarrolladas de


plantas sanas no inoculadas fueron cosechadas y guardadas en Nitrógeno líquido. Se realizaron
dos series independientes de RNA. Cada muestra de 15 µg de RNA fue cargada para la
electroforesis y luego tansferida a una membrana Hybon-N+. Tanto el Northern blot como el
Southern blot se hibridaron a la par con las sondas que representaban los genes PR-1, PR-2 y PR-
5 y tubulina a 65, 60, 60 y 65ºC respectivamente y fueron lavadas 1, 0.5, 0.5 y 1xSSC
rigurosamente. Los niveles de mRNA fueron determinados del Northern blots utilizando un
analizador Fuji Bio-Imaging. Las señales fueron cuantificadas por un estímulo fotoluminiscente
(PSL) por mm2 (Vleeshouwers et al., 2000).

Las sondas utilizadas para la detección de los genes arriba señalados fueron: un fragmento de
400 bp Eco R-I/KpnI de StPR-1, un clon PR-1 cDNA de papa, un fragmento de 1.300 bp Eco R-
I/Xho1 de un clon c DNA de una glucanasa ácida de tomate, un fragmento amplificado por PCR
de un DNA genómico de tomate para PR-5 y un fragmento de 1.800 bp Eco R-I/Xho1 de un clon
cDNA pFB19 que codifica para tubulina de papa ( Vleeshouwers et al., 2000).

Mucha de las plantas Solanum evaluadas, mostraron niveles variables y significativos de


raza/aislamiento no específico con resistencia parcial a cinco aislamientos de P. infestans de
diferentes origenes. Los noveles de mRNa constitutivos de los genes PR-1, PR-2 y PR-5
relacionados con la patogenicidad, en hojas no infectadas varió entre los clones de Solanum. A
nivel de género no se observó correlación entre los niveles basales de PRmNRA y la resistencia,
pero sí en el nivel de las especies S.arnezii x hondelmannii, S. microdontum, S. sucrense y S.
tuberosum. Los mayores niveles de expresión de genes R fueron para la variedad mas resistente
Robijn, intermedio en las parcialmente resistentes Première, Estima y Ehuh y el más bajo en la
susceptible Bintje.

Los resultados de la investigación indican que la diferencia entre compatibilidad e


incompatibilidad es del tipo cuantitativo mas que cualitativo (genes R). Sin embargo, el modelo
clásico de un gen R de resistencia del huésped por un gen Avr de avirulencia en el patógeno, se
puede utilizar para explicar el carácter cuantitativo de la resistencia parcial. Existe la posibilidad
33
de que un gen débil R-10 de la papa, interactúe con un gen Avr y desarrolle niveles alterados de
la resistencia, que permiten alguna colonización del patógeno bajo ciertas condiciones. Además
los PRmRNAs, pueden servir como marcadores moleculares en los programas de mejoramiento
genético de la papa (Vleeshowuers, et al., 2000).

3.4. Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción RFLPs


para análisis de los genomas nuclear y mitocondrial

Esta técnica ha sido utilizada en estudios de poblaciones y evolución biológica.

En hongos permite establecer las relaciones entre géneros y aislamientos de las especies. Carter
et al. (1990), evaluaron el DNA mitocondrial de 24 aislamientos procedentes de 11 países y
encontraron cuatro tipos de polimorfismos utilizando un rango pequeño de endonucleasas de
restricción. Estos polimorfismos del DNA mitocondrial deben ser analizados conjuntamente con
los RFLPs del DNA nuclear, para lo cual se utiliza la sonda marcada RG 57, con el fin de
determinar la huella del genoma nuclear (Goodwin et al.,1992).

Se extrae DNA de origen mitocondrial o nuclear y se trata con enzimas endonucleasas que
cortan las moléculas de DNA en sitios específicos. Los fragmentos que resultan se clasifican por
tamaño mediante electroforesis sobre geles, los cuales pueden ser fotografiados y evaluados, con
el fin de depurar la información obtenida con las isoenzimas o las características morfológicas y
fisiológicas.

Se secuenció el genoma completo de la mitocondria de P infestans y se encontró que tenía


37.957 pares de bases. Como un excelente indicador filogenético se determinó el gen 4Lnad, el
cual codifica la subunidad del complejo mitocondrial NADH deshidrogenasa y Chesnick et al.,
(1996) citado por Smart et al., (2002) fueron capaces de resolver diferencias evolutivas entre las
plantas terrestres, hongos verdaderos y straminopilos y dentro de estos pudieron diferenciar P.
infestans de Chrysodidimus synuroides y Ochroma danica.

Los análisis de la digestión con enzimas de restricción del DNA mitocondrial, también han sido
útiles para comparar las especies estrechamente relacionadas P infestans, P. mirabilis y P.
phaseoli, indicando que esta última tiene diferentes sitios de restricción que para las dos
primeras, las cuales difieren entre sí por un sitio de restricción (Moller et al, 1993, citado por
Smart, 2002) y la utilización del nitrato de sodio como fuente nitrogenada en el caso de P.
mirabilis. Posteriormente Gavino (1998) demostró un mayor número de diferencias entre estas
dos especies que dentro de diferentes aislamientos de P. infestans.

Para P. infestans se utilizan las enzimas de restricción Cla I, Eco RI, Bgl II, Bcl I. Los patrones
de DNA mitocondrial de aislamientos de varios países mostraron diferencias que fueron útiles
para identificar el origen de varios aislamientos y su grado de afinidad. Un inserto de DNA de
aproximadamente 2 Kbp se observó en el DNA mitocondrial de aislamientos de Brasil, Egipto,
Reino Unido y Estados Unidos, lo que sugiere que este biotipo tuvo una distribución global.

Shaw y Wattier (2002), indican que los marcadores moleculares han revelado que en muchas
zonas cultivadas con papa predomina la población con el viejo genotipo US-1. En otras áreas las
poblaciones están compuestas de uno o unos pocos genotipos o linajes clonales, ampliamente
dispersos y que persisten cada año. En otras zonas puede predominar un sólo linaje clonal, pero

34
puede detectarse un cambio genético a nivel de DNA nuclear o mitocondrial en unos pocos
individuos.

En el noroeste de México, García et al., (2000), determinaron el patrón de RFLP perteneciente


al linaje clonal US-7 con variantes en los años posteriores y concluyeron que la reproducción fue
sólo asexual y los cambios que se presentaron fueron debidos a la introducción de nuevos
aislamientos con tubérculos-semilla de papa. Los aislamientos fueron igualmente agresivos en
papa y tomate, dado que comparten el mismo nicho ecológico, en cuyo caso las poblaciones no se
separan por huésped.

En Nepal, Ghimire et al. (2003) caracterizaron aislamientos de cultivos de papa y tomate


durante 1999-2000, por la sonda RG57 del DNA nuclear y detectaron 11 genotipos multilocus en
280 aislamientos, de los cuales tres genotipos constituyeron el 94% de la población total,
mientras que otros genotipos tuvieron muy baja frecuencia (0,004-0,014), el genotipo NP-3
presentó una huella por la sonda RG57, idéntica a la de US-1, con un haplotipo mitocondrial I-b,
confirmando la presencia del linaje clonal mas antiguo de P. infestans en ese país.

A pesar de que el índice de diversidad de genotipos de Gleason fue muy bajo (1.78), con
relación al último índice calculado para Antioquia (4,26) Colombia, por Gilchrist et al. (2003), la
mayor parte de los genotipos presentaron huellas dactilares con RG57 diferentes a US-1, junto
con el haplotipo mitocondrial I-a, lo que significa la presencia de nuevas poblaciones, que están
desplazando las viejas poblaciones, como sucede en diversos países, posiblemente como producto
de las introducciones en los tubérculos-semilla (Ghimire et al., 2003).

Hay nuevos métodos con marcadores moleculares disponibles que prometen definir mas
claramente la forma como va evolucionando el patógeno, y como hacer un mejor control, es el
caso de microsatélites y polimorfismos de un solo nucleótido, marcadores codominantes, que a la
par con la isoenzimas permiten determinar la frecuencia de alelos y cuantificar la recombinación.
Igualmente los nuevos marcadores del DNA mitocondrial, detectan genotipos adicionales, los
cuales no están influenciados por el sexo y por lo tanto son útiles para trazar linajes a través de la
distancia y el tiempo ( Shaw y Wattier, 2002).

3.5. Haplotipos Mitocondriales (RFLP-PCR)

Carter (1990) utilizó la técnica de RFLPs para determinar cuatro haplotipos del DNA
mitocondrial (I-a y I-b, II-a y II-b) de 24 aislamientos procedentes de 11 paises. Luego se utilizó
la técnica de PCR-RFLP para detectar dichos haplotipos en 90 aislamientos procedentes de Rusia
y el Reino Unido. En 1991, Goodwin descubrió cuatro haplotipos por la técnica de southern,
determinando los haplotipos A,B,C y D entre 173 aislamientos procedentes de México, Perú y
Europa.

Griffith y Shaw (1998) diseñaron cuatro pares de “primers” para la amplificación de PCR, de
regiones polimórficas conocidas del genoma mitocondrial, de P. infestans. La digestión de los
productos amplificados con enzimas de restricción, permitió la identificación de los haplotipos
previamente establecidos. El producto del corte P2 con Msp1 únicamente identificó los
haplotipos I-b y II-a, mientras los haplotipos I-a y II-b fueron diferenciados por la digestión del
producto P4 con Eco R1. Las digestiones de los productos P1 y P3 dieron resultados similares a
los obtenidos con la digestión de P4, pero la amplificación de estos productos fue menor. Por lo

35
tanto los cuatro haplotipos comunes son identificados por amplificar y digerir los productos P2 y
P4 (figura 1), cuyo DNA puede ser extraído directamente de los foliolos de papa y tomate con
pequeñas lesiones de tizón tardío, lo que permite monitorear de manera rápida y eficiente la
población de P. infestans.

Figura 1. Representación del genoma mitocondrial de P. infestans. Ilustra la ubicación de


varios productos de la amplificación (según Griffith y Shaw, 1998).

Koh et al 1994, citados por Gavino y Fry (2002), encontraron dos haplotipos diferentes
utilizando el método de Goodwin en 124 aislamientos del Oeste del Asia, los cuales
denominaron E y F. Con el propósito de unificar criterios en torno a los haplotipos
mitocondriales, dichos investigadores propusieron un esquema de relaciones entre los diferentes
sistemas de haplotipos, según se ilustra en la figura 2.

Existen dos sistemas de nomenclaturas para seis haplotipos del DNA mitocondrial de P.
infestans. Los haplotipos I-a y I-b (grupo I de Carter) fueron determinados por el método PCR-
RFLP adaptado por Griffith y Shaw (1998), al parecer corresponden a los haplotipos A de
Goodwin (1991). Los haplotipos II-a y II-b corresponderían a los haplotipos B de Goodwin
(1991). El haplotipo C difiere del A por una inserción y el D por tener varias mutaciones. Los
haplotipos E y F de Koh fueron incluidos en el haplotipo I-b. El haplotipo E (I-b) tiene una
deleción con respecto al haplotipo A (I-a) y el F (I-b) tiene una inserción. (Gavino y Fry, 2002).

36
Figura 2. Relaciones entre los haplotipos de DNAs mitocondrial I-a, I-b, II-a y II-b por Carter
y A, B, E y F por Goodwin fueron reconciliadas y conformaron los grupos I y II, con base en el
diagrama de Griffith y Shaw (1998). El haplotipo I-b(A) muestra un mapa de restricción Eco R1
(círculo interno) basado sobre la secuencia completa del DNAm de P. infestans. Los fragmentos
de 1-10 corresponden a los siguientes tamaños: 1=7.6Kb, 2=5.7Kb, 3=0.4Kb, 4=6.5Kb,
5=3.3Kb, 6=4.4Kb, 7=4.7Kb, 8=2.9Kb, 9=0.6Kb y 10=1.5Kb. Las regiones (en negro) P1, P2,
P3, P4, P5, P6 y P7 amplificadas y analizadas para polimorfismos. Las inserciones ( )fueron
encontradas en los haplotipos I-b(E) y I-b(F), II-a(B) y II-b(B). Las sustituciones de un solo
nucleótido ( ) que resultan en la ganancia (+) o pérdida -) ( de sitios de restricción fueron
detectados en P1, P2, P4 y P6 por secuenciamiento. El número de sustitución de nucleótidos ( )
y de inserciones ( ) que difieren entre los haplotipos son indicadas en las ramas que conectan
los haplotipos. (Tomado de Gavino y Fry, 2002).

37
A su vez el haplotipo I-b de Carter difiere del I-a por el cambio de un nucleótido (CxT) y se
pierde un sitio de restricción Msp 1(-) y I-a o I-b, podría ser el haplotipo mitocondrial ancestral
de los demás genotipos por mutaciones, razón por la cual concluyeron que el haplotipo
mitocondrtial en dicha zona es momomórfico. En el grupo II, el haplotipo II-a difiere de I-b por
un inserto de 2Kb en P5. Además hay cambios en P4 (CxT) Eco R1 (-); en P2 (TxC) (+) y (CxT)
(-) Msp1; en p1 (CxT) Cfo (-) y en P6 (AxT). El haplotipo II-b difiere de II-a por cambios en P6,
así (AxT) y (GxA) lo que indica la sustitución de dos nucleótidos (Figura 2).

Según Gavino y Fry (2002) el haplotipo I-a, asociado a los linajes clonales US-7 y US-8, y
varios linajes de Perú, Argentina , Brasil, Ruanda e Israel, se ha encontrado en aislamientos de
papas cultivadas del valle de Toluca y cinco aislamientos de especies silvestres en México, lo que
indica que la población de esa zona tiene una diversidad de DNA mitocondrial muy limitada,
pues los cinco aislamientos de las especies silvestres tuvieron exactamente los mismos 182 bp en
la región P2.

El haplotipo I-b no se ha encontrado en ningún aislamiento procedente de México, pero


posiblemente es el origen ancestral de los demás haplotipos mitocondriales y está asociado
exclusivamente a las huellas con la sonda RG57 del DNA nuclear, encontradas únicamente en el
linaje clonal US-1 presente en las colecciones mas viejas de Estados Unidos, Perú y Holanda.
Difiere del haplotipo I-a, por el cambio de un nucleótido (CxT) y se pierde un sitio de restricción
Msp1 (-) el cual difiere de I-b (E) por un inserto de 0.8 Kb y de I-b (F) por un inserto de 0.4 Kb.
Las variantes E y F sólo han sido observadas en Filipinas (Gavino y Fry, 2002).

El haplotipo II-a se ha reportado en Japón y Corea, asociados al linaje (JP-1), Sur América y
Europa. Sin embargo, el haplotipo II-a no se encontró en Norte América. Los haplotipos I-a y
II-a estuvieron presentes en Europa entre diversos genotipos del DNA nuclear que contenían los
tipos de apareamiento A1 y A2. El haplotipo II-b solo se ha encontrado asociado al genotipo o
linaje clonal US-6, en Mochis al noroeste de México y al oeste de Norteamérica. La diferencia
entre los haplotipos II-b y II-a está en la sustitución de dos nucleótidos (AxT) y (GxA) (Gavino y
Fry, 2002).

Esta técnica fue utilizada por Knapova et al., (2002), para determinar los haplotipos
mitocondriales en aislamientos de P. infestans colectados en papa y tomate, en Suiza, Francia y
Alemania. En dicha evaluación utilizaron como referencia los aislamientos cuyo genotipo
nuclear correspondía a US-1, US-7, US-8 y los aislamientos Europeos EU-49 y EU-414 y la
progenie de dos aislamientos de campo compatibles de origen suizo, encontrando que el 93% de
las poblaciones de P. infestans europeas presentaban el haplotipo I-a (168 aislamientos
colectados en los últimos 4 años). El haplotipo clonal antiguo I-b, solo se encontró en el 2% y el
haplotipo II-a, en el 5% de los aislamientos evaluados.

Dichos investigadores indican que la progenie obtenida del cruce A1 (T04.97) y A2 (P317) fue
principalmente uniparental y posiblemente materno, pues sólo dos descendientes de los 27
evaluados, presentaron un patrón diferente propio de la mitocondria paterna. Situación similar
observaron Gavino y Fry (2002) en los aislamientos del centro de México donde solo se observó
el haplotipo I-a, en contraste con la expectativa de encontrar alguna diversidad mitocondrial que
coincidiera con la mayor diversidad nuclear.

Flier et al., (2003) señalan que de 170 genotipos colectados en papas comerciales, especies
silvestres nativas de Solanum, S. demissum y S. xedinense, colectadas en el valle de Toluca,
38
México, presentaron el haplotipo mitocondrial I-a, como lo observaron Gavino y Fry (2002).
Para el estudio separaron el origen de los aislamientos en tres poblaciones: los de papas
comerciales en el valle de Toluca, los de cultivos de subsistencia en las laderas del Nevado y los
de las especies silvestres de las zonas boscosas de la ladera del nevado de Toluca, las cuales
mostraron un alto grado de diversidad genética, cuyo número de polimorfismos varió de 20 a
62.4% de los aislamientos colectados en los cultivos y especies silvestres.

Con base en el análisis de las poblaciones encontraron que las líneas procedentes de papas
cultivadas presentaron una diferencia significativa con respecto a las líneas o aislamientos de
especies silvestres de Solanum (0.001-0.022) y se observaron alelos únicos en individuos de las
tres poblaciones en un número que varió de 9 a 16 para aislamientos colectados de cultivos
comerciales de papa y de especies silvestres de Solanum respectivamente..

Hay un flujo de genes restringido entre poblaciones de P. infestans de papas cultivadas y de


especies silvestres. Ellos proponen la hipótesis de que la diferenciación de poblaciones y
aislamiento genético de P. infestans en el valle de Toluca, centro de México, se debe a factores
de interacción específica con el huésped (como genes R) ampliamente distribuidos en especies
silvestres de Solanum y deriva (rumbo) genética al azar. Encontraron cuatro marcadores
exclusivos de aislamientos procedentes de S. demissum (Flier, et al., 2003).

Gavino y Fry (2002) proponen la hipótesis de que la presencia de un solo linaje clonal se debe a
la selección, que actúa sobre el DNA mitocondrial de P. infestans, cuyo mecanismo no se conoce,
pero que podría estar relacionado con la selección del DNA mitocondrial de P. infestans
colectados de plantas de papa que crecen bajo diferentes condiciones ambientales y de especies
silvestres, lo que fue señalado para Mycosphaerella graminicola, en el cual se presentó una
variación limitada del DNA mitocondrial, a medida que la población se fue especializando para
infectar el trigo.

Si un evento similar ocurrió en el patosistema P. infestans/Solanum, se necesita explicar la


amplia distribución mundial del haplotipo I-b en papa y I-a en diversas solanáceas en México
Central, para lo cual Gavino y Fry (2002) proponen tres mecanismos:

El haplotipo I-b presente en los aislamientos de papa, puede estar ligado a un genotipo nuclear
particular.

La ocurrencia del haplotipo I-a sobre diversas solanáceas nativas en el centro de México, podría
explicarse por la influencia de una zona extensa con producción muy intensiva de cultivos de
papas, a partir de la segunda mitad del siglo XX. Las progenies de un cruce de aislamientos con
un haplotipo mitocondrial I-a y un haplotipo I-b, podría producir una población de individuos
genéticamente diversos que contiene el haplotipo I-a o I-b, lo que indica que no hay un efecto
nuetral del haplotipo del DNA mitocondrial.

Las pruebas de eficacia patogénica sobre esta progenie, similares a las realizadas por Day y
Shattock (1997), podrían revelar diferencias patogénicas atribuibles a los haplotipos
mitocondriales. Tales pruebas requieren el desarrollo de su propia progenie. En Colombia se ha
observado el predominio del haplotipo II-a en aislamientos colectados de plantas de papa y del
haplotipo I-b de tomate. Los haplotipos se originaron todos de un solo linaje (Gavino y Fry,
2002) y han venido cambiando (mutando) posiblemente por efecto de los huéspedes y la
evolución colineal de los mismos, presentándose preferencias en la relación huésped-patógeno

39
Los haplotipos pueden ocurrir en diversos DNA nuclear. Los haplotipos I-a y II-a se presentan
en diversos genotipos del DNA nuclear (linaje clonal), pero el haplotipo I-b y II-b están
estrechamente asociados a linajes clonales. Es así como el I-b solo se encontró en el linaje clonal
US-1 y sus variantes (número reducido de mutaciones entre individuos).

El haplotipo II-b se encontró en individuos que presentaban el linaje clonal US-6 con tipo de
apareaminto A1 y sin derivados (Gavino, 1999; 2000), cuya distribución se ubicó en el noroeste
de México y oeste de Norteamérica. Griffith y Shaw (1998), solo encontraron el haplotipo II-b en
USA y Canadá en los dos tipos de apareamiento (A1 y A2)., con muestras diferentes a las de
Gavino y Fry (2002).

Recientemente se observó el linaje clonal US-11,en el cual se presenta el haplotipo II-b, el cual
pudo surgir por recombinación sexual con US-6 (Gavino et al., 2000). Al parecer el DNA
mitocondrial de los Oomycetes y sus parentales, está evolucionando lentamente en contraste con
el de hongos verdaderos, en los cuales se presentan intrones, los cuales no existen en P. infestans
y P. megasperma. Estos dos patógenos y las formas especiales de P. megasperma f. Sp. glycine,
f.Sp. medicaginis y P. parasitica var nicotianae, presentan las mismas secuencias para los cuatro
genes del DNA mitocondrial. La conservación de las secuencias es consistente con el hecho de
que mas del 95% del genoma mitocondrial de P. infestans codifica para genes (Forster et al.,
1987, Poquín et al.,1997, citados por Gavino y Fry, 2002).

La diversidad del haplotipo I-b (A), I-b (E) y I-b (F) es consistente con las hipótesis de que es
el haplotipo mas viejo y que el linaje clonal US-1, en el cual se presenta dicho haplotipo, es el
mas antiguo de los linajes existentes. Por otro lado, se plantea la hipótesis de selección para el
haplotipo I-a en el valle de Toluca, México (Gavino y Fry, 2002).

En aislamientos de P. infestans colectados en Antioquia y norte de Santander, Jaramillo, et al.,


2002a, encontraron que la gran mayoría de los aislamientos evaluados presentaron el haplotipo
II-a y poco aislamiento presentaron el haplotipo I-b, lo que indica una posible transición de una
población antigua a otra mas reciente y asociada a una mayor resistencia a metalaxyl. En las
zonas marginales bajas para papa en las cordilleras de los Andes, se desarrollan cultivos de
tomate, los cuales pueden ser afectados por gota, con posibilidad de transporte de esporangios de
lotes cercanos con el haplotipo I-b mas frecuente en tomate hacia los lotes de papa.

Maldonado y García (2000), Calderón et al. (2002) encontraron que todos los aislamientos
procedentes de cultivos de papa de Cundinamarca y Boyacá (región centro-oriental de Colombia)
presentaron el haplotipo mitocondrial II-a. Esto demuestra la homogeneidad de las poblaciones
en Colombia, asociada a la reproducción asexual del patógeno, corroborada por dichas
investigaciones mediante la técnica de PCR con “Primers” específicos S1A asociados al estado
hemicigótico A1 y en el segundo caso, además, por cruces consigo mismos y con un aislamiento
previamente caracterizado con el tipo de apareamiento A1, en medio agar-centeno.

Ordoñez et al., (2000) encontraron que la nueva población EC-2 de P. infestans caracterizada
por el tipo de apareamiento A2, no pudo clasificarse dentro de los sistemas de haplotipos
mitocondriales previamente descritos, lo que indica la posibilidad de un nuevo haplotipo del
DNA mitocondrial, el cual posteriormente (Oliva et al., 2002), lo refirieron a un haplotipo I-c.
Existe la posibilidad de que esta población sea nativa de Ecuador y/o zonas ecológicas similares
en los países andinos, dado que comparten ecosistemas y especies silvestres de Solanum.

40
May y Ristaíno (2002), amplificaron el DNA con un par de “primers específicos” PIN/HERB1
para P. infestans en plantas de siete herbarios de los siglos XIX y XX y encontraron que el 87%
de las hojas estaban afectadas con dicho patógeno, pues amplificaron un fragmento de 100 bp, el
cual fue evaludo con primers específicos para los haplotipos mitocondriales. Ellos observaron
que sólo un especímen procedente del Ecuador, contenía el haplotipo I-b, con predominancia para
el haplotipo I-a, en las muestras mas antiguas de Estados Unidos, Inglaterra, Irlanda y Francia.

3.6. Método AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

Fue utilizado originalmente por Van der Lee et al., (1997) para elaborar el primer mapa
genético de ligamiento del DNA de P. infestans y posteriormente por Knopova et al. 2002, para
caracterizar aislamientos europeos, utilizando marcadores fluorescentes. Los mapas genéticos
permiten posicionar el clonaje de genes ligados a fenotipos particulares, entender las relaciones
evolutivas entre los organismos y analizar los rearreglos dentro del genoma.

La técnica de las huellas AFLP-DNA tiene como ventaja la posibilidad de evaluar muchos
marcadores en un sólo experimento, con una combinación de “primers”, sí el número posible de
combinaciones con el primer E+2/M+2 es 256 y por lo tanto, se pueden generar 4.500
marcadores mas con la combinación de enzimas EcoRI/MseI.

El número de fragmentos amplificados depende del tamaño del genoma, la frecuencia de corte
de las enzimas, y el número y naturaleza de las bases selectivas adheridas a los cebadores o
“primers” de la PCR. Con el fin de optimizar a las condiciones para las huellas AFLP de P.
infestans, Van der Lee et al., 1997, variaron: i) Las enzimas de restricción (cortan cuatro pares
de bases) para digerir el DNA genómico, ii) el número de bases selectivas (2 o 3) y iii) los
perfiles del ciclo en los pasos de preamplificación y amplificación.

A pesar del gran tamaño de los fragmentos MseI la mejor combinación de las enzimas para las
huellas digitales por AFLP con el menor background parece ser EcoRI/MseI. La mayor
resolución fue obtenida con un gel separador de poliacrilamida al 4%. La mejor PCR fue corrida
con cebadores que contenían los 3’nucleótidos selectivos E+2/M+2. Se variaron las temperaturas
y el número de ciclos de la PCR. En dicho trabajo se obtuvieron 183 marcadores de AFLP, se
mapiaron 7 marcadores RFLP y el locus del tipo de apareamiento. (Van der Lee et al., 1997).

El mapa genético de ligamiento comprende 10 grupos mayores (I-X) con marcadores A, B y H


que podrían representar los cromosomas de P. infestans, están compuestos de los marcadores
derivados de ambos padres y presentaron segregación mendeliana, mientras otros siete grupos
menores contienen los marcadores del tipo de apareamiento (A1 o A2) de los parentales (I-X),
pero no se encontró segregación mendeliana para el tipo de apareamiento y sólo 13 marcadores
de AFLP muestran distorciones claras en las relaciones de sgregación, los cuales se originaron
del parental A1 y mapiado sobre LG III, el grupo de ligamiento que contiene el locus del tipo de
apareamiento. Se destaca que el parental A1 sólo tiene un locus heterocigoto dominante, el cual
no segrega como las relaciones mendelianas (Aa x aa) (Van der Lee et al., 1997).

Knapova et al. (2002) encontraron que con 31 marcadores AFLP se detectaron 43 genotipos
diferentes entre 83 aislamientos evaluados. Prácticamente cada dos aislamientos evaluados,
presentaban un genotipo diferente. Estos resultados demostraron una alta diversidad de las
poblaciones de P. infestans, pero ninguno de los aislamientos europeos evaluados perteneció al

41
antiguo genotipo (US-1, EU 49 y EU 314) ni a los nuevos genotipos (US-7, US-8 hallados por
Goodwin et al., 1992).

De 170 aislamientos del valle de Toluca, se determinaron 158 genotipos AFLPs multilocus, lo
que indica una alta variabilidad genética y cada aislamiento prácticamente está representado por
un único genotipo basado en el análisis de 165 loci con marcadores AFLP. Un promedio de
81.8% (135) de los loci AFLP fueron polimórficos y la heterocigocidad varió de 7,7 a 19,4%
(Flier et al., 2003).

Según Knopova et al., (2002) el patrón de bandas encontrado en la progenie también apareció
en las poblaciones de campo. La herencia de los marcadores AFLP en la F1, fue principalmente
de segregación mendeliana (excepto el marcador 411) y la distribución del tipo de apareamiento
A1:A2 fue 1:1. Este método presentó el mas alto polimorfismo para aislamientos individuales,
observación hecha por Pérez et al., (1997-1998), en aislamientos de P. infestans del Perú, al
comparar los dendrogramas derivados del análisis de RFLP usando la sonda RG57 y las huellas
de AFLP.

Se esperaba que con el mapa de ligamiento de P. infestans y la disponibilidad de la tecnología


de marcadores AFLPs, se pudiera analizar la herencia de fenotipos (a)virulentos y clonar los
genes de avirulencia (Van der Lee et al., 1997), lo cual se logró cuatro años mas tarde, pues
encontraron que la detección de un fragmento ubicado en el grupo VIII de ligamiento y que
corresponde a Avr3-Avr10-Avr11 se correlaciona con los genes de resistencia R3, R10 y R11 de
los clones diferenciales de papa (Van der Lee et al., 2001a)

Van der Lee et al. (2001a), encontraron la sonda o marcador (AFLP) M5.1, ligada al grupo de
genes Avr3-Avr10-Avr11 que híbrido sólo con el padre y la progenie de P. infestans que
presentaba características de avirulencia sobre clones de papa, con los respectivos genes de
resistencia R3, R10 y R11. Dicho grupo de genes avirulentos está localizado sobre la parte distal
de grupo de ligamiento VIII, según el mapa genético de P. infestans.

3.7. Marcadores Microsatélites

Los marcadores microsatélites fueron desarrollados para P. infestans usando una librería
genómica para este patógeno, enriquecida con una secuencia simple de repetición (TC)n, como lo
describió para Venturia ineaqualis Tenzer et al., (1999) citado por Knapovaet al., (2002). Los
clones positivos fueron secuenciados y los loci de los microsatélites únicos identificados. En
total se seleccionaron seis marcadores microsatélites para caracterizar los aislamientos de P.
infestans (Knapova et al., 2002).

De los seis marcadores microsatélites, tres mostraron polimorfismo para los aislamientos
evaluados. En total se identificaron 20 alelos diferentes en tres loci. La diversidad genética
calculada de acuerdo con el índice de Nei (1973) fue mas alta en los loci 4G y G118 (0.65 y 0.66
respectivamente) que en el locus 4B (0.30). Con los dos microsatélites Pi4G y Pi4B, se
identificaron 26 genotipos de P. infestans de 175 aislamientos europeos evaluados.

Los genotipos viejos y nuevos de P. infestans no fueron detectados entre los aislamientos
Europeos. Los cruces de los dos aislamientos de campo compatibles generaron los mismos
genotipos identificados en las poblaciones de campo, sugiriendo que emergen al menos

42
parcialmente de las recombinaciones sexuales. Los microsatélites son un método rápido,
específico y reproducible para identificar los genotipos en las poblaciones. (Knopova et al.,
2002).

3.8. ITS Regiones espaciadoras transcritas

Permiten la diferenciación de especies dentro de un mismo grupo, por el análisis de los regiones
espaciadoras de los genes del DNA ribosomal, pero no dentro de la especie, pues dentro de un
mismo grupo no se diferencian P. infestans, P. mirabilis y P. phaseoli, pero sí de P. elicis, P.
colocacie y P. hibernalis. (Briard, et al.,1995).

Ordoñez et al., 1998, determinaron si la región ITS2 del DNA ribosomal de los aislamientos
tomados de lesiones típicas de tizón tardío, que crecían en dos especies silvestres de Solanum, en
el Ecuador, con tipo de apareamiento A2, pertenecían a P. infestans. Utilizaron los primers
específicos ITS3 y PINF2 y una muestra de 10ng de DNA extraída según el procedimiento
propuesto por Tooley et al. (1997) y encontraron que todos los aislamientos que habían sido
ubicados en el tipo de apareamiento A2 amplificaron, confirmando que pertenecían a dicha
especie.

Clonaron la región ITS 2 del aislamiento 1836 de S. brevifolium utilizando el “kit” de clonación
“Invitrogen Original TA Cloning”; la región del DNA clonada fue purificada con el sistema de
purificación de Promega “WizardT M Plus Minipreps”. Las digestiones del plásmido con el
inserto fueron hechas con EcoR1 y los productos se corrieron en un gel de agarosa al 1% con el
buffer TAE (0.04 M tris-acetate,0.001 M EDTA pH 8.0). El tamaño del inserto se comparó con
el del producto PCR amplificado. La región ITS2 clonada del rDNA del aislamiento 1836 fue
secuenciada utilizando el “dsDNA Cycle Sequencing System from Gibco BRL (Gaitherburg,
MD) y luego alineado con otras 14 especies de Phytophthora para identificar cualquier diferencia
en los nucleótidos, encontrando que sólo difería en dos nucleótidos de la secuencia publicada
para P. infestans (Ordoñez et al., 1998).

3.9. Nuevos cebadores (primers) para la detección de Phytophthora


infestans por PCR

Dado que los ITS del DNA ribosomal y otras secuencias con pocas copias no son tan precisas
para determinar la infección inicial con P. infestans, de cultivos de papa y tomate, puesto que
pueden repetirse entre 1.000-3.000 veces en el genoma, se optó por evaluar secuencias en las
familias de DNA con alto número de copias (Primers O8-1/O8-4 con 260 bp), basados en la
hibridación específica, logrando una detección de hasta 10 fentogramos de P. infestans, 100
veces mas preciso que los ITS. Pero para incrementar la certeza del diagnóstico, se desarrolló un
control positivo utilizando un simulador de amplificación (0,2 fentogramos de un plásmido
plantilla, 54 bp), que servió como competidor para la PCR cuantitativa. Se compararon los
resultados de dos laboratorios con diferencias, que deben ser consideradas en las aplicaciones de
los diagnósticos, en cualquier sistema. (Judelson y Tooley, 2000).

43
3.10. Marcadores de polimorfismo del DNA amplificado al azar ( Random
amplified polymorphic DNA, RAPD)

Según Mahuko, et al., (2000), se utilizan para detectar variación genética entre la población de
P. infestans durante periodos de cambio rápido, para lo cual evaluaron 40 cebadores (primers) y
seleccionaron seis, que exhibieron polimorfismos y patrones de bandas consistentes. El primer
OPE-4 permitió detectar la mayor cantidad de haplotipos RADP y el análisis de correspondencia
múltiple los separó en 21 grupos. Los polimorfismos resultan de cambios de secuencia por
deleciones, inserciones, sustituciones o inversiones.

La variación promedio dentro de un grupo fue del 80% y entre grupos del 61%. La mayoría de
los grupos tenían ambos tipos de apareamiento, pero no se observó correlación entre los
marcadores RADP y los orígenes geográficos de los aislamientos, ni con los genotipos
previamente descritos (Gpi), el tipo de apareamiento y la resistencia al metalaxyl, puesto que los
marcadores RADP, detectan la variación que es distribuida a través de todo el genoma, mientras
que el tipo de apareamiento y la respuesta al metalaxyl representan loci definidos en el genoma.
En el laboratorio de Estudios Moleculares de la Universidad Nacional de Colombia (Jaramillo et
al., 2002a) se logró la separación de dos grupos por huésped uno para papa y otro para los
aislamientos de tomate, pepino, pimentón y la raza r0, mediante el cebador OPM-09.

POBLACIONES DE P. INFESTANS REPORTADAS A NIVEL MUNDIAL

Forbes et al., (1998) elaboraron una base de datos con marcadores globales para P. infestans de
41 localidades incluidos 31 países y 10 regiones dentro de México. Se tuvieron en cuenta los
tipos de apareamiento, isoenzimas, RFLPs con la sonda RG57, resistencia a metalaxyl y
propusieron una nomenclatura con el fin de que sea internacionalmente aceptada que incluye dos
letras del del pais de origen del aislamiento, asignadas por la Organización Internacional de
Estandarización (ISO) seguida de un número único. Un ejemplo es US-1, el cual fue
originalmente identificado en Estados Unidos, pero luego ha sido encontrado en muchos países,
donde mantiene su designación.

Para identificar genotipos que surgen dentro de un linaje clonal, excepto por cambios en una o
dos aloenzimas o loci (bandas) en las huellas del DNA con la sonda RG 57, es mediante la
colocación de un punto decimal y luego un número después del nombre del genotipo como US-
1.1, EC-2.1 los cuales son variantes dentro del linaje o se han desarrollado a partir de dicho linaje
como US-6.1, algunos de los cuales aparecen en la tabla 3. La unificación de la nomenclatura
facilita la comparación y complementariedad de los resultados de las investigaciones, evitando la
duplicidad. Uno de los limitantes del sistema es que está ligado a los marcadores utilizados para
definir los genotipos (Forbes, et al., 1998).

44
Tabla 3. Algunos Genotiposa multilocus los cuales están representados en la base de datos
(Tomado de Forbes et al.,1998)

Tipo de b c Bandas de DNA por RFLPd


Genotipo Gpi Pep Fuente y País
apareamiento Sonda RG57
AU-1 A1 24 55 1001100001001101010110011 13, Australia
AU2* A1 24 55 1011101000001100000110011 13, Australia
BR-1 A2 44 55 1011101000001100001111011 13, Brasil
CA-1* A1 24 35 1111101011001101001110011 12, Canadá
CA-2 A1 44 55 1011001000001100001110011 12, Canadá
CA-2.1 A1 44 55 1011001000001100001111011 12, Canadá
CA-3 A2 24 55 1111101001001001100110011 12, Canadá
CA-4 A2 45 55 1001000001001101000110011 17, Canadá
CA-5 A2 44 55 1000110000001101000110011 17, Canadá
CA-6 A2 44 55 1010001001001100010110011 17, Canadá
CA-7 A2 44 55 1001000000001100010110011 17, Canadá
CR-1 A1 44 56 1001000001001101000110011 14, Costa Rica
EC-1 A1 34 45 1111101001001101000111011 5, Ecuador
EE-1 A1 34 55 1001100001001100100110011 17, Estonia
EE-2 SF 34 55 1010101011001101000110011 14, Estonia
IL-1 A2 44 55 1001100001001101000110011 13, Israel
JP-1 A2 44 44 1001110000001101100010011 18, Japón
RU-1 A1 44 55 1011101011001101000110011 14, Rusia
RW-1 A1 34 25 1111111011001101001111011 13, Ruanda
RW-2 A1 34 55 1111101001001101001111011 13, Ruanda
US-1* A1 24 35 1011101011001101000110011 13, USA
US-1.1* A1 24 55 1011101011001101000110011 28, USA
US-1.2* A1 24 35 1011101010001101000110011 13, USA
US-1.3** A1 24 35 1011101001001101000110011 13, USA
US- 1.4* A1 24 55 1011101010001101000110011 12, USA
US-1.5* A1 24 35 1011101011001101010110011 17, USA
US-1.6* A1 24 35 1011101011001101000111011 14, USA
US-1.7* A1 44 35 1011101011001101000110011 14, USA
US-2* A1 24 35 1011101001001101011110011 12, USA
US-3* A1 24 35 1011100000001101000110011 12, USA
US-4* A1 44 33 10 11101001001101100110011 12, USA
US-5* A1 44 35 1011101001001101011110011 12, USA
US-6* A1 44 35 1011111001001100010110011 17, USA
US-6.1* A1 44 33 1011111001001100010110011 12, USA
US-6.2* A1 44 35 1011101001001100010110011 12, USa
US-6.3* A1 44 35 1011111001011100010110011 12, USA
US-6.4* A1 44 55 1011011001001100010110011 12, USA
US-6.5* A1 44 35 1011111001001100010010011 12, USA
US-7 A2 45 55 1011101011001101000110011 17, USA
US-8 A2 44 456 1001100001001101000110111 17, USA
US-9e A1 44 25 17, USA
45
Tipo de b c Bandas de DNA por RFLPd
Genotipo Gpi Pep Fuente y País
apareamiento Sonda RG57
US-10e A2 56 55 17, USA
AR-1 A2 44 34 1001000000000000000111111 Argentina
AR-2 A2 44 44 1001000000000000000111111 Argentina
AR-3 A2 44 34 1001100010000000000101111 Argentina
AR-4 A2 44 44 1001100010000000000101111 Argentina
AR-5 A2 44 45 1001100010000000000101111 Argentina
FR-1 A1 44 25 1010111111001101001110101 Francia
ES-1 A1 34 55 1100100001001101000110011 España
a
genotipos basados en 23 bandas de RFLPs, gentipo aloenzimático y tipo de apareamiento. Los nombres originales
de los genotipos han sido guardados en la base de datos, p ara facilitar el cruce de las referencias.
b
Glucosa-6-fosfato isomerasa. Los alelos en el locus Gpi son codificados como 86=2, 90=3, 100=4, 111=5 y 122=6.
c
Peptidasa. Los alelos para el locus Pep son codificados como: 83=2, 92=3, 96=4 y 100=5
d
DNA bandas por la sonda RG57, moderadamente repetitivas, indican presencia 1 y ausencia 0, las cuales se
enumeran de izquierda a derecha. Las bandas 4 y 25 no fueron utilizadas en el análisis.
e
US-9 y US-10 están basados sobre nuevos patrones de Gpi y Pep: No se conocen las bandas RFLP
*Genotipos “viejos”
Genotipos con A2

Existen genotipos multilocus de poblaciones asexuales presentes en mas de un país. Genotipos


antiguos: RU-1 presente en Rusia y Ruanda, US-1-1 registrado en Brasil, Canadá, Estados
Unidos y Filipinas, US-1-2 reportado en el Perú, Gran Bretaña y Estados Unidos, US-1.3 existe
en Perú y Estados Unidos. Genotipos nuevos: BR-1 registrado en Bolivia y Brasil, JP-1 reportado
en Japón y Korea, PO-4 presente en Polonia y Bielorusia, PO-57, registrado en Polonia, Israel y
Rusia y EC-1 reportado en Ecuador y Colombia.

Hay genotipos comunes en países vecinos, pero también en países distantes, pero no se conoce
si es producto de la migración o de la evolución independiente de cada genotipo en dichas
regiones, lo que amerita una mayor investigación en dichos países y centralizar la información
alrededor de la base de datos creada en la Universidad del Estado de Oregón, para hacer mas
eficiente el uso de recursos y tener un panorama global sobre este patógeno y su evolución, que
permita entender la dinámica del patosistema P. infestans/ solanáceas

En la base de datos se puede observar el desbalance de las investigaciones en Asia, África y


América del Sur, las cuales son necesarias para mejorar las estrategias de manejo y para la
selección y desarrollo de variedades con resistencia genética prolongada. De 1.776 entradas, se
destaca la presencia de 369 genotipos únicos determinados por RFLP y 288 genotipos multilocus
para aloenzimas. Los aislamientos con tipo de apareamiento A1 (1.118) prácticamente duplican
la cantidad de aislamientos con apareamiento A2 (608) y sólo se registró autofertilización en un
aislamiento de Saltillo México, dos de Holanda, cinco de Polonia y uno de Ruanda (Forbes, et al.,
1998).

Shaw y Watier (2002) señalan que los marcadores moleculares han revelado que las
poblaciones de P. infestans, en zonas donde se cultiva la papa en el mundo, están compuestas de
un sólo genotipo (US-1) o mezclas de unos cuantos genotipos, que se van dispersando o
persisten año tras año. En otras zonas se pueden presentar mezclas, dada la presencia de los dos
tipos de apareamiento y la posibilidad de generar oosporas que pueden quedar en el suelo, pero
con el tiempo queda un solo genotipo. Por lo tanto, es necesario estudiar (identificar y
cuantificar) todos los factores que influyen en la evolución del patógeno como: condiciones
46
climáticas, sexualidad, parasexualidad, métodos de cultivo, migración de otras poblaciones sobre
papa y otros huéspedes, rumbo genético, mutaciones.

Hacia los años 1980s se reportó la población US-1, en Estados Unidos y Canadá y EU-49 y
EU-314 en Europa con sensibilidad al metalaxyl y con el tipo de apareamiento A1, y aloenzimas
Gpi 86/100 y Pep 92/100. Los datos genéticos de estas poblaciones indican que P. infestans
sufrió un severo cuello de botella al pasar de México a Estados Unidos, Canadá y Europa,
generándose poblaciones muy simples, dominadas por un sólo linaje clonal US-1, del cual sólo se
detectó un aislamiento colectado en 1997 en papa al Este de Carolina del Norte por
Wangsomboondee et al., (2002), pues después de 1990’s aparecen nuevas poblaciones.

Fry et al., (1993) indican que en Japón, Corea, Egipto, Israel, Ruanda, Alemania, Irlanda,
Holanda, Polonia, Suiza, Gran Bretaña, Bolivia, Brasil Colombia y Ecuador, se presentaron
nuevos genotipos de P. infestans que no habían sido detectados en colecciones anteriores a los
años de 1980s y comienzos de los 1990s, dando origen a nuevas poblaciones. En 1987 se reporta
US-8 principalmente en papa al Oeste de Estados Unidos y Canadá y US-7 en papa y tomate.
Ambos muy patogénicos y resistentes al metalaxyl. Entró un sólo clon del Noroeste de México a
los extremos continentales de los Estados Unidos con el comercio del tomate?.

El genotipo correspondiente a US-7 fue encontrado en el noroeste de México, un semestre antes


de ser encontrado en Estados Unidos, lo que indica que dicho genotipo probablemente se originó
en México y emigró a Norteamérica. Las epidemias sobre los cultivos de papa, posiblemente se
iniciaron a partir de los tubérculos semilla, pero las epidemias sobre tomate pudieron haber
empezado de tubérculos de papa o frutos de tomate infectados. Los primeros genotipos
encontrados en tomates, presentaron una agresividad variable en el follaje de la papa, al igual que
el grado de susceptibilidad al metalaxyl (García et al., 2000).

Mahuko et al., (2000) estudiaron las poblaciones de P. infestans colectados en diferentes


provincias paperas de Canadá entre 1994 y 1996, observando variaciones genéticas en el genoma,
las cuales no correlacionaron a los genotipos que fueron definidos por análisis aloenzimáticos del
locus Gpi, ni con los grupos definidos por los marcadores RAPD, ni con la resistencia al
metalaxyl. No se observaron diferencias estadísticas entre los años y las poblaciones, pero sí
dentro de los individuos que conforman una población. En los años 1995-1996 se colectó un
mayor número de aislamientos US-8.

Los genotipos US-7 y US-8 fueron A2 y presentaron mayor agresividad, tamaño de lesión y
esporulación que el US-1. Este último fue sensible al metalaxyl, mientras que el US-11 (A1)
mostró insensibilidad. El genotipo US-8 presentó un amplio rango, con predominio de
aislamientos medianamente resistentes. Se presume que la variación surge de la reproducción
sexual o migraciones (Mahuko, et al., 2000).

Miller y Johnson (2000) evaluaron la habilidad competitiva (eficacia biológica) entre los
aislamientos US-1 y US-8 de P. infestans, en condiciones de campo semiárido en Pullman USA y
encontraron que US-8 predominó sobre US-1, dado el incremento de su agresividad en los tejidos
de papa, tanto en campo como en laboratorio, a la vez que fueron insensibles al metalaxyl. Fue
escasa la detección de oosporas, por lo cual se considera que la reproducción sexual entre estos
dos aislamientos sería un evento raro.

47
Los resultados de esta investigación confirman las observaciones de otros investigadores, en el
sentido de que cuando un aislamiento se establece en un cultivo, lo hace a expensas de otros
aislamientos, en este caso el US-8 proliferó significativamente, mientras que US-1 casi se
extinguió. Por un sistema de simulación concluyeron que para hacer un control adecuado de la
gota en campos de papa, con el linaje clonal US-8, debe reducirse en 2-3 días la frecuencia de las
aplicaciones para el control químico, con relación a un campo afectado con el linaje US-1 (Miller
y Johnson, 2000).

En Carolina del Norte, Wangsomboondee et al., (2002), evaluaron 93 aislamientos de cultivos


de tomate que crecían al oeste del Estado, contra las montañas y 157 de papa de la zona este,
entre 1993 y 1998. Todos los aislamientos de papa presentaron el genotipo US-8, excepto un
aislamiento que presentó el US-1 (con haplotipo mitocondrial I-b), los cuales presentaron
resistencia intermedia o alta al metalaxyl, mientras que los aislamientos de tomate, presentaron
los genotipos US-7, US-8 y dos nuevos genotipos denominados US-18 y US-19 (con tipo de
apareamiento A2, genotipo aloenzimático Gpi 100/100 y Pep 92/100). Con un patrón de bandas
RFLP único y sensibles al metalaxyl, lo que demuestra mayor complejidad de P. infestans en las
poblaciones de tomate que de papa, en dicho Estado. Excepto US-1, todos los aislamientos
presentaron el haplotipo mitocondrial I-a

En Ecuador se han reportado cuatro linajes clonales: US-1 antigua población, que prevalece en
tomate, con el tipo de apareamiento A1 y el haplotipo mitocondrial I-b. EC-1 que representa el
95% de la población de P. infestans en dicho país y presentó el genotipo Pep 100/100 (96/100?),
con el tipo de apareamiento A1 y el haplotipo mitocondrial II-a. Población reciente, con
resistencia a metalaxyl, muy agresiva e introducida de Colombia. Esta sólo afecta especies
tuberíferas, el linaje clonal EC-2 sólo afecta solanáceas silvestres no tuberíferas y presenta el
tipo de apareamiento A2 (Forbes et al., 1997, Oyarzún et al., 1998). La población EC-3 es del
tipo de apareamiento A1 y afecta el tomate de árbol (S. betaceum) (Oyarzún et al., 1998).

Posteriormente Chacón et al., (2002) hicieron un muestreo de P. infestans en nueve especies de


la sección petota y nueve en no petota (no tuberíferas): Todos los aislamientos colectados en
especies de la sección petota, presentaron el tipo de apareamiento A1 y los de la sección no
petota presentaron A1 o A2. Las isoenzimas fueron heterocigotas con el fenotipo Gpi 90/100,
Pep 96/100. Para la sección no petota fueron Gpi 90/100, 86/100 o 100/100, Pep 76/100 o
92/100. Igualmente el haplotipo mitocondrial para las petotas fue II-a, en tanto que las no petotas
presentaron diferentes haplotipos mitocondriales I-a, I-b o I-c.

Las huellas con la sonda RG57 correspondieron para la sección petota al linaje clonal EC-1, las
de la sección no petota se ubicaron en los linajes clonales EC-1; EC-2; EC-2.1; EC-3 y US-1
(Chacón et al., 2002), que demuestra la gran diversidad genética de las poblaciones de P.
infestans en esta zona, en especies no tuberíferas, lo que pude ser similar a la situación que se
presenta en Colombia, en donde se ha encontrado el predominio de aislamientos con haplotipo
mitocondrial II-a y I-b en papa y I-b en tomate y pepino.

Dichos investigadores reportan que por primera vez se detectó el tipo de apareamiento A2 en
pepino y un nuevo haplotipo mitocondrial denominado I-c en pepino, S. brevifolium y una
especie de Solanum no identificada. Además se observaron nuevas bandas de RFLPs, que
determinaron los linajes clonales ya señalados (Tablas 4 y 5).

48
Tabla 4. Diversidad de Phytophthora infestans en Solanaceas en el Ecuador (Alder, et al.,
2002)

Tipo de
Linaje a Haplotipo b Gpi c Pep d Huéspedes
apareamiento
S. ochrantum, S.lycopersicon,
US-1 I-b A1 86/100 92/100
S.caripense, S. muricatum e
S. tuberosum, todas las solanaceas
EC-1 II-a A1 90/100 96/100
de la sección petota
f
I-a A1 100/100 76/100 Complejo de S. brevifolium, Datura bicolor
EC-2 I-c A2 100/100 76/100 Complejo f S. brevifolium y S. muricatum g
EC-3 I-a A1 86/100 76/100 S. betaceum
a
Linaje clonal definido por marcador.. El DNA del haplotipo mitocondrial de los aislamientos que atacan s.
brevifolium, hasta la fecha tienen las huellas del arquetipo EC-2RFLP, pero difiren de otros marcadores.
b
Haplotipo mitocondrial c Patrón de bandas de la Glucosa fosfato isomerasa
d
patrón de bandas de Peptidasa e Antes del 2001 sólo se encontraba US-1 en S. Muricatum
f
Especies huéspedes de este complejo, aún no han sido identificadas
g
Dos aislamientos con este genotipo fueron tomados de un campo muy afectado de S. muricatum cerca a los Baños

Aunque las poblaciones EC-2 y EC-3 con morfología y otras características moleculares
diferentes a cualquiera de los genotipos descritos, sólo es reportada en el Ecuador, en Colombia
también se ha observado la presencia de P. infestans en hojas de tomate de árbol y tallos de lulo
(Solanum quitoense), variedad La Selva (Zapata y Castañeda, comunicación personal, 2000).
Estos aislamientos deben ser caracterizados en próximas evaluaciones.

Según Abad (1983), Botero Y Gilchrist, (1998), Oyarzún et al. (1998), normalmente se reporta
un sólo linaje clonal sobre un huésped (preferencia patogénica o especialización fisiológica). Es
así como Yun Lee (1998) citado por Smart et al., (2000) determinó que todas las líneas de P.
infestans evaluadas eran patogénicas a papa y solo unas pocas eran patogénicas a tomate.

Erselius et al., (2000) observaron la estabilidad de los aislamientos procedentes de cultivos de


tomate en el Ecuador, pues se mantuvieron dentro del linaje clonal US-1, mientras que dos
aislamientos de un campo colindadate con un cultivo de papa muy afectado por el tizón tardío,
presentaron el linaje clonal EC-1 mas frecuente en papa, razón por la cual se dice que la papa y el
tomate son atacados por poblaciones separadas de dicho patógeno, cuando existe una barrera
geográfica como en la zona Andina, donde generalmente los cultivos de papa y tomate se realizan
en ecosistemas diferentes, pero se presentan algunas zonas de transición, donde se cultiva papa y
tomate, como las zonas marginales de café en las cordilleras de Colombia.

Es posible que se presente una adaptación paulatina a uno de los huéspedes cuando comparten
el nicho ecológico y hay predominancia de una de las poblaciones, como en el caso de la fuerte
epidemia con tizón tardió en un campo de papa vecino a tomate, en el cual se observó la
presencia de dos aislamientos con las características de EC-1 mas frecuente en papa. Estos son
aspectos de importancia en la epidemiología del patógeno en una zona.

Igualmente en Colombia se observaron campos de papa con uno o dos aislamientos con
haplotipos mitocondriales I-b, como en el caso de Norte de Santander (Gilchrist, 2001) y que
podrían corresponder a la población US-1 predominante en tomate. Sin embargo, parece haber
un mecanismo reproductivo que impide la recombinación sexual entre aislamientos y que
49
posiblemente está relacionada con la adaptación a los huéspedes, pues en condiciones naturales
no se ha observado la hibridación entre las poblaciones EC-2 (A2) de las especies silvestres que
crecen como setos o enredaderas en zonas aledañas a los cultivos de papa y tomate y las (A1)
EC-1, EC-3 y US-1 de papa, tomate de árbol y tomate (tabla 4).

Oliva et al., (2002) obtuvieron un sólo cruce en condiciones in vitro, cuya progenie no fue
patogénica a los huéspedes de los aislamientos parentales. Tampoco se han observado cruces
entre los aislamientos A2 de Bolivia ubicados en el linaje clonal BR-1 y A1 del Perú, linaje
clonal EC-1, presentes en cultivos de papa en la zona limítrofe entre los dos países alrededor del
lago Titicaca, centro de origen de la papa cultivada. En tal sentido es necesario aumentar los
muestreos, incluyendo las especies huéspedes alternos, en los cuales se puede estar presentando
la posibilidad de una recombinación sexual, que resultaría en la formación de oosporas, con
cosecuencias sobre la epidemiología y problemas de manejo del patógeno en esta zona, como lo
indican Forbes et al., 1998.

Alder et al., (2002) hacen referencia a la diversidad genética de las poblaciones de P. infestans
presentes en América del Sur, en papa, tomate y otras especies de la familia solanácea de la
sección petota (que tuberizan) y de la Etuberosum (no tuberizan), donde se destaca el amplio
rango de especies cultivadas en el Ecuador, las cuales también se cultivan en Colombia como
papa, tomate, tomate de árbol (S. betaceum), lulo (S. quitoense), pepino de agua (S. muricatum) y
de especies silvestres como S. andreanum, S. caripense, S. brevifolium, S tuquerrense y otras
(tabla 4).

Hasta el presente han encontrado dos grupos de P. infestans distintos afectando el complejo de
S. brevifolium, uno de los cuales ha sido asociado con un fenotipo identificado tentativamente
como S. oblongifolium y es caracterizado por el tipo de apareamiento A1, Gpi(100/100),
Pep(76/100) y el haplotipo mitocondrial I-a. El otro grupo tiene las mismas aloenzimas, pero con
apareamiento A2 y el haplotipo mitocondrial I-c, el cual está asociado a otros fenotipos en el
complejo de huéspedes, probablemente S. brevifolium y S. tetrapetalum y en dos oportunidades
se encontró en pepino (Alder et al., 2002).

50
Tabla 5. Diversidad Genética de Poblaciones de P. infestans en América del Sur (Adaptado de
Alder et al., 2002)

Especies de Tipo de
País Haplotipos a Linajes clonales b
plantas estudiadas apareamiento
AR-1, AR-2, AR-3,
Argentina Papas y tomates A1, A2 I-a y II-a
AR-4, AR-5, BR-1
Bolivia Papas A2 II-a BR-1
Brasil Papas y tomates A1, A2 I-a, II-a US-1, BR-1
Chile Papas A1, A2 I-b US-1
Papas, tomates, pepino y
Colombia1 A1 II-a, I-b US-1, EC-1
otras
Papas, tomates, pepino, I-a, II-a, I-b, I-
Ecuador A1, A2 US-1, EC-1; EC-2, EC-3
otras.. c
Petota, tomate y S.
Perú A1 I-a, II-a, I-b, US-1, EC-1, PE-3, PE-5, PE-6
caripense
Uruguay Papas A2 Ii-a Br-1
Venezuela Papas A1 II-a, I-b US-1, EC-1
a b 1
DNA del haplotipo mitocondrial Linaje clonal definido por marcador Gilchrist, 2001

Los análisis con AFLPs dividen todos los aislamientos ecuatorianos en dos grupos principales.
Los linajes US-1 y EC-1 conforman un grupo, mientras que el complejo de aislamientos de S.
brevifolium y los aislamientos EC-3 conforman el otro grupo. Es posible que estos dos linajes
estén emparentados a una población “antigua” de P. infestans que es propia del Ecuador o
inmigró mucho antes de que tuviera lugar el primer reporte de migraciones desde México (Alder,
et al., 2002).

En el Perú, Pérez et al. (1997-98), encontraron cinco linajes clonales de P. infestans. Los
linajes clonales EC-1.2 (siete genes de virulencia) y PE-5 (Seis genes de virulencia),
representados cada uno por un solo genotipo con resistencia a metalaxyl y procedían de Cusco.
Los genotipos mas abundantes fueron del linaje EC-1, con 8 razas o patotipos diferentes, con 5-
10 factores de virulencia, todos resistentes al metalaxyl.

Los genotipos de PE-3 con 8 patotipos poseían 2-8 factores de virulencia, excepto uno de
Cusco, los demás procedían de Puno. Los genotipos mas complejos presentaron resistencia al
metalaxyl, mientras que los menos complejos (2-3 factores de virulencia) fueron susceptibles.
Los genotipos de US-1 sólo se encontraron en Puno, con cinco razas, siendo la mas compleja la
1,2,3,4,7,8,10,11; con resistencia a metalaxyl, los otros cuatro genotipos presentaron entre dos y
tres factores de virulencia y fueron susceptibles (Pérez et al., 1997-98).

Pérez et al., (1997-98) concluyeron que los aislamientos peruanos de P. infestans con 5-10
factores de virulencia, presentaron resistencia al metalaxyl y los moderadamente resistentes o
susceptibles presentaron entre dos y siete genes de resistencia, razón por la cual, el aumento en la
complejidad del patógeno, podría estar relacionada con el desarrollo de la resistencia a las
fenilamidas. Sin embargo, en Chile, Rivera et al., (2002) observaron que los aislamientos con 2.1
genes de patogenicidad fueron resistentes a metalaxyl.

51
Reis, et al., (2002) estudiaron el estado y factores epidemiológicos sobre las poblaciones de P.
infestans en Brasil, determinando que los componentes epidemilógicos son específicos a los
huéspedes, dado que observaron valores altos para los parámetros de frecuencia de infección (IF),
área de la lesión (LA), tasa de expansión de las lesiones y de esporulación (SP), acompañadas de
corto periodo de latencia, cuando las inoculaciones de los tejidos huéspedes se hicieron con sus
respectivos linajes clonales.

La temperatura afecta los componentes epidemiológicos, así: Por encima de 22 ºC, los
aislamientos BR-1 (papa) no presentaron germinación, a los 10 ºC con humedad en las hojas
durante 24 horas, presentaron el mayor número de lesiones y el mayor tamaño de lesiones se
logró entre 15-22 ºC, a 27 ºC no hubo esporulación, mientras que los aislamientos tipo US-1
(tomate) desarrollaron el mayor número de lesiones a los 22 ºC con humedad en las hojas por 24
horas, el mayor tamaño de lesión a los 27 ºC y no se presentó esporulación a los 10 ºC. Esto
indica la estrecha relación con las condiciones ecoambientales de los cultivos huéspedes (Reis, et
al., 2002).

En Chile se observó que todos los aislamientos de P. infestans procedentes de papa, presentaron
características propias del linaje clonal US-1, puesto que el tipo de apareamiento fue A1 y Gpi
86/100, pero todos mostraron resistencia al metalaxyl, con LD50 que oscilaron entre 200 y
400µg/ml. Se detectaron 17 razas fisiológicas que representaban el 50% de la población de P.
infestans, con predominio de infección sobre los diferenciales R3 (75%) y R7 (56%). El 1,8%
(1/52) no infectó los diferenciales. La población presentó patotipos muy simples (cada
aislamiento infectó 1.8 diferenciales de papa) y el índice de complejidad de las razas también fue
simple. Cada raza en promedio tuvo 2,1 genes r (Rivera et al., 2002).

En México (subtrópico) y varios países de zonas templadas, los cultivos de papa y tomate
generalmente comparten los ecosistemas y de manera general los aislamientos colectados en
papa, afectan en un grado similar a tomate, aunque dentro de los aislamientos hay diferentes
grados de patogenicidad (García, et al., 2000). Igualmente en Marruecos, observaron que los
aislamientos colectados en papa eran patogénicos a tomate, pero los aislamirentos patogénicos a
tomate, afectaban en menor grado a papa y fueron sensibles a Metalaxyl. Los aislamientos de
papa presentaron insensibilidad o sensibilidad intermedia (Sedegui et al., 2000).

Los linajes clonales o genotipos predominantes en Marruecos, fueron: MO-1 con aislamientos
colectados en papa (1996-97), con un tipo de apareminto A1 y con Gpi (100/100) y Pep (92/100);
MO-2 cuyos aislamientos fueron colectados en tomate (1997-1998), con apareamiento A1 y Gpi
(86/100) y Pep (92/100), todos sensibles al metalaxyl; MO-3 colectados en papa (1998) con
apareamiento A2 posiblemente introducido con semilla de papa, lo que indica un potencial para
la reproducción sexual, pues en un mismo campo se encontraron ambos tipos de apareamiento,
pero no observaron indicios de que ésta se haya presentado, Gpi (100/100) y Pep (100/100);
MO-4 colectados en papa (1998) con apareamiento A1 , Gpi (100/100) y Pep (100/100),
(Sedegui, et al., 2000).

En Uganda, el muestreo realizado entre noviembre del 2000 y mayo de 2001 y caracterizado
por Ochwo et al. (2002) presentó ausencia de diversidad genética, pues sus características se
agruparon con las de los asislamintos US-1, lo que indica que la población de P. infestans es de
naturaleza clonal y que el incremento de la severidad del patógeno, puede deberse a procesos de
mutaciones o autofertilización, pues sólo se ha detectado el tipo de apareamiento A1, en el linaje
UA-1 encontrado en dicho país.
52
En el Sur de Alemania Moeller et al.,(2002) observaron que la mayor parte de los aislamientos
colectados en papa y tomate de cultivos comerciales y huertas caseras, fueron A1, con haplotipo
mitocondrial (II-a), los cuales mediante el análisis de los AFLPs, presentaron dos grupos,
separados por huéspedes, uno correspondiente a papa y otro a tomate.

Cooke et al., (2002) evaluaron 500 aislamientos de P. infestans de papas comerciales y jardines
de Escocia entre 1995-1997 y encontraron que la quinta parte de la población fue A2,
posiblemente restringida por la sensibilidad a las fenilamidas, ya que sólo el 5% presentó
resistencia, mientras que el 51% de los aislamientos A1 fueron resistentes al metalaxyl. En los
tres años evaluados se incrementó la población con sensibilidad intermedia. Los AFLPs fueron
diversos, posiblemente por la recombinación sexual y flujo de genes, con la respectiva formación
de oosporas de larga vida, que dan un significado evolutivo y epidemiológico del patógeno en
dicha zona, que debe ser analizado al momento de establecer las prácticas de manejo de la gota.

En la China, Zhang et al., (2002) evaluaron 210 aislamientos entre 1995 y 2001 y determinaron
que el 26.2% presentaban el tipo de apareamiento A2. A su vez los aislamientos de la provincia
del Norte presentaron una proporción mayor de A2 que los del Sur y mayor resistencia al
metalayl. Se observó una proporción alta de aislamientos con resistencia intermedia, lo que
indica un posible cambio paulatino de los aislamientos hacia las nuevas poblaciones, con flujo de
Norte a Sur.

En Nepal, Ghimire et al., (2002) evaluaron aislamientos procedentes de tres regiones


agroecológicas: las colinas altas, colinas y las zonas bajas, entre los años 1999-2000. Ellos
identificaron 30 razas de P. infestans entre 251 aislamientos de 36 campos, que representaban las
nueve pricipales zonas paperas, el tipo de apareamiento A1 se encontró en siete de las regiones,
en una región se encontró el tipo de apareamiento A2 y en otra se encontraron ambos tipos de
apareamiento.

270 aislamientos fueron evaluadas para resistencia al metalaxyl presentando resistencia (10%)
sensibilidad intermedia (12%) y sensibilidad (78%). La resistencia se observó en todas las
regiones, pero con predominancia en las zonas donde históricamente se han utlizado los
fungicidas. Por la sonda RG57 se separaron 11 genotipos entre 280 aislamientos, los cuales
constituyeron los linajes NP-1, NP-2 y NP-3 con un 94% de la población (Ghimire et al., 2002).

En todas las regiones se observó el haplotipo mitocondrial I-a; el haplotipo mitocondrial I-b,
sólo se observó en dos sitios de colinas, correspondientes al tipo de apareamiento A1 y los
denominaron NP-3, el cual parece ser idéntico en todos los loci a US-1, el cual parece ser su
origen. En las colinas fue donde observaron las mayores variaciones, mientras que en las colinas
altas se presentó la menor variación, situación similar a las observaciones hechas en Colombia
por Jaramillo et al, 2002. En las zonas bajas se presentó variación en la sensibilidad al metalaxyl
y a la virulencia (Ghimire et al., 2002), confirmando las observaciones de Fontem y Tsopmbeng
Noumbo (2002), en Camerún.

En Pakistán (Iram et al.,2002), Rusia y Bielorusia (Lavrova et al., 2002) los aislamientos de P.
infestans procedentes de cultivos de papa comercial, conformaron dos grupos claramente
definidos, en el primer caso por perfiles de proteína y en el segundo por marcadores moleculares
SINEs (Short Interspersed Elements), que separó los aislamientos de Rusia de los de Bielorusia,
lo que indica una alta homogeneidad de las poblaciones dentro de dichos países.

53
Thompson et al., (2002), evaluaron las poblaciones de P. infestans de cultivos de papa de Sur
Africa, para determinar la correlación entre la severidad de la enfermedad causada por este
patógeno y el genotipo del mismo. Los 657 aislamientos evaluados presentaron el tipo de
apareamiento A1, conla isoenzima Gpi 86/100. El patrón RG57 presentó las bandas
correspondientes al linaje clonal US-1 y el haployipo mitocondrial fue I-b, lo que indica que en
esta región permanece el linaje clonal US-1 originalmente introducido.

En Camerún, Fontem y Tsopmbeng Noumbo (2002), evaluaron aislamientos de P. infestans


procedentes de cultivos de arándano (Solanum scabrum), papa y tomate por la patogenicidad
entre sí, observando que los aislamientos de arándano fueron igualmente infectivos a los tres
huéspedes, mientras que los aislamientos de papa, fueron mas agresivos a papa que a arándano y
tomate, demostrando su preferencia por el huésped original, comportamiento observado por
Botero y Gilchrist (1997). Los aislamientos de tomate de la provincia del oeste fueron
igualmente agresivos a papa y tomate, mientras que los de la provincia noroeste fueron mas
agresivos a papa que sobre tomate y arándano. Esto da indicios de que los aislamientos se
originaron en papa y se fueron adaptando a las demás especies a medida que fueron compartiendo
los nichos ecológicos.

Al evaluar la susceptibilidad al metalaxyl, encontraron que el 48% fueron resistentes, el 24 %


intermedios y el 28% sensibles. Los aislamientos procedentes de tomate presentaron la mayor
población con resistencia (64%), los de papa un 44% y los menos resistentes fueron los de
arándano (36%). Estos resultados sugieren que la patogenicidad y la sensibilidad al metalaxyl,
dependen del huésped y origen geográfico de los aislamientos de P. infestans (Fontem y
Tsopmbeng Noumbo, 2002).

Schiessenddopler y Molnar (2002) separaron los aislamientos de P. infestans de la región del


sur del Sahara en África, en dos grupos, uno conformado por los aislamientos de Kenia y
Uganda, con apareamiento A1, haplotipo mitocondrial I-b y sensibles al metalaxyl. En otro
grupo ubicaron los aislamientos de Etiopía, los cuales también fueron A1, pero con el haplotipo
mitocondrial I-a, con el 80% de ol s aislamientos sensibles al metalaxyl y el 19% resistentes. Se
encontraron líneas autofértiles en aislamientos de las tres regiones, con mas alta tasa en Etiopía.
Es posible que los aislamientos de Kenia y Uganda pertenezcan a las poblaciones antiguas,
mientras que los aislamientos de Uganda se ubiquen en la nueva población.

Además de las poblaciones mencionadas Forbes et al., (1998), hace alusión a otras como: tres
entradas de Taiwan (TW) con un sólo genotipo por RFLP y el tipo de aparemiento A1, Filipinas
(PH) con 28 entradas, igualmente con un solo genotipo RFLP y con apareamiento A1, mientras
que los de Holanda con 211 entradas, registraron 131 genotipos RFLP, 11 genotipos
aloenzimáticos, 107 con apareamiento A1 y 99 con A2 y Polonia de 251 entradas presentaron 62
genotipos RFLP, 81 para aloenzimas, 189 con apareamiento A1 y 43 con A2 con una situación
similar a la de México (MX) con 318 entradas, con 102 genotipos RFLP, 93 genotipos
isoenzimáticos, 194 con apareamiento A1 y 124 con A2. Se destaca la complejidad de los
aislamientos de los países tradicionalmente paperos como Polonia y Holanda comparable a la de
México, supuesto centro de origen del patógeno.

54
CAPÍTULO IV

BIOLOGÍA DE PHYTOPHTHORA INFESTANS

Dada la habilidad de P. infestans para la manipulación bioquímica, fisiológica y morfológica en


su huésped, a través de la formación de diversas moléculas de virulencia o avirulencia, definidas
como “efectoras”, es necesario realizar estudios de genómica estructural, con el fin de entender
las bases moleculares de la patogenicidad de P. infestans, a través de la identificación de genes
que contribuyan a los procesos de infección, identificar la función de virulencia y avirulencia en
los huéspedes y no-huéspedes y los centros del control químico. Además permite entender la
estructura poblacional y su evolución a través del mejoramiento de las técnicas de marcadores
moleculares y los marcadores que determinan los fenotipos (Kamoun, 2002).

Al ligar las secuencias a los fenotipos, Kamoun (2002) aplica el paradigma de genómica
funcional que le permite descubrir nuevos genes efectores y blancos a fungicidas, en P. infestans,
para lo cual desarrollaron herramientas computacionales, con el fin de minimizar los datos a
secuenciar y aplicar ensayos funcionales para validar las funciones predichas de los genes
candidatos, con los siguientes criterios de selección:

Genes que codifican para enzimas que degradan. Se predice que estos genes codifican para los
factores propios de la virulencia involucrados en la penetración del tejido huésped y la
degradación.

Genes que codifican para proteínas extracelulares. Estos están probablemente involucrados en
el intercambio (cross-talk) con la planta huésped.

Genes que son regulados durante la infección. Estos genes codifican factores propios de la
virulencia o patogenicidad y pueden servir como blanco de los fungicidas.

Genes que son conservados en los Oomycetes. Pueden servir como blanco de los fungicidas.

Este patógeno se propaga sexual y asexualmente. La reproducción sexual sirve para


proporcionar un estado de supervivencia de las esporas (oosporas) y generar nueva
combinaciones de genes. Sin embargo, este organismo ha tenido grandes explosiones de
poblaciones epidémicas por la reproducción asexual, como parásito obligado, causando la gota o
tizón tardío en cultivos de papa y tomate principalmente en muchas partes del mundo, con
marcadas consecuencias económicas y sociales.

Según Turkesteen (S.F.) hay dos tipos de esporas, los mas frecuentes son los zoosporangios que
son hialinos y de pared delgada y tiene forma de limón, con un tamaño de 21-38 nm x 12-23 nm
ubicados en las puntas de las ramificaciones del micelio. Otro tipo son las oosporas, cuerpos
redondos 24-46 nm, con paredes gruesas. Bajo condiciones secas, los esporangióforos empiezan
a retorcerse y el esporangio se desprende. Bajo condiciones de sequía los zoosporangios son de
vida corta, al igual que si no encuentran el tejido huésped apropiado. La germinación se da en
agua libre, de manera directa por la emisión de un tubo germinativo, pero comúnmente se liberan

55
ocho (8) o mas zoosporas, las cuales nadan con la ayuda de los dos flagelos. Mas tarde estas
esporas se enquistan y forman el tubo germinativo para infectar.

Lees et al., (2002) establecieron una metodología basada en PCR, para detectar P. infestans en
tejido y oosporas en el suelo, para lo cual diseñaron un par de “primer” específicos (INF FW2 y
INF REV) logrando como producto de la amplificación un fragmento de DNA de 613 bp,
específico de P. infestans, con una sensibilidad in vitro, para sólo dos oosporas, dos eporangios,
cuatro zoosporas y 0,5 pg de DNA de micelio deshidratado y congelado. En tejido con o sin
síntomas se podría detectar con 10 mg de tallo, hoja o tubérculo y 10 oosporas podrían ser
detectadas en 0,5 g de suelo.

Los estudios de sobrevivencia a largo plazo, de las oosporas (sexual) y esporangios y micelio
(asexual), realizados sobre hojas quemadas por la gota en el campo, permitieron detectar el
inóculo de tipo asexual y sexual en al s hojas hasta 12 y 21 meses después de la quemazón de las
hojas. La detección del inóculo asexual fue menos efectiva nueve meses después de la
quemazón, por posible degradación del inóculo no adaptado a la sobrevivencia por periodos
prolongados. Las pruebas de viabilidad mostraron que los esporangios de los apareamientos A1
y A2, no fueron capaces de causar enfermedad. Sin embargo, las oosporas recuperadas de hojas
de 21 meses después de muertas infectaron hojas de papa y produjeron abundante micelio y
desarrollo de los esporangios (Lees et al., 2002).

Los cromosomas de P. infestans son muy grandes, Van der Lee et al., (2001), consideran que
pueden ser 2,5 veces el tamaño de los de P. megasperma, con alrededor de 250 Mb en promedio
y un fragmento de AFLP puede tener 10 Kb. El mapa físico del genoma de P. infestans viene
siendo desarrollado por Whisson et al. (2002) quienes indican que es el genoma mas grande y
complejo dentro del grupo de los oomycetes caracterizado hasta el presente, y contiene una alta
proporción de DNA repetitivo.

Dado que los cromosomas varían de tamaño entre las especies de Phytophthora, pueden ser
utilizados como características para la identificación de especies. Aunque no se conoce su
número, se puede considerar que los grupos de ligamiento de I a X podrían representar los
cromosomas, pues según Samsome y Brasier (1973) un gametangio en la profase meiótica,
contiene de 16-20 cromosomas, lo que indica que el número haploide de cromosomas es 9 + 1, los
cuales son difíciles de observar por microscopio de luz y por lo tanto, se ha intentado determinar
el número de cromosomas por electroforesis de campo pulsado, sin éxito (Van der Lee et al.
1997).

Quintero y Saldarriaga (1998), lograron separar cuatro bandas de DNA, mediante electroforesis
de campo pulsado, dos moléculas de gran tamaño y poca resolución (5,7 y 5,2 Mb) aparecieron
en la zona cuatro del gel y otras dos bandas (1,64 y 1,057 Mb) con buena resolución, pero con
baja intensidad en la zona tres del gel. Sin embargo, en el pozo del gel quedó gran cantidad de
DNA sin separar, lo que indica la existencia de macromoléculas mayores de 12 Mb, que no
pueden ser separadas por ese sistema. Es posible que el genoma posea múltiples copias de cada
cromosoma y que los cromosomas tengan mayor peso molecular, pues se ha reportado poliploidía
en P. infestans y formas aneuploides (Samsome y Brasier, 1993).

En P. infestans se ha observado poliploidía (2n; 3n; 4n) y aneuploidía en aislamientos de


Europa y Estados Unidos. Además se han reportado núcleos con diferente nivel de ploidía en la

56
misma hifa (Brasier, 1992). En aislamientos mexicanos y británicos se encontraron diploidías,
tetraploidías y mezclas de ploidías (Sansome y Brasier, 1993).

Sin embargo, Tooley y Therrien (1987) citados por Erwin y Ribeiro (1996) evaluaron el
contenido de DNA en zoosporas de aislamientos de P. infestans por citofluorometría con tinción
de Fulgen y concluyeron que los aislamientos mexicanos, se pueden considerar diploides y los de
fuera de México presentan diferentes niveles de ploidía, incluyendo aneuploidías.

Se presume que el ciclo de duplicación del núcleo de las zoosporas que germinan de P.
infestans, requiere de 7 a 8 horas para un aislamiento diploide, pero de 10 a 12 horas para un
aislamiento tetraploide y dicho núcleo en el estado germinativo, equivale al estado G1 del ciclo
celular y la variación del DNA entre aislamientos, se debe a los cambios en los niveles de ploidía,
los cuales existen en la naturaleza y explican la complejidad genética de este patógeno (Whittaker
et al., 1992, citados por Erwin y Ribeiro, 1996).

1. Reproducción asexual

El esporangio (zoosporangio) es la unidad de reproducción asexual, el cual puede ser producido


en abundancia en muchas especies huéspedes: Una sola lesión puede producir hasta 300.000
esporangios en una noche. (Legard et al., 1995, citado por Smart, et al., 2000).

Los esporangios son estructuras hialinas con un tamaño que oscila entre 18-28 nm por 25-35
nm, separados del micelio por una septa. Cada esporangio tiene de seis a diez núcleos. Se
desprenden fácilmente de los esporangióforos cuando maduran y son arrastrados por los vientos
que los dispersan y los cambios de humedad relativa que los ayudan a germinar en los tejidos de
las plantas huéspedes, mediante la germinación directa a través de un tubo germinativo o
indirectamente al producir zoosporas (Smart, et al., 2000).

Según Henfling, (1987) y Turkesteen, (S.F.) la germinación de los esporangios es afectada por
la temperatura. Así: temperaturas entre 18-24 ºC favorecen la germinación directa de las
zoosporangios, mientras que temperaturas inferiores 12-16 ºC, estimulan la liberación de las
zoosporas móviles (10 a 20), por el fraccionamiento del citoplasma multinucleado, en células
uninucleadas de paredes delgadas. Los tubos germinativos pueden penetrar directamente la
epidermis de las hojas y tallos (no requieren estomas) y en los tubérculos por las lenticelas o
heridas. En Brasil se observó una respuesta diferencial con relación a las temperaturas óptimas
para germinar y esporular entre las poblaciones de P. infestans BR-1 de papa y US-1 de tomate
(Ries et al., 2002).

Los esporangios de los oomycetos están programados más para la producción de zoosporas que
para la germinación directa. Cada zoospora produce dos flagelos, pero después de
aproximadamente una hora de movilidad las zoosporas se enquistan (pierden los flagelos y
desarrollan una pared celular) y germinan por la producción de un tubo germinativo. La
diferenciación de las zoosporas requiere la síntesis de proteínas pero no de DNA, mientras que la
germinación directa de los esporangios vía un tubo germinativo, es presumiblemente dependiente
de un evento de cascada, que involucra la degradación de proteínas innecesarias y de los RNAs
involucrados en zoosporogénesis. Adicionalmente la producción del tubo germinativo
posiblemente requiere síntesis de novo de otros RNAs y activación de la vía metabólica, tal como
la biogénesis de la pared celular (Smart, et al., 2000).

57
Las proteínas y genes involucrados en la germinación directa e indirecta están identificados.
Para 1998, habían entrado mas de 50 genes a la base de datos del banco de genes. Un estudio (no
publicado) realizado por Sandock y Fry, citados por Smart et al., (2000) para diferenciar las
librerías de cDNA de los estados de micelio, zoosporas y esporangios, reveló 16 grupos de RNAs
diferentes, los cuales fueron expresados de manera abundante en los estados de esporangio y
zoospora.

En dicho estudio, nueve de los cDNAs mostraron secuencias de alta similitud a las de los genes
en los bancos, mientras que las otras siete no mostraron similitud. Los cDNAS que codificaron
para sorbitol deshidrogenasa y una especie de proteína IpiB fueron expresados de manera
abundante en las zoosporas y los esporangios.

Paris y Lamattina (2002) observaron fluctuaciones en los contenidos de RNA y DNA durante el
ciclo de vida de P. infestans, relacionados con los procesos de la enfermedad. Encontraron altos
niveles de rRNA en las mitocondrias de las zoosporas (mitrRNA), en relación con los rRNA del
micelio y de los cistos en la germinación, los cuales pueden deberse al incremento en el número
de copias de genes, por el alto número de mitocondrias por célula, o al incremento en la tasa de
transcripción del rDNA, o ambos.

Los experimentos indican que la cantidad de rDNA de la mitocondria es el doble del rDNA
citoplasmático en el estado de zoosporas que en los cistos en germinación y el micelio, lo que
puede explicar los altos niveles de rRNA mitocondriales en las zoosporas. Por el contrario, en el
proceso de germinación de los cistos se conserva el contenido del rDNA mitocondrial, pero el
RNA bajó al 50% con relación a las zoosporas, lo que indica una alta actividad de la síntesis de
las proteínas mitocondriales durante la fase de zoosporas, seguida por una reducción regulada y
rápida de la actividad de las mitocondrias durante la formación del cisto. Se propone que los
cambios en la expresión de los genes constitutivos de P. infestans, operan durante los primeros
estados de desarrollo de la gota y hacen parte de la respuesta de adaptación metabólica durante
los estados de infección, lo cual es vital para que el patógeno complete los ciclos de infección
(Paris y Lamattina, 2002).

2. Reproducción sexual

Según Smart et al., (2000), la formación de oosporas es uno de los aspectos mas relevantes del
ciclo de vida de P. infestans. Como organismo heterotálico, son necesarios ambos tipos de
apareamiento denominados A1 y A2 para la reproducción sexual. Las esporas se forman a
medida que cada tipo de apareamiento responde a la hormona inducida por el tipo de
apareamiento contrario, produciendo un oogonio y un anteridio (Galindo y Gallegly, 1960; Ko,
1988; Shaw, 1987). Al parecer el control genético del apareamiento es muy débil. Las oosporas
de autofertilización en organismos heterocigotos generan mayor variabilidad, condición que
constituye un factor importante en la epidemiologia del patosistema (Smart et al., 2000).

La meiosis ocurre inmediatamente antes del desarrollo de los gametangios, representando el


único estado haploide del ciclo de vida de este organismo. La cariogamia se da entre estos dos
núcleos haploides, formando una oospora diploide uninucleada de paredes gruesas, que puede
servir además, como estructura de supervivencia para el invierno en las zonas templadas
(Sansome,1976; Drenth, et al., 1995, citado por Smart, et al., 2000).

58
Las Oosporas se forman cuando los micelios con distinto tipo de apareamiento A1 y A2, crecen
juntos y uno de ellos puede formar células masculinas (anteridio) y el otro células femeninas
(oogonio). El oogonio crece a través del anteridio permitiendo la fertilización. El oogonio
fertilizado se convierte en una espora de descanso, que le permite resistir condiciones
desfavorables, como sequía, bajas temperaturas, ausencia de huéspedes. Las oosporas forman un
tubo germinativo sobre el cual se forma un zoosporangio similar a los de la reproducción asexual,
el cual germina y las zoosporas resultantes pueden iniciar un nuevo ciclo de vida (Henflig, 1987).

Según Fabritius y Judelson 1997 citados por Smart et al.,(2000), la determinación del tipo de
apareamiento está controlada por un solo locus, que en condición homocigota produce el tipo de
apareamiento A2 y heterocigota el A1. Sin embargo, se ha observado desigualdad numérica en
las proporciones de A1 y A2 en las progenies en muchos apareamientos. La segregación no
mendeliana, para varias características como Pep, es descrita corrientemente por la presencia de
un loci recesivo letal balanceado, cerca al locus de apareamiento, el cual se presenta en relaciones
de segregación anormales (Fabritius y Judelson, 1997, Judelson et al., 1995), situación también
observada por Oliva et al., (2002). Sin embargo, Van der Lee et al., (1997), no soportan la
hipótesis de la letalidad balanceada, según su investigación con la progenie del cruce 71.

Cuando se cruzan aislamientos de P. infestans diploides con tetraploides dieron progenies


diploides, triploides y tetraploides y al cruzar tetraploides entre sí, la progenie presentó
características de diploides y tetraploides. Las oosporas de estos cruces presentaron mas bajo
porcentaje de germinación, que cuando se cruzaron con diploides, cuya progenie fue diploide y
resultó ser híbrida. ¿Qué impacto tienen estas progenies en campo? (Wittaker et al., 1991, citado
por Erwin y Ribeiro, 1996).

En el noroeste y este de Europa, las poblaciones viejas de reproducción asexual, están siendo
reemplazadas por poblaciones con mezclas A1/A2, genéticamente diversas por la reproducción
sexual, observadas en Asia y posiblemente en Africa y Suramérica, pero no existen medidas
especiales que interfieran con la producción y sobrevivencia de las oosporas, lo que significa un
alto potencial de reproducción por esta vía, especialmente en las zonas donde predominan las
socas o residuos de cosecha en el campo y las condiciones ambientales (zonas con estaciones) lo
favorezcan, pero es independiente del grado de resistencia de la variedad. Las oosporas son
susceptibles a bajas dosis de diferentes fungicidas, al igual que con temperaturas altas y
saturación del suelo (Flier, et al., 2002).

Donde coexisten los tipos de apareamiento A1 y A2, se pueden observar oosporas en las hojas
de papa que crecen en el campo, indicando que la recombinación sexual puede generar mas
variación y un banco de oosporas en el suelo, razón por la cual Shaw y Wattier (2002) consideran
que es necesario identificar y cuantificar los factores involucrados en la evolución del patógeno
como: cambios climáticos; métodos de cultivo de los huéspedes; sexualidad; parasexualidad;
migración de otras poblaciones sobre papa y otros huéspedes; deriva (rumbo) genética; mutación.

Un estudio sobre la preferencia sexual de P. infestans en cultivos en agar, revela que se podrían
producir entre 5-95% de oosporas dependiendo de los aislamientos parentales involucrados en el
cruce. El origen del parental fue determinado por coloración debida a la ß’ glucuronidasa (GUS),
que reveló que las oosporas fueron derivadas de un solo parental. Ahora no se sabe si las demás
oosporas se produjeron por autofertilización, apomixis o una combinación de ambos procesos,
puesto que las oosporas no germinaron. (Judelson, 1997a citado por Smart et al., 2000).

59
En Gran Breyaña, Earnshaw y Shattock (2002) realizaron cruces con dos parentales A1 y un
parental A2, los cuales produjeron 144 y 146 ooporas respectivamente. Detectaron un 10% de
autofertilización y evaluaron la patogenicidad en 7 variedades, en las cuales observaron que 15%
y 19 % de las oosporas de los respectivos cruces no fueron patogénicas, mientras que el 22% y
6%, fueron mas patogénicas que los aislamientos parentales. La variedad menos resistente
presentó la misma agresividad en los parentales y las progenies.

Stromberg, et al., (1999) produjeron Oosporas de dos aislamientos (A1 y A2) de Escandinavia,
las cuales mezclaron con talco y secaron por siete semanas, al cabo de las cuales fueron
inoculadas en diferentes concentraciones en suelo estéril, en el cual se sembraron plantas de papa
de la variedad Bintje, procedentes de cultivo in vitro y se incubaron por un mes a 15ºC y 16 horas
de luz, periodo en el cual se desarrollaron lesiones de gota en tallos y tubérculos con 250 y 400
oosporas/ml de suelo. El patógeno pudo ser aislado de estos tejidos.

En los países nórdicos se estudió la frecuencia de la formación de oosporas, en foliolos que


tuvieran dos o mas lesiones. Las lesiones que coalescieron fueron analizadas y congeladas y las
que no se juntaron, fueron incubadas hasta que se juntaran. Se detectaron oosporas en 10 campos
de Suecia y 13 de Noruega. La frecuencia de oosporas fue mayor con la incubación. La
reproducción sexual en estos países, incrementa la variabilidad genética y la posibilidad de
sobrevivencia en el suelo (Dahlbery et al., 2002).

Medina y Platt (1999) estudiaron la viabilidad de las oosporas bajo las condiciones de campo en
el noreste de América del Norte y encontraron que después de siete meses de exposición a
condiciones de invierno la viabilidad de las oosporas enterradas en la Isla Príncipe Eduardo (PE)
Y New Brunswick (NB) osciló entre 2.5-13% y 1-28% respectivamente con la prueba de
plasmólisis y con la prueba de bromuro de tetrazolio varió entre 13-44% y 2.5-40%. En otros
estudios en la isla PE la viabilidad de oosporas varió entre 5-15% doce meses después de
enterradas.

En condiciones controladas de laboratorio, Meedina y Platt (1999) observaron que la menor


viabilidad (22%) de las oosporas, se presentaba a la mas alta temperatura evaluada (36 ºC) y la
germinación fue relativamente baja (6-19%), pero suficiente para demostrar que las oosporas son
una fuente de inóculo importante, pues fue estimulada por extractos de tallos y tubérculos
adicionados al sustrato. Por otro lado, las oosporas que se formaron en los tallos de papa y el
suelo, fueron infectivas a discos de hojas, siete meses después de permanecer en el suelo. Estos
autores no indican el origen de la oosporas (cruce sexual, apomixis o autofertilización)

Oliva et al, (2002) evaluaron el potencial sexual in vitro de aislamientos representativos de las
diferentes poblaciones ecuatorianas (A1: EC-1 de papa y S. colombianum, US-1 de tomate, EC-3
de S. betaceum y como A2: EC-2 de S. brevifolium especie silvestre) de P. infestans, y
encontraron bajo porcentaje de germinación de oosporas, posiblemente por una barrera para la
reproducción sexual, entre poblaciones adaptadas a huéspedes diferentes, ya que solo un cruce
produjo suficiente progenie para la evaluación (EC-1 x EC- 2) en medio con agar.

El cruce arriba señalado se produjo entre el aislamiento A1 perteneciente al linaje clonal EC-1,
aislado de Solanum colombianum con un haplotipo mitocondrial II-a y el A2 (población EC-2) de
S. brevifolium, con un haplotipo mitocondrial I-c. La progenie conformada por 23 oosporas que
germinaron, pareció ser híbrida, aunque no todos los marcadores presentaron las segregaciones
esperadas. Esto indica que existe un riesgo de recombinación entre genotipos que coexisten,
60
aunque filogenéticamente sean distantes, pues se destaca que la mayor progenie se dio entre
aislamientos de dos especies de Solanum silvestres y Brasier et al., 1999 citado por Oliva et al.,
reportaron un nuevo híbrido interespecífico de Phytophthora que afecta el sauce (Alnus spp).

La fertilización cruzada parece ser mas efectiva entre los aislamientos procedentes de una
misma especie, que entre aislamientos procedentes de diferentes especies, según las
observaciones de Oliva et al., (2002). Muchos de los aislamientos exhiben una preferencia
sexual, produciendo de manera predominante, gametangios masculinos si los aislamientos eran
A2, o femeninos si los aislamientos eran A1.

Cuando el anteridio y el oogonio se forman en el mismo parental (además son auto fértiles o
apomícticos), el número de la progenie tiende a incrementarse, si las oosporas se forman muy
cerca al parental, lo cual puede deberse a una mas alta proporción de micelio de uno de los
parentales. Pero la ocurrencia de esta “progenie no híbrida”, varía con el tipo de aislamientos
utilizados en el apareamiento. Ahora se sabe que existen tres mecanismos diferentes para la
producción de oosporas en P. infestans: Apomixis, autofertilización y fertilización cruzada
(Judelson, 1997 a, citado por Smart et al,. 2000).

Las progenies apomícticas deben tener la misma patogenicidad y agresividad del parental, dado
que son idénticas y por lo tanto pueden tener una ventaja por la eficacia biológica sobre las
progenies autofertilizadas o de cruces, cuyas consecuencias epidemiológicas se desconocen. En
términos generales las líneas apomícticas han sido regeneradas de muchos aislamientos apareados
en el laboratorio. Lo que ha sido determinado por alelos aloenzimáticos, el tipo de apareamiento
y el tipo de huellas (finger printing) del genoma nuclear (Smart, et al., 2000).

La autofertilización en P. infestans es muy común y puede ser iniciada por muchos


mecanismos. En un estudio de laboratorio se encontró que los linajes clonales US-7 y US-8
fueron autofértiles cuando crecieron sobre agar-V8. La progenie de las oosporas de una de estas
líneas fueron germinadas y parecían haber sido producto de un evento meiótico, mas que una
apomixis. Un estudio mas extenso de autofertilidad, ha mostrado que el 96% (n=47) de las líneas
con tipo de apareamiento A2 y 6% (n=69) de líneas A1, fueron autofértiles en agar-V8. ( Smart y
Fry, no publicado, citado por Smart et al., 2000).

Diversas investigaciones han mostrado diferentes factores que inducen la formación de


oosporas en especies de Phytophthora heterotálicas, que indica que el control genético sobre el
apareamiento puede ser débil. Dichos factores son: edad del cultivo, heridas, presencia de
Trichoderma viridae, exudados de plantas huéspedes, niveles de calcio, fungicidas. La
importancia relativa de las oosporas producidas por los diferentes mecanismos es completamente
desconocida. Es posible que las progenies de origen apomíctico, sean mas adaptadas
biológicamente, que las de autofertilización o fertilización cruzada; o que la autofertilización de
este organismo altamente heterocigoto, pueda producir una progenie genéticamente diversa y
epidemiológicamente importante. Así, las oosporas de cada uno de los tres procesos, pueden
tener un determinado papel en las relaciones huésped-patógeno (Smart, et al, 2000).

3. Ciclo de Vida de Phytophthora infestans

La figura 3 presenta el ciclo de vida con los respectivos mecanismos de reproducción sexual y
asexual: Este último mecanismo es mas frecuente.

61
Figura 3. Ciclo de vida de Phytophthora infestans.
Tomado de : http://www.cals.ncsu.edu/plantpath/Faculty/ristaino/graphics/fig1.gif

62
CAPÍTULO V

FUENTES GENÉTICAS DE RESISTENCIA A LA GOTA CAUSADA POR P.


INFESTANS

Se considera un huésped resistente cuando no puede ser atacado por el patógeno. Sin embargo,
en la relación huésped-patógeno, la resistencia puede ser de varios niveles y algunos individuos o
clones, pueden estar mas afectados que otros. La resistencia puede ser total (100%), o parcial
(Turkensteen, S.F.).

Ha habido un éxito limitado en la resistencia de variedades de papa a P. infestans, a pesar de


que existe una amplia reserva de genes en especies silvestres de Solanum, dado que se conoce
muy poco sobre la fisiología y las bases moleculares de la resistencia (Vleeshowuers, et al.
2000). Otro aspecto es la complejidad del patógeno, pues los aislamientos a evaluar deben ser
representativos de la población de P. infestans en por lo menos 12 a 20 años. Se cuestiona si las
pruebas deben ser hechas con un solo aislamiento compatible a todas las fuentes de resistencia
disponibles. Es necesario readaptar los procedimientos de selección por resistencia, acompañada
de una base de datos y una colección de aislamientos debidamente caracterizados, para las
pruebas de selección de materiales mejorados ( Turkensteen y Flier, 2002b).

Según Wastie (1991) los mejoradores necesitan con urgencia, la información concerniente a la
localización de los genes responsables de los diferentes componentes de la resistencia de campo,
para lo cual la genética detallada y el análisis estadístico de los diferentes componentes de la
resistencia, pueden ayudar en la localización e identificación de genes de resistencia que operan
en diferentes estados del proceso de infección y además se incrementan los niveles de
resistencia, por la combinación apropiada de genes. En la actualidad hay buena parte de esta
identificación (Gebhardt, 1999; Vleeshowuers, et al., 2000; Smart et al., 2000).

Hay diferencias de criterio entre los grupos que defienden la utilización de materiales vegetales
con genes R los que prefieren que estén libres de los genes R. El hecho es que los materiales con
genes R pronto o mas tarde pierden la resistencia por compatibilidad con las poblaciones de P.
infestans predominantes. Según Turkensteen y Flier (2002b) existen tres normas básicas sobre la
resistencia a este patógeno: 1. Los genes R pueden contribuir a la resistencia parcial durable a
través del ligamiento o por efectos pleitrópicos. 2. Hay evidencia de que el mejoramiento por
genes R Puede producier variedades muy susceptibles , como la variedad Vertifolia que posee
cuatro genes R (R1, R2, R3, R4). 3. Hay una sólida evidencia de los buenos niveles de
resistencia después de la remoción de los genes R de las poblaciones mejoradas.

Estas tres reglas parecen ciertas, pero no todas al mismo tiempo, en el mismo clon o con la
misma fuente de resistencia. La experiencia y malicia del mejorador son muy importantes para
definir los procedimientos, además de los recursos económicos, pues la resistencia tiene una alta
prioridad, para contrabalancear el incremento de la agresividad de las nuevas poblaciones de P.
infestans (Turkensteen y Flier, 2002b)

Umaerus et al., (1983) citado por Wastie (1991) opinan que un mayor conocimiento de la
bioquímica de los mecanismos de resistencia y sobre el cual todavía hay grandes falencias, podría
63
ayudar al desarrollo de las técnicas de selección. Las técnicas in vitro para la producción de
haploides, combinadas con el tamizado in vitro, favorecerían el proceso de mejoramiento.

Hermsen (1987) citado por Wastie (1991), señala que el mejoramiento a nivel diploide tiene
muchas ventajas, dado que se puede utilizar mayor diversidad de parentales con amplia base
genética, permite mejor entendimiento de la herencia de caracteres específicos, por la evaluación
a nivel diploide y el incremento de la resistencia a nivel de poligenes, posibilita la conversión al
estado tetraploide por el uso de gametos 2n y el mejoramiento de tetraploides por la fijación de
características deseables.

Dicho investigador recalca que es difícil determinar la mejor estrategia para el mejoramiento
para una resistencia alta y estable, debido a la asociación de la resistencia poligenética con las
características de madurez tardía por la asociación de los poligenes con los genes R o porque la
resistencia poligénica aparentemente no se expresa en gran extensión en el follaje de variedades
tempranas.

El programa de mejoramiento Sueco, (Umareus et al.,1983, citados por Wastie, 1991), ha


logrado separar la asociación entre madurez y resistencia. Gebhardt (1999), señala que es posible
con ayuda de los marcadores de DNA, identificar alelos superiores para resistencia cuntitativa,
separados de los ligados a la maduración de las plantas y determinar en una población híbrida, los
genotipos poco frecuentes con alelos QTL superiores para la resistencia a tizón tardío. Unos
pocos QTLs para resistencia a gota, están relacionados con los genes de las proteínas (PR)
asociadas a la patogénesis.

Mendoza (1997) citado por Waste (1991) señala que el programa de mejoramiento del CIP,
viene utilizando la resistencia del germoplasma de México y Sur América, a través de cuatro
ciclos de selección recurrente de fenotipos. Las pruebas de campo para tamizar las poblaciones
en el estado de plántulas, produjeron un 75% de clones resistentes, después de cuatro años de
evaluación en Colombia, la mayoría de las selecciones fueron también resistentes en Toluca
México. Las características agronómicas, incluyendo la adaptación a la longitud del día y el
periodo de maduración, también fueron mejoradas. Estos parentales sobresalientes son una
fuente de germoplasma valioso, para los programas de mejoramiento de otros países.

Al comparar 10 clones sin genes mayores R (población B del CIP) y 10 variedades de papa
mexicanas con los genes R y menores (población A del CIP), bajo las condiciones del valle de
Toluca, no se observaron diferencias entre ambas poblaciones, a pesar de que se presentaron
condiciones climáticas favorables. Al final del periodo vegetativo se observó que las poblaciones
A y B presentaron menos de 25% de severidad, mientras que en la altamente susceptible, Alfa, se
presentó el 95% de severidad de la gota. Estos resultados sugieren que los genes con resistencia
de campo operan de manera similar cuando están solos o en combinación con los genes mayores.
Es difícil separar los genes R porque generalmente están ligados, además las evaluaciones para
seleccionar las poblaciones B, se hicieron con base en la imposibilidad de la raza “o” de infectar
cualquier material con los genes R conocidos, pero existe la posibilidad de que existan otros
genes R ligados a los genes menores en la población B (Rubio-Covarrubias, et al., 2002).

Los programas de mejoramiento necesitan pruebas de progenie, con amplio juzgamiento de los
parentales potenciales de alto valor por resistencia fenotípica y los productos de dicho
juzgamiento, proporcionan materiales valiosos para la selección por resistencia a gota y otras
características, permitiendo una escala de tiempo y recursos para lograr los objetivos del
64
mejoramiento. Se debe coordinar la provisión de facilidades de materiales con resistencia,
cuarentenas y pruebas de evaluación en el mundo sobre una base recíproca, pues para determinar
si la resistencia tiene una base estable, deben hacerse evaluaciones en varias localidades,
incluyendo México e impulsar el trabajo multidisciplinario, que permita poner las nuevas
tecnologías al servicio de la agricultura (Wastie, 1991).

Es necesario continuar con las investigaciones sobre la relación entre la resistencia del follaje y
la de los tubérculos, los factores bioquímicos y fisiológicos que influyen en la infección y el
análisis genético de sus componentes los cuales a su vez pueden facilitar el tamizado para los
factores de pre y pospenetración y la posibilidad de diseñar pruebas moleculares (Wastie,1991).

Estrada (2000) enfatiza en la utilización de S.stoloniferum como fuente de resistencia al tizón


tardío, en cruzamientos con S. phureja. Aunque la mayoría de los clones producen tubérculos
muy pequeños en la F1, algunos presentan buen tamaño y buena forma. Aunque los híbridos son
triploides, (2n=3x=36) tiene 5-20% de polen funcional que origina gametos (2n=2x=24) para
fertilizar cultivares tetraploides y obtener una segunda generación de híbridos con buen
rendimiento, buena forma y tamaño de tubérculos, resistencia horizontal a la gota y bajo
contenido de alcaloides.

En cruzamientos de S. stoloniferum (clones PI 220552, 160225 y 230490) con S. brevidens se


obtuvo híbridos triploides con polen de baja fertilidad (2%) los cuales se cruzaron con clones
avanzados de tetraploides y se obtuvieron clones promisorios para caracteres agronómicos, con
resistencia a gota, PLRV y PVY. Además, fue posible acortar los ciclos de cruzamiento para
obtener clones de calidad (dos, tres generaciones), reducir las poblaciones necesarias para
transferir los genes deseados en las especies silvestres y explotar los genes mas convenientes de
las especies S. stoloniferum, S. brevidens, S. avilesii, S. brachycarpum, S.bulbocastanum,
S.cardiophylum, S. demissum, S.hougasii, S. iopetalum, S. polytrichon, S. polyadenium, S.
verrucosum, S. tuberosum, S. andigena, S. phureja, S. stenotomum y S. juzepczukii (Estrada,
2000).

El cruce con especies diploides como S. phureja con dihaploides de S. tuberosum, resulta en el
desarrollo de partenogénesis del núcleo del óvulo y da origen a plantas que pueden tener óvulos
fértiles y ocasionalmente polen fértil, lo que facilita la selección especialmente la determinada
por poligenes. Sin embargo, se pueden presentar componentes genéticos aditivos y no aditivos,
que resulta en altos niveles de resistencia a la gota en los folíolos. Un parental que se comporta
aditivamente en un cruce, puede no serlo en otro (Wastie, 1991).

Bolívar y López (1995) evaluaron 195 clones diploides de papa derivados de Atzimba (variedad
tetraploide mexicana), por resistencia a P. infestans y producción de polen 2n, después de dos
evaluaciones sucesivas, seleccionaron 32 clones que producían polen 2n y de éstos 29
presentaron resistencia moderada a gota. Este material fue producido por el CIP y evaluado en
Rionegro, Colombia, Centro Regional Experimental “La Selva”.

1. Resistencia Específica a Razas de P. infestans

En la interacción S. tuberosum/Phytophthora infestans, el tipo de resistencia mas comúnmente


estudiado, es la resistencia específica a razas, la cual está gobernada por un sólo gen resistente y
dominante (gen R), y por lo tanto, efectiva contra una determinada raza del patógeno y se rompe

65
facilmente por una evolución rápida del patógeno, por lo que se hace poco durable en el campo.
Según Estrada (2000), estos genes R fueron aislados de la especie S. demisum, por Salaman en
Inglaterra y Reddick en Estados Unidos en 1910’s, los cuales posibilitaron nuevas variedades con
resistencia completa, pero sólo se mantuvo en los primeros años, posiblemente por la variación
sexual o parasexual del patógeno

La resistencia específica es manifestada por una respuesta o reacción de hipersensibilidad (HR)


rápida, que produce una necrosis localizada en el sitio de la infección, lo que restringe el
patógeno al sitio de la lesión, impidiendo su expansión a otros tejidos de la planta, debido a que
el producto de un gen de resistencia dominante de la planta (R), interactúa específicamente con
un elicitor específico de la raza del patógeno, producto de un gen genéticamente dominante de
avirulencia “Avr” que resulta en el estímulo de una reacción de hipersensibilidad (Cornelissen y
Melchers, 1993).

Las proteasas extracelulares ricas en serina inician la reacción necrótica sobre las hojas de papa
(respuesta hipersensible) y por análisis estadístico del banco de datos de la Universidad de
Agricultura de Wageningen, encontraron un clon que tiene alta homología con las proteasas
aspárticas, las cuales pueden elicitar la necrosis en las hojas microinyectadas y las células
muertas sobre cultivos celulares de papa (Paris y Lamattina, 2002b).

En el CIP se ha venido evaluando la introducción de genes que inducen la formación de


proteínas antifúngicas, como la glucanasa (PR-2) de papa, el gen de la osmotina de S.
commersonii y los genes de las lisosimas del bacteriófago T y bovino, en diferentes
combinaciones (simple, dobles y triple gen) para transformar los tejidos de dos variedades de
papa y se obtuvo callos y tejidos transformados con uno o dos genes, pero no con el constructor
de tres genes (Guevara-fugita et al., 2002).

Igualmente están tratando de aislar genes como la defensina de Lepidium meyenii, que codifican
para proteínas relacionadas con la patogénesis y pertenecen a la familia PR-12, las cuales son
ampiamente distribuídas dentro de las plantas como trigo, cebada, arveja y varios miembros de la
familia Brassicae. De los cuatro tipos de defensinas que existen en las plantas sólo las del grupo I
(defensinas morfogénicas) y las del grupo II (defensinas no morfogénicas) tiene propiedades
antifungosas y se espera poder evaluar contra la actividad de varios patógenos de papa,
incluyendo P. infestans (Guevara-fugita et al., 2002).

Wastie (1991) indica que el programa de mejoramiento genético de Alemania, utilizó


materiales producidos por cruces con S. demissum, dando origen al material “W-Rassen” del cual
se obtuvo en 1934, la primera variedad resistente a la gota “Sandnudel”, y luego se llegó a
obtener un 83% de las variedades con genes de S. demissum, al igual que Escocia, en donde
también se utilizó S. phureja. En Europa y Norte América se utilizaron además S. chacoense y S.
verrucosum. La variedad “Empire” de Estados Unidos liberada en 1945, procedía de S.
demissum, seguida por variedades producidas por retrocruces con S.maglia y S. fendleri. La
variedad “Kennebec”, obtenida en 1948, procedía del material denominado “W-Rassen”.

En Rusia han identificado que S.polytrichon, S. verrucosum, S. pinnatisectum de México y S.


simplicifolium, S. berthaultii y S. gourlay de Suramérica, son buena fuente de resistencia
horizontal y representan una fuente poco utilizada para los programas de mejoramiento genético,
sin olvidar que se reduce la producción (Kolovayev, 2002).

66
Estrada (2000) señala que para 1932, se observaron infecciones fuertes en los nuevos híbridos,
debido a que el patógeno empezó a seleccionar sus propios patotipos o razas, por lo cual Black et
al., (1953) desarrollaron un esquema internacional para explicar la resistencia, basado en los
genes del huésped que interactuaban o correspondían a los genes del patógeno, de tal forma que
P. infestans desarrollaba genes recesivos, en la medida que se incorporaban genes resistentes en
los nuevos cultivares de papa. Así, el genotipo R1 de un cultivar se infectaba con el patotipo
simple r1, y con los mas complejos 1.2, 1.3, 1.2.3, y demás, pero no con los patotipos 2.2, 2.4,
2.3.4... con mayor variación en México, donde se han encontrado los dos tipos de apareamiento
A1 y A2. Sin embargo, estos patotipos también se pueden formar en ausencia de genotipos de
papa.

Según Wastie (1991) S. demissum presenta los dos tipos de resistencia, la general o de campo,
que depende de la acción combinada de muchos genes y la resistencia específica a razas, cuya
base genética es la relación gen-a- gen, propuesta por Flor en 1958. Según Estrada, (2000) en
dicha especie hexaploide, se reconocieron 11 genes de resistencia, los cuales actúan por
condicionar una respuesta necrótica hipersensible, en las células invadidas por el patógeno, la
cual está conectada al menos en los tubérculos, con la formación de fitoalexinas como risitina,
fituberina y raras veces solavetivon y lubimina, las cuales son sesquiterpenoides de bajo peso
molecular, formados en la vía metabólica acetato-mevalonato, la cual termina con la producción
de a-chaconina, a-solanina y otros

Ross (1986) citado por Estrada (2000) dice que la síntesis de las fitoalexinas, está mediada por
la formación de elicitores-ácidos grasos insaturados de la pared celular del patógeno. Los
elicitores reaccionan con la lectina de la papa, glicoproteínas ricas en hidroxiprolina y otros
fragmentos similares de la pared celular, que sirven como receptores de las células del huésped,
induciendo la producción de fitoalexinas, las cuales se acumulan en las células, que mueren junto
con las del patógeno invasor, dando como resultado una reacción de incompatibilidad. La
síntesis es inhibida cuando los glucanos (cadenas de glucosa, específicos y solubles en agua)
formados por patotipos especiales, bloquean los sitios receptores, reduciendo o impidiendo la
formación de terpenoides tóxicos, dándose una reacción de compatibilidad.

Al parecer los productos del huésped sintetizados por el gen R, controlan los sitios receptores.
Cada patotipo posee un sistema patogénico no específico para inducir la síntesis de fitoalexinas y
por otro lado, un sistema específico para bloquear la síntesis, si encuentra receptores específicos
en el huésped. Parece que la reacción de hipersensibilidad no está relacionada con la acumulación
de fitoalexinas. (Ross, 1986, citado por Estrada, 2000).

Vleeshowuers, et al., (2000b) opinan que la principal respuesta de defensa durable de las
plantas al patógeno es la HR, dado que está asociada con resistencia parcial y resistencia total
(no huésped) a P. infestans, tanto para las especies de Solanum spp., Nicotiana tabacum y
N.rustica, como para las no solanaceae A. thaliana, R. sativa, y M. Jalapa, posiblemente por una
cascada de señales iniciada por genes R, que se traduce en una respuesta HR. Igualmente la
variedad antigua Robijn de papa, presenta resistencia parcial durable.

Los resultados de la investigación de Vleeshowuers, et al., (2000b) indican que la diferencia


entre compatibilidad e incompatibilidad es del tipo cuantitativo mas que cualitativo (genes R).
Sin embargo, el modelo clásico de un gen R de resistencia del huésped por un gen Avr de
avirulencia en el patógeno, se puede utilizar para explicar el caracter cuantitativo de la resistencia
parcial. Existe la posibilidad de que un gen débil R-10 de la papa, interctúe con un gen Avr y
67
desarrolle niveles alterados de la resistencia, que permiten alguna colonización del patógeno bajo
ciertas condiciones. Estrada (2000) señala que la combinación de genes R con poligenes o genes
menores en el híbrido de S. demissum MPI 19286, que tiene el gen R10, da origen a una
resistencia de campo muy alta, según las investigaciones realizadas por el CIP en 1983.

Por otro lado, los productos de los genes Avr del patógeno pueden codificar ligandos débiles,
según lo observaron Kamoun et al., (1999b) (citado por Vleeshowuers, et al., 2000a) la expresión
de genes Avr, con una actividad reducida del elicitor en plantas de papa transgénicas con
resistencia al virus X, dieron una respuesta de mas baja resistencia en tabaco. Estos datos
indican que los genes R tienen un papel potencial dentro de la resistencia parcial, por lo tanto los
mejoradores, no deben seleccionar variedades sin los clásicos genes R, para lograr resistencia
durable al tizón tardío, al igual que la utilización de genes de resistencia de los no huéspedes. Al
respecto hay criterios encontrados.

La actividad diferencial de la respuesta HR entre variedades R1 y R10 puede sugerir la


existencia de umbrales diferenciales entre R1 y R10 para activar la HR. Un efecto de dosis en los
receptores o en los genes R, puede incrementar la sensibilidad del patógeno y luego la resistencia.
Las plantas “duplex” de plantas tetraploides que contienen dos genes R de la misma clase
(R1R1r1r1), fueron mas resistentes a P. infestans que los “simplex” (R1r1r1r1). Pero no se
puede excluir la presencia de otros genes R desconocidos (Vleeshowuers, et al., 2000b).

Se demostró que los genes de avirulencia Avr (reportados después de 1980s) en la mayoría de
los casos se presenta con un gen específico de resistencia R del huésped. La descendencia de
ambos padres virulentos (rr x rr = F1 rr) genera hijos virulentos. Pero en ocasiones se han
presentado descendientes avirulentos, razón por la cual el modelo de que la avirulencia del
patógeno, está relacionado con la dominancia del huésped, es inadecuado o tiene excepciones
(Vleeshowuers, et al., 2000).

Hasta el presente han sido mapiados varios genes R. Así: R1 en el cromosoma 5, R2 en el


cromosoma 4, R3, R6 y R7 en el cromosoma 11: recientemente se ha aislado un nuevo gen R de
S. berthaultii en el cromosoma 10. En tomate se aislaron los genes Ph-1 en el cromosoma 7 y Ph-
2, sobre el brazo largo del cromosoma 10. El mapa genético de papa es altamente colineal con el
de tomate (Smart et al., 2000).

El gen R1 es miembro de una familia de genes que codifica para una proteína de 1293
aminoacidos, con una masa molecular de 149,4 Kda, y pertenece a la clase de genes para
resistencia a patógenos, dicha proteína es alta en leucina (Gebhardt, 2003). Al parecer hay dos
QTLs en el cromosoma V que no se pueden distinguir: uno para el tipo de madurez del follaje y
el otro para la resistencia a P. infestans, o existe un sólo gen con un efecto pleiotrópico sobre
ambas características. Los dos QTLs para resistencia a gota (en los cromosomas 3 y 5) muetran
una importante interacción epistática, sugiriendo que los QTLs para resistencia afectan la
expresión el uno del otro (Visker et al., 2003).

2. Resistencia Parcial o Cuantitativa (Resistencia de Campo)

En contraste con los grandes efectos asociados a la resistencia con genes R, se presenta una
resistencia producto de la suma de muchos efectos pequeños, los cuales probablemente están bajo
control poligénico, denominada resistencia parcial, de campo o resistencia no específica y se

68
atribuyen a las expresiones del fenotipo en las parcelas de campo, contribuye a la reducción de la
enfermedad, pero es difícil de analizar por técnicas mendelianas e incluso por marcadores
moleculares, dada la naturaleza poligenética de la resistencia y la poliploidía y heterocigosis de la
papa.

Hay consenso de que la resistencia cuantitativa generada por genes menores debe ser utilizada
para lograr una resistencia durable contra P. infestans, demostrado por mas de 30 años en
Holanda con las antiguas variedades y en regiones tropicales donde la gota es endémica, puesto
que se presentan rangos de infección estables a la gota. En el CIP se hizo mejoramiento
inicialmente con materiales con genes R y luego con fuentes libres de genes R, presentando un
incremento significativo de la frecuencia de genes con resistencia a niveles mas altos y con
características agronómicas de importancia económica superiores, cuyos materiales deben
continuar siendo evaluados en diferentes condiciones ambientales y poblaciones de dicho
patógeno (Landeo, 2002).

Según Wastie (1991) se han estudiado los componentes bioquímicos de la resistencia de campo,
en los que se incluyen los compuestos glucanos y fenólicos. Se atribuyó la resistencia de S.
berthaultii a ésteres de los ácidos grasos exhudados por los tricomas glandulares sobre las hojas.
También se describió una toxina que producía P. infestans en cultivos líquidos, la cual causaba
una lesión necrótica sobre S. tuberosum, pero no pudo relacionarse con la resistencia al patógeno,
por lo tanto no puede ser utilizada para seleccionar la resistencia.

Behnke (1979-1980) citado por Wastie (1991) seleccionó varios cultivos callosos de tres clones
de papa sobre medios que contenían filtrados de cultivos de P. infestans. Los callos que
sobrevieron varias transferencias sobre este medio, produjeron plantas las cuales desarrollaron
pequeñas lesiones, en relación a las plantas no seleccionadas, cuando fueron inoculadas en el
invernadero, pero la prueba de campo no produjo resultados.

También Stolle y Schöber (1985), Foroughi-Wehr y Stolle (1986) citados por Wastie (1991)
cultivaron callos sobre toxinas producidas por cultivos líquidos del patógeno, encontrando
diferencias en las reacciones entre cultivares, pero desafortunadamente no coincidieron con los
ensayos de campo para la resistencia al patógeno.

Dicho sistema fue utilizado por Urrea (2000), haciendo selección de células in vitro de la
variedad Diacol Capiro con filtrados y toxinas producidas en medios líquidos de diferentes cepas
de P. infestans y algunas pruebas de inoculación en plantas regeneradas in vitro, adaptadas a
invernadero y campo, con poca efectividad, pues varios de los materiales seleccionados in vitro y
en invernadero al ser llevados a pequeñas parcelas en campos comerciales, presentaron alta
susceptibilidad, al igual que la variedad Diacol Capiro (Botero, H., 2001, comunicación
personal).

Según Estrada (2000) este tipo de resistencia fue observado en los años 1950’s por
Niederhauser y su grupo en México y Thurston, Guzmán, Estrada y Heidrick en Colombia, en
algunas variedades e híbridos mejorados, considerados muy susceptibles, pero que permanecían
verdes por un tiempo más largo, que otras variedades durante las epidemias fuertes de tizón
tardío. Es posible acumular genes de resistencia utilizando especies silvestres resistentes como S.
stoloniferum, S. verrucosum, S. polyadenium, S. bulbocastanum, S. iapetalum, S. brachycarpum,
S. hougasii, S. chiquidenum, S. berthaultii, S. vernei, S. avilesii y otras.

69
En Rusia Zoteyeva, (2002) hizo evaluaciones de campo en dos periodos ampliamente
distanciados (1982 y 2001) en 22 especies de papa silvestres. Encontró que la patogenicidad de
P. infestans en las estaciones de 1982 y 2001 fue similar con base en las fechas de los primeros
síntomas de gota en el campo y la infección total de dos de las especies mas susceptibles: S.
Kurtzianum y S. chacoense. En ambos periodos las evaluaciones de campo mostraron algún
grado de desarrollo de la enfermedad sobre plantas de S. bulbocastanum, S. verrucosum, S.
spegazzinii y S. kurtzianum, S. demissum, S. stoloniferum, S. vernei, S. papita, S. polytrichon, S.
berthaultii, S. oplocense y S. canesense. Se confirmaron los niveles altos de resistencia para
accesiones individuales de S. simpicifolium, S. stoloniferum,S. S. ruiz-ceballosii, S.
neoantipoviczii y S. pinnatisectum, lo que indica los niveles de resistencia estables de la mayoría
de las accesiones probadas en los dos periodos.

Algunos clones como las variedades López, Amarilla de Puebla (andigena) y Atzimba
(tuberosum) en México, Algodona, Jabonilla, Flora (andigena) y Soliman (phureja) y en los
híbridos Monserrate y Cumbal y otros de Colombia, se observó que aunque se infectaban con
gota, el daño de la planta era limitado (ligero a moderado) y el patógeno se diseminaba mas
lentamente en el campo. Situación similar fue observada por Jaramillo y Gilchrist (2002), en la
evaluación de seis de los clones que el grupo de papa de la Universidad Nacional de Colombia,
ha venido produciendo y evaluando, con miras al lanzamiento de nuevas variedades para
consumo fresco e industria y posiblemente forrajeras.

En dicha investigación se observó que algunos clones presentaron el comportamiento típico de


resistencia específica y luego resistencia general, confirmando las observaciones de
Vleeshowuers et al., (2000b) y Gebhardt (1999), quienes señalan la presencia de algunos loci que
confieren resistencia específica y alelos QTL (regiones del genoma con contribución cuantitativa
de resistencia) en un mismo cromosoma, conformados por secuencias similares a genes de
resistencia “resistance gene-like sequences”.

El estudio mas destacado de resistencia poligénica en Colombia, fue el realizado por Estrada y
Guzmán (1969) con la variedad “Algodona” de S. andigena, cultivado en el sur del país y
probado por mas de seis años en el campo sin la aplicación de fungicidas. Posiblemente este sea
la variedad mas resistente a gota de esta especie, según pruebas realizadas por Estrada (2000) en
Perú y Bolivia.

Al evaluar la descendencia producto de la autofecundación de esta variedad, determinaron que


que se trataba de una resistencia basada en la herencia tetrasómica, suponiendo que hubo una
distribución independiente de los genes y un tipo de segregación cromosómica. Se postuló que la
resistencia se debía a cuatro pares de genes con un efecto aditivo similar, suponiendo que la
variedad algodona era dúplice para cuatro pares de factores, AAaaBBbbCCccDDdd, donde la
letra mayúscula no indica dominancia, sino un factor de resistencia horizontal (Estrada y
Guzmán, 1969).

Guzmán (1964) estudió la resistencia de campo en numerosos clones de las especies tuberosum,
andigena y phureja y encontró diferencias en la penetración, velocidad de esporulación, tamaño y
tipo de lesión en diferentes variedades. No observó diferencias en el periodo de incubación. Los
tamaños de lesiones fueron de menor a mayor en las siguientes variedades: Monserrate (tbr x
adg) con alta resistencia; algodona (andigena) resistente; Tocana (andigena) ligeramente
resistente y Curipamba (adg x adg) susceptible.

70
La variedad Monserrate obtenida por Estrada y Hawkes en 1950, proviene del cruzamiento de
la variedad Branca Cascuda de tuberosum, una antigua variedad holandesa seleccionada en
Brasil, con la variedad Pana Blanca de andigena, nativa de Colombia. Ambos padres tienen una
resistencia intermedia, pero dentro de la descendencia se obtuvieron 3-4 clones con resistencia
superior, de los cuales se seleccionó Monserrate (Estrada, 2000).

La resistencia de la variedad Monserrate se podría explicar por la complementación de genes o


por la interacción no alélica. Si se supone que los padres tenían por parte de Branca Cascuda
cuatro (4) genes dúplices para resistencia y por parte de Pana Blanca Seis (6) genes dúplices para
resistencia, el híbrido Monserrate, podría resultar con 10 genes para resistencia en cuatro loci
distitos. Esta variedad ha mostrado durante cuarenta años, en localidades y ambientes diferentes,
nivel superior de resistencia horizontal, a los materiales de tuberosum evaluados (Estrada, 2000).

El mapeo y análisis de los (QTL) para la resistencia general del follaje de papa a la gota, se
efectuó en ocho (8) familias híbridas producidas a partir de once (11) líneas parentales diploides
de diferentes origenes intra o interespecífico y de una familia híbrida, que se produjo de un cruce
entre la variedad Stirling y la linea 12601 ab1 derivada de SCRI. Al juntar y analizar todos los
resultados de los experimentos del mapeo de los QTL, se observó que los factores que afectaban
la resistencia cuantitativa a la gota en el follaje, se encontraban en los 12 cromosomas de papa,
demostrando la naturaleza poligénica de la resistencia de campo (Gebhardt, 1999).

Sin embargo, no siempre se detectan los QTL en todos los híbridos evaluados, lo que indica la
presencia de diferentes alelos en cualquiera de los QTL de los materiales genéticos analizados, lo
cual puede tener diversos efectos sobre la resistencia y además pueden interactuar de manera
diferente entre sí y con el ambiente (Vleeshowuers, 2000). Las grandes diferencias entre los
componentes de la resistencia dependen de las variedades y de las especies silvestres. En algunos
híbridos, pueden actuar los efectos de la habilidad combinatoria general debida a genes aditivos
y/o la habilidad combinatoria de los genes específicos (R) debido a interacciones no alélicas de
genes (epistasis) o una combinación de ambas (Estrada, 2000).

Se han encontrado QTL de resistencia general a gota, ligados a genes R de resistencia


específica: el R1 sobre el cromosoma V y el grupo de R3, R6 y R7 sobre el cromosoma XI, lo
que sugiere que los componentes de la resistencia general a la gota, están controlados por genes
similares, como los de la resistencia específica a razas, según lo señala Vleeshowuers (2000), en
cuyo caso, no sería tan fundamental diferenciar entre los genes que controlan la resistencia
cuantitativa de la cualitativa a la gota. Las diferencias observadas a nivel de fenotipo, pueden ser
el resultado de variaciones alélicas de uno o varios genes relacionados (Gebhardt, 1999).

Las características de la resistencia de campo generalmente se expresan por la reducida


posibilidad del establecimiento del patógeno, por una demora o inadecuado reconocimiento de
los elicitores del patógeno, por los genes débiles de resistencia (R), lo que se traduce en la
reducción de la tasa de crecimiento del patógeno en los tejidos del huésped, y por una reducida o
ausencia de la esporulación y desarrollo de la lesión (Estrada, 2000 ; Smart, et al., 2000).

En las interacciones compatibles e incompatibles del patosistema S. tuberosum/P. infestans, se


han encontrado depósitos de calosa en la pared celular. En diferentes especies, la lignificación
(lignina y suberina), también está asociada con la resistencia a éste y otros patógenos (Estrada,
2000; Vleeshouwers, et al., 2000).

71
Al comparar los procesos de infección y las respuestas de resistencia de las plantas con
diferentes tipos y niveles de resistencia, se puede entender mejor los mecanismos involucrados en
la resistencia durable. En las especies silvestres de Solanum, es posible encontrar una gama de
resistencias, desde altamente resistentes como Solanum nigrum-SN18, con reacción de
hipersensibilidad en el sitio de la inoculación, a mas susceptibles como S. arvenzii x
hondelmannii-72, las cuales presentaron alta eficiencia de la infección (IE 86%) y alta tasa de
crecimiento de la lesión (IGR 2,4 mm/día) o susceptibles, mostrando una expansión rápida de la
lesión (hasta 4 mm/dia). Mientras que en las especies no huéspedes (completamente resistentes)
como Arabidosis, rábano (Raphanus sativus), tabaco y Mirabilis jalapa macroscópicamente no se
observaron lesiones (Vleeshouwers, et al., 2000b).

Cuando la resistencia se da por efecto de no huésped, se denomina resistencia completa a nivel


de especies o géneros, la cual se conoce poco en oomycetes. La penetración de P. infestans en
los no huépedes, se caracteriza por una reacción de hipersensibilidad, debido a que las elicititinas
secretadas de manera abundante por este patógeno, inducen una reacción de hipersensibilidad
como en Nicotiana. Pero cuando se transforman las cepas para inhibir la producción de elicitina,
INF1, se incrementa el rango de huéspedes de P. infestans. Además muchos elicitores de
patógenos interactúan con receptores de genes R de diversas plantas y median la resistencia de las
no huéspedes (Kamoun et al., 1999b, citado por Vleeshouwers, et al. 2000b).

3. Resistencia Sistémica Adquirida (SAR)

La resistencia sistémica adquirida (SAR) se presenta cuando se da un ataque localizado de un


patógeno, sin lograr éxito. Involucra un incremento del estado de resistencia a una amplia gama
de patógenos y está asociada con el incremento de la expresión de los genes que codifican para
las proteínas relacionadas (PR) con la patogénesis. En otros casos, el patógeno que ataca es
impedido por la resistencia sistémica inducida (RSI), la cual no está asociada con un incremento
en la expresión de las proteínas relacionadas con la patogénesis (Vleeshouwers, et al., 2000b).

La SAR ocurre en muchas especies de plantas incluyendo la papa, en la cual puede ser iniciada
por el efecto de compuestos de paredes hifales, ácidos grasos no saturados y ácido jasmónico, que
dan un incremento a la resistencia a P. infestans. Puede ser inducida por muchas señales, pero
además, los niveles básicos pueden variar entre plantas. En mutantes de Arabidopsis, los niveles
de SAR se correlacionaron positivamente con la resistencia a los patógenos Peronospora
parasitica y P. syringae, por una sobreexpresión del gen npr1, pues es una relación dependiente
de la dosis. En tanto que en los mutantes que impiden que se expresen los genes para las PR, no
responden a los tratamientos que inducen SAR y son susceptibles al patógeno P. syrigae
(Vleeshouwers, et al., 2000b).

Vleeshouwers, et al., (2000b), indican que la sobrexpresión del gen PR-1 en tabaco incrementó
la resistencia a P. parasitica y Peronospora tabacina y la sobreexpresión de PR-5 (osmotina)
ligeramente incrementó la resistencia a P. infestans en papa y S. commersoni. La proteínas tipo
PR-1 están implicadas en la defensa. En tomate y tabaco inhibieron la germinación de zoosporas
de P. infestans in vitro y el crecimiento de la lesión in vivo.

Los genes PR-2 y PR-3 codifican glucanasas y quitinasas, enzimas que juegan un papel en la
degradación de la pared celular. Sin embargo, los oomycetes carecen de quitina en sus paredes
celulares y se espera que no sean afectados por quitinasas. Los estudios relacionados con la
72
actina, sugieren que una quitinasa básica y una proteína como osmotina, pueden estar
involucrados en la agregación citoplamática, evento importante en la defensa celular de la papas a
P. infestans. Además las proteínas PR-5 participan en el estrés osmótico, tolerancia al frío,
permeabilización de las membranas plasmáticas de hongos y oomycetes y resistencia a patógenos
(Vleeshouwers, et al., 2000b).

No se ha observado una correlación entre los niveles básicos del RNA mensajero que codifica
para una proteína de resistencia (PRmRNA) y la resistencia a nivel de género, pero sí hay
correlación a nivel de especie en S. arnezii x hondelmannii, S. microdontum, S. sucrense y S.
tuberosum. En esta última especie se presentan diferentes niveles de expresión del mRNA de los
genes PR a nivel de variedades. Así: La variedad mas resistente Robijn presentó los mas altos
valores, las parcialmente resistentes Premiere, Estima y Ehud, presentaron valores intermedios y
los valores mas bajos se observaron en la variedad susceptible Bintje (Vleeshouwers, et al.,
2000b).

Entre especies los patrones de hibridación fueron bastante diversos. Para PR-2 se pudo notar
una cierta especificidad, en los patrones de hibridación de especies relacionadas estrechamente
como S. berthaulti y S. arnezii x hondelmannii, lo que indica que son muy similares. Pero la
hibridación de la sonda de tomate PR-2 con el DNA de S. nigrum, fue excepcionalmente débil,
mientras la hibridación con PR-1 y PR-5 dió una señal de mayor intensidad. Esto sugiere que los
genes PR-2 y los de S. nigrum son bastante divergentes de las demás especies de Solanum
evaluadas, por lo tanto es la especie mas alejada del grupo de especies evaluadas y está ubicado
dentro del subgénero solanum, mientras las otras especies evaluadas y tomate pertenecen al
subgénero petota (Vleeshouwers, et al., 2000b).

Vleeshouwers, et al., (2000b), concluyeron que la resistencia sistémica adquirida (SAR) básica,
puede estar en función de un mecanismo de resistencia independiente, pero muy probablemente
contribuye a la red de reacciones de defensa que toma lugar después de que ataca el patógeno.
Los niveles básicos de SAR, pueden incrementar la sensibilidad de las células vegetales a la
elicitación de la HR, o el patógeno puede invadir lentamente al crear condiciones fisiológicas que
limitan su crecimiento.

La identificación de marcadores ligados a la resistencia parcial de P. infestans en especies


Solanum, es de gran valor para el mejoramiento de la papa por resistencia a la gota. Altos niveles
de mRNA de los genes PR, pueden servir como marcadores moleculares, utilizados para
seleccionar las poblaciones en los procesos de mejoramiento y para evaluar el germoplasma.

Ensayos basados en la cuantificación del nivel de expresión de los genes PR utilizando RT-
PCR específicos de dichos genes, podrían ser desarrollados para ayudar a los mejoradores y
genetistas de la papa, en la identificación de genotipos promisorios y complementar otras pruebas
basadas en QTL (Quantitative trait loci), utilizando genes marcadores para mecanismos de
resistencia conocidos, tales como SAR. Estas técnicas se constituyen en una perspectiva
novedosa para el mejoramiento asistido por marcadores (Vleeshouwers, et al., 2000b).

Strömberg (1995), estudió el efecto de la resistencia sistémica inducida (RSI) en tres variedades
de papa con diferente grado de resistencia a la gota, por inoculaciones de plantas previamente
multiplicadas in vitro, con cepas de P. infestans o P. cryptogea no patogénica. Se logró una
resistencia mas intensa en la variedad Matilda, cuyo grado de resistencia en una escala de 1-5,

73
tuvo grado 4, presentando una reducción en la formación de lesiones que osciló entre 50-60%,
después de 4 días de haberse realizado la inoculación.

Es posible modificar genes que permitan la expresión de una proteína como la osmotina, la cual
tiene un efecto inhibitorio sobre el crecimiento in vitro de Phytphthora infestans, y que pueden
ser introducidos en un proceso de transformación genética de las plantas de papa, contribuyendo
al control integrado de este patógeno (Cornelissen y Melchers,1993).

4. Factores Posiblemente Involucrados en la Pérdida de la Resistencia de


las Plantas a la Gota

Van der Lee et al., (2001b), encontraron que deleciones o pérdidas de fragmentos de
cromosomas, en aislamientos de P. infestans, estaban correlacionadas con la virulencia sobre las
líneas de papa que poseían los genes R3, R10, R11. Pero cuando estaba presente el marcador M
5.1, derivado de un fragmento amplificado (AFLP) de DNA y ligado a un grupo de tres genes
dominantes para avirulencia Avr3-Avr10-Avr11, se presentaba avirulencia sobre las líneas de
papa que tenían los genes R3, R10 y R11.

Igualmente encontraron que las deleciones se presentaban en aislamientos de campo colectados


en Holanda entre 1980-1991, de los cuales el 37% no poseían el homólogo M 5.1 y dicha
deleción estuvo fuertemente correlacionada con la ganancia de virulencia sobre las líneas de papa
que poseían los genes R3, R10 y R11. Además detectaron que algunos aislamientos antiguos
que pertenecían al linaje clonal US-1 y por lo tanto altamente homogéneos, presentaban
deleciones en el locus M 5.1, indicando que dicha región es inestable (Van der Lee et al., 2001b).

De los 83 aislamientos evaluados 28 presentaron el tipo de apareamiento A1, dos se


autofertilizaron y los 53 restantes fueron A2, mostrando una relación A1:A2 de 1:2 en dicha
zona. Menos del 10 % de los aislamientos presentaron el mismo genotipo según la sonda RG57.
Dichos aislamientos presentaron una alta incidencia de virulencia en los clones de papa R3, R10
y R11, tanto con el marcador M 5.1 como sin el marcador, al igual que a los clones de papa con
R4, posiblemente por algunas mutaciones que pueden volver virulentos a otros genes R (Van der
Lee et al., 2001b).

Aunque no se conoce con certeza, los factores que podría romper la resistencia vertical y
menos los mecanismos que conducirían al rompimiento de la resistencia de las plantas huéspedes
al patógeno, incluyendo la resistencia de campo (por genes menores o cuantitativa) en plantas de
papa, Van der Lee et al., (2001b), señala los siguientes mecanismos y los autores:

Que únicamente se expresen de manera parcial los genes de virulencia del patógeno
(Malcolmsom, 1969).

Por hibridación vegetativa o fusión nuclear (Malcolmsom, 1970).

Parasexualidad, herencia citoplasmática o heterosis (Leach y Rich, 1969).

Mutaciones puntuales o entrecruzamiento somático (Shattock, 1977; Shaw, 1991)

74
La naturaleza heterocariótica de los aislamientos parentales, que conduce a la inducción de
nuevas razas. Sin embargo, los aislamientos parentales utilizados por dichos investigadores en el
mapeo genético no fueron heterocarióticos (Van der Lee et al., 1997).

Deleciones, metilación, elementos trasponibles o moléculas de dsRNA. (Van der Lee et al.,
1997, 2001).

Egan et al., (1995) consideran que es poco probable que la ingeniería genética o las técnicas de
mejoramiento tradicionales, puedan producir resistencia durable, o conduzcan a una reducción
significativa de la necesidad del uso de fungicidas en un futuro inmediato, pues además de
variedades resistentes y el mejoramiento de las estrategias de control, podrían involucrarse
nuevos y mejores fungicidas, con mayor flexibilidad de uso y tiempo de aplicación, integrado a
métodos de predicción de la enfermedad.

75
CAPÍTULO VI

PATOGENICIDAD

Existen tres componentes fundamentales para determinar la habilidad patogénica de un


aislamiento: periodo de latencia, área de la lesión y esporulación después de 96 horas de haber
ocurrido la inoculación, razón por la cual Kato et al., (1997) evaluaron aislamientos de los linajes
clonales US-1, US-7 y US-8, colectados en Estados Unidos y Canadá en 1994, por inoculaciones
con 20.000 esporangios/ml, en hojas desprendidas de una variedad con alta suceptibilidad a P.
infestans.

Dichos investigadores encontraron diferencias significativas entre los linajes clonales US-1 y
US-8 para el área de la lesión y el grado de esporulación y entre US-1 y US-7 para el periodo de
latencia. A su vez las diferencias en los componentes de habilidad patogénica, contribuyen a la
predominancia de los nuevos linajes clonales mas agresivos y con resistencia a los fungicidas tipo
fenilamidas, mayor agresividad en las hojas y tubérculos de papa y hojas de tomate. Peters et al.,
(1999) observaron que los aislamientos canadienses (US-7; US-8 y US-11) fueron mas agresivos
a los tejidos de los tubérculos aún de variedades mas resistentes, que los del genotipo tradicional
(US-1).

Botero y Gilchrist (1998) observaron diferencias en el tiempo de iniciación, desarrollo de los


síntomas, esporulación y área afectada, para ocho aislamientos de Phytophthora infestans,
procedentes de distintas especies, cuando fueron inoculados en tejidos de su misma especie y
cruzados con las diferentes especies que originaron los aislamientos. Al parecer estos
aislamientos pertenecían a un sólo linaje clonal con un tipo de apareamiento A1, reforzando las
observaciones de Kato et al., (1997), quienes determinaron mayores diferencias entre los
aislamientos dentro de las poblaciones, que entre poblaciones, aunque los factores abióticos
pueden contribuir de manera significativa en la respuesta diferencial y por lo tanto amerita mas
investigación.

En el Ecuador Oyarzúm et al, (1998), encontraron que algunas líneas de P. infestans,


demostraron mas agresividad sobre tomate que otras. Estos investigadores observaron que
aislamientos obtenidos de Solanum tetrapetalum y Solanum brevifolium fueron diferentes a los de
las líneas originadas sobre papa y tomate, por el tipo de apareamiento, RFLPs , aloenzimas y la
poca o no patogenicidad sobre la papa y el tomate.

La hipótesis propuesta por Oyarzúm et al., (1998), es que los aislamientos de las especies
silvestres deben haber sido introducidos en eventos separados. Sin embargo, existe la posibilidad
de que no hubiesen sido introducidos, sino que se originaron y han coevolucionado con los
especies huéspedes en sus lugares de origen y no fueron observados en tiempos anteriores,
posiblemente por la falta de estudio del patógeno en los ecosistemas naturales de los Andes
Suramericanos, en los cuales se espera un equilibrio dinámico “huésped-patógeno” y por ende no
existe el concepto de enfermedad, en dichas especies.

Yun Lee (1998), estudió el control genético de la agresividad de este patógno en tomate: todas
las líneas parentales fueron patogénicas a papa, pero algunas también fueron agresivas a tomate.
76
Cuando ambos parentales fueron agresivos a tomate, todos los individuos de la progenie fueron
patogénicos a tomate. Pero cuando uno solo de los parentales era patogénico a tomate, la
progenie segregó para la patogenicidad en tomate. Unos fueron patogénicos y otros no lo fueron,
razón por la cual se concluyó que un factor recesivo controlaba la patogenicidad en tomate, dado
que la mayor parte de la progenie no fue agresiva a tomate. (Smart, et al., 2002).

Por su parte Oyarzún et al., (1998) también observaron alta agresividad de los aislamientos de
P, infestans en su huésped original, pero muy poca o ninguna agresividad en su huésped alterno
(papa, tomate). Sin embargo, el aislamiento 1642 de tomate produjo lesiones débiles en todas las
variedades de tomate evaluadas y un par de aislamientos de papa causó lesiones tan débiles en
tomate como las causadas por el aislamiento 1642 de tomate.

Algunos aislamientos de papa fueron virulentos sobre la variedad de tomate Perialbo


(diferencial sin genes mayores de resistencia). Por las razones expuestas concluyeron que la
población EC-1 era predominante en papa y US-1 en tomate, como se ha observado en Colombia
por Gilchrist et al., (2002), donde papa y tomate comparten una misma región geográfica. La
agresividad cuantitativa determina la agresividad entre los huéspedes.

Ninguno de los aislamientos evaluados produjo síntomas de reacción, ni esporularon en


pimentón (Capsicum annum), mientras que en hierbamora (Solanum nigrum), dos aislamientos de
papa y dos de tomate, indujeron una respuesta hipersensible en tejidos foliares de dicha especie,
caracterizada por puntos necróticos en el sitio de inoculación, sin producción de micelio ni
esporulación, lo que indica que hay algún tipo de resistencia, como lo observó Vleeshouwers et al
(2000b).

Sin embargo, se ha reportado que aislamientos procedentes de papa, pueden inducir reacciones
de hipersensibilidad en tejidos foliares de pimentón (Berg citado por Brommonschenkel, 1988;
Abad, 1983). Marín y Mira (1998) colectaron varios folíolos de pimentón con síntomas de tizón
tardío, cuyo agente causal no creció en discos de tubérculos de la variedad Tuquerreña de papa, la
cual se usa corrientemente en el laboratorio, para el aislamiento y purificación de cepas de P.
infestans.

Es posible que un medio como agar-centeno con un coctel de fungicidas y antibióticos,


frecuentemente utilizados para dicho propósito, hubiese permitido el aislamiento de cepas de P.
infestans, pues está reportado como patógeno de pimentón (Erwin y Ribeiro, 1996) y la zona
donde se colectaron la muestras es productora de tomate, pimentón y diferentes variedades de
papa incluyendo S. phureja (papa criolla). Esta observación refuerza la hipótesis sobre la alta
especificidad de los aislamientos de P. infestans sobre su huésped original.

Los aislamientos de P. infestans procedentes de lulo (S. quitoense) variedad la selva, han sido
purificados y multiplicados en discos de tubérculo de la variedad Diacol Capiro, con buena
esporulación y formación de esporangios, los cuales son almacenados en Nitrógeno líquido y se
vuelven a activar para nuevas inoculaciones en los discos de tubérculo de dicha variedad (Zapata,
2002). Vale la pena resaltar que los aislamientos procedentes de papa y tomate, desarrollan
buena cantidad de micelio, pero no se ha conseguido su esporulación, cuando han sido inoculados
en discos de tubérculo de la variedad Diacol Capiro, lo que sí se ha logrado con discos de la
variedad tuquerreña.

77
Botero y Gilchrist (1998), Patiño et al., (1998) evaluaron la respuesta de aislamientos cruzados
de P. infestans con diferentes especies huéspedes. Los aislamientos procedentes de papa
presentaron un rango de reconocimiento mas amplio, al infestar y esporular relativamente mas
rápido (4-5 días después de la inoculación) en la variedad de papa Alfa (sin genes mayores),
tomate variedades Marglobe y Chonto y pepino (S. muricatum). La variedad Monserrate de papa
(con resistencia vertical) tuvo un inicio lento del desarrollo de la lesión y baja esporulación, pero
a los ocho días, dos de los aislamientos procedentes de papa, presentaron un incremento
significativo del área afectada. Incluso el aislamiento ST1 de papa, produjo una alta esporulación
(18.625 esporangios) y presentó la mayor área de tejido foliar afectada (269 mm2 ).

La situación arriba señalada indica, que una vez que se rompa la barrera de la resistencia en una
planta, es muy difícil detener la infección con este patógeno y el inicio de la gota, lo cual fue
observado por Jaramillo y Gilchrist (2002), en una evaluación de clones de papa con diferente
fuente de resistencia a P. infestans, en una zona papera del Oriente de Antioquia Colombia, en la
cual la resistencia se rompió por daños físicos causados por granizo y una fuerte presión de
inóculo de parcelas con variedades susceptibles sin control químico. En este caso es conveniente
involucrar otro componente, para el control de tan nefasta enfermedad, como el uso adecuado de
moléculas químicas.

En términos generales se presentó la esporulación mas rápida en los tejidos inoculados con
aislamientos originalmente colectados en la misma especie, que cuando se hicieron inoculaciones
cruzadas, las cuales presentaron esporulaciones a partir del 6-7 día después de la inoculación
(Botero y Gilchrist, 1998). Los tejidos de los clones que poseían algún grado de resistencia,
presentaron un retrazo en la infección y esporulación sobre el tejido, lo que indica que es posible
ampliar el intervalo entre las aplicaciones para el control químico de la gota, lo que se traduce en
la reducción de las aplicaciones hasta un 50%, pero no se pueden suprimir especialmente cuando
las condiciones ambientales favorecen la epidemia como observaron Jaramillo y Gilchrist (2002).

Los aislamientos de tomate incluyendo el tomate silvestre (Lycopersicon pimpinelifolium) se


reconocieron rápidamente con los tejidos de tomate variedades Marglobe (suceptible) y chonto
(resistente) produciendo una esporulación relativamente alta (153.000 - 28.125 esporangios).
Sin embargo, en la variedad Chonto, las lesiones fueron pequeñas a pesar de la abundante
esporulación.

En papa la esporulación promedio fue menor, pero en la variedad Alfa se logró una alta
esporulación (78.000 esporangios) con uno de los aislamientos y muy baja esporulación sobre la
variedad Monserrate (9.375 esporangios), con una respuesta de hipersensibilidad en S. nigrum,
especie que tiene un amplio rango de adaptación ecológica y en la cual no se han observado
síntomas de gota en condiciones naturales, en diferentes ecosistemas en los cuales se ha estudiado
su comportamiento.

Se destaca que en hojas de pepino no se desarrolló lesión, ni esporulación de los aislamientos


TOM S de la especie silvestre de tomate y MT1 (tomate de Marinilla). El primero procedente de
una zona geográfica y ecológica (Venecia Suroeste Antioqueño, 1480 msnm) muy diferente, a la
zona donde ha venido creciendo el pepino (Oriente de Antioquia), lo que indica que el no
compartir el nicho ecológico, ni la especie y/o variedad de origen del aislamiento, puede incidir
en el tiempo de respuesta del patógeno al huésped, mientras que MT1 esporuló específicamente
en tomate, presentando la mas alta esporulación (153.000 esporangios) en la variedad susceptible
Marglobe.
78
Al igual que las observaciones de Botero y Gilchrist (1998) la especificidad por huéspedes
mantiene el aislamiento genético entre las subpoblaciones de P. infestans en el Ecuador (tabla 6),
ya que ha sido imposible infectar plantas del complejo S.brevifolium (huéspedes del grupo de
aislamientos I-c mDNA) con aislamientos obtenidos de huéspedes de la sección Petota y
viceversa. Los resultados de experimentos de inoculación cruzada demuestran de manera
general, que cada linaje clonal, excepto el EC-3 que es el único encontrado en S. betaceaum
(tomate de árbol), está asociado con mas de un huésped, pero rara vez los huéspedes están
asociados con mas de un linaje clonal. La ínica excepción parece ser el pepino, donde se han
encontrado dos linajes clonales afectando el cultivo, igual observación se hizo en papa, en
Colombia. Serán poblaciones en transición

Tabla 6. Inoculaciones cruzadas de subpoblaciones de P. infestans sobre diferentes huéspedes


(+ infección, - no infección o reacción hipersensible en hojas desprendidas).

Especies huéspedes del aislamiento


Huéspedes S. lycopersicon, S.
Petota Complejo S. S. betaceum
murictum, S. caripense
(EC-1) brevifolium (EC-3)
(US-1)
Grupo petota + - - +a
Complejo S. brevifolium - + - -
S. betaceum - - +
S. lycopersicon, S.
murictum, S. caripense +a S. murictumb - +
(US-1)
a
US-1 y EC-1 pueden ser inoculados de manera cruzada sobre sus huéspedes alternos, pero son mas agresivos
sobre su huésped primario.
b
Dos aislamientos típicos del complejo de S. brevifolium, fueron colectados de un cultivo muy afectado de S.
muricatum

Abad (1983) manifiesta que la adapatación de P. infestans a un determinado huésped resistente


es una situación frecuente, pero requiere una serie de transferencias sucesivas (hasta 7 veces) a
través de hojas iniciando senescencia y hojas jóvenes de la especie resistente, hasta lograr
abundante esporulación y por ende la adaptación del patógeno a dicho huésped. Igual ha
sucedido con la mezcla de razas para formar nuevos patotipos.

Los foliolos de papa pueden ser afectados mas fácilmente por aislamientos procedentes de
tomate o pepino. Los aislamientos de papa esporulan en pepino o tomate, pero los aislamientos
procedentes de tomate no esporulan o lo hacen en muy baja cantidad en pepino y lo contrario, lo
que indica un posible flujo de genes de P. infestans de dichas especies a través de la papa, donde
posiblemente ha alcanzado la mayor variabilidad genética y por ende la variación en el grado de
adaptación al huésped, que se comprueba por la diversidad de especies silvestres de papa con
resistencia (Estrada, 2000) y el número de razas del patógeno, cada vez mas complejas, en los
aislamientos colectados en los cultivos de papa ubicados en diferentes regiones y /o zonas
ecológicas (Mazo y Patiño,1995; Marín y Mira,1998, Jaramillo y Gilchrist, 2002).

Marín y Mira (1998), observaron que los aislamientos procedentes de huertas caseras, en las
que crecen1 varias especies de plantas huéspedes o no, y de zonas poco intervenidas por cultivos

79
intensivos de papa colectados en cultivos comerciales, presentaron prácticamente una raza
relativamente simple por especie, mientras que los aislamientos de papa, presentaron pocas razas
pero de gran complejidad, determinadas por el número de clones diferenciales afectados por los
aislamientos, lo que indica una posible relación de equilibrio relativo del patógeno en los
ecosistemas poco intervenidos por el hombre.

No se encontró una relación directa entre la esporulación y el área de tejido afectada. Algunos
aislamientos presentaron poca esporulación, pero causaron mayor daño en los tejidos de su
huésped original, situación observada con los aislamientos de papa y pepino, mientras que los de
tomate presentaron la mayores esporulaciones, con poca área afectada, excepto uno de los
aislamientos que causó la mayor esporulación y área afectada en la variedad mas susceptible
(Marglobe), confirmando una estrecha relación huésped-patógeno.

Vleeshouwers et al., (2000b), realizaron estudios a nivel citológico y macroscópico, sobre el


desarrollo de las lesiones inducidas por aislamientos de P. infestans en diferentes especies
huéspedes y no huéspedes. La frecuencia de penetración está relacionada con la severidad y el
tiempo de aparición de los síntomas de hipersensibilidad. En especies no huéspedes la reacción
de hipersensibilidad se presenta entre las 22 y las 46 horas después de la inoculación.

La resistencia parcial de clones de Solanum presentó mayor cantidad de células con la HR


(reacción de hipersensibilidad) antes de que se restringiese el crecimiento del patógeno,
produciendo una lesión de mayor tamaño, mientras que en los clones mas sensibles, no se
observó HR, y a las 46 horas después de la inoculación, los discos de hoja estaban
completamente cubiertos por las hifas y se desarrollaba una necrosis extensiva. La variación en
la estructura morfológica de las capas epidermales o la cutícula, puede explicar las diferencias en
la frecuencia de penetración de las hifas y puede ser propio de cada planta, la expresión de la
resistencia se presenta después de la penetración (Vleeshouwers et al., 2000b).

En la reacción hipersensible de la interacción P. infetans/Solanum, se activa un mecanismo


conservado de muerte programada de la célula (PDC), y en varias plantas diversos fenómenos
citológicos, exhiben las características de apoptosis, mientras otras sufren necrosis. Las células
vecinas con respuesta HR, que parecen estar activas metabólicamente de manera transitoria en el
patosistema, puede expresar dicho programa de muerte anti-celular. Existen dudas si la necrosis
que aparece es una forma de muerte programada de la célula (PCD) o una necrosis patológica. Si
un clon es resistente, la necrosis de la muerte celular programada aparece rápidamente. Si el clon
es susceptible la necrosis de patogenicidad se desarrolla mas lentamente (Vleeshouwers et al.,
2000b).

En las regiones donde penetran y crecen las hifas, en especies susceptibles, se presentan
collares y papilas de callosa cerca al micelio expandido, mientras en los clones resistentes con
HR, los depósitos de callosa se observan alrededor de las paredes celulares y en los clones con
resistencia parcial, se observó un fenotipo intermedio. Al inocular el híbrido S.nigrum x Desireé
se observaron depósitos de callosa distribuídos al azar, asociados a las zonas de la inoculación
con los aislamientos IPO-0 y 90128 de P.infestans y lesiones necrosadas con HR, similares a las
lesiones simuladas en otras plantas no huéspedes como Arabidopsis sp. La calosa también se
puede presentar en las células como una respuesta general de estrés (Vleehouwers et al., 2000b).

Aunque los compuestos de fenoles (suberina, lignina y callosa) no están asociados a los
oomycetes, a menudo se observaron cerca a las lesiones HR sobre las células del parénquima
80
esponjoso y epidermales, afuera de la membrana plasmática y sobre la superficie de la pared
celular. La diferencia en la localización de los glóbulos de fenoles, entre los clones de Solanum,
parece estar relacionada con la posición de las reacciones HR, puesto que éstas están limitadas a
la epidermis en S. berthualtii y al mesófilo en S. arnezii x hondelmannii. Pero no hubo señales de
correlación entre la cantidad de glóbulos de fenoles formados y los niveles de resistencia
observados en los diferentes clones de Solanum evaluados (Vleeshouwers et al., 2000a).

Además se observaron compuestos autofluorescentes acumulados sobre las hifas de P. infestans


dentro de las células de plantas completamente resistentes, como S. nigrum y Arabidopsis
thaliana, donde se presenta un reconocimiento rápido, respuesta observada en otros patosistemas
con oomycetes. En soya tratada con un elicitor de P. sojae, se presentó una actividad
incrementada de peroxidasas con la acumulación de polímeros fenólicos, incluyendo la lignina
(Grham y Graham 1991, citado por Vleeshouwers et al., 2000a).

1. Interacción de P. infestans con Plantas Altamente Susceptibles

Cuando los esporangios o las zoosporas liberadas por éste llegan al tejido de la planta huésped,
en presencia de agua en forma líquida, emiten un tubo germinativo y entran por los estomas,
ubicados principalmente en el envés de las hojas. Después de la germinación de las esporas, se
desarrolla el apresorio y ocurre la penetración al cabo de las 16 o mas horas, formando las
vesículas de infección intracelular en las células epidermales. En este primer estado biotrófico,
22 horas después de la inoculación, las hifas crecen en los espacios intercelulares, presentándose
la ramificación a través del mesófilo y forman entre uno y dos haustorios por célula
parenquimatosa que encuentran (Vleeshouwers et al., 2000a).

A nivel macroscópico, durante las primeras 24 horas las células del huésped tienen una
respuesta poco detectable. Entre 24-48 horas o un periodo mas prolongado en los huéspedes
resistentes, se observa el inicio de la lesión que consta de células necróticas en el centro, rodeadas
por tejido aparentemente saludable, en el cual el patógeno está creciendo, razón por la cual se
denomina como organismo hemibiotrófico. La zona necrosada va creciendo y es muy
característica de los estados avanzados de patogenicidad en las plantas huéspedes (Smart et al.,
1999).

Después de 46 horas de inoculados los discos de hoja de plantas susceptibles S. microdontum


265 y S. sucrense-23, y la variedad Bentji de papa, se cubrían completamente de hifas y se
observaba una necrosis en el sitio de la inoculación. Ocasionalmente se inducen respuestas de
HR. A menor resistencia de la planta al patógeno, menor respuesta hipersensible en los tejidos
inoculados (Vleeshouwers et al., 2000b).

A partir de las 46 horas después de la inoculación, las observaciones microscópicas, permiten


observar los esporangióforos que empiezan a emerger a través de los estomas, se forman los
esporangios y las células afectadas empiezan a necrosarse. Sin embargo, no siempre son exitosos
los intentos de P. infestans por colonizar células huéspedes de los tejidos foliares, pues
ocasionalmente al penetrar a las células epidermales, se presenta una reacción de
hipersensibilidad (HR), la cual está restringida a una célula epidermal (Vleeshouwers et al., 1999,
2000b).

81
2. Interacción de P. infestans con Plantas Altamente Resistentes y con
Resistencia Intermedia

En las variedades de papa con fuerte resistencia a P. infestans, como Solanum nigrum-SN18
(no huésped) la respuesta hipersensible (HR) fue inducida extremadamente rápido, mostrando
necrosis en una de las tres células a las 22 horas después de la inoculación, con un aislamiento de
la raza 0 (IPO-0) y una interacción biotrófica cuando se inocularon con un aislamiento de una
raza compleja del patógeno (90128), como la variedad de papa Ehud (Gen fuerte R-1) inoculada
con dichos aislamientos. En S. berthaultii- 9 y S. circaeifolium-circl la HR, se estableció más
lentamente, pero se completó a las 46 horas después de la inoculación (Vleeshouwers et al.,
1999).

Las variedades Estima y Première que llevaban el gen débil R-10, también mostraron una
reacción HR cuando fueron inoculadas con IPO-0, al igual que para los clones S.berthaultii-19 y
ABTP-44, pero la inducción de la reacción se inició más tarde. El crecimiento de las hifas a
menudo sobrepasó las lesiones de hipersensibilidad y estableció una reacción compatible, lo que
sugiere que en estas plantas las reacciones HR son menos efectivas que en una variedad
resistente. Al ser inoculadas con el aislamiento 90128, también se indujo la reacción HR pero
con menor efectividad que en la interacción con el aislamiento IPO-0 (Vleeshouwers et al.,
1999).

3. Interacción de P. infestans con Plantas que Presentan Resistencia de


Campo (sin genes R)

En la variedad Robijn con resistencia de campo y sin los genes R conocidos de S. demissum, se
demostró la respuesta hipersensible cuando las hojas fueron inoculadas con ambos aislamientos
IPO-1 y 90128 de P. infestans, pero después de las 46 horas de la inoculación, las hifas se
escaparon de la lesión HR y establecieron una interacción biotrófica con las células del mesófilo,
formando uno o dos haustorios por célula que encontraban, presentando síntomas similares a los
estados iniciales de una interacción compatible sobre plantas susceptibles. La diferencia entre la
necrosis desarrollada por la reacción compatible y la de la respuesta hipersensible (HR), está en
que la primera se desarrolla mas rápidamente. En este caso el grado de resistencia está
determinado por la velocidad de aparición de los síntomas necróticos (Vleeshouwers et al.,
1999).

En todos los clones de Solanum silvestres evaluados con los aislamientos de P. infestans IPO-0
y 90128, se promovieron respuestas de resistencia similares, pero las lesiones causadas por 90128
se desarrollaron ligeramente mas rápido. En S. sucrense-23 se observó que a las 46 horas
después de la inoculación, apareció la reacción de hipersensibilidad (HR), la cual no se expandió
mas allá de su tamaño. Sin embargo, a las 70 horas algunas hifas que se escaparon
ocasionalmente, desarrollaron la necrosis. Con el aislamiento IPO-0 se estableció una interacción
biotrófica a las 22 horas después de la inoculación, que resultó en un necrosamiento del tejido a
las 46 horas. Los investigadores plantean la ambigüedad de si la necrosis se debió a una reacción
de hipersensibilidad o una interacción de patogenicidad (Vleeshouwers et al., 2000b).

82
4. Desarrollo de la Interacción de P. infestans con Plantas no Huéspedes
de P. infestans

En las plantas no huéspedes o Solanum completamente resistentes, Vleehouwers et al., ( 1999,


2000), observaron una respuesta hipersensible a las 22 horas, que consistía en la muerte de 1 a 3
células. La HR parece ser la principal respuesta de defensa de las especies silvestres de Solanum
con diferentes genes de resistencia, pero no con los genes R conocidos. El patógeno fue capaz de
penetrar todas las células epidérmicas de las plantas evaluadas, confirmando las observaciones
realizadas por Abad (1983) y Patiño et al., (1998).

Las inoculaciones de S. nigrum con P. mirabilis especie estrechamente relacionada con P.


infestans y patógeno natural de Mirabilis jalapa, indujeron una reacción rápida de
hipersensibilidad, observada además cuando las especies no huéspedes Raphanus sativa,
Nicotiana tabacum, N. rustica y Arabidopsis thaliana fueron inoculadas con el aislamiento IPO-0
de P. infestans. En todas las especies no huéspedes las células epidermales y ocasionalmente del
mesófilo, fueron penetradas por el patógeno, pero el rápido desarrollo de la reacción HR estuvo
asociado con el cese de la colonización (Vleeshouwers et al., 2000b).

Los clones de Solanum, particularmente los mas resistentes, pueden presentar una respuesta
reversible, restaurando su apariencia normal, en los primeros estados de inducción de la
hipersensibilidad, lo cual fue observado por Vleehouwers et al, (2000b), en células del mesófilo
adyacentes a la HR, puesto que al ser coloredas con azul-tripano, presentaron una característica
fenotípica diferentes a las células muertas y retomaron su apariencia normal.

Hay ocasiones en que las hifas colonizan las nervaduras de las hojas en los vasos muertos del
xilema, puesto que no se da el mecanismo de HR, pero una vez emergen del xilema a las células
vivas del mesófilo, se desarrolla la respuesta hipersensible. Esta situación se observó en algunos
clones de Solanum incluyendo los completamente resistentes como S. nigrum-SN18.
(Vleeshouwers et al. 2000b).

5. Cómo Estimar la Resistencia de las Plantas a P. infestans?

Zimnoch-Guzowaska y Flis (2002) indican que existen amplias discrepancias en los sistemas de
descripción de la resistencia a P. infestans, que se originan de las diferencias de severidad entre
los países para los diferentes materiales, razón por la cual recomienda que hasta donde sea
posible se eviten, para obtener resultados mas consistentes.

Simonds y Malconson (1967) citados por Estrada (2000) seleccionaron sucesivamente clones a
partir de poblaciones masales de S. andigena y obtuvieron mayor resistencia, la cual se usó para
los cruzamientos con S. tuberosum. Humaerus (1970) también citado por Estrada, recomendó
seleccionar plantas con resistencia horizontal, caracterizadas por pocas lesiones de gota después
de la inoculación o necrosis rápida con poca esporulación. Indicó que S. demissum, S.
bulbocastanum y S. stoloniferum son fuentes valiosas para resistencia de campo, la cual presenta
diversos grados de modificación por factores ambientales como la luz, la temperatura, la
humedad y el tipo de suelo.

Wastie (1991) opina que la inoculación con una mezcla de razas no es conveniente por el
periodo de tiempo que transcurre entre la fase estacionaria, la fase de multiplicación, la
83
dispersión de razas compatibles en la mezcla y la impresión falsa de resistencia, que se puede
crear si cualquier gen R presente, no puede ser inmediatamente dominado. Recomienda que se
deben mantener las condiciones ambientales favorables para la penetración y dispersión del
patógeno, incluyendo el riego si es necesario.

5.1. Pruebas moleculares para la detección de resistencia

Para probar la resistencia de materiales producto del mejoramiento genético, además de las
pruebas de campo, es posible utilizar técnicas moleculares, dado que se han determinado
segmentos genómicos para loci con efectos reproducibles de resistencia a la gota. Una región
distal de cada uno de los cromosomas II, VIII, IX y XII, ambas regiones distales de los
cromosomas VI y XI, una región central y una distal del cromosoma III, la mitad del cromosoma
IV y todo el cromosoma V (Gebhardt, 1999).

El QTL mas destacado y consistente con la resistencia a gota, está localizado en el cromosoma
V, el cual está fuertemente ligado a un marcador GP179, que afecta tanto, la resistencia de hojas
como de tubérculos. Fuertemente ligado al mismo marcador GP179, está el locus R1, que
confiere resistencia específica para una raza de P. infestans ligado a un QTL fundamental para la
maduración de la planta. Dice Gebhardt (1999 ) que es posible que el (los) gen(es) en este QTL,
controlen tanto la resistencia a gota como la maduración de la planta.

Las plantas que tienen alelos QTL que incrementan la resistencia al follaje, presentan reducción
de resistencia de gota en el tubérculo y maduración tardía. La mayoría de los cultivares con
buena resistencia de campo a la gota, son de maduración tardía, lo que sugiere que debido a la
selección fenotípica, los alelos en este QTL pudieron haberse vuelto homocigotos en muchas
poblaciones de mejoramiento genético. Es necesario investigar en la identificación de QTLs con
resistencia a gota, que no estén ligados a los genes de maduración de las plantas (Gebhardt,
1999).

Los alelos QTL que incrementan la susceptibilidad a gota, son generalmente dominantes sobre
los alelos que incrementan la resistencia, razón por la cual, durante los retrocruces con variedades
susceptibles, se pierde frecuentemente la resistencia de campo a la gota. Además la relación de
segregación de los QTL, a menudo son distorcionadas, con alelos de susceptibilidad mas
frecuentes que los de resistencia a gota. Por tal razón, los marcadores DNA deben ser
herramientas preferidas para identificar en una población de híbridos, los genotipos poco
frecuentes con alelos QTL superiores para la resistencia a gota. (Gebhardt, 1999 ).

La secuencias ligadas a los genes de resistencia (resistence gene-like sequences RGLs), según
Gebhardt (1999) son técnicas utilizables para determinar los genes que controlan la resistencia
cualitativa y los componentes de la resistencia cuantitativa a la gota de la papa. Estos RGLs son
miembros de una familia de multigenes que codifican para proteínas con alta repetición de
leucina (LRR) y un sitio de enlazamiento nuclear (NBS) dominante. Es conveniente buscar
QTLs involucrados con las proteínas relacionadas con la patogénesis (PR).

Bormann, et al., (2002) han venido realizando diferentes análisis genéticos para cuantificar la
resistencia cuantitativa a la gota de la papa. De clones tetraploides aprovechando la experiencia
con los materiales diploides, para lo cual efectuaron dos cruces con un parental susceptible y dos
parentales con buena resistencia de campo a la gota y se efectuó la evaluación de las progenies

84
por la resistencia cuantitativa a la gota, durante dos años en campo. Las plantas fueron
genotipificadas con 36 marcadores PCR (SCAR, CAPS, SSCP), con el fin de determinar efectos
significativos sobre la resistencia cuantitativa. Los marcadores que correlacionaron
significativamente con la resistencia cuantitativa fueron encontrados en los cromosomas V,IX y
XI.

Otra forma de determinar la resistencia de las plantas a P. infestans, es mediante la


determinación de la biomasa del patógeno, mediante pruebas serológicas como ELISA o
mediante evaluaciones con líneas transgénicas de P. infestans con el gen “GUS” y que se expresa
produciendo ß’ glucuronidasa, aunque podrían ser menos eficientes (Vleeshouwers, et al.,
2000a).

5.2. Pruebas de selección y evaluación de resistencia en plántulas bajo


condiciones controladas.

En Holanda se utilizan discos de hoja y en Suecia e Inglaterra hojas desprendidas, pero los
resultados en tan pequeña escala deben ser interpretados con mucho cuidado, pues las
condiciones no siempre son apropiadas para la identificación precisa de resistencia/
susceptibilidad, en el caso de los valores que no están en los extremos de la escala. Así por
ejemplo, Tegera y Fouarge (1984), citados por Wastie (1991) no fueron capaces de distinguir
entre genotipos moderadamente susceptibles y moderadamente resistentes.

Steward et al., (1983) citados por Wastie (1991), señalaron que las pruebas de invernadero,
tendieron a subestimar la resistencia de plantas resistentes y la susceptibilidad de los susceptibles,
al compararlas con pruebas de campo, pero Erjefalt (1975) citado por dicho autor, puntualizó que
una prueba de invernadero, favorece la selección de clones con altos niveles de resistencia a la
infección, mas que a la invasión, mientras las pruebas de campo determinan ambos componentes.

Para evaluar la resistencia se deben estandarizar las metodologías para las diferentes zonas,
acordes con las exigencias de las especies y variedades a evaluar. Así por ejemplo,
Vleeshouwers, et al., (1999), proponen la siguiente metodologia, similar a la utilizada por el CIP
y descrita por Trillos (1989):

Es conveniente utilizar plantas completamente sanas preferiblemente de cultivos in vitro. El


suelo debe de estar estéril en el caso de hacer las evaluaciones en el invernadero o una cabina
climatizada, en la cual se debe suministrar luz 16/8 horas dia-noche, 18/15 ºC día-noche, 65-80%
de humedad relativa. Las lámparas Phillips HPIT de 400 wat a 50 cm de la superficie de las
plantas y separadas 1,5 m. Para las condiciones del trópico estas evaluaciones se pueden realizar
bajo condiciones de casa de malla, ubicada en una zona ecológica apropiada para el cultivo de la
papa o el tomate, según la especie a evaluar, dado que los ecosistemas propios de estos cultivos
son diferentes.

Las plántulas de 4 a 6 semanas de edad (cuando presenten el primer par de hojas compuestas),
las cuales proceden de semilla sexual y que vienen creciendo bajo condiciones ambientales
controladas, en bandejas bajo casa de malla o invernadero, se inoculan con un aislamiento lo mas
complejo posible (varios factores de virulencia), con el fin de seleccionar las plántulas que
sobreviven, aunque no siempre son resistentes, pues pueden escapar a la infección por diferentes
situaciones.

85
Este sistema tiene la ventaja de evaluar de manera rápida un gran volumen de plantas producto
de las progenies de un amplio número de parentales e identifica las combinaciones mas
adecuadas, para posteriores cruzamientos y puede facilitar los estudios de arquitectura genética
de la resistencia horizontal a la gota. Su mayor utilidad depende del alto nivel de resistencia
presente, en la mayoría de las progenies que están siendo tamizadas; además facilita el descarte
de un alto número de plantas, debido a la susceptibilidad a la gota, antes de que sean
seleccionadas para otros atributos (Wastie, 1991).

5.3. Preparación de las suspensiones de zoosporangios para la


inoculación

El inóculo se activa y multiplica en medio agar centeno o arveja-centeno-agar suplementado


con sacarosa al 2%, o preferiblemente en hojas o rodajas de papa de una variedad que no posea
genes mayores (Alfa, Bintje o Tuquerreña para Colombia). Se incuba a 18 ºC en oscuridad. Los
aislamientos de lulo Solanum quitoense, esporulan bien en rodajas de la variedad Diacol Capiro
(Comunicación personal de J. L. Zapata, 2000).

Cuando se tiene suficiente desarrollo del micelio (4-7 días) se procede a lavar con agua
destilada estéril y se filtran los esporangios en un filtro de nylon de 10µ, hasta obtener una
suspensión muy pura de esporangios, que se almacena a 4 ºC por dos horas para la liberación de
zoosporas. La suspensión de 3x103 - 5x104 Zoosporangios/ml, se inoculan en las hojas o foliolos
de la tercera, cuarta y quinta hoja plenamente desarrolladas, o en discos de estas hojas, con 10 µl
de dicha suspensión, sobre el lado abaxial, con un aspersor de plástico o vidrio, a una presión
que no exceda las 5 psi (libras por pulgada cuadrada). Para asperjar las 100 plántulas de una
bandeja se requieren 25 ml (Trillos, 1989).

Una vez asperjadas se incuban a 95-100% de humedad relativa, con una temperatura entre los
16-19 ºC y en oscuridad por 10 horas, al cabo de las cuales se deben de pasar a luz difusa (1.500
bujías-pie) con un fotoperiodo de 10-14 horas. Al cabo del 4-5 día, se procede a la evaluación,
retirando las plántulas con lesiones grandes en tallos u hojas o con lesiones necróticas. Sin
embargo, en este último caso, se debe ser cuidadoso, ya que se han encontrado en el mismo
cromosoma genes de resistencia R (Resistencia cualitativa) con resistencia de campo o cuntitativa
(Trillos, 1989).

Las plántulas con lesiones pequeña o que no presenten síntomas son conservadas, para lo cual
se les aplica un fungicida no sistémico como mancozeb, clorotalonil u otro y se adaptan a una
nueva condición de humedad relativa (menor de 95%) y mayores temperaturas, incluso se pueden
transplantar a campo, para su multiplicación y pruebas posteriores (Trillos, 1989).

Para evitar demoras en la determinación de resistencia en los tubérculos a la gota, Wastie


(1991) sugiere que se tomen dos muestras de 10 plántulas por cruce, que crecen en el
invernadero. Cada plántula debe proporcionar dos tubérculos, los cuales son analizados para
predecir la susceptibilidad de una progenie al tizón tardío. En Colombia no es frecuente el daño
por gota en los tubérculos, aunque éstos pueden llevar el inóculo en las semillas posibilitando una
rápida infección después de la siembra, al momento de la emergencia, la cual es mas difícil de
curar.

86
5.4. Pruebas de evaluación de resistencia en plantas bajo condiciones de
campo

Para las evaluaciones de campo se deben elegir sitios en los cuales, se presenten las condiciones
ambientales mas apropiadas para una alta incidencia de gota y preferiblemente se deben hacer
inoculaciones mediante la aspersión de las plantas con suspensiones de 5.000 zoosporangios /ml
de una cepa compleja (originalmente una cepa sin los factores de virulencia r5, r7 y r9 y
caracterizada por Turkesteen, actualmente se tiene una cepa mas compleja, que no posee el factor
r5, del Oriente Antioqueño) en horas de la tarde, previa aplicación de riego en caso que se
presente un periodo seco. Hay que evitar hasta donde sea posible, la dispersión del inóculo a los
cultivos de papa y tomate de los agricultores, razón por la cual se debe tener en cuenta la
distancia de los campos experimentales y la dirección de los vientos, ya que los esporangios
pueden ser transportados a varios kilómetros (J. L. zapata, comunicación personal, 2002).

Según Trillos (1989) para el lanzamiento de una variedad, se hacen por lo menos 5
evaluaciones de campo, previas a las pruebas regionales. Así: Plántulas o familias de tubérculos.
Cada planta representa un genotipo diferente, razón por la cual hay que ser muy objetivo, para
seleccionar los fenotipos adecuados, por comparación con el testigo, el cual a su vez sirve como
fuente de inóculo. Los fungicidas se pueden omitir o utilizarse hasta las dos terceras partes del
ciclo vegetativo. La fertilización y el manejo de plagas se realiza según las necesidades del
cultivo.

Se hacen máximo 6-7 lecturas para gota, empleando intervalos de 5-10 días después de iniciada
la infección, o cuando se observe entre 0,1 y 1 % del follaje afectado. Se recomienda que una
persona haga las lecturas en campo y otra haga las anotaciones en el libro de campo, para que las
estimaciones previas no influyan en las lecturas. Además se determina la producción, para lo
cual hay que determinar el número de plantas que germinaron y permanecieron al momento de la
cosecha y otras características importantes como la arquitectura de la planta, la morfología, el
tamaño, color de la piel y la carne de los tubérculos, sabor, uniformidad, reacción a otras
enfermedades y plagas, periodo de latencia, características para industria, capacidad de
almacenamiento.

Según Wastie (1991) las relaciones entre la resistencia de la variedad y el nivel de pérdida de la
cosecha, determinadas bajo diferentes condiciones de intensidad de la enfermedad, han sido poco
consideradas en el mejoramiento por resistencia a gota. Se asume que hay una relación y se cree
que el crecimiento ya se ha alcanzado, cuando la defoliación alcanza el 75% (equivalente a una
calificación de 3 en la escala de 1-9). Esta situación es el caso de las zonas templadas, donde al
comienzo de la estación lluviosa es muy baja la cantidad de inóculo en el campo, pero en el
trópico, donde se tienen cultivos de papa todo el año, en diferentes estados de desarrollo, hay una
alta presencia de inóculo de manera permanente, pues además, las condiciones climáticas
favorecen el desarrollo de la gota.

Las únicas variedades con dicho nivel de susceptibilidad, que son tolerantes en la práctica en
Europa, son las de maduración temprana, que logran la producción deseada, antes de que
aparezca el tizón tardío. Obviamente la infección temprana afecta mas la producción y esta es la
razón de los programas de aspersión con fungicidas y de mejoramiento genético por resistencia al
patógeno, al punto que se retrace el inicio de la epidemia lo mas posible y se logre la tuberización
temprana, lo cual proporciona al menos un escape parcial a la gota (Wastie, 1991).

87
Las cuatro primeras evaluaciones clonales, se realizan de manera similar. Se siembran a la
distancia de los cultivos comerciales. En la primera generalmente no hay semilla para las
repeticiones entonces se deben sembrar surcos con 10 tubérculos, separados por la variedad
testigo (susceptible) y se hacen de 4-6 lecturas para gota en le follaje, de acuerdo con la escala
propuesta por Turkesteen (escala CIP, tabla 3). Se pueden aplicar fungicidas hasta las dos
terceras partes del periodo vegetativo del cultivo. Las siguientes tres evaluaciones deben tener
por lo menos tres a cuatro (bloques) repeticiones. (Trillos, 1989).

No siempre la resistencia del follaje se relaciona con la resistencia de los tubérculos, razón por
la que deben ser evaluadas por separado, para lo cual, se toma una muestra representativa de cada
clon de aproximadamente 5 Kg, al momento de la cosecha y se almacenan por dos semanas, a 15-
18 ºC y alta humedad relativa, al cabo de las cuales se procede a determinar el número de clones
infectados con tizón tardío, como un porcentaje de la muestra total. Si la infección de los
tubérculos en el campo no es muy frecuente, bajo las condiciones experimentales o en su área
particular, se hacen inoculaciones artificiales a los tubérculos inmaduros de los clones en etapas
avanzadas de selección (Trillos, 1989).

Parámetros para estimar la resistencia de las plantas en el campo

En las evaluaciones de campo, el Centro Internacional de la Papa (CIP) utiliza una escala (tabla
7) que va de 1 a 9, basada en cuatro elementos básicos:

La ley de Fechner-Weber, la cual implica que las diferencias de la percepción visual del ojo
humano, están basadas sobre una escala logarítmica. Una consecuencia es que por ejemplo, las
diferencias entre 3% y 6% del área de la hoja afectada es fácilmente distinguible por personas,
pero no es tan diferente entre el 25% y el 28%.

Es fácil memorizar los valores de los porcentajes escogidos 3%, 10%, 25% y 50%.

La misma logística de la escala de crecimiento mencionada al comienzo. Sin embargo, para


encajar los valores escogidos, se ha distorsionado levemente la curva para la escala de 1 a 9 en el
intervalo de 2 a 8. Los valores R, calculados con la escala de 1 a 9 pueden ser transferidos a los
valores logit al multiplicarlos por 1,16 de acuerdo con la ecuación y=1,16x – 5,8 (Turkesteen,
1973).

La transformación logarítmica no acepta los valores 0 ó 1. Sin embargo, en las pruebas de


campo con agricultores, los valores 0 y 1 son conocidos y son de importancia.

88
Tabla 7. Escala para evaluar el grado de área foliar afectada por P. infestans

Porcentaje de
Grado Descripción
follaje afectado
1 0. 0 Ninguna o muy pocas lesiones dentro de todo el surco
2 0.1- 3 (1.55) Hasta 10 lesiones pequeñas por planta. > de 0%, pero< 10%
3 3.1-10(6.55) Hasta 30 lesiones pequeñas por planta o 1/20 hoj
4 10.1-25(17.55)
5 25.1-50(37.55) La mitad del follaje destruído
6 50 1-75(62.55)
7 75.1-90(82.55)
8 90.1-97(93.55) Muy pocas áreas verdes, menos del 10%
9 97.1-100 (98.5) Follaje completamente destruído
Tomado de Henfling, J.W.1980. El Tizón Tardío de la Papa Phytophthora infestans. Boletín de Información
Técnica 4 . Centro Internacional de la Papa (CIP). Lima, Perú. 16p. Trillos,1989

Se pueden evaluar los parámetros como la curva de incremento de la enfermedad, la tasa de


infección aparente (coeficiente de regresión lineal r) y el área bajo la curva de infección (A). En
general por la permanente liberación de inóculo nuevo, se desarrolla una curva típica en forma de
S, con crecimiento lento al principio y al final, pero acelerado en la parte media del ciclo, para lo
cual se grafican los valores del porcentaje del área foliar afectada, contra el tiempo y puede
transformarse matemáticamente a una gráfica lineal, por la transformación logarítmica de la
proporción de tejido afectado.

Si x es la porción de tejido afectado, se tiene:

Logit de x= Loge( x/1-x) ó Logit de x=Ln( x/1-x)

Ejemplo: si el área afectada en un momento dado es 30%, el logit x será :

Log e (0.30/1-0.30) =Log e (0.30/0.70)= -0.085.

La tasa de infección aparente representa la susceptibilidad del clon a la gota, la cual es mayor
en la medida que el coeficiente de regresión (r) sea mayor, cuyo cálculo se indica a continuación:

Días 1 8 15 22 29 36 44

% de área afectada 0 3 7 40 70 80 98

Grados CIP 1 2 3 5 6 7 9

Punto ½intervalo% 0 1.5 6.5 37.5 62.5 82.5 98.5

∑ xy −∑ x∑ y
r= ∑ xy
de donde r = n
∑ x 2
∑ ∑x − ( x ) 2 2

utilizando la escala CIP r = 263,3/1.414,9

89
r = 0.186, cuando hay varias repeticiones, los valores de x se pueden promediar.

El área del progreso de la enfermedad o área bajo la curva de infección, corresponde a la


sumatoria de trapecios.

∑( x i +1 + xi )
A= i =1

2 ⋅ (ti +1 − t i )

x: Proporción de tejido afectado (punto medio del intervalo en porcentaje)

t: Tiempo cuando se realiza la observación en días

n: Número total de observaciones

Ejemplo:

A={(1.55+0)/2(8-1)}+{(6.55+1.55)/2(15-8)}+{(37.55+62.5)/2(22-15)}+

{(62.55+37.33)/2(29-22) } +{(82.55+62.55)/2(36-29) } + {(98.5+82.55)/2(44-36) }

A=5.43+28.35+154.35+350.35+507.85+724.20=1.770.53

A=1.770.53

En la escala CIP basada en una transformación logarítmica, se puede calcular directamente el


coeficiente de regresión, pero las comparaciones siempre tendrán que hacerse con los cálculos de
la escala para todos o con la porción de área afectada para todos, pero no se deben mezclar
escalas, para que las comparaciones sean válidas.

El mejor parámetro para estimar la resistencia de plantas en el campo, puede ser expresado
como los valores del área bajo la curva del progreso de la enfermedad (ADPC). A nivel de
laboratorio generalmente se utilizan: tamaño de la lesión (LS), periodo de latencia (LP) y
densidad de esporas (SD) sobre folíolos desprendidos, los cuales parece que se correlacionan con
el parámetro ADPC, determinado en campo, al correr una regresión lineal múltiple. Otros
parámetros son la tasa de crecimiento de la lesión (LGR) o tasa de extensión de la necrosis, que
se correlaciona con el tamaño de la lesión (LS), eficiencia de la infección (IE) y porcentaje de
lesiones exitosas, (Vleeshouwers, et al., 2000).

Dorrance e Inglis, 1997 (citado por Vleeshouwers, et al., 2000b) señalan que las pruebas con
plantas de invernadero, se correlacionan mejor con el área bajo la curva del progreso de la
enfermedad en el campo, que las pruebas de laboratorio con folíolos desprendidos y discos de
hoja. Las condiciones ambientales del campo, son muy diferentes a las de las camas climatizadas
y de invernadero. En este último se puede presentar resistencia inducida por el estrés del calor y
la sequía. Sin embargo, se observó interacción entre el material inoculado (plantas intactas y
hojas desprendidas) y la variedad evaluada (p=0,029), pero las hojas desprendidas presentaron
una expresión reducida de la resistencia. Además se ha demostrado que la edad del tubérculo
tiene efecto sobre la resistencia en el follaje (Stewart et al., 1983).

90
Jaramillo y Gilchrist (2002) evaluaron diferentes clones de papa con resistencia de campo, bajo
las condiciones de Paysandú (BhMb, a 2.550 asnm, 14 ºC de temperatura media y 1.500mm de
precipitación), los cuales presentaron diferentes grados de resistencia, expresados por las áreas
bajo la curva de infección y los índices de regresión (r).

Cuando las lesiones en folíolos no crecen mas de 16 mm2, se considera que es una reacción de
hipersensibilidad y no se incluye dentro de los cálculos de la tasa de crecimiento de la lesión,
mientras si crece mas de 16 mm2 , al menos en uno de las repeticiones en el tiempo evaluado, se
estiman las tasas de crecimiento de las lesiones y la regresión lineal a través del tiempo. El área
afectada se calcula por el uso de la fórmula (A=¼ LA) y se transforma a raíz cuadrada.

Se ha observado que el patógeno no es capaz de detoxificar (metabolizar) fitoalexinas y que la


resistencia se basa mas en la concentración que en el tipo de fitoalexinas. Al parecer la variedad
Diacol Capiro tiene una baja concentración de Fitoalexinas y es suceptible a P. infestans,
mientras que la variedad “Unica”, presenta buena resistencia al patógeno y tiene una alta
concentración de fitoalexinas, posiblemente procedente de genes que confieren resistencia de
campo (ensayos preliminares realizados en tubérculos de las variedades UNICA, Diacol Capiro,
Monserrate y Puracé en el Laboratorio de Estudios Moleculares, en 1997 (cuyos resultados no
fueron publicados).

La resistencia específica de raza se debe a los genes mayores (R) los cuales se conservan entre
especies de plantas, que conducen a la codificación de receptores específicos y que al ser
disparados por elicitores, inician las señales de traducción por una vía que conduce a la
hipersensibilidad. En un modelo gen x gen, la presencia de los genes R en la planta y su
correspondiente gen de avirulencia (Avr) en el patógeno, resulta en una resistencia (interacción
incompatible), mientras la ausencia de genes R o de Avr resulta en una interacción compatible y
por lo tanto se presenta la enfermedad.

En total se han introducido 11 genes R a variedades de papa, procedentes de Solanum


demissum. En la naturaleza han evolucionado numerosas razas del patógeno y son capaces de
infectar plantas con genes R, por lo que se denominan razas complejas del patógeno, mientras
que la raza 0, se define como la raza incapaz de infectar cualquier planta que tenga genes R.
Dicha respuesta podría ser de completa incompatibilidad, cuando la presencia de genes en la
papa, resulta de interacciones incompatibles con los aislamientos de P. infestans avirulentos; o
hipersensibles si se presenta una muerte rápida de 2 o 3 células de la epidermis, al momento de
iniciar la penetración, lo que evita que el patógeno crezca.

Según Forbes y Jarvis (1993) para seleccionar clones con resistencia parcial al tizón tardío, se
requiere un conocimiento de los tipos de resistencia involucrados y sus respectivas expresiones
fenotípicas. Además, debido a las complejas interacciones entre la resistencia parcial y el
ambiente, se requiere tener en cuenta la fuente (variedad o especie), para definir claramente el
tipo de resistencia. Es necesario controlar los efectos de los genes R o mayores, con el fin de
identificar y medir la resistencia parcial (Estrada, 2000).

91
CAPÍTULO VII

CONTROL DE LA GOTA (TIZÓN TARDÍO) CAUSADA POR Phytophthora


infestans

La forma mas adecuada para enfrentar la gota (tizón tardío) de la papa y el tomate, es mediante
la utilización de todas las técnicas que conducen al manejo integrado de la enfermedad, como las
medidas de prevención, mediante el cumplimiento de las normas sanitarias para el transporte de
material vegetal, erradicación, las cuarentenas cuando se requieran, variedades resistentes,
semillas sanas.

Govers (2001) opina que la clasificación errónea de P. infestans como hongo, ha causado
muchas décadas de retrazo, dado que gran parte de los ingredientes activos de los fungicidas no
son tan efectivos para el control de los oomicetos, además de que se ha limitado el conocimiento
de la biología de este patógeno.

Las prácticas culturales bien ejecutadas y oportunas como la calidad sanitaria de la semilla, la
siembra, fertilización, control de malezas y socas, recolección de residuos de cosecha, riegos y
drenajes si se requieren, cosecha oportuna y finalmente acudir al control químico del patógeno,
para lo cual es conveniente hacer un diagnóstico temprano del patógeno en los tejidos. Por la
importancia de la resistencia genética, este tópico ha sido tratado en un capítulo separado.

Egan et al., (1995), consideran que es poco probable que la ingeniería genética o las técnicas de
mejoramiento tradicionales, puedan producir resistencia durable, o conduzcan a una reducción
significativa de la necesidad del uso de fungicidas en un futuro inmediato, pues además de
variedades resistentes y el mejoramiento de las estrategias de control, podrían involucrarse
nuevos y mejores fungicidas, con mayor flexibilidad de uso y tiempo de aplicación, integrado a
métodos de predicción de la enfermedad.

Schöber-Butin et al. (1995), evaluaron un método indirecto de ELISA (ensayo de


inmunoabsorbancia ligada a enzimas) y uno especifico con dos cebadores (primers Pi1 y Pi2)
para la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Con el método de ELISA, encontraron que
a los tres días de inoculación del tejido foliar con zoosporas, fue posible observar reacciones
directamente relacionadas con el grado de resistencia de las variedades evaluadas y en tubérculos
a los dos días, pero se presentan reacciones cruzadas con otras especies de Phytophthora no
patogénicas a papa. Mientras que la PCR fue mas específica, con resultados a los dos días
después de haber sido inoculados los tubérculos y folíolos. Ambas pruebas presentaron
sensibilidad similar para los umbrales de micelio puro (100ng/ml).

Es importante que los agricultores protejan bien sus cultivos. Si este no es el caso un sistema
de predicción basado en los sistemas de control de la gota, se vuelve riesgoso. Si algún agricultor
permite que la gota se desarrolle en el campo, alcanzando niveles altos y liberación de esporas, se
pueden desarrollar epidemias en los cultivos de los agricultores vecinos.

En el largo plazo, es mas exitoso la integración de todos los factores, con variedades mas
resistentes y nuevos fungicidas, acoplados con un mayor entendimiento del impacto de la
92
epidemiología y la variación genética de las poblaciones, por efectos de la presencia del tipo de
apareamiento A2, sobre el control de la enfermedad (Egan, et al., 1995), dado que la
recombinación sexual, permite que el patógeno se adapte mas fácilmente a las condiciones
adversas y las oosporas pueden sobrevivir en el suelo, de manera independiente a sus plantas
huéspedes y actuar como una fuente extra de inóculo (Govers, 2001).

ELEMENTOS PARA EL MANEJO INTEGRADO DE LA GOTA DE LA PAPA

Es necesario conocer los factores que inciden en las epidemias de gota de la papa y/o el tomate
y el impacto de las diferentes fuentes de inóculo de P. infestans, para poder establecer las
medidas de control mas convenientes, según las situaciones particulares de cda zona.

1. Control Biológico

Hay algunos intentos de conseguir microorganismos para control biológico. Se han realizado
algunas inoculaciones previas con cepas de P. infestans, que por su cultivo permanente en medios
artificiales han perdido su agresividad a las plantas de papa y se han venido buscando cepas de
bacterias que le den alguna actividad de antibiosis a P. infestans y otros patógenos de plantas.
Sturz et al., (1999) opinan que algunas comunidades de bacterias endofíticas, pueden inducir un
cierto grado de defensa contra los patógenos, según su adaptación y localización dentro del
huésped, la cual puede ser específica para un determinado sitio y tipo de tejido.

2. Saneamiento

Estas prácticas están encaminadas a reducir la cantidad de inóculo para los cultivos siguientes.
Implica la destrucción del follaje antes de la cosecha, pilas de tubérculos de cosechas anteriores
que hayan quedado en el campo, o socas y demás residuos de cosecha, que permiten mantener el
inóculo vivo como cordones verdes en la zona de los cultivos. También la eliminación de plantas
huéspedes alternos, en muchos casos especies silvestres u otros cultivos de papa , tomate de árbol
y lulo, infestados y sin control en los lotes aledaños a los cultivos de papa. Esta práctica evita
que tubérculos infestados puedan ser almacenados, para semillas en la siguiente generación.
También es conveniente introducir rotaciones del cultivo a mas largo plazo.

Un sólo tubérculo afectado por cuatro millones de tubérculos sembrados, del cual puede
emerger un brote afectado, es suficiente para iniciar en esa misma estación, el ciclo de la
enfermedad en el campo a través de las esporas que se liberan de la lesión e inician nuevas
lesiones. Bajo condiciones favorables y en variedades susceptibles, el periodo de una generación
de esporas a la siguiente, sobre una nueva lesión es de cuatro días. Dicho periodo es similar al
periodo de latencia utilizado en el sentido epidemiológico (Turkesteen S.F.).

En Holanda, Zwankhuizen et al., (1998) establecieron que las pilas de tubérculos abandonados
en los campos, eran significativamente los focos principales de diseminación de la gota, seguidos
por los cultivos orgánicos en los cuales se ha observado una alta intensidad de la gota, las socas o
tubérculos abandonados en los lotes de cultivos previos, los tubérculo-semilla y las plantas de
papa y tomate en los jardines de las casas, pero las epidemias variaron dramáticamente de un año
a otro, según las condiciones del clima que favorecieran en mayor grado el desarrollo de la gota.

93
Cabe resaltar que las condiciones ecológicas, de manejo y las variedades de papa y tomate, son
muy diferentes en los países del trópico, por lo tanto estas experiencias deben ser tomadas como
referencia, para la elaboración de los programas de control integrado en las diferentes
ecoregiones.

3. Escape

Esta práctica va encaminada a evitar los cultivos en ciertas zonas y/o durante los periodos que
favorecen las condiciones ambientales para el desarrollo del patógeno, mediante la anticipación o
retrazo de las fechas de siembra. Es muy importante conocer el comportamiento de la resistencia
de las variedades, ya que algunas variedades, se vuelven susceptibles bajo ciertas condiciones
ambientales, como Alfa que se vuelve susceptible en días cortos. Hay variedades de tuberización
temprana o alta resistencia de los tubérculos, por lo tanto, el desarrollo de la enfermedad no
afecta la producción.

4. Predicción

Según Turkesteen (198.) se han adaptado dos sistemas de predicción de la enfermedad, para
determinar la necesidad de aplicar fungicidas, el sistema BLITECAST y el sistema de pronóstico
negativo, los cuales registran las condiciones del clima y las relacionan con las condiciones del
tiempo posibles para el desarrollo de la gota, según los registros históricos, por comparar las
condiciones del tiempo para el desarrollo de la gota en el campo y en el laboratorio durante varios
años.

Estas metodologías son funcionales en los sistemas agrícolas caracterizados por muy bajos
niveles de inóculo iniciales, debidos a largos periodos en los cuales las condiciones para el
desarrollo de la enfermedad son desfavorables. En las zonas templadas o donde hay
estacionalidad en la producción existen tres periodos con riesgo variable de la enfermedad, el
primero después de la siembra del cultivo, caracterizado por bajo riesgo; el segundo de posible
riesgo durante el desarrollo de los cultivos, en el cual los agricultores deben de ser alertados y el
tercero es un estado mas avanzado del cultivo, con un periodo de permanente peligro para el
desarrollo de la epidemia. La resistencia genética induce a una baja velocidad de desarrollo de la
enfermedad, razón por la cual el agricultor tiene suficiente tiempo para aplicar fungicidas, si las
condiciones de epifitotia lo requieren (Turkesteen S.F.).

Myint (2002), indica que en Myanmar se ha logrado un buen control de la gota, cuando se
hacen las aplicaciones después de que se acumulan 12,7 mm de lluvia, similar a las
recomendaciones del ICA en Colombia, que señala la necesidad de realizar aplicaciones de
fungicidas después de la acumulación de 13 mm, en el caso de variedades susceptibles a P.
infestans.

Colombia y los países de la zona Andina, tienen condiciones ecológicas muy variables en los
ecosistemas paperos, razón por la cual es difícil establecer sistemas de predicción, para grandes
regiones, razón por la cual se deben realizar estudios de la dinámica patogénica para las distintas
regiones con variedades adaptadas a cada zona, utilizando los registros de lluvias y temperaturas,
dadas las facilidades de implementar termómetros y pluviómetros manuales en las fincas a bajo
costo, con el fin de que los agricultores empiecen a utilizar los sistemas de predicción y no

94
dependan de las aplicaciones calendario, contribuyendo a una agricultura mas tecnificada y
acorde con las exigencias de los mercados mundiales.

Hay que tener presente que los riesgos de las epidemias son altos debido a que se siembra papa
todo el año, hay cultivos en diferentes estados de desarrollo y se da un manejo irregular de la
gota, por los diversos criterios de los agricultores, que en su mayoría siembran pequeñas áreas
(menos de una hectárea para Boyacá y menos de tres para Cundinamarca, según el censo papero
de 2001-2002), por lo que cualquier foco de infección puede dar inicio a la epidemia en la región,
razón por la cual el componente químico es un factor indispensable dentro de las prácticas de
manejo integrado de la enfermedad, dado el alto número de agricultores involucrados en esta
cultivo y los altos riesgos que se corren por no hacer una aplicación oportuna.

5. Otras prácticas de control cultural

La fertilización adecuada puede ser una práctica que puede contribuir de manera importante a la
reducción de los daños causados por la gota, por incidir en la relación resistencia/susceptibilidad
del cultivo. Sin embargo, hay pocos reportes, uno de los cuales fue realizado por Santos et al.,
(2002), en el cual manifiesta que se ha identificado que el potasio tiene un efecto sobre la
enfermedad a través de funciones metabólicas específicas, que alteran las relaciones de
compatibilidad del ambiente, en torno al huésped-parásito (Huber y Arny, 1985, reportados por
Santos et al., 2002).

Frenkel et al., (2002) indican que el boro como microelemento que abunda en las aguas de
riego recicladas y otros compuestos no determinados, pueden inducir resistencia sistémica
adquirida contra P. infestans y Alternaria solani. Según Moeller et al., (2002) en el sur de
Alemania se estudió la influencia de la interacción de la aplicación de nitrógeno y la
susceptibilidad a P. infestans sobre el llenado de los tubérculos, en cultivos de campos de
producción orgánica de papa, observando que el análisis de la regresión muestra que la variación
en la producción fue principalmente explicada por las diferencias en el suministro de Nitrógeno
entre los campos individuales, pero el progreso de la enfermedad por Phytophthora infestans sólo
explica diferencias aproximadas de un 25% del total de la producción, posiblemente por la
influencia del nitrógeno sobre el llenado de los tubérculos.

El suministro de Nitrógeno determina la tasa de llenado y el periodo de crecimiento de los


tubérculos. En aproximadamente el 50% de los cultivos orgánicos el suministro de Nitrógeno es
tan bajo, que el llenado de los tubérculos es limitado sólo por el Nitrógeno, aún en años con
aparición temprana de Phytophthora infestans, pero con suministros mas altos de Nitrógeno en
campos individuales, existe una mayor probabilidad de que P. infestans se vuelva limitante, lo
que implica que la fertilización con N tenga una importancia relativa en las medidas de
prevención de la gota (Moeller et al., 2002).

En un campo de papas orgánicas y una parcela experimental, se evaluó el desarrollo de P.


infestans en dos variedades de papa (una susceptible y otra moderadamente resistente) en un
suelo arenoso con plantas de la familia Brassicae como cultivo previo, el cual fue fertilizado con
excrementos de pollo y compost con diferentes niveles de nitrógeno (85-170 Kg/ha de N) y
algunos de los tratamientos fueron suplementados con sulfato de potasio, para lograr los niveles
N:K requeridos (1:1; 1:2). No se observó incremento en el desarrollo de la gota en follaje, ni
tubérculos a medida que se incrementó el nivel de N. Pero las producciones en ambas variedades
95
fueron mas altas cuando se abonaron las parcelas con compost a razón de 170 Kg/ha de N, que
con estiércol de pollo peletizado. Cuando se aplicó K adicional la materia seca del tubérculo
disminuyó (Santos et al., 2002).

6. Control químico

El control químico hace parte de las estrategias del manejo integrado de la gota de la papa y el
tomate, dado que es imposible hacer un control eficiente a base de productos orgánicos o
biológicos, razón por la cual hay que integrarlo a las medidas de prevención y mejoramiento
genético, no sólo por genes mayores o específicos a razas del patógeno (resistencia vertical) sino
por resistencia de campo, la cual es mas durable, pero difícil de conseguir. El control químico
puede estar enfocado a fungistáticos (inhiben la germinación de las esporas) o fungicidas que
matan las esporas, con acción erradicante, pero que pueden causar fitotoxicidad, de forma
específica a los oomycetes, pues según Govers (2001) hay que producir y utilizar productos
oomicidas.

Griffith et al.,(1992), citado por Erwin y Ribeiro, (1996), el desarrollo de fungicidas debe estar
asociado a enzimas particulares y otros procesos bioquímicos que son únicos para los Oomycetes,
puesto que poseen una maquinaria bioquímica y molecular propia. El antibiótico poliene suprime
el crecimiento de la mayoría de los hongos pero no de Phytophthora. Govers (2001) minifiesta
que ha habido cierta demora en el desarrollo de moléculas químicas para este patógeno, puesto
que hasta hace poco tiempo fue considerado como hongo, cuyas características bioquímicas son
diferentes.

Dado que los Oomycetes no requieren esteroles para su crecimiento, no son sensibles a
fungicidas que inhiben la síntesis de estos compuestos, como Triademefon, Triadimenol,
Bitertanol y Propiconazol , es así como el Benomyl, que es muy activo en hongos en bajas dosis,
se utiliza como medio selectivo para aislar Phytophthora, pues este compuesto no se adhiere a la
tubulina (Erwin y Ribeiro, 1996) .

Según Egan et al., (1995), a finales de 1880’s se utilizaron los productos a base de cobre (Caldo
Bordelés), los cuales pueden ser aplicados al comienzo y final del cultivo, pero están siendo
reemplazados por los ditiocarbamatos (Zineb, Maneb y Mancozeb) a partir de 1930, por ser
menos fitotóxicos y en ocasiones aumentan el color verde de las hojas, posiblemente porque
corrigen la deficiencia de algunos elementos menores tipo cationes como el Zinc. Para los años
1970’s, se pusieron en el mercado los fungicidas sistémicos y curativos.

En Checoeslovakia en los periodos de fuertes lluvias en 2000-2001 y alta humedad en el suelo,


se favoreció el desarrollo de la gota, causando pérdidas entre el 50-80% en las parcelas no
tratadas: los fungicidas empleados fueron el Fluazinam, Fentin y el hidrocloruro de propamocarb.
El Mancozeb y el Oxicloruro de Cobre, proporcionaron un bajo control. (Hausvater, 2002).
Después de tres años de ensayos de campo en Suiza, Wiik (2002) lanza la hipótesis de que es
posible reducir el número de tratamientos y las dosis de productos químicos, al comienzo de la
estación, en combinación o mezclas de fungicidas con efectos sinergísticos, apoyados en los
pronósticos y alertas de epidemias posibles.

El control curativo o posterior a la infección de las plantas, está relacionado con muchos
factores, algunos relacionados con la naturaleza específica del fungicida y otros como la

96
temperatura, la densidad del inóculo y localización de la infección son mas generales y afectan de
manera similar a los distintos fungicidas curativos. Geddens et al., (2002) observaron que la alta
temperatura, alta densidad de inóculo y la infección de las hojas, favorecieron el desarrollo rápido
de la infección, reduciendo la efectividad de los fungicidas curativos.

La resistencia genética de las variedades, permite la reducción significativa de las aplicaciones


de fungicidas, como fue observado por Jaramillo y Gilchrist, 2002, Kato y Shimanuki (2002), sin
que se afecte de manera significativa la producción, pero no es posible lograr una buena
producción sin control químico, especialmente cuando las condiciones ambientales son
favorables para el desarrollo de la gota en el follaje.

Flier et al., (2002) opinan que la mayoría de los fungicidas tienen una excelente actividad
contra la formación de las oosporas. A concentraciones por debajo de las recomendadas, todos
los fungicidas evaluados in vitro, redujeron significativamente la formación de oosporas. De las
evaluaciones en plantas, se concluyó que tanto los fungicidas protectantes como los
semicurativos, podían ser aplicados para evitar la formación de oosporas, a pesar de que la
epidemia hubiese estado bien avanzada. La absorción por el tejido necrótico parece ser mas
importante que la actividad de los fungicidas que tienen características sistémicas específicas.

6.1. Normatividad para el Registro de Productos con Acción Fungicida

El Instituto Colombiano Agropecuario (ICA) es la autoridad colombiana que da la autorización


para el registro de los productos de uso agropecuario, condición sin la cual no puede
comercializarse ningún producto, que no haya sido previamente evaluado dentro del país, según
la normatividad vigente, la cual tiene mucha similitud con las normas para otros países, como el
es caso de la Unión Europea, los cuales son descritos por Slawson, 1995. De manera general,
comprenden los siguientes aspectos relacionados con las pruebas de efectividad en el campo:

Condiciones experimentales, para lo cual cada país o región tiene su propia guía.

Aplicaciones de los tratamientos. Se refiere a dosis, métodos de aplicación e intervalos entre


las aplicaciones.

Métodos de evaluación como porcentajes de severidad en el follaje y los tubérculos, efectos en


las producciones.

Resultados para cada tratamiento y ensayo, establecido con validez estadística.

Los criterios de evaluación tienen que ver con el número de ensayos de campo, el control
aceptable de la enfermedad con una dosis mínima, datos de la posible resistencia, efectos sobre la
cantidad y calidad de la cosecha, fitotoxicidad y efectos no deseables (residualidad en los
tubérculos y en el medio, deriva hacia otros cultivos, efectos sobre organismos benéficos o que
no son el blanco del producto).

97
6.2. Fungicidas utilizados para el Control Químico de la Gota (tizón
tardío)

6.2.1. Protectantes

Debido a los cambios significativos en la composición de las poblaciones de P. infestans en


Estados Unidos y Canadá, Kato et al., (1997), evaluaron la sensibilidad de los fungicidas
protectantes Mancozeb y Clorotalonil con aislamientos colectados entre 1990-1994,
pertenecientes a los linajes clonales US-1, US-6, US-7 y US-8, encontrando que ningún
aislamiento o linaje clonal fue resistente a dichos fungicidas, con ligeras variaciones en el grado
de sensibilidad entre las poblaciones, con un rango de EC 50 para el Mancozeb de 1,61-4,22 µg/ml
y para Clorotalonil de 0,47-0,73µg/ml.

6.2.1.1. Ditiocarbamatos

Erwin y Ribeiro (1996), indican que los protectantes tipo ditiocarbamatos (mancozeb, maneb,
metiran, propineb y zineb) inhiben la germinación de las zoosporas y el crecimiento del micelio.
No se translocan en el follaje y representan el 33% del mercado mundial para el control del tizón
tardío de la papa y el tomate, además son de amplio espectro. En mezclas con productos
sistémicos y curativos como fenilamidas y cymoxanil, introducidos en 1970’s, pueden ser mas
efectivos para el control del tizón tardío.

6.2.1.2. Phthalamidas

El Clorotalonil pertence al grupo de los phthalonitrilos, cuya acción no es específica, pero al


parecer reacciona con los grupos tioles de las células.

Como fungicida foliar puede ser utilizado por largo plazo, debido a la buena tolerancia del
cultivo. Tiene buena residualidad y propiedades de redistribución sobre la planta de papa,
haciéndolo mas resistente a las lluvias, constituyéndose en un excelente producto para el control
de la gota del follaje de la papa, sin embargo tiene limitaciones por el costo del producto. Egan et
al., (1995) actúa como protectante y se vende como Bravo, es muy efectivo contra gota y el tizón
temprano (causado por Alternaria solani) en hojas de la papa y el tomate, dado que no es
fitotóxico como otros productos. Es mas persistente en tiempos lluviosos que los demás
protectantes como el zineb y puede ser utilizado en mezcla con un ditiocarbamato. No se observó
resistencia cruzada con los fungicidas metalaxyl y cymoxanil (Power et al. 1995).

6.2.1.3. Piridineaminas

El fluazinam es un fungicida, cuyo uso a dosis bajas actúa como protectante con excelente
acción residual, por su actividad antiesporulante, puede ser utilizado en las últimas tres
aplicaciones, para prevenir la infección de tubérculos. Es un potente desactivador de la
fosforilación oxidativa e inhibe la transferencia de protones a través de las membranas
mitocondriales (Egan et al., 1995).

98
El fluazinam ofrece una alternativa no sistémica al mancozeb, bien sea para ser utilizado
durante toda la estación, o seguido de aplicaciones con sistémicos. Generalmente tienen mayor
permanencia que el mancozeb y efectividad contra la gota del follaje. No se evaluó su
efectividad como tratamiento curativo (Cooke et al., 1995).

Schepers y van Soesbergen, (1995) encontraron fluazinam a 0,1% inhibió de manera


significativa la movilidad de las zoosporas, al igual que al 1,0%, en la mezcla de
maneb/fentinacetato, con relación al efecto del clorotalonil y el oxicloruro de cobre a las mismas
dosis. La germinación de las zoosporas fue significativamente inhibida por fluazinam y
maneb/fentinacetato a 0,001%. Igualmente la proporción de rodajas de papa infectadas fue mas
baja con estos productos, cuya infección no sólo estaba determinada por la reducción de esporas
viables, sino por la periodicidad y cantidad de lluvia, el contenido de humedad y la temperatura
del suelo.

A pesar de una fuerte esporulación en el follaje, se hizo inoculación artificial al suelo, para
medir el efecto de los fungicidas ya señalados, sobre los síntomas en el follaje y los tubérculos
que crecían en dos tipos de suelo, encontrándose que el clorotalonil mostró la mas baja
proporción de follaje afectado después de la inoculación. Es posible que el menor número de
rodajas infectadas se debió a la baja proporción de tejido afectado y no por un efecto fuerte del
clorotalonil sobre las esporas presentes, cuya movilidad y germinación fueron fuertemente
afectadas por el fluazinam y el maneb/ fentinacetato (Schepers y van Soesbergen, 1995)

6.2.1.4. Compuestos trifeniltinas

Incluyen fentin-acetato y fentin–hidróxido. Son muy efectivos contra la gota de la papa en el


follaje y también ofrecen alguna protección a los tubérculos, debido a su actividad en el suelo. Es
antiesporulante, reduciendo la dispersión de los esporangios, que podrían causar infección en los
tubérculos. Actúan inhibiendo la fosforilación oxidativa de las esporas y el micelio, a la vez que
pueden inhibir el transporte de electrones en los cloroplastos de las plantas, causando
fitotoxicidad, razón por la cual solo son recomendables para las aspersiones al final del periodo
vegetativo del cultivo (Egan, et al., 1995).

Los fungicidas protectantes deben ser utilizados con mayor frecuencia en tiempos lluviosos (3-
7 días) dependiendo de la localidad y la severidad de la enfermedad, procurando que se apliquen
en el momento de la germinación de las zoosporas, pero antes de que penetren al tejido, para
evitar que se presente la infección. En condiciones de alta humedad (o lluvias) y temperaturas
superiores a 10 ºC (alto riesgo de enfermedad) es preferible utilizar productos con actividad
curativa. (Egan et al., 1995).

6.2.2. Fungicidas Sistémicos

Hay cinco grupos principales de nuevos productos sistémicos que son activos contra
Oomicetos, los cuales se pueden trasladar hacia arriba con la transpiración (por el Apoplasto) a
las nuevas zonas de crecimiento o hacia abajo por el floema (por el Simplasto), en ambos
sentidos como el fosetil de Al o translaminar como el Cymoxanil, los cuales se indican a
continuación:

99
CARBAMATOS: Prothiocarb y Propamocarb, cuya fórmulación es “Previcur”

ISOXAZOLES: Tachigaren (5- methylisoxasol-3-ol).

CYANOACETAMIDE-OXIMES: (Cymoxanil), formulado como Curzate

ETHYL PHOSPHONATES: (fosetyl), en formulación como Alliete

PHENYLAMIDES

5-1 Acylalanines: Furalaxyl formulado como fongrid, Metalaxyl formulado como Ridomil,
Benalaxyl, en la fórmula Galben

Acylamino-butyrolactones: (Ofurace) con su fórmula Patafol; Cyprofuram , formulado como


Vinicur

Acylamino-oxazolidionones, con su fórmula Sandofan

6.2.2.1. Carbamatos

El Propamocarb es un carbamato, que demostró sinergismo en mezcla con mancozeb para el


control del tizón tardío, en papa. Tiene movimiento translaminar en las hojas, pero poco
movimiento sistémico acropétalo o basipétalo. Afecta las membranas celulares, pero su acción es
principalmente fungistática. Aunque químicamente no tiene relación con las fenilamidas, en
Israel se encontró, que es menos efectivo en aislamientos resistentes a fenilamidas (Egan, et al.,
1995).

6.2.2.2. Derivados del Ácido Cinámico

El Dimetomorf, producido por la Shell, es un nuevo fungicida curativo y de gran efectividad


contra especies de Phytophthora a bajas concentraciones (0,25- 0,75 microgramos por mililitro).
Cohen et al., (1995), mostraron que era muy efectivo para el control de P. infestans en papa. Las
dosis EC90 variaron entre diferentes aislamientos desde 62 hasta 193 µg/ml de ingrediente
activo.

El Dimetomorf es un derivado del ácido cinámico con acción sistémica local, tiene actividad
translaminar (a través de la hoja), y fuerte resistencia al lavado por las lluvias. Fue muy activo
contra líneas de P. infestans resistentes al metalaxyl. Su actividad fue asociada a la supresión de
los procesos de formación de la pared celular de las zoosporas. Impide la germinación de
esporangios y zoosporas, llegando a ser letal (Egan, et al ., 1995).

6.2.2.3. Cianoacetamidas-oximes (CYMOXANIL)

Se formula como Curzate (Du Pont) o Curathane (Dow AgroSciences). Penetra localmente y
tiene un movimiento traslaminar rápido, no se transloca de una hoja a otra, ni del tallo al follaje.
Es curativo y preventivo, pues es efectivo en los tres primeros días de iniciada la infección, antes

100
de que aparezcan los síntomas. Se metaboliza rápidamente en los tejidos de la planta y tiene
pocos días de actividad, pero mas que los protectantes (Erwin y Ribeiro,1996).

Tiene efecto sinergístico para el control de aislamientos de P. infestans en papa y tomate,


cuando se aplica en mezcla con mancozeb y con oxadixyl. Se ha demostrado que afecta la
síntesis de RNA en los hongos (Samoucha y Cohen, 1988,1989, Erwin y Ribeiro, 1996, Egan et
al., 1995).

Power et al., (1995) encontraron que el cymoxanil era igualmente efectivo para inhibir el
crecimiento radial del micelio de los tipos de apareamiento A1 y A2 que fueron clasificados
como resistentes al metalaxyl. La dosis letal media (EC50), fue menor para los aislamientos tipo
A1(0.27 mg/l) que para los tipo A2 (0.49 mg/l) con tendencia similar en los aislamientos
resistentes al metelaxyl. No se observó resistencia cruzada entre los fungicidas metalaxyl,
cymoxanil y clorotalonil, lo que tiene implicaciones positivas para las estrategias de manejo de
aislamientos de P. infestans resistentes.

Las evaluaciones en hojas aisladas y plantas completas, mostraron una estrecha correlación con
los ensayos in vitro para el metalaxyl, proporcionada por las poblaciones resistentes (10-277
mg/l) y susceptibles (0,00002-1,0 mg/l), mientras que con cymoxanil y clorotalonil, no se
observaron variaciones significativas en los ensayos in vitro y en invernadero (Power et al.,
1995).

6.2.2.4. Fosfonatos

No se ha entendido de manera clara las razones por las cuales el fosetil-Al (Aliette 80 wp) tiene
amplio espectro de acción en las especies de Phytophthora, posiblemente por muchos sitios de
acción bioquímica, no es muy efectivo para el control de la gota de la papa en el follaje, pero sí
tiene actividad para su control en los tubérculos. Este modo complejo de acción sucede por la
variación en los resultados, cuando se usan diferentes plantas y líneas o especies de patógenos y
explica las razones por las cuales en la práctica no se ha encontrado resistencia a los fosfonatos
(Erwin y Ribeiro, 1996).

6.2.2.5. Fenilamidas (METALAXYL)

El desarrollo del Metalaxyl (fenilamida) fue un éxito en el control de patógenos como


Phytophthora, por su efectividad y efecto curativo a bajas dosis en condiciones de alta presión de
la enfermedad, lo que hizo que fuera tan atractivo para los agricultores quienes explotaron sus
potencialidades al máximo, presionando la resistencia (Nuninger, et al., 1995).

Es altamente sistémico con translocación hacia arriba o hacia abajo, pues el tratamiento al
follaje da buena protección a los tubérculos, posiblemente por la translocación del ingrediente
activo, inhibiendo la esporulación y el desarrollo de los esporangios, lo que no sucede con los
productos protectantes, los cuales actúan sobre las zoosporas hasta su germinación, antes de
penetrar al tejido. Además el metalaxyl es menos susceptible de ser lavado por las lluvias (Egan,
et al.,1995).

101
El Metalaxyl afecta la síntesis del RNA ribosomal y por ende la síntesis de las proteínas y
reducción del crecimiento del micelio, mas que sobre las zoosporas, las cuales pueden ser
controladas por un fungicida protectante como mancozeb, antes de penetrar al tejido, condición
que se aprovechó en Inglaterra, para mejorar el control de la gota en hojas viejas y el control a la
par de Alternaria solani (Nuninger, et al., 1995).

Uno de los primeros reportes de la actividad del Metalaxyl indica que aplicaciones de 10 µg/ml
al follaje de papa inhibieron el desarrollo de lesiones, expansión y esporulación. Fue necesario
aplicar una dosis de 100 µg/ml, cuando se hicieron las inoculaciones al follaje, tres días antes de
la aplicación. Aplicaciones al suelo requieren dosis mas altas (1000 µg por 1000 cc de suelo)
para suprimir la formación de lesiones en las hojas, cuando se inocula tres días antes de la
aplicación (Erwin y Ribeiro, 1996).

Según Grohmann y Hoffman (1989) citados por Erwin y Ribeiro (1996) el Metalaxyl estimula
la formación de las fitoalexinas capsidiol en pimentón (Capsicum annum) y glyceolina en soya
(Glicine sojae), pero no se observaron cambios ultraestructurales en las hojas de la papa, después
de ser tratados con dosis de 10, 100 y 200 µg/ml, lo que indica un efecto secundario sobre lo
mecanismos de defensa de las plantas.

La rápida generación de resistencia del patógeno a este producto, obligó a su retiro del mercado
por algún tiempo, en varios países de Europa como Suiza, Irlanda y Holanda, donde fue
nuevamente reintroducido en forma de mezclas con protectantes y otros sistémicos, dado que a
los cuatro o cinco años las poblaciones de P. infestans, se vuelven nuevamente susceptibles al
producto.

Schepers y van Soesbergen (1995) propusieron un programa para el control de la gota en


Irlanda con amplia utilización de protectantes para reducir el riesgo de cepas resistentes a
fenilamidas

RESISTENCIA A FUNGICIDAS SISTÉMICOS CON ÉNFASIS EN LAS


FENILAMIDAS

Una pequeña población puede sobrevivir a la aplicación de fungicidas por diferentes razones,
entre otras: 1) el escape por deficiencias en las aplicaciones, las cuales no cubren completamente
las plantas, 2) Algunos individuos de la población son menos sensible que otros, previo a las
aplicaciones del producto, de tal forma que no son controlados y continúan los ciclos de
multiplicación y 3)puede llegar inóculo de campos vecinos (o plantas arvenses), no tratados o en
los cuales el fungicida redujo su acción por degradación (Gisi et al., 1997).

Para 1980 la resistencia a fenilamidas en las poblaciones de P. infestans en Holanda, era del
77% de los aislamientos y decreció en la medida que el producto se fue retirando del mercado.
En 1984 se aplicó en mezcla con Mancozeb y luego se hicieron mezclas con Maneb y
Fentinacetatos, con un manejo limitado, pues sólo se recomendaba y se recomienda hacer dos
aplicaciones por ciclo del cultivo en situaciones críticas, para el manejo de epidemias severas,
pero se debe evitar las aplicaciones en estado avanzado de la enfermedad. (Davidse, et al., 1989)

Según el Comité de Apoyo para la Resistencia a Fungicidas (FRAC, 2002) la sensibilidad de


las poblaciones de P. infestans fluctúa de un año a otro y dentro de una misma estación. En

102
muchos casos los aislamientos sensibles predominan al comienzo de la estación y los resistentes
al final, tanto en campos tratados como en los no tratados. En Europa los aislamientos de tomate
son mas sensibles, mientras que los de papa son mas resistentes a las fenilamidas.

De acuerdo con la FRAC (2002) algunos biotipos de P.infestans son naturalmente resistentes al
metalaxyl, habiéndose reportado poblaciones resistentes y susceptibles en campos no tratados con
fenilamidas, situación observada en el laboratorio de Estudios Moleculares con aislamientos
procedentes de Paysandú, corregimiento de Medellín Colombia. Igualmente Fraser, et al.,
(1995), observaron que el 82% de los aislamientos evaluados en Carolina del Norte presentaron
resistencia, muchos de los cuales no habían sido tratados previamente con fungicidas.

Gisi et al.,(1997) opinan que antes de la aplicación de fungicidas la sensibilidad básica de


individuos en una población de patógenos puede diferir de 10 a100 entre los aislamientos menos
y mas sensibles. En poblaciones de P. infestans, este factor determinado en ensayos con discos de
hojas fue de 100 para azoxystrobin, para el cual no se detectaron aislamientos resistentes,
aumentado a 1.000 para Cianoacetamidas-Cymoxanil, sin presentar resistencia y mayor de
10.000 para Fenilamidas-oxadicyl, con subpoblaciones sensibles, con sensibilidad intermedia y
resistentes.

Shattock (1988) citado por Erwin y Ribeiro (1996), dice que no hay claridad sobre los
mecanismos por los cuales surge la resistencia de P. infestans al metalaxyl, pero dado que es un
patógeno diploide, la progenie de oosporas aisladas de cruces entre un aislamiento sensible contra
uno resistente, es consistente con la explicación de que la resistencia es gobernada por un locus
nuclear simple, que exhibe dominancia incompleta.

FRAC (2002) menciona que el modo de resistencia puede involucrar uno (o dos genes)
mayores y potencialmente varios genes menores. Sin embargo, no se sabe si el cambio en el
mismo locus es siempre el responsable de la insensibilidad. Por analogía con otros sistemas, la
insensibilidad puede resultar de una variedad de mecanismos incluyendo desactivación,
transporte alterado, o metabolismo alterado del fungicida, o un cambio en el blanco de las
fenilamidas. Además varios loci pueden contribuir a la insensibilidad. Pero es claro que afecta la
síntesis del RNA (Judelson y Roberts,1999).

Según los autores arriba señalados, una diversidad de mecanismos contribuyen a la


insensibilidad de P. infestans a las fenilamidas:

La insensibilidad es una característica propiamente cuantitativa, en la cual los loci mayores


MEX, interactúan con genes de efectos menores. Muchos de los genes menores son
posiblemente epistáticos a MEX, debido a que la descendencia de padres sensibles muestran poca
variación en la respuesta al metalaxyl.

Al menos dos loci mayores parecen estar presentes, los cuales se denominaron MEX1, para
aislamientos mexicanos, americanos y alemanes y MEX2 para uno de los aislamientos británicos,
pertenecientes al mismo linaje del MEX1, pero en un sitio diferente y posiblemente ligados.

Las diferencias alélicas posiblemente existen en MEX1, como evidencia por los altos valores
de insensibilidad exhibida por los heterocigotos MEX 1/mex1 de los aislamientos canadienses,
frente a los heterocigotos de los aislamientos alemanes y mexicanos.

103
Hay una fuerte posibilidad que la mutación de genes cromosómicos, cuyo sitio no ha sido bien
mapeado, podría dar origen a heterocigotos con resistencia intermedia. Además las mutaciones o
alternativamente retrocruces durante la profase mitótica en el núcleo diploide heterocigoto,
podrían producir segregantes homocigóticos con resistencia, según la herencia mendeliana
(Shattock, 1988 citado por Erwin y Ribeiro, 1996). Dado que diferentes aislamientos del linaje
clonal US-8, mostraron reducción del crecimiento entre el 5-60%, a 5 µg/ml de metalaxyl, indica
que mutaciones adicionales se han acumulado dentro del linaje (Judelson y Roberts,1999).

Dowley et al., (1995), al monitorear la resistencia al metalayl confirmaron que hubo un


incremento inicial de la distribución en la resistencia, seguida por la introducción de mezclas
comerciales de Fenilamidas/ Mancozeb, pero decreció en la medida que se implementaron las
estrategias anti-resistencia y se evitó el uso de curativos.

Los aislamientos resistentes pueden estar presentes en las poblaciones de campo a altas
proporciones, pero están en un “equilibrio dinámico” con los aislamientos sensibles. Las
dinámicas de la evolución de la resistencia están manejadas no solo por la resistencia a
fenilamidas, sino por la herencia genética, los antecedentes de resistencia, la eficacia biológica y
la migración de los aislamientos (FRAC, 2002).

Para tener una idea sobre el comportamiento del producto en una determinada área, se deben
tomar muestras iniciando y finalizando la estación, para evaluar la sensibilidad y observar la
respuesta de sensibilidad al final de la selección, migración, apareamiento y competencia que se
presenta durante la epidemia, en un cierto periodo de tiempo, pero este muestreo no es útil para
predecir la permanencia del producto. En muchos casos las mezclas de poblaciones pueden ser
controladas por las fenilamidas, si la proporción de resistencia no es muy alta y no se hacen mas
aplicaciones de las recomendadas con estos productos (FRAC, 2002).

Se ha reportado resistencia en Holanda, Irlanda, Israel, Escocia, el Noroeste de Estados Unidos,


Canadá, entre otros. En una epidemia de tizón tardío al Noroeste de Washington se observó que
el 81% de los aislamientos encontrados en el campo, fueron resistentes al metalaxyl en dosis de
10 µg/ml (Dahl et al., 1993 , citados por Erwin y Ribeiro,1996).

En España, donde los problemas por gota son menores que en otros países de Europa, se
encontró resistencia en 5 de 9 aislamientos evaluados por la metodología de discos de hoja (Sozzi
y Staub, 1987), lográndose la mayor cantidad de aislamientos resistentes a partir de tubérculos,
debido a que los aislamientos resistentes tienen la habilidad de sobrevivir durante la estación de
crecimiento, lo que facilita la infección del tubérculo (Marquínez, 1995).

Collier y Le Boutillier (1995), reportaron que en el Estado de Jersey Reino Unido, el nivel de
resistencia a fenilamidas se mantuvo relativamente estable durante 10 años. En algunos años
(1987-1989) se presentó una alta presión de inóculo, debido a las condiciones meteorológicas
prevalecientes, presentándose poblaciones con resistencia parcial. En las socas (plantas que
permanecen por residuos de cosecha en el campo) se observaron mas poblaciones resistentes de
las esperadas.

La reducción del riesgo potencial de resistencia en Jersey por un periodo relativamente largo,
pudo deberse a la destrucción de los focos de infección y la remoción de los tubérculos que
quedaron en el lote, acompañado del uso de mezclas con fungicidas protectantes, incluidas las
mezclas de tres fungicidas con modos de acción diferente como fenilamidas, cymoxanil y

104
mancozeb, que han mostrado gran efectividad contra las poblaciones resistentes de P. infestans
en otros países como Israel (Cohen y Coffey, 1986; Samoucha y Cohen 1988,1989; Collier y Le
Boutillier,1995).

Según Goodwin y Fry 1995, los Linajes clonales US-6, US-7 y US-8 previamente identificados
en México por marcadores aloenzimáticos, migraron a Estados Unidos en donde se reportaron
como resistentes al metalaxyl y Sojkowski et al., (1995) indicaron que la mayoría de 75
aislamientos mexicanos evaluados, mostraron baja sensibilidad al Metalaxyl (en dosis mayores
de 100 µg/ml).

Puesto que en varios países de Europa, África, Asia y América, se han encontrado los Tipos de
Apareamiento A1 y A2, se puede dar una recombinación meiótica y una segregación, que
conduciría a la producción de homocigotos resistentes al metalaxyl, que podrían multiplicarse
rápidamente obteniéndose poblaciones resistentes en poco tiempo (Erwin y Ribeiro, 1996).

A pesar de que la FRAC 2002, afirma que no hay ninguna conexión genética entre la resistencia
a las fenilamidas y el tipo de apareamiento (A1, A2). En Pakistán (Ahmad et al., 2002b),
encontraron un incremento significativo en los aislamientos de P. infestans con resistencia
intermedia al metalaxyl, para ambos tipos de apareamiento.

La proporción de aislamientos A2 colectados en campos comerciales de Pakistán fue variable


pero muy inferior (Ahmad et al., 2002a) ,al igual que en algunos países como el Reino Unido,
Francia, Alemania y Suiza, mientras en otros puede llegar al 50% como en México, Estados
Unidos, Holanda y Scandinavia. En nuestras investigaciones se ha encontrado un alto porcentaje
de aislamientos resistentes y un bajo porcentaje con sensibilidad y resistencia intermedia al
metalaxyl forma cis, todos agrupados en el tipo de apareamiento A1 (Jaramillo et al., 2002a).

En Suiza Gisi et al., (1995), encontraron que hasta 1990 el 50% de las poblaciones fueron
resistentes a las fenilamidas, pero a partir de 1992, eran del orden del 70%, para 1994
encontraron un incremento de aislamientos con sensibilidad intermedia al oxadicyl, pero la
incidencia del tipo de apareamiento A2, se mantuvo baja (4-5%), lo que indica la prevalencia del
tipo de apareamiento A1 en la mayoría de los países.

Los autores arriba mencionados, consideran que no hay una relación entre el número de genes
de virulencia y el perfil de sensibilidad a las fenilamidas, en las poblaciones suizas de P.
infestans, puesto que no encontraron evidencias de la complejidad con respecto al incremento en
la resistencia a dichos compuestos. Sin embargo, recomiendan los muestreos por varios años y la
utilización de las técnicas moleculares, tipo huellas (finger printing) del DNA.

Dado que el patógeno es multicíclico y se multiplica en un tiempo muy corto, no es


recomendable aplicar metalaxyl en los campos de multiplicación de semilla, porque pueden
quedar esporangios en los tubérculos, que llevarían inóculo de aislamientos resistentes, los
cuales infectarían las plantas en los campos. Una sola planta por kilómetro cuadrado puede
originar una epidemia, razón por la cual hay que tener una estrategia de manejo integrado, que
evite el desarrollo de poblaciones resistentes a las fenilamidas, puesto que estos productos son
buenas herramientas de control (Erwin y Ribeiro, 1996).

105
En Israel se ha encontrado que poblaciones con resistencia al metalaxyl tuvieron mayor
adaptación para infectar, esporular y colonizar que las poblaciones susceptibles. (Kadish y
Cohen, 1989).

MÉTODOS PARA EL MONITOREO DE LA RESISTENCIA

Ante la evidente resistencia del metalaxyl y compuestos afines, con modo de acción específico
sobre P. infestans, y por lo tanto poco efectivos para el control del tizón tardío en papa, Sozzi y
Staub (1987) propusieron los métodos para hacer monitoreo de la resistencia en poblaciones de
campo del patógeno, por crecimiento radial en medio agar-centeno, tratamiento a plantas
completas, hojas y discos de hojas flotando en una suspensión del fungicida y su posterior
inoculación con esporangios del patógeno.

1. Evaluación en discos de tubérculo (Tomado de Sedegui, et al., 1999 y


basado en la técnica de Kadish y Cohen, 1988).

Se utilizan tubérculos de una variedad susceptible, como Bintje o Tuquerreña para Colombia,
producidos en invernadero, sin tratamiento con fungicidas, los cuales se extraen con un
sacabocados estéril (16-20 mm) y se colocan en platos de petri de 90 mm estériles y sobre papel
de filtro humedecido con 2,5 ml de agua desionizada estéril (testigo) o con la suspensión en dosis
creciente del respectivo fungicida.

El inóculo se produce por lavar la superficie del plato de cultivo, donde están creciendo
activamente los esporangios de aislamientos de P. infestans, en medio agar-V8 o agar–centeno,
filtrados y con una concentración ajustada a 104 esporangios/ml usando un hemocitómetro. Para
la liberación de zoosporas, los esporangios se refrigeran a 6 ºC por 2 ½horas y luego se incuban
a 25 ºC por 30 minutos antes de la inoculación, la cual consta de una gota de 2.5 µl de una
suspensión de esporangios y zoosporas.

La gota se deposita en el centro de tres discos de tubérculo por plato de petri, con una
micropipeta, con tres (platos de petri) repeticiones por tratamiento, los cuales se incuban a 15 ºC
en 12 horas de luz por día. La respuesta a los diferentes fungicidas y dosis se determina por la
escala propuesta por Dehal et al., (1993) para el % de lesión desarrollada = (diámetro promedio
de la lesión sobre el disco del tubérculo sin fungicida)/( diámetro promedio de la lesión sobre el
disco del tubérculo con fungicida)X100. Este experimento se repite dos veces, bajo las mismas
condiciones.

2. Evaluación con discos de hoja flotando en la solución fungicida


(Tomado de Sedegui, et al.,1999 y Basado en la técnica descrita por
Kadish et al., 1990).

Se cortaron discos de hoja de 20 mm de diámetro con un sacabocados a partir de plantas de 6-8


semanas de crecimiento bajo condiciones de invernadero de la variedad Bintje (Tuquerreña) los
cuales se ponen a flotar en un agua destilada estéril (testigo) o en las soluciones de los fungicidas
en platos de petri con la superficie abaxial hacia arriba. El inóculo se prepara y la inoculación se

106
ejecuta de igual forma que para los discos de tubérculo, ya señalado. Se utilizan cuatro discos
por plato y tres platos por tratamiento.

Una vez inoculados los discos son incubados a 16 horas luz-día y 75.000 lx, 15 ºC por 5-10
días. El porcentaje de la lesión de cada disco foliar, se calcula con la misma escala que para los
discos de tubérculo. Una lesión desarrollada menor del 20%, indica sensibilidad al fungicida. El
ensayo se repitió dos veces bajo las mismas condiciones.

Jaramillo et al., (2003) estandarizaron la metodología de discos de hoja propuesta por Mauras y
Latorse (2002) para la evaluación del Fenamidone, utilizando hojas de la variedad Diacol Capiro
crecidas en casa de malla, en una zona ecológica propia para el cultivo de la papa.

3. Evaluación con hoja flotando en la solución fungicida (Tomado de


Sedegui, et al, 1999 y Basado en la técnica descrita por Goth y Kean,
1997).

Se cortan las hojas completas entre el tercero y sexto nudo de los tallos de papa de la variedad
Bintje, se insertan los peciolos en tubos con agua de 14 x 100 mm que contienen 9 ml de agua
destilada estéril. Las hojas son soportadas sobre el lado abaxial hacia abajo en una malla de
metal de 12 x 12 mm. La malla de soporte es colocada a 4 cm del agua destilada en una cubeta
plástica de 30 x 12 x 8 cm ajustada firmemente. El inóculo se prepara de igual forma que para
los discos de hoja o tubérculo.

Para la inoculación se utilizan discos de papel de filtro de 12 mm de diámetro, humedecidos


durante tres minutos con una solución de esporangios suspendidos a una concentración de 104
esporangios por ml y colocados sobre cada foliolo de cada hoja. Cada tratamiento incluyó tres
foliolos por hoja y tres hojas por tratamiento. Los foliolos testigos son inoculados con agua
desionizada estéril.

Las hojas son incubadas a 15 ºC con 15 horas de luz. El desarrollo de las lesiones se evidencia
a los 5-7 días después de la inoculación. Las escalas de evaluación son las mismas que para los
discos de hoja y basado sobre el porcentaje de área foliar que muestra desarrollo de la lesión. El
experimento se repite una vez mas.

La comparación de estos métodos se realizó con aislamientos del linaje clonal US-8. Un
aislamiento sensible y otro resistente fueron proporcionados por DuPont. Se observó que se
presenta diferencia en la respuesta de los aislamientos a los fungicidas, por el desarrollo de la
lesión. Los aislamientos resistentes al metalaxyl también lo fueron al oxadixyl.

Al parecer existe resistencia cruzada entre el Metalaxyl y el Oxadixyl, puesto que el genotipo
US-8, no expuesto a Oxadicyl previamente, (no estaba registrado en USA), fue igualmente
insensible a ambos fungicidas. Todos los métodos mostraron claramente las diferencias entre los
aislamientos sensibles e insensibles a las fenilamidas ( Sedegui, et al.,1999).

El método de discos de hoja suspendidos mostraron resistencia de P. infestans al cymoxanil,


mientras que por los métodos de discos de tubérculo y hoja desprendida, todos los aislamientos
fueron susceptibles, los cuales no presentaron diferencia por el desarrollo de la lesión, lo que
indica que el método de discos de hoja, no es adecuado para evaluar la sensibilidad de P.

107
infestans al cymoxanil. Por los sistemas evaluados, todos los aislamientos presentaron
sensibilidad al clorotalonil y al cymoxanil con respuestas similares. (Sedegui, et al.,1999).

ESTRATEGIAS PARA EVITAR RESISTENCIA A FENILAMIDAS

Las estrategias de resistencia han sido enunciadas por varios investigadores, (Nuninger et al.,
1995, Dowley et al.,1995, Erwin y Ribeiro, 1996) quienes proponen una estrategia para utilizar
exitosamente las fenilamidas, en mezclas con productos residuales, en presencia de líneas
resistentes, cuyos elementos claves son:

El uso de mezclas preempacadas con fungicidas residuales (a razón de una dosis ¾ a completa),
en las tres primeras aplicaciones, dada la baja translocación en plantas maduras.

Limitar las aplicaciones tempranas a 2 máximo 3 aspersiones por cultivo y estación. Mayores
aplicaciones dieron como resultado menor follaje y producción de tubérculos

Asperjar en intervalos máximos de 10-14 días.

El uso de un producto protectante; no aplicar curativos o erradicantes, después de la tercera


aplicación.

SINERGISMO ENTRE DIFERENTES FUNGICIDAS PARA EL CONTROL DEL


TIZÓN TARDÍO

En ensayos realizados por Nuninger et al., (1995) en Suiza entre 1990 y 1994, se observó un
fuerte efecto supresor de la población inicial del patógeno y mayor producción por hectárea,
cuando se utilizó Ridomil MZ (200+1600 g ia/ha de Metalaxyl+Mancozeb) con 3 aplicaciones en
intervalos de 10-14 días, seguidas de aplicaciones semanales de Mancozeb, frente a las
aplicaciones semanales con solo Mancozeb (2.400 g/ha), a pesar de haberse detectado resistencia
del patógeno al Metalaxyl.

Si dos pesticidas utilizados producen mayor grado de control que la suma de la acción de cada
uno por separado, se dice que tienen acción sinergística. Gisi et al., 1995, demostraron que
varios fungicidas sistémicos y protectantes tenían acción sinergística para lo cual propusieron la
aplicación de las siguientes fórmulas para calcular el porcentaje (%) de control esperado:

Fórmula de Abbott ( Levy et al., 1986)

%Cesp = A+B-(AB/100), donde A y B son los niveles de control individuales.

SF : Factor de sinergismo entre la relación de la eficiencia experimental ( Cobs) observada de la


mezcla y la eficiencia(Cexp) esperada de la mezcla.

SF= Cobs / Cexp

Si FS es mayor de 1 hay sinergismo

108
Este método no es muy preciso si los controles individuales de los productos son mayores de
70%, pues los valores de SF serían iguales a 1.0, para lo cual Gisi et al., (1985) y Levy et al.,
(1986), propusieron un método mas laborioso con curvas de respuesta a dosis de A, B, y A+B,
que con una transformación Logit- log, se convierten en regresiones lineales, que pueden ser
utilizadas para calcular las concentraciones efectivas de los diferentes niveles de control

(ejemplo EC50, EC90 con inhibición del 50 y 90% respectivamente).

Erwin y Ribeiro (1996) citan una serie de trabajos donde se muestra la actividad de diferentes
tipos de fungicidas, contra líneas susceptible y resistentes de Phytophthora infestans a
fenilamidas en tomate. Dado lo útil de este trabajo para futuras investigaciones en los aspectos
de control químico, se presenta la tabla 8 ilustrada por dichos autores.

Tabla 8. Actividad Fungicida (EC90 mg/l) de Oxadicyl (A), Mancozeb (B); y Cymoxanil (C),
solos y en mezcla y la relación de sinergia de mezclas contra aislamientos resistentes y sensibles
a Fenilamidas de Phytophthora infestans en tomate.

Fungicidas y Relaciones EC90 (mg/l) Relación de sinergia


de compuestos Sensible Resistente Sensible Resistente
(A) Oxadicyl 34 mayor de 5.000
(B) Mancozeb 776 495
(C) Cymoxanil 48 23
A+B = 1:7 69(9+60) 406 (51+355) 3.0 1.4
B+C = 7:0.4 134(127+7) 51(48+3) 3.2 4.6
A+C = 1:0.4 22(16+6) 41(29+12) 1.7 2.0
A+B+C = 1:7:0.4 74(9+62+4) 63(8+53+3) 2.4 4.2
Copiado de Erwin y Ribeiro 1996, quienes a su vez obtuvieron los respectivos permisos, en la cual se destaca la
relación de sinergia de la mezcla de dos y tres fungicidas

Estos trabajos mostraron una alta sinergia con la mezcla de dos o tres fungicidas en
evaluaciones in vitro, invernadero y campo para reducir el crecimiento de líneas resistentes y
suceptibles de P. infestans y por lo tanto para controlar el tizón tardío de la papa y el tomate en el
campo.

Gisi (1991) citado por Erwin y Ribeiro (1996) indican que hay unas combinaciones mejores
que otras, señalando que la mezcla de tres fungicidas (Oxadicyl, Mancozeb y Cymoxanil) fue
mejor que la de dos fungicidas (Oxadicyl + Mancozeb), lo que demuestra que las mezclas
frecuentes de un sistémico tipo fenilamida con un protectante, son menos efectivas para el control
de líneas resistentes a fenilamidas.

Se ha reportado mayor efectividad con formulaciones con tres fungicidas oxadicyl + cymoxanil
+ mancozeb, para el control de P. infestans resistentes a fenilamidas; sin embargo en ninguno de
los ensayos evaluados por Cooke et al., 1995, se presentaron diferencias significativas entre la
utilización de mezclas con dos y tres fungicidas. En años recientes el sistémico propamocarb y el
translaminar dimetomorf, han sido introducidos en formulaciones con mancozeb, particularmente
por la contribución al control de líneas resistentes a fenilamidas.

Es posible que el Cymoxanil que penetra rápidamente las hojas y tiene un modo de acción
diferente a las fenilamidas como Oxadicyl y Metalaxyl, mejore la actividad sinergística de las
109
mezclas, retardando el desarrollo de líneas resistentes. Dicho sinergismo no ha sido bien
entendido, pero Gisi (1991) cita evidencias de varios mecanismos que pueden hacer posible la
explicación:

Incremento en la toma y enlazamiento del fungicida al sitio de acción, lo que puede conducir a
altas concentraciones en la célula objetivo.

Reducción de la biodegradación de los fungicidas por las células del patógeno y la planta, lo
que conduce a una actividad mas prolongada.

Diferentes sitios de acción de los fungicidas, tanto en las células del patógeno (mecanismo
bioquímico) como en el ciclo de vida (mecanismo patogénico) lo que puede reducir su
agresividad.

UN PROGRAMA PARA EL CONTROL QUÍMICO DE LA GOTA O TIZÓN


TARDÍO DE LA PAPA Y EL TOMATE

Cooke et al., (1995), evaluaron durante 10 años un programa de fungicidas en Irlanda, en dos
centros de investigación uno con infección natural y en el otro con inoculación controlada, con
los siguientes resultados por programa y grado de resistencia a las fenilamidas.

1. Efectividad de los productos fenilamidas/mancozeb (Inóculo natural)

Con 100% de resistencia a fenilamidas no hubo diferencias en el daño del follaje por gota, entre
los tratamientos con metalaxyl + dosis completa de mancozeb y mancozeb solo a iguales
intervalos. Los intervalos de 14 días para las aplicaciones de metalaxyl + mancozeb con
aislamientos resistentes a fenilamidas, presentaron mas daño en el follaje que con las aplicaciones
de mancozeb solo en intervalos de 10 días.

No se observó diferencias en los daños causados a los tubérculos con las aplicaciones de las
mezclas y el mancozeb solo. Las aplicaciones de oxadicyl + cymoxanil + mancozeb presentaron
resultados similares a metalaxyl + mancozeb.

2. Efectividad del control con propamocarb (Inóculo artificial)

Compararon propamocarb-HCl + mancozeb con mancozeb a intervalos de 10 días y metalaxyl


+ mancozeb con intervalos de 14 días, utilizando inóculo 100% resistente como fuente de
infección. La mezcla de propamocarb + mancozeb fue mejor al final de la estación que
mancozeb solo, cuando se utilizaron a intervalos de 10 días, pero con intervalos de 14 días fue
inferior, pero significativamente mejor que con metalaxyl + mancozeb a los mismos intervalos.
No hubo efectos significativos sobre la gota en el tubérculo, ni en la producciòn (Cooke et al.,
1995).

110
3. Efectividad del control con Dimetomorf (Inóculo Natural)

La mezcla de dimetomorf + mancozeb fue mas efectiva que el mancozeb para el control de la
gota en el follaje, al final de la estación, pero solo en un año hubo diferencias significativas para
la infección en los tubérculos entre dicha mezcla y mancozeb. No se observó efecto consistente
sobre la producción. En la mayor parte del tiempo los resultados fueron similares entre
dimetomorf + mancozeb y metalaxyl + mancozeb (Cooke et al., 1995).

4. Efectividad del control con Fluazinam a intervalos de 10 días

Se evaluaron los tratamientos Fluazinam en dosis de 200 y 150 g/ha, frente a mancozeb y
metalaxyl + mancozeb con intervalos iguales en las aplicaciones. Fluazinam retrazó
significativamente el inicio de la enfermedad frente al mancozeb y redujo el nivel de daño en el
follaje al final de la estación. Ambos productos fueron igualmente efectivos para controlar la
gota en los tubérculos. No hubo un efecto significativo del fluazinam frente a la mezcla
metalaxyl + mancozeb para la reducción de daños en el follaje, ni gota en los tubérculos .
Igualmente no se observó un efecto consistente en la producción (Cooke et al., 1995).

5. Efectividad del control con Fluazinam a intervalos de 7 y 10 días

Se hicieron evaluaciones de 200 g a.i./ha a intervalos de 10 días y 150 g a.i./ha a intervalos de 7


días y 10 días, en comparación con mancozeb con 10 días de intervalo. Todos los programas con
fluazinam redujeron significativamente el daño en el follaje al final de la estación y también en el
tubérculo. Los intervalos de 7 días de fluazinam mostró de manera significativa, menor daño en
el follaje que el intervalo de 10 días, pero ambos presentaron síntomas similares en los tubérculos
(Cooke et al., 1995).

MEZCLAS DE FUNGICIDAS DE USO COMÚN PARA EL CONTROL DE LA


GOTA EN PAPA Y TOMATE EN COLOMBIA.

Algunos de los productos utilizados en mezclas de protectantes (a base de cobre,


ditiocarbamatos, clorotalonil) y sistémicos (Fenilamidas, Carbamatos, Cyanoacetamidas,
Fosfonatos) vienen previamente formulados por las casas comerciales o los agricultores hacen las
mezclas, algunos de los cuales no tienen en cuenta ninguna recomendación técnica, pues no
conocen su modo de acción.

En casi todos los casos utilizan surfactantes o adherentes

Propamocarb + Clorotalonil ( Previcur + Daconil o Bravo )

Propamocarb+ mancozeb (tattoo)

Metalaxyl y Clorotalonil (Ridomil+ Daconil)

Metalaxyl y Maneb o Mancozeb (Ridomil +Manzate o Dithane)

111
Oxadicyl + Mancozeb (Sandofan)

Benalaxy + Mancozeb (Galben)

Cymoxanil + Mancozeb (Curzate o Curathane).

Cymoxanil + Clorotalonil

Cymoxanil + Propineb (Fitoraz)

SISTEMAS EXITOSOS DE CONTROL QUÍMICO DE LA GOTA DE LA PAPA.

Dadas las condiciones de humedad relativa de muchas zonas con cultivos de papa en Colombia,
es necesario realizar aplicaciones incluso en los periodos de verano, pues la condensación del
agua al amanecer permite la germinación de los esporangios y/o zoosporas. En algunas zonas se
aumenta la frecuencia de aplicación a períodos de 10 días, en condiciones de verano y se reduce
a cinco días en períodos de lluvias alternadas con ratos soleados, condiciones muy favorables
para el desarrollo del patógeno.

En San Pedro Antioquia Colombia (Jaramillo, F., 2002, comunicación personal) en condiciones
meteorológicas que favorecen el desarrollo de la enfermedad (fuertes lluvias seguidas de días
soleados), algunos agricultores han logrado un buen control de la gota en la variedad Diacol
Capiro (susceptible), con aplicaciones cada cinco (5) días con una mezcla de Clorotalonil +
propamocarb + adherente, alternada con un fungicida de contacto como mancozeb, por máximo
tres aplicaciones de la primera y en total 18-20 aplicaciones con fungicidas por ciclo del cultivo.
Mientras que con algunos clones con resistencia de campo y posiblemente con resistencia por
genes mayores (Jaramillo y Gilchrist, 2002, Jaramillo, F., 2002, comunicación personal) se han
podido reducir las aplicaciones a una quinta parte (3-4), como la han observado Fernández
Northcote et al., (2002).

Según Doster y Fry (1991) cit por Erwin y Ribeiro (1996) es preferible reducir las dosis que
aumentar las frecuencias de aplicación, pues observaron que al final del período del cultivo, las
dosis se pueden reducir hasta en un 50%, sin que se incremente de manera significativa la
enfermedad. Ellos utilizaron un modelo de simulación por computador para determinar el
esquema de aspersión del metalaxyl en mezcla con un protectante (Clorotalonil) que permitiera la
reducción de la gota, con la decisión basada en las condiciones del clima, con relación a los
esquemas tradicionales.

Stein et al. (2002) determinaron el periodo (tiempo) crítico para la aplicación de fungicidas
foliares, con el fin de limitar la infección del follaje de la papa con Phytophthora infestans y el
nivel crítico (umbral) de la infección foliar, en la cual los fungicidas solos o en mezclas, evitan o
limitan la dispersión de la infección con P. infestans. En muchas estaciones, se logró reducir la
epidemia de la gota en el follaje a menos del 50% de la observada en una parcela testigo no
tratada, cuando el programa de las aplicaciones se iniciaron 72 horas antes y 72 horas después de
la inoculación con P. infestans y cuando el área foliar con lesiones de gota fue estimada en 1% o
menos. Las lesiones a nivel microscópico se observan después de las 22 horas de penetración de
las zoosporas al tejido, cuando las plantas son altamente susceptibles. Entre la 24-48 horas se
observa el inicio de las lesiones a nivel macroscópico (Vleehouwers et al., 2000b).

112
Después de 46 horas de inoculados los discos de hoja de plantas susceptibles S. microdontum
265 y S. sucrense-23, y la variedad Bentji de papa, se cubrían completamente de hifas y se
observaba una necrosis en el sitio de la inoculación. Ocasionalmente se inducen respuestas de
HR. A menor resistencia de la planta al patógeno, menor respuesta hipersensible en los tejidos
inoculados (Vleehouwers et al., 2000b).

La demora en las aplicaciones de cualquier fungicida, hasta que el área foliar afectada
representó el 5-10% del área total de la planta, produjo el desarrollo de la enfermedad en
proporción similar a las parcelas no tratadas. Muchos fungicidas y mezclas de fungicidas
evaluados, redujeron entre el 30-50% de la infección con gota, con respecto a las parcelas no
tratadas, siempre y cuando sus aplicaciones no se realizaran después de que se estimara el 1% del
follaje afectado con gota ( Stein et al., 2002).

Las observaciones de Stein et al. (2002), demuestran la fragilidad de las plantas frente a la
agresividad del patógeno y la inminente necesidad de incorporar genes de resistencia a dicho
patógeno, en combinación con el control químico, pues Jaramillo y Gilchrist (2002) observaron
que las lesiones se desarrollan mas lentamente, lo que permite espaciar las aplicaciones,
reduciéndose en por lo menos un 50% con respecto al testigo susceptible con aplicaciones.

Si se presentan daños físicos en las plantas por heladas y granizadas, se debe realizar
inmediatamente una aplicación con un fungicida, pues la barrera proporcionada por la resistencia
de las paredes celulares se pierde por la ruptura, permitiendo la entrada de los esporangios por las
heridas de los tejidos. Si las plantas están en estado juvenil (antes de floración ) se pueden
recuperar,dado que es posible activar el crecimiento vegetativo, produciendo. Si está en un
estado avanzado (Floración o después) sólo se logra retrazar un poco la muerte acelerada del
follaje, pero con gran desgaste energético por las respuestas fisiológicas a las heridas.

Geddens et al., (2002) observaron que Curzate (marca registrada) fue efectivo para el control de
la gota de la papa en Francia, cuando las temperaturas, densidad del inóculo y daño de la
enfermedad en los tallos fueron bajas, por el contrario cuando las condiciones de altas
temperaturas, alta densidad de inóculo e infección foliar que favorecieron un rápido desarrollo de
la enfermedad, el Curzate fue menos efectivo, pero superior a los demás productos que evaluaron.

Sin embargo, hay que ser cuidadoso con el uso del Curzate M (cimoxanyl + mancozeb) y el
Ridomil Gold (metalaxyl + macozeb) dado que Kessel et al., (2002), los señalan como poco
efectivos para la inhibición de las oosporas, en las zonas donde potencialmente se puedan
presentar los dos tipos de apareamiento.

Hausvater et al., (2002) observaron que bajo condiciones favorables para el desarrollo de la
enfermedad en follaje y tubérculos en la República Checa, entre los años 2000-2001, se logró un
mejor control con fluazinam, fentin y propamocarb- HCl, con poco control sobre la gota de los
tubérculos con mancozeb y oxicloruro de cobre. En la producción de papa orgánica, Böhm y
Cerny (2002), evaluaron extractos de plantas, oleato de potasio y el hidróxido de cobre, siendo
éste el único producto que presentó algún control, determinado por la reducción del área foliar
bajo la curva e incremento en la producción de tubérculos.

Ante la restringida efectividad del cobre se podría pensar que con las variedades de papa que
tienen actualmente los papicultores colombianos, no se puede hacer un cultivo comercial de papa
completamente orgánico. Es posible lograr mejores sistemas de control integrado de la

113
enfermedad, que reduzcan el número y/o dosis de aplicación de los distintos tipos de fungicidas,
como una alternativa de producción mas limpia, con variedades resistentes a P. infestans, pues
Cooke y Little (2002) observaron que tres aplicaciones de oxicloruro de cobre, proporcionaron
protección aceptable a las variedades mas resistentes.

En Suecia Wiik (2002) evaluó en tres zonas cuatro tratamientos de fungicidas, para los cuales
hicieron entre 7-8 aplicaciones durante el periodo, especialmente en las variedades susceptibles a
la enfermedad en follaje y tubérculos, encontrándose que es factible hacer un buen control, con
pocos tratamientos a bajas dosis al comienzo de la estación con mezclas de fungicidas con efectos
sinergísticos, acompañados de un buen sistema de pronósticos, para reducir al mínimo el uso de
fungicidas. Los tratamientos evaluados fueron los siguientes:

0.3-0.4 l/ha de Shirlan ( i.a. fluazinam 500 g/l).

0.4-0.5 l/ha de Epoc 600 EC (i.a. fluazinam 400g/l + metalaxyl M 200 g/l).

1.5-2.0 Kg/ha de Acrobat MZ (i.a. mancozeb 60% p/p + dimetomorf 9% p/p).

2.0-4.0 l/ha de Tattoo (i.a. mancozeb 302g/l + propamocarb 248g/l).

Kato y Shimanuki (2002) evaluaron tres variedades susceptible (Iris Cobbler), con resistencia
intermedia (Norin Nº 1) y resistente (Hanashibetsu) y tres frecuencias de aplicación de
fungicidas: 1) sin fungicida, 2) con 4-5 aplicaciones y 3) con 7 aplicaciones. Con este último
tratamiento se observaron pocos síntomas en las variedades evaluadas entre los años 2000-2001.
Al reducir el número de aplicaciones se redujo la producción entre el 16-19% para la variedad
susceptible, 7-22% para la intermedia y 7-20% para la resistente.

Sin aplicaciones de fungicidas, la producción se redujo entre 35-49% para la variedad


susceptible, 28-41% para la variedad con resistencia intermedia y del 5-16% para la resistente.
Cuando la variedad resistente creció bajo condiciones favorables para la gota, hasta finales de
agosto (un mes antes de la cosecha), presentó completa defoliación, pero solo se afectó el 5% de
los tubérculos.

Las observaciones anteriores sugieren la posibilidad de reducir a 1-2 aplicaciones al final de la


estación de crecimiento, sin que se presente una pérdida en la producción, en las zonas templadas
o se realicen cultivos en condiciones cuarentenarias en el trópico. En diferentes clones con
resistencia producidos por el grupo de papa de la Universidad Nacional de Colombia, ha sido
posible reducir de manera significativa el número de aplicaciones, distribuidas durante el periodo
vegetativo, pero siempre y cuando no se presenten condiciones extremas de clima que incluya
heladas y granizadas, las cuales disparan la gota en los cultivos.

Fernández-Northcote et al., (2002) han venido trabajando en una estrategia de control apoyada
en el uso de fungicidas sistémicos a la emergencia del cultivo conocida como la estrategia
PROINPA, la cual validó y ajusto en Huanuco Perú, con una variedad susceptible (Amarilla
Tumbay), logrando una reducción del 30-50% de las aspersiones que realizan los agricultores
locales.

La estrategia PROINPA logró la reducción en el número de aspersiones entre el 40-70% con


relación a los agricultores. La primera aplicación del fungicida sistémico se debe realizar cuando
ha emergido entre el 50-100% de las plantas, extendiéndose a todo el periodo de crecimiento,
114
con aplicaciones alternadas con fungicidas de contacto y utilizando al menos dos fungicidas
sistémicos de diferente clase y tipo químico como cymoxanil + propineb o mefenoxam +
mancozeb, alternados con clorotalonil, a intervalos de 5 días, cuando las condiciones
epidemiológicas locales favorecen la pronta aparición de la enfermedad, para un total de 12-15
aplicaciones durante el periodo vegetativo del cultivo (Fernández-Northcote et al., 2002).

CONDICIONES PARA UNA ADECUADA APLICACIÓN DE FUNGICIDAS

Es primordial las condiciones meteorológicas durante y después de las aplicaciones de los


fungicidas. Las condiciones óptimas se presentan cuando los vientos son suaves (menos de 10
nudos), bajo condiciones secas o hay ausencia de lluvias por varias horas. Las fungicidas
sistémicos son menos dependientes del clima y solo requieren de media hora sin lluvia, mientras
que los de contacto que forman una capa protectora sobre la planta y contienen un adherente o
humectante para una adhesión adecuada, necesitan dos horas bajo buenas condiciones de tiempo
y varias horas cuando el follaje está húmedo, antes de que la protección sea segura (Keane,1995).

115
CAPÍTULO VIII

PRONÓSTICO DE LA GOTA CAUSADA POR P. INFESTANS

Es importante tomar precauciones basadas en los pronósticos para el desarrollo de la


enfermedad, debido al tiempo de regeneración tan corto de P. infestans como especie
multicíclica, cuyo inóculo se incrementa y se reproduce varias veces en el ciclo del cultivo. La
naturaleza multicíclica afecta directamente las medidas de control de una enfermedad epidémica,
razón por la cual es muy difícil erradicar el 100% del inóculo, cuyo nivel puede incrementarse en
poco tiempo; además explica el incremento de líneas del patógeno resistentes al metalaxyl, las
cuales esporulan y se diseminan rápidamente por todo el campo con cultivos.

Según Turkensteen y Flier (2002b) la infección primaria se puede originar de un tubérculo antes
de la cosecha, en la cosecha o durante el almacenamiento o unas cuantas plantas huéspedes
(plantas de papa, tomate, pepino, y otras especies silvestres) infectadas en el campo, llegando a
causar una epidemia, cuando los brotes afectados emergen translocándose a los tallos y hojas,
causando lesiones sobre las cuales forman esporangios, si las condiciones meteorológicas (agua
líquida y temperatura óptima) son favorables. Dichos esporangios se pueden desprender y ser
transportados a las plantas huéspedes, como tomate y papa, donde germinan o liberaran las
zoosporas, que a su vez se desarrollan sobre los tejidos de dichas plantas, con alta preponderancia
en las socas o residuos de cosecha, formando focos de infección, los cuales repiten el ciclo varias
veces en el cultivo, llegando a causar la epidemia.

Dada la efectividad en la diseminación de este patógeno una vez se desarrolla en una planta el
el campo, los tubérculos afectados de manera latente, son ideales para la dispersión en un amplio
rango y contribuyen a la globalización de nuevas poblaciones, razón por la cual es necesario
identificar y erradicar las fuentes de inóculo iniciales (a escala nacional o regional) lo que implica
una permanente inspección para la erradicación o la iniciación del control químico. Las oospora
no son muy efectivas como fuente de inóculo primario, pues requieren precipitaciones por 24
horas o mas para asegurar la inundación de los suelos que permita la germinación Turkesteen y
Flier, (2002b).

En algunos sitios la enfermedad tiene ciclos tan cortos como 2,5 días, lo que demanda una
vigilancia permanente por parte de los agricultores, sin embargo la mayoría prefieren asperjar
según el calendario, que en algunas regiones es de cuatro o mas días, lo que según Turkesteen y
Flier (2002b), es riesgoso, con 2,5 días de ciclo de la enfermedad en el campo por lo tanto es
importante utilizar sistemas de predicción, debidamente ajustados a las diferentes ecoregiones
donde se establecen los cultivos.

Hay sistemas de predicción basados en parámetros meteorológicos (del clima) que ayudan al
manejo eficiente de los recursos de los agricultores, porque se pueden reducir al mínimo las
aplicaciones, si el ambiente no es favorable para el desarrollo de la enfermedad. Por otro lado,
las predicciones permiten la reducción del riesgo de grandes pérdidas en los cultivos, puesto que
se pueden programar aplicaciones adicionales de fungicidas, cuando los pronósticos indican la

116
probabilidad de que la enfermedad puede alcanzar proporciones epidémicas. El propósito es
cuantificar el riesgo de una fuente conocida.

Hasta el presente se ha determinado la supervivencia de los esporangios en relación con la


temperatura, la humedad relativa y la irradiación solar. Esta última parece tener mayor efecto si
los esporangios están en el aire o en la superficie de las hojas. Es necesario investigar sobre
modelos para describir la vía del transporte aéreo, modelos sobre la forma como se depositan y
sobreviven los esporangios después de que llegan a la superficie del tejido.

Por varios años Fry et al., (2002) han encontrado que bajo condiciones favorables se forman
mas de 30000 esporangios/cm2 durante una noche sobre lesiones foliares. Las pequeñas parcelas
de experimentación con el 6% de enfermedad, podían tener 109 esporangios disponibles para la
dispersión. Dichos investigadores detectaron hasta 10.000 esporangios/m3 en el aire
inmediatamente encima del follaje del cultivo. En condiciones favorables para la producción de
esporangios, pero desfavorables para la dispersión encontraron nuevamente hasta 30.000
esporangios/cm2 , pero menos de 2.000 esporangios/m3 en el aire por encima del follaje. Sin
embargo, observaron una pequeña concentración en el aire a 188-299 m de altitud y a una
distancia de 300-700 m de la fuente de inóculo viento abajo.

Según Mizubuti et al., (2002) los modelos de predicción y simulación deben ser validados
previamente antes de utilizarlos, basados en las evaluaciones de los efectos de la temperatura y la
combinación de la temperatura/duración de la humedad en la hoja, sobre el componente
epidemiológico en dos linajes clonales (US-1, A1 en tomate y BR-1, A2 en papa). No
observaron germinación de esporangios de BR-1 por encima de 22 ºC ni esporulación de las
lesiones a 27 ºC, mientras que las lesiones de US-1, no esporularon a 10 ºC. Los índices de
latencia y esporulación se observaron a 22 ºC, temperatura en la cual se formó el mayor tamaño
de lesión de US-1, pero para BR-1 la temperatura óptima varió de 15-22 ºC. El mayor número de
lesiones se determinó cuando las plantas fueron mantenidas en condiciones de humedad por 24
horas a 22 ºC para tomate con US-1 y 10 ºC para papa con BR-1.

En áreas donde las condiciones del ambiente son continuamente favorables (temperatura
promedio de 20 ºC y agua líquida por lluvia o zona húmedas donde se da la condensación por el
punto de rocío), las predicciones son de poco valor (Erwin y Ribeiro, 1996). Esta condición
correponde a varias zonas paperas del trópico como Colombia, especialmente en el Oriente de
Antioquia, durante gran parte del año. En Irlanda y Canadá el servicio de meteorología anuncia
por radio o televisión las condiciones meteorológicas que favorecen el desarrollo de la gota, con
el propósito de que los agricultores tengan la oportunidad de asperjar sus cultivos.

Keane (1995), hace referencia a varios modelos para la predicción, pero en Irlanda opera un
modelo basado en los trabajos de Bourke (1955), quien mostró que para que se presenten
condiciones favorables para el desarrollo de los esporangios y la germinación de las zoosporas, se
requiere un periodo de humedad de al menos 12 horas, con temperaturas no inferiores a 10 ºC y
humedad relativa del aire (HR) del 90%, si ocurre precipitación a las 7-15 horas después de haber
empezado el período. Si no ocurre precipitación en ese periodo se requiere un tiempo mínimo de
16 horas para el desarrollo de la enfermedad.

En Cuba, Gómez y Hernández (2003), después de evaluar la efectividad de varios modelos de


predicción en los que se destaca el uso de la precipitación y la temperatura, diseñaron un nuevo
modelo que denominaron “Indice de Riesgo al Tizón Tardío” (IRTT), el cual aplica los
117
componentes mejores de los modelos “Naumova Modificado” y “Umbral de lluvia”, que pueden
ser calculados semanalmente o diariamente desde el primero de diciembre, teniendo en cuenta
los valores del umbral de las lluvias diarios o acumulados en la semana, los cuales indican que
con 38 mm de precipitación en un periodo de cuatro semanas y un promedio de temperatura
inferior a 24 ºC se puede inducir una epidemia.

Este modelo permite la emisión de alerta o peligro de aparición y un estimativo del riesgo de
enfermedad, de tal forma que se puedan proteger los campos con cultivos. El riesgo puede ser
obtenido al comparar los valores semanales del periodo analizado cuando la papa está en
crecimiento, con las tablas de valores promedios IRTT cuando las epidemias son suaves,
intermedias y severas, el cual se está aplicando como una ayuda para mejorar el manejo integrado
de la gota en el 2005. Dicho modelo puede ser empleado en predicciones a largo plazo, para lo
cual se utilizó un modelo climático simple del efecto de invernadero por liberación de gases
(IS92a), que estima un rango promedio de emisiones futuras y un Modelo de Clima Global
(HADCM2) que tiene en cuenta la mayor condición de alerta y la condición mas seca de la tierra
(Gómez y Fernández, 2003).

La situación señalada es típica para los países con estaciones, en los cuales es fácil predecir las
condiciones climáticas, pero en el trópico húmedo el riesgo es permanente desde la siembra hasta
la cosecha de los cultivos, los cuales se establecen durante todo el año, como sucede en buena
parte de los municipios paperos de Colombia, donde los sistemas de predicción no funcionarían
muy bien, salvo de que se disponga de variedades con alto grado de resistencia y que se
desarrollen sistemas de información confiables y oportunos, por la ubicación de microestaciones
meteorológicas en las diferentes regiones paperas, conectadas a un sistema central de recolección
y análisis de lo datos, lo que implica hacer investigación en cada región, con el fin de reducir las
aplicaciones de fungicidas.

Según Turkesteen (S.F.) este sería el caso de agriculturas de alto capital, común en los países
desarrollados y no para una agricultura de subsistencia como sucede generalmente en los países
en desarrollo. Actualmente se habla de agricultura de precisión, la cual requiere de estudios a
nivel de micro-regiones lo mas homogéneas posibles, situación difícil de lograr en las zonas de
ladera de los departamentos paperos de Colombia, por la alta concentración minifundista.

Las predicciones de gota basadas en los sistemas de control, asumen que el inóculo inicial viene
de algún lugar, pero el desarrollo de la gota en el campo empieza a muy bajos niveles. Grünwald
et al., (2003), validaron el sistema SimCast modificado para predecir el uso de fungicidas en
variedades mexicanas con altos niveles de resistencia a gota, logrando reducir el número de
aplicaciones de fungicidas. La precipitación fue la variable del ambiente responsable de la
mayoría de los eventos de predicción, al igual que en Cuba, donde además la temperatura que
favorece los frentes fríos como el fenómeno de niño, proporcionan condiciones favorables para
el desarrollo de la enfermedad.

Las predicciones mas ajustadas de la enfermedad podrían permitir a los agricultores precisar de
manera mas adecuada, los periodos de aspersión cercanos a los períodos de infección predichos y
a los mejoradores la evaluación de la resistencia de clones en los estados iniciales del
crecimiento, para acelerar los procesos de mejoramiento genético y la producción de nuevas
variedades con resistencia a dicho patógeno Turkesteen (S.F.).

118
Los criterios utilizados en Alemania son diferentes a los de Irlanda. Los primeros se basan en
el inicio de la epidemia, considerado en el 0,1% de las plantas afectadas, mientras que en Irlanda
se basan en el periodo cero (antes de mediados de junio). En ambos casos se utilizan los registros
de los inspectores de campo y las predicciones basadas en un sistema de simulación de las
condiciones meteorológicas favorables para la epidemia (Keane,1995)

Uno de los sistemas de predicción mas utilizados en Estados Unidos es el BLITECAST, el cual
combina un sistema de predicción de la gota con un sistema de valores de severidad, asignados a
periodos de alta humedad relativa. Se registran máximo cuatro valores de severidad por día, con
incrementos en la duración de la humedad relativa y la temperatura hasta 26,6 ºC.

Se predice que la aparición inicial de la gota se presenta después de que se acumulan 18-21
valores de severidad, desde el momento de germinación de la planta; además las ocurrencias
pueden ser predichas después de la acumulación subsiguiente de tres valores de severidad. Este
sistema está adaptado a un equipo microcomputarizado acoplado a un sistema de toma de datos
climatológicos, en una unidad autocontenida y colocada en el campo del cultivo (Erwin y
Ribeiro, 1996).

Según Fohner et al., (1984), el programa BLITECAST y el sistema de Fry et al., (1983)
determinan cuando tienen que hacerse aplicaciones de fungicidas en el Estado de New York y
parece ser equivalente a una aplicación semanal, como sucede con los agricultores del
departamento de Antioquia, Colombia, quienes prácticamente realizan aplicaciones calendario,
las cuales suspenden o reducen la frecuencia, cuando el cultivo inicia su madurez fisiológica,
para papa comercial y semilla respectivamente y /o cuando las condiciones climática (baja
precipitación) lo permitan.

El sistema propuesto por MacHardy en 1979 (citado por Erwin y Ribeiro, 1996), podría ser una
buena herramienta para Colombia, por los microclimas que se presentan en las regiones paperas,
las cuales se caracterizan por ser esencialmente minifundistas. Ellos describen un programa no
computarizado, basado en BLITECAST, en el que se registran diariamente las temperaturas
máximas, mínimas y promedios, a la par con los registros de lluvias.

Una temperatura promedio por debajo de 25,6 ºC durante 5 días y la lluvia total para 10 días de
1,2 pulgadas (3 cm) o más, dan una condición favorable para el desarrollo de la enfermedad. Si
la temperatura es superior a la indicada, o inferior a 7,5 ºC con lluvias menores a 3 cm, no se
favorece el desarrollo de la enfermedad. Un modelo similar fue propuesto en Colombia por el
ICA a comienzos de los 1970’s, el cual debe ser ajustado para cada microclima y variedad, con
base en la experimentación.

119
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