Trung taâm ÖÙng duïng Tieán boä KH & CN Bình Ñònh Huyønh Xuaân

Tröôøng
Bài 1: SƠ LƯỢC VỀ KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

1. Giới thiệu:
Nuôi cấy mô thực vật ( plant tissue culture) là kỹ thuật đưa một mô, bộ phận
hoặc tế bào của thực vật vào trong một hệ thống vô trùng có thể kiểm soát về: thành
phần chất khoáng, điều hoà sinh trưởng, các chất hữu cơ cung cấp cho cây, ánh
sáng, nhiệt độ, độ ẩm để mô, bộ phận đó sinh trưởng, phát triển theo mục đích của
người nuôi cấy.
Phương pháp nuôi cấy mô thực vật chủ yếu hướng về những ứng dụng thực tiễn
như:
- Tạo được một quần thể lớn và đồng nhất trong một thời gian ngắn, với diện
tích nhỏ, có điều kiện hoá lý kiểm soát được.
- Tạo được nhiều cây con từ mô và cơ quan của cây ( lóng, thân, phiến lá, hoa,
hạt phấn, chồi phát hoa…) mà ngoài thiên nhiên không thực hiện được.
- Làm sạch nguồn virus cho cây bằng cách cấy đỉnh sinh trưởng.
- Cải tiến các giống cây trồng bằng công nghệ sinh học.
2. Các phương pháp nuôi cấy mô thực vật:
Có nhiều phương pháp nuôi cấy mô thực vật như:
- Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng hoặc chồi đỉnh, chồi bên.
- Nuôi cấy mô sẹo.
- Nuôi cấy tế bào đơn.
- Nuôi cấy tế bào trần ( protoplast).
- Nuôi cấy hạt phấn đơn bội.
3. Các bước nhân giống bằng nuôi cấy mô ( micropropagation):
Để nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô thường phải trải qua các bước sau:
- Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng hoặc chồi đỉnh, chồi bên.
- Tạo thể nhân giống in-vitro.
- Nhân giống in-vitro.
- Tái sinh cây hoàn chỉnh in-vitro.
- Chuyển cây in-vitro ra vườn ươm.
CÁC YÊU CẦU TRONG NUÔI CẤY MÔ
Để nuôi cấy mô thành công, có 03 yếu tố quan trọng cần phải thực hiện được đó
là:
- Chọn và xử lý mẫu cấy thích hợp.
- Đảm bảo điều kiện vô trùng trong quá trình nuôi cấy.
- Chọn và chuẩn bị môi trường nuôi cấy phù hợp.
Cả 03 yếu tố này đều rất quan trọng trong nuôi cấy mô thực vật. Nếu thiếu một
trong 03 yếu tố trên thì việc nuôi cấy mô sẽ gặp thất bại.

Giaùo trình Nuoâi caáy moâ thöïc vaät Trang 1

Trung taâm ÖÙng duïng Tieán boä KH & CN Bình Ñònh Huyønh Xuaân
Tröôøng
Bài 2: PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

Bố trí mặt bằng:

Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật có thể gồm từ 1 đến nhiều phòng tùy
theo khả năng và nhu cầu sử dụng nhưng nếu cso khả năng thì thường bao gồm các
Phòng với các trang thiết bị như sau:

1. Phòng rửa và cất nước

+ Máy cất nước 1 lần (8 L/giờ)
2. Phòng sấy hấp
+ Tủ sấy 60-300oC
+ Nồi khử trùng (autoclave) loại nhỏ (25 L)
3. Phòng chuẩn bị môi trường
+ pHmeter
+ Máy khuấy từ gia nhiệt
+ Cân phân tích 10-4g
+ Cân kỹ thuật 10-2g
+ Bếp điện
+ Tủ lạnh 100-200 L
4. Phòng cấy vô trùng
+ Tủ cấy vô trùng (Laminar, Clean Bench)
+ Quạt thông gió
+ Đèn tử ngoại treo trần hoặc treo tường (1,2 m)
5. Phòng ảnh
- Máy ảnh kỹ thuật số
- Hệ thống đèn chiếu
6. Phòng kính hiển vi
+ Kính hiển vi 2 mắt (độ phóng đại 1000 lần).
+ Kính hiển vi đảo ngược (độ phóng đại 1000 lần) có gắn máy chụp ảnh kỹ
thuật số.
+ Kính lúp 2 mắt (độ phóng đại 75 lần).
7. Phòng nuôi
+ Các giàn đèn huỳnh quang nhiều ngăn, có độ chiếu sáng ở chỗ để bình
nuôi cấy từ 2000-3000 lux.
+ Máy điều hòa nhiệt độ
+ Tủ ấm
8. Phòng sinh hóa
+ Máy sắc ký (HPLC, sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng...)

Giaùo trình Nuoâi caáy moâ thöïc vaät Trang 2

Trung taâm ÖÙng duïng Tieán boä KH & CN Bình Ñònh Huyønh Xuaân
Tröôøng
+ Thiết bị điện di gel (agarose và polyacrylamide)
+ Máy quang phổ có dải đo từ 190-1100 nm
Đối với các phòng nuôi cấy mô đơn giản thì ta có thể gộp nhiều phòng lại với
nhau, thường bao gồm 03 phòng chính sau:
- Phòng chuẩn bị môi trường
- Phòng cấy vô trùng
- Phòng nuôi

Giaùo trình Nuoâi caáy moâ thöïc vaät Trang 3

Trung taâm ÖÙng duïng Tieán boä KH & CN Bình Ñònh Huyønh Xuaân
Tröôøng
Bài 3: CHỌN VÀ XỬ LÝ MẪU CẤY

Trong cơ thể thực vật ta có thể chọn bất cứ bộ phận nào trừ các bộ phận đã hoá
gỗ để nuôi cấy mô vì tế bào có tính toàn năng. Tuy nhiên để dễ thành công trong
nuôi cấy mô người ta thường chọn các mẫu cấy ở các mô, bộ phận còn non trẻ có
khả năng sinh trưởng mạnh ( mô phân sinh ngọn, tượng tầng, phôi đang phát triển,
lá non, cuống hoa non, đế hoa, mô phân sinh bên….). Để khởi đầu cho việc nghiên
cứu nuôi cấy mô thực vật người ta thường tập trung vào mô phân sinh ngọn và mô
phân sinh bên.
Để chọn mô cấy chúng ta cần chú ý đến các đặc điểm sau:
- Giai đoạn và tuổi của cây mẹ
- Giai đoạn lấy mẫu
- Vị trí của mẫu cấy trên cây mẹ
- Kích thước và nguồn gốc của mẫu cấy
Mẫu cấy sau khi được chọn cần xử lý vô trùng, cắt theo yêu cầu và cấy vào môi
trường phù hợp theo đúng phương pháp. Sau khi cấy mẫu cấy cần được đặt vào các
điều kiện nuôi cấy phù hợp về ánh sáng (cường độ, thời gian chiếu sáng), nhiệt độ,
độ ẩm để mẫu cấy có thể sinh trưởng và phát triển đúng với yêu cầu của người thực
hiện. Tùy vào các mục đích nghiên cứu mà có các chế độ chiếu sáng khác nhau,
chẳng hạn quá trình tạo callus có thể cần bóng tối hoặc chiếu sáng nhưng quá trình
tái sinh và nhân giống vô tính nhất thiết cần ánh sáng. Nhiệt độ phòng nuôi nên giữ
ổn định từ 25 ± 2oC bằng máy điều hòa nhiệt độ. Cường độ chiếu sáng khoảng từ
2000-3000 lux.

Giaùo trình Nuoâi caáy moâ thöïc vaät Trang 4

Trung taâm ÖÙng duïng Tieán boä KH & CN Bình Ñònh Huyønh Xuaân
Tröôøng

Bảng 3.1: Các cơ quan của thực vật sử dụng trong nuôi cấy mô và tế bào

Nguồn gốc mẫu Kích

Stt Mẫu nuôi cấy
vật nuôi cấy thước
Mô phân sinh Đỉnh sinh trưởng
1 đỉnh 0,5-1 mm
(meristem)
Chồi đỉnh Chóp đỉnh có chứa một
2 0,5-1 cm phần thân
(shoot tip)
Chồi nách Chồi bên có chứa một phần
3 0,5-1 cm thân, lá và chồi nách
(axillary bud)
Cuống lá Cuống lá được cắt nhỏ,
0,2-0,3
4 (leaf petiole) phân nửa được cấy chìm
cm
vào môi trường
Phiến lá Phiến lá non đặt trên môi
5 (leaf blade) 0,2-1 cm trường, mặt dưới đặt trên
mặt thạch
Rễ Mẫu rễ được đặt trên mặt
6 0,5-1 cm thạch
(root)
Dạng hành Mẫu được đặt trên bề mặt
7 (bulds, scale) 1-2 cm hay cấy chìm phân nửa vào
môi trường
Cây mầm Chồi non
8 2-3 mm
(seedling)
Hạt phấn Hạt phấn trong bao phấn
0,1-0,5
9 (pollen, mm
microspore)

Giaùo trình Nuoâi caáy moâ thöïc vaät Trang 5

Trung taâm ÖÙng duïng Tieán boä KH & CN Bình Ñònh Huyønh Xuaân
Tröôøng
Bài 4: ĐẢM BẢO ĐIỀU KIỆN VÔ TRÙNG

1. Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật
Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, muối khoáng,
vitamin... rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Nếu trong môi
trường nuôi cấy chỉ nhiễm một vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến
một tuần, toàn bộ bề mặt môi trường và mô nuôi cấy sẽ phủ đầy một hoặc nhiều loại
nấm và vi khuẩn. Thí nghiệm phải bỏ đi vì trong điều kiện này mô nuôi cấy sẽ
không phát triển và chết dần.
Thông thường, một chu kỳ nuôi cấy mô và tế bào thực vật dài từ 1-5 tháng (tùy
đối tượng và mục đích nuôi cấy), mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô và
tế bào thực vật đòi hỏi rất nghiêm khắc, đặc biệt khi nuôi cấy các tế bào đơn thực
vật trong các nồi phản ứng sinh học (bioreactor), điều kiện vô trùng phải rất cao
mới có hy vọng thành công được.
2. Nguồn nhiễm tạp
Có 3 nguồn nhiễm tạp chính:
- Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy không được vô trùng tuyệt đối.
- Trên bề mặt hoặc bên trong mô nuôi cấy tồn tại các sợi nấm, bào tử nấm hoặc
vi khuẩn.
- Trong quá trình thao tác làm rơi nấm hoặc vi khuẩn theo bụi lên bề mặt môi
trường.
3. Vô trùng dụng cụ thủy tinh, nút đậy và môi trường
a. Dụng cụ thủy tinh
Dụng cụ thủy tinh dùng cho nuôi cấy mô và tế bào thực vật phải là loại thủy tinh
trong suốt để ánh sáng qua được ở mức tối đa và trung tính để tránh kiềm từ thủy
tinh gây ảnh hưởng đến sự phát triển của mô nuôi cấy.
Cần rửa sạch dụng cụ thủy tinh trước khi đưa vào sử dụng. Thông thường, chỉ
cần xử lý dụng cụ thủy tinh bằng sulfochromate một lần đầu khi đưa vào sử dụng,
về sau chỉ cần rửa sạch bằng xà phòng, tráng sạch bằng nước máy nhiều lần và cuối
cùng tráng bằng nước cất. Sau khi để ráo nước, dụng cụ thủy tinh (trừ các loại dùng
để do thể tích) cần được vô trùng khô bằng cách sấy ở 60-70oC/2 giờ. Sau khi nguội
được lấy ra cất vào chỗ ít bụi.
b. Nút đậy
Thường dùng nhất là các nút đậy làm bằng bông không thấm nước. Nút phải
tương đối chặt để đảm bảo bụi không đi qua được, đồng thời nước từ môi trường
không bị bốc hơi quá dễ dàng trong quá trình nuôi cấy. Bông không thấm nước là
loại nút đơn giản nhất, nhưng có các nhược điểm sau:
+ Nếu khi hấp nút bông bị ướt hoặc dính môi trường thì về sau sẽ bị nhiễm nấm,
nhất là ở các thí nghiệm nuôi cấy trong thời gian dài.
+ Thao tác làm nút bông chậm, không thuận tiện khi nuôi cấy trên quy mô lớn.
+ Chỉ dùng được một vài lần, sau phải bỏ.

Giaùo trình Nuoâi caáy moâ thöïc vaät Trang 6

Trung taâm ÖÙng duïng Tieán boä KH & CN Bình Ñònh Huyønh Xuaân
Tröôøng
Hiện nay, người ta sử dụng nhiều loại nắp đậy khác thay thế nút bông. Các hãng
sản xuất dụng cụ nuôi cấy mô cung cấp loại nắp ống nghiệm và bình tam giác bằng
nhựa chịu nhiệt có thể hấp vô trùng ở nhiệt độ 121oC (khoảng 1 atm) mà không bị
biến dạng. Một số phòng thí nghiệm dùng nắp ống nghiệm inox hoặc cao su hoặc
bằng nilon rất thuận tiện cho việc vô trùng khô hoặc ướt. Cũng có thể sử dụng giấy
nhôm để làm nắp đậy.
c. Môi trường
Nói chung, môi trường được pha chế và dự trữ trong điều kiện không vô trùng
và đem hấp vô trùng khi đã phân phối vào các dụng cụ thủy tinh đã đậy nút hoặc
nắp. Thời gian hấp từ 15-20 phút ở áp suất khoảng 1 atm (121oC). Sau khi vô trùng
cần phải làm khô nắp ống nghiệm hoặc nút bông.
Các dung dịch mẹ (stock solutions) dùng để pha chế môi trường (dung dịch
muối khoáng, vitamine, chất kích thích sinh trưởng...) cần được bảo quản trong tủ
lạnh. Dung dịch mẹ của hỗn hợp vitamin nên chia thành nhiều lọ nhỏ và bảo quản
trong ngăn đá của tủ lạnh. Không nên pha một lượng quá lớn dung dịch mẹ các chất
sinh trưởng, thường chỉ nên dùng các lọ có dung tích từ 100 đến 200 mL.
Đôi khi ta cần cho vào môi trường nuôi cấy các chế phẩm mẫn cảm với nhiệt, có
thể bị phân hủy khi ta hấp ở 121oC. Trường hợp này cần tiến hành lọc vô trùng
riêng các chế phẩm đó và sau đó đưa vào môi trường được khử trùng.
d. Lọc vô trùng
Phương pháp đơn giản nhất là dùng các màng lọc Millipore (Hình 1.1) do hãng
Millipore sản xuất hoặc dùng các phểu lọc thủy tinh xốp số 5.

Hình 1. Một số loại màng lọc vô trùng của hãng Millipore (disposable). Đây là loại màng lọc đã được

Giaùo trình Nuoâi caáy moâ thöïc vaät Trang 7

Trung taâm ÖÙng duïng Tieán boä KH & CN Bình Ñònh Huyønh Xuaân
Tröôøng
4. Vô trùng mô nuôi cấy
Mô nuôi cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như: hạt
giống, phôi, noãn sào, đế hoa, lá, đỉnh sinh trưởng, đầu rễ, thân củ... Tùy theo sự
tiếp xúc với điều kiện môi trường bên ngoài, các bộ phận này chứa ít hay nhiều vi
khuẩn và nấm. Hầu như không thể vô trùng mô nuôi cấy được nếu nấm khuẩn nằm
sâu ở các tế bào bên trong chứ không hạn chế ở bề mặt.
Phương thức vô trùng mô nuôi cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các hóa
chất có hoạt tính diệt nấm khuẩn.
Trong thời gian xử lý, mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn.
Đối với các bộ phận thực vật có nhiều bụi đất, trước khi xử lý nên rửa kỹ bằng xà
phòng dưới dòng nước chảy. Khi xử lý xong, mô cấy được rửa nhiều lần bằng nước
cất vô trùng (3-5 lần). Những phần trên mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng
ra cần phải cắt bỏ trước khi đặt mô cấy lên môi trường. Để tránh ảnh hưởng trực
tiếp của các tác nhân vô trùng lên mô cấy, nên chú ý để lại một lớp bọc ngoài khi
ngâm mô vào dung dịch diệt khuẩn. Lớp cuối cùng này sẽ được cắt bỏ hoặc bóc đi
trước khi đặt mô cấy lên môi trường.
Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên. Tuy
vậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần
thử, chắc chắn sẽ đạt kết quả.
Bảng 4.1: Nồng độ và thời gian sử dụng một số chất diệt khuẩn
để xử lý mô cấy thực vật

Thời gian xử lý

STT Tác nhân vô trùng Nồng độ Hiệu quả
(phút)
1 Calcium hypochlorite 9-10% 5-30 Rất tốt
2 Sodium hypochlorite 2% 5-30 Rất tốt
3 Nước Bromine 1-2% 2-10 Rất tốt
4 H2O2 10-12% 5-15 Tốt
5 HgCl2 0,1-1% 2-10 Khá
6 Kháng sinh 4-50 mg/l 30-60 Khá
5. Vô trùng nơi thao tác cấy và tủ cấy vô trùng:
Nguồn nhiễm tạp quan trọng và thường xuyên nhất là bụi rơi vào dụng cụ thủy
tinh chứa môi trường trong khi mở nắp hoặc nút bông để thao tác cấy. Người ta áp
dụng nhiều biện pháp khác nhau để chống lại nguồn nhiễm tạp này.
Buồng cấy thường là buồng có diện tích hẹp, có hai lớp cửa để tránh không khí
chuyển động từ bên ngoài trực tiếp đưa bụi vào. Sàn và tường lát gạch men để có
thể lau chùi thường xuyên. Trước khi đưa vào sử dụng, buồng cấy cần được xử lý
hơi formol bằng cách rót formadehyde (formalin) 40 % ra một số nắp đĩa petri để
rải rác vài nơi trong phòng cho bốc hơi tự do. Đóng kín cửa phòng cấy trong 24 giờ,

Giaùo trình Nuoâi caáy moâ thöïc vaät Trang 8

Trung taâm ÖÙng duïng Tieán boä KH & CN Bình Ñònh Huyønh Xuaân
Tröôøng
sau đó bỏ formaldehyde đi và khử hơi formaldehyde thừa bằng dung dịch NH3 25%
cũng trong 24 giờ. Mặt bàn cấy, trước khi làm việc phải lau mặt bàn bằng cồn 900.
Các dụng cụ mang vào buồng cấy đều vô trùng trước: từ áo choàng, mũ vải,
khẩu trang của người cấy, đến dao, kéo, kẹp, giấy lọc, bình đựng nước cất... Trên
bàn cấy thường xuyên có một đèn cồn (hoặc đèn gas) để sử dụng trong khi cấy và
một cốc đựng cồn 900 để nhúng các dụng cụ làm việc.
Trước khi cấy, kỹ thuật viên cần rửa tay bằng xà phòng và lau kỹ đến khuỷu tay
bằng cồn 700. Để đảm bảo mức độ vô trùng cao trong tủ cấy cần có một đèn tử
ngoại 20W. Chỉ cho đèn này làm việc khi không có người trong phòng cấy. Nên bật
đèn tử ngoại 30 phút trước khi cấy. Cần giảm sự chuyển động của không khí trong
buồng cấy đến mức tối thiểu, vì vậy tất cả các dụng cụ phục vụ việc cấy đều phải
chuẩn bị đầy đủ để trong khi cấy tránh đi lại, ra vào buồng cấy nhiều lần.

Hình 2. Tủ cấy vô trùng

6. Hạn chế nhiễm khuẩn trong quá trình nuôi:
Các bình nuôi cây được giữ trong một khu vực riêng cách ly ánh sáng mặt trời, và
có nhiệt độ khỏang 250C khi chứa các bình nuôi cây. Nếu bạn nuôi dưới ánh sáng,
chỉ sử dụng đèn huỳnh quang. Chu trình chiếu sáng thường dùng là 16 giờ sáng và 8
giờ tối. Kiểm tra nhiệt độ nuôi tại những vùng nuôi sáng bởi vì đèn hùynh quang
làm tăng nhiệt độ.
Kiểm tra quá trình nuôi mỗi 3 – 5 ngày để xác định sự nhiễm bẩn. Những vùng
nhầy có nghĩa là đã nhiễm khuẩn còn những vùng có khuẩn ty có nghĩa là đã nhiễm
nấm. Không được mở những bình đã bị nhiễm. Những loại gây nhiễm bẩn có thể
gây bệnh. Cách an toàn nhất là hấp các bình chứa này với nồi hấp ở áp suất 1atm.

Giaùo trình Nuoâi caáy moâ thöïc vaät Trang 9

Trung taâm ÖÙng duïng Tieán boä KH & CN Bình Ñònh Huyønh Xuaân
Tröôøng
Bài 5: MOÂI TRÖÔØNG NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT

1. Thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy moâ thöïc

vaät:
Moâi tröôøng nuoâi caáy moâ thöïc vaät thay ñoåi tuøy theo
loaøi vaø moâ thöïc vaät ñöa vaøo nuoâi caáy nhöng veà cô baûn
moâi tröôøng nuoâi caáy goàm coù 05 thaønh phaàn sau:
- Caùc muoái khoaùng ña löôïng.
- Caùc muoái khoaùng vi löôïng.
- Caùc Vitamin.
- Caùc chaát ñieàu hoaø sinh tröôûng
- Ñöôøng laøm nguoàn cacbon.
Ngoaøi ra coøn coù theå coù moät soá chaát höõu cô coù thaønh
phaàn xaùc ñònh ( acid amin, EDTA,…) hoaëc coù thaønh phaàn
khoâng xaùc ñònh ( nöôùc döøa, chuoái, khoai taây…).
a) Caùc muoái khoaùng ña löôïng:
Caùc nguyeân toá ña löôïng caàn thieát cho caây laø: nitô, phoát
pho, kali, canxi, magieâ, saét…
Bảng 5.1. Các muối khoáng đa lượng dùng trong nuôi cấy mô
Nguyên tố Nồng độ
Stt Dạng sử dụng
đa lượng (mM)
N Ca(NO3)2.4H2O, KNO3, NaNO3, ∑ [NO3-,
1 NH4NO3, (NH4)2SO4
(NO3 , NH4+)
- NH4+] khoảng
20
2 P NaH2PO4.7H2O, KH2PO4 khoảng 1
3 K KNO3, KCl.6H2O, KH2PO4 khoảng 10
4 Ca Ca(NO3)2.4H2O, CaCl2.2H2O khoảng 2
5 Mg MgSO4.7H2O 0,5-3
6 S (NH4)2SO4 khoảng 1

b) Caùc muoái khoaùng vi löôïng:

Có nhiều loại khoáng vi lượng cần thiết cho cây tùy thuộc vào loại cây, tuy nhiên
có một số loại vi lượng là cần thiết cho gần như tất cả các loại cây, các loại vi lượng
đó là: Mangan (Mn), Kẽm (Zn), Bo (B), Molipđen (Mo), Iốt (I), đồng (Cu), Coban
(Co).
Bảng 5.2. Các muối khoáng vi lượng dùng trong nuôi cấy mô

Nguyên tố Nồng độ

Stt Dạng sử dụng
vi lượng (mg/L)
1 Mn MnSO4.4H2O 15-100
2 B H3BO3 6-100
Giaùo trình Nuoâi caáy moâ thöïc vaät Trang 10
Trung taâm ÖÙng duïng Tieán boä KH & CN Bình Ñònh Huyønh Xuaân
Tröôøng
3 Zn ZnSO4.7H2O 15-30
4 Cu CuSO4.5H2O 0,01-0,08
5 Mo Na2MoO4.2H2O 0,007-1
6 Co CoCl2.6H2O 0,1-0,4
7 I KI 2,5-20
8 Fe FeSO4.7H2O 15-27,9

c) Caùc Vitamin:
Coù nhieàu loaïi vitamin ñöôïc duøng trong nuoâi caáy moâ
nhöng chuû yeáu laø caùc vitamin nhoùm B vì chuùng tan deã
daøng trong nöôùc, caùc loaïi vitamin ñoù nhö sau: Thiamin HCl
(vitamin B1), Pyridoxine HCl (vitamin B6), Axit nicotinic (vitamin
PP), Riboflavine (Vitamin B2), Biotin (Vitamin H), Canxi
panthotenat ( B3).

Bảng 5.3. Các loại vitamin thường dùng trong nuôi cấy mô

Nồng độ
Stt Tên vitamin
(mg/L)
1 myo-inositol 100
2 Nicotinic acid 0,5-1
3 Pyridoxine.HCl (Vit B6) 0,05-0,5
4 Thiamine.HCl (Vit B1) 10-50
5 Panthotenate calcium (Vit B5) 1-5
6 Riboflavin (Vit B2) 1-5
7 Biotin 0,1-1
8 Folic acid 0,1-1

d) Caùc chaát ñieàu hoaø sinh tröôûng:

Coù nhieàu loaïi ñieàu hoøa sinh tröôûng khaùc nhau söû duïng
trong nuoâi caáy moâ thöïc vaät, nhöng chuû yeáu söû duïng 03
nhoùm chính sau:
- Nhoùm Auxin: bao goàm caùc chaát nhö IAA hoaëc coù hoaït
tính töông töï nhö IAA nhö α-NAA, IBA, 2,4D; caùc chaát
thuoäc nhoùm naøy coù taùc duïng kích thích taïo reã, taïo
moâ seïo, ngaên caûn söï taïo choài, kích thích taêng tröôûng
teá baøo.
- Nhoùm Cytokinin: bao goàm caùc chaát nhö Zeatin hoaëc
coù hoaït tính töông töï nhö Zeatin nhö Kinetine, BA, 2-iP,
TDZ. Caùc chaát thuoäc nhoùm naøy coù taùc duïng kích
Giaùo trình Nuoâi caáy moâ thöïc vaät Trang 11
Trung taâm ÖÙng duïng Tieán boä KH & CN Bình Ñònh Huyønh Xuaân
Tröôøng
thích söï taïo choài, ngaên caûn söï taïo reã, kích thích phaân
chia teá baøo.
- Nhoùm Giberelin: goàm caùc chaát nhö GA3 hoaëc coù hoaït
tính töông töï nhö GA3. Caùc chaát thuoäc nhoùm naøy coù
taùc duïng kích thích söï keùo daøi teá baøo, ngaên caûn söï
hình thaønh choài.

Bảng 5.4. Chữ viết tắt của một số chất kích thích sinh trưởng

Chữ Chữ
Chất kích thích sinh
viết viết Chất kích thích sinh trưởng
trưởng
tắt tắt
BA Benzyladenin KIN Kinetin
BAP Benzyladeninpurine NAA Naphthaleneacetic acid
GA3 Gibberellic acid 2hZ Dihydrozeatin
IAA Indoleacetic acid TDZ Thidiazuron
IBA Indolebutyric acid Zea Zeatin
2-iP 2-Isopentenyl adenin 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid
NOA Naphthoxyacetic acid Pic Picloram

e) Ñöôøng:
Ñöôøng laø chaát cung caáp nguoàn cacbon cho caây trong
thôøi gian caây ñöôïc nuoâi caáy trong bình kín giuùp teá baøo
phaân chia, taêng sinh khoái moâ. Coù hai loaïi ñöôøng chuû yeáu
duøng trong nuoâi caáy moâ laø saccaroz vaø glucoz. Tuy nhieân
saccaroz ñöôïc duøng phoå bieán do deã tìm, giaù thaønh reõ,
noàng ñoä ñöôøng trong moâi tröôøng cuõng thay ñoåi tuøy
thuoäc loaïi caây, muïc ñích nuoâi caáy, tuy nhieân hieän nay söû
duïng thoâng duïng nhaát laø noàng ñoä töø 20 – 30 g/l.
Trong nuoâi caáy moâ quang töï döôõng do caây coù theå söû
duïng CO2 trong khoâng khí laøm nguoàn cacbon vaø töï toång
hôïp chaát höõu cô töø quaù trình quang hôïp neân trong moâi
tröôøng khoâng caàn söû duïng ñöôøng.
f) Caùc chaát höõu cô khaùc:
Coù nhieàu chaát höõu cô ñöôïc söû duïng trong caùc moâi
tröôøng nuoâi caáy moâ thöïc vaät. Ta coù theå chia thaønh 02
loaïi nhö sau:
- Loaïi coù thaønh phaàn xaùc ñònh: caùc chaát nhö caùc axit
amin nhö : myo-inositol, L-tyrozin, L-arginin, Casein
hydrolysate, Na2EDTA,…

Giaùo trình Nuoâi caáy moâ thöïc vaät Trang 12

Trung taâm ÖÙng duïng Tieán boä KH & CN Bình Ñònh Huyønh Xuaân
Tröôøng
- Loaïi coù thaønh phaàn khoâng xaùc ñònh nhö: nöôùc döøa,
nöôùc chieát naám men, dòch chieát khoai taây…
Caùc chaát naøy thöôøng ñöôïc theâm vaøo moâi tröôøng vôùi
muïc ñích öùc cheá caùc chaát tieát cuûa moâ thöïc vaäât
( phenol) hoaëc kích thích teá baøo, moâ sinh tröôûng, phaùt
trieån toát hôn.
2. Choïn löïa moâi tröôøng nuoâi caáy moâ thöïc vaät:
đÑeå khôûi ñaàu coâng vieäc nuoâi caáy moâ vôùi moät ñoái
töôïng cuï theå, thöôøng ngöôøi ta phaûi choïn moät neàn moâi
tröôøng nuoâi caáy cô baûn ñeå ñaët maãu vaøo ñaûm baûo cho
maãu sinh tröôûng vaø phaùt trieån theo yù muoán.
Ñeå xaùc ñònh moät moâi tröôøng nuoâi caáy cho moät ñoái
töôïng caùch thoâng thöôøng nhaát laø chuùng ta tìm hieåu trong
taøi lieäu caùc moâi tröôøng nuoâi caáy maø caùc nhaø nghieân
cöùu ñi tröôùc ñaõ söû treân ñoái töôïng ñoù, Bước đầu có thể giữ
nguyên môi trường của các tác giả đó hoặc trên cơ sở đó mà cải tiến cho phù hợp
qua một số thí nghiệm thăm dò.
Trong hàng trăm môi trường do rất nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại cây khác
nhau, nhiều mục đích nuôi cấy khác nhau, có thể chia ra làm ba loại:
- Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: điển hình là môi trường White, Knop
và Knudson C.
- Môi trường trung bình: điển hình là môi trường B5 của Gamborg.
- Môi trường giàu chất dinh dưỡng: Điển hình là môi trường Murashige-
Skoog và Linsmaier-Skoog.
Vì vậy, khi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô một số đối tượng mới, chưa có
tài liệu trước thì nên thăm dò so sánh ba loại môi trường trên xem đối tượng nghiên
cứu thích hợp với loại môi trường nào nhất. Sau đó, cần tìm tỷ lệ NO 3-/NH4+ thích
hợp. Việc sử dụng mang tính kinh nghiệm đối với một số môi trường đã cản trở khá
nhiều sự tiến bộ trong các nghiên cứu về nuôi cấy mô và tế bào thực vật.
Hiện nay, môi trường Murashige-Skoog được coi như là một môi trường thích
hợp với nhiều loại cây do giàu và cân bằng về chất dinh dưỡng. Vì vậy, những
người mới tập sự nuôi cấy mô thường bắt đầu với môi trường này trước khi tìm ra
được môi trường riêng của mình.
3. Pha cheá moâi tröôøng
a) Pha cheá dung dòch meï
Trong nuoâi caáy moâ thöïc vaät, töøng loaïi hoùa chaát ñöôïc
pha cheá rieâng reõ hoaëc toå hôïp thaønh caùc dung dòch coù
noàng ñoä cao gaáp 100 ÷ 1000 laàn noàng ñoä moâi tröôøng.
Dung dòch naøy goïi laø dung dòch meï, ñeå deã daøng trong
vieäc baûo quaûn vaø tieän lôïi cho vieäc pha cheá moâi tröôøng
nuoâi caáy.

Giaùo trình Nuoâi caáy moâ thöïc vaät Trang 13

Trung taâm ÖÙng duïng Tieán boä KH & CN Bình Ñònh Huyønh Xuaân
Tröôøng
Caùc dung dòch meï sau khi pha cheá, söû duïng toái ña trong
voøng 3 thaùng vaø ñöôïc baûo quaûn trong tuû laïnh, toát nhaát
neân söû duïng trong voøng 01 thaùng.
Coâng thöùc caùc dung dòch meï cuûa moâi tröôøng MS ( 1962)
1. Dung dòch M1 : ( hoøa tan trong 100 ml ) ( 10 ml/l)
KNO3 19 g
NH4NO3 16.5g
2. Dung dòch M2 : ( hoøa tan trong 100 ml ) ( 5 ml/l)
MgSO4.7H2O 7,4 g
KH2PO4 3,4 g
3. Dung dòch M3 : ( hoøa tan trong 100 ml ) ( 5 ml/l)
CaCl2.2H2O 8,8 g
4. Dung dòch M4 : ( hoøa tan trong 100 ml ) ( 5 ml/l)
NaH2PO4 3,4 g
5. Dung dòch M5: ( hoaø tan trong 100ml)( 5 ml/)
FeSO4.7H2O 0,556 g
Theâm 20 ml nöôùc caát ñun caùch thuûy ñeán tan
Na2EDTA 0,744 g
Theâm 20 ml nöôùc caát ñun caùch thuûy ñeán tan. cho dung
dòch Na2EDTA vaøo dung dòch FeSO4.7H2O theâm nöôùc caát
vöøa ñuû 100 ml.
6. Dung dòch 1 ( hoøa tan trong 100 ml ) ( 1ml/l)
a. MnSO4.4H2O 2,23 g
H3BO3 0,62 g
KI 0,083 g
ZnSO4.7H2O 0,86 g
( laàn löôït hoøa tan vaøo 50 ml nöôùc caát
theo thöù töï )
b. Na2MoO4.2H2O 0,025 g
( hoøa tan trong 20 ml nöôùc caát )
c. CuSO4.5H2O 0,25 g
( hoøa tan trong 100 ml nöôùc caát )
d. CoCl2.6H2O 0,25 g
( hoøa tan trong 100 ml nöôùc caát )
Huùt 1 ml dung dòch 1c vaø 1 ml dung dòch 1d ñoå chung vaøo
vôùi 2 dung dòch 1a vaø 1b. Theâm nöôùc caát cho ñeán 100 ml.
ñöôïc dung dòch 1.
7. Dung dòch 2: ( 100 ml dung dòch ) ( 1ml/l)
Glycin 200 mg
Nicotinic acid 50 mg
Thiamin HCl 100 mg
Pyridoxin HCl 50 mg
8. Dung dòch BA : ( 100 ml dung dòch )
BA 100 mg

Giaùo trình Nuoâi caáy moâ thöïc vaät Trang 14

Trung taâm ÖÙng duïng Tieán boä KH & CN Bình Ñònh Huyønh Xuaân
Tröôøng
Theâm 20 - 30 ml dung dòch HCl 0,1 N laéc ñeàu ñeán tan. Sau
ñoù theâm nöôùc caát cho ñuû 100 ml.
9. Dung dòch NAA ( 100 ml dung dòch )
NAA 100 mg
Theâm 20 - 30 ml coàn 98 laéc ñeàu ñeán tan. Sau ñoù theâm
o

nöôùc caát cho ñuû 100 ml. Coù theå duøng dung dòch NaOH 1N
ñeå pha thay cho coàn.
10. Dung dòch IBA ( 100 ml dung dòch )
IBA 100 mg
Theâm 20 - 30 ml coàn 98o laéc ñeàu ñeán tan. Sau ñoù theâm
nöôùc caát cho ñuû 100 ml. Coù theå duøng dung dòch NaOH 1N
ñeå pha thay cho coàn.
II. Pha cheá moâi tröôøng:
Töø caùc dung dòch meï laáy theå tích caàn cho soá lít dung
dòch laøm vieäc cuûa moãi loaïi caây.
Cho laàn löôït caùc dung dòch meï hoaëc hoaù chaát theo thöù
töï töø treân xuoáng vaøo coác thuûy tinh coù saün nöôùc caát,
khuaáy ñeàu. Sau moãi laàn ñeàu theâm 1 ít nöôùc caát ñeå
traùnh bò keát tuûa.
Sau khi theâm nöôùc döøa, ñöôøng vaø caùc thaønh phaàn
khaùc ( neáu coù ), tieáp tuïc theâm nöôùc caát cho ñuû theå tích
caàn thieát.
Ñieàu chænh pH cuûa dung dòch baèng HCl 1N hoaëc NaOH 1N
theo pH cuûa moâi tröôøng caàn pha.
Ñun soâi dung dòch ñaõ pha cheá theâm agar vöøa ñuû,
khuaáy ñeàu ñeán tan. ( Neáu söû duïng moâi tröôøng raén )
Phaân dung dòch ñaõ ñun vaøo caùc bình tam giaùc nuoâi
caáy, theå tích khoaûng 30 - 60 ml/l bình, ñaäy nuùt cao su. coät
giaáy laïi baèng daây thun chòu nhieät.
Haáp tieät truøng baèng noài aùp suaát ôû 1210C; 1,2 atm.
Laáy dung dòch ñaõ haáp tieät truøng ñöa vaøo phoøng thí
nghieäm, sau 2 - 3 ngaøy kieåm tra ñoä voâ truøng roài söû duïng
nuoâi caáy.

Giaùo trình Nuoâi caáy moâ thöïc vaät Trang 15