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13/12/2011 1
La Electroforesis Capilar (E.C.)
(E C ) incluye una familia de técnicas que
involucran una gradiente diferencial o de equilibrio, que están
basadas principalmente en los siguientes modos:
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Electroforesis Capilar
p de Zona
Este método,
é d que combina
b l cromatografía
la fí y la
l electroforesis
l f
capilar, permite la separación de moléculas no cargadas. Es
necesario añadir un elemento tensioactivo (dodecil sulfato sódico,
SDS) en concentraciones
t i l suficientemente
lo fi i t t grandes
d como para
que forme micelas.
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Partes principales del Sistema de Electroforesis
Capilar – Depósitos para el buffer en el cátodo y en el ánodo –
Electrodos – Sistema de inyección de la muestra – Detector – Fuente
de poder
El tubo capilar se llena con el buffer, se aplica un campo eléctrico
é
(voltaje hasta 30 kV), la muestra es inyectada por reemplazo de
uno de los depósitos del buffer por el vial de la muestra, se
i t d
introduce un volumen
l d fi id de
definido d ésta.
é t El detector
d t t es ubicado
bi d en
el sentido contrario al sitio de inyección.
• Un
U computador
t d conectado
t d all d
detector
t t permite
it la
l adquisición
d i i ió d de
datos y su interpretación.
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Instrumentación
Inyección de la muestra:
hidrostática – electromigración - por presión
Detección
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Evaluación de la ejecución del detector
Modos de detección
UV/Vis -Fluorescencia – Conductividad – Electroquímico –
espectrometría de masa
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- Para minimizar el calor de Joule seleccionar un contraión de baja
movilidad
Columna Capilar
Composición
Dimensiones
Acondicionamiento
Almacenamiento
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Sistema de Electroforesis Capilar en
condiciones normales
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Instrumentación
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Electroforesis
v = μe.E (1)
Donde
D d v= velocidad
l id d del
d l ion
i
μe = movilidad electroforética
E= Campo eléctrico aplicado
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μe α Fuerza eléctrica (FE)
(FE) (2)
Fuerza Friccional (FF)
FE = q . E (3 ) FF = - 6 π η r v
q . E = 6 π η r v (5)
Resolviendo
R l i d para lla velocidad
l id d y sustituyendo
i d lla ecuación
ió (5)
en la ecuación v= μe.E (1), tenemos la ecuación que describe
la movilidad.
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μe= q //6 π η r ((6))
μ
Alta movilidad: Especies pequeñas y altamente cargadas
Baja movilidad: Especies grandes y mínimamente cargadas
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Flujo electrosmótico (EOF)
· Longitud de capilar
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El EOF es importante sobre pH 4.
VEOF = (ε ζ / η) E (7)
μ EOF = (ε ζ / η) (8)
donde :
VEOF= velocidad
μ EOF = movilidad del EOF
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CE : Flujo de perfil plano ( dispersión)
Cromatografía : Flujo laminar o parabólico
Campo eléctrico
pH del buffer
Fuerza iónica o concentración del buffer
Temperatura
Modificaciones orgánicas
Surfactantes
· Polímeros hidrofílicos neutros
Recubrimiento covalente
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Parámetros
á Analíticos
í
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Movilidad aparente del analito :
μa = l/ t E = l L/tV (9)
Donde μa = μe + μEOF
V = voltaje aplicado
l = largo efectivo del capilar ( al detector)
L = largo total del capilar
t = tiempo de migración
E= Campo eléctrico
En p
presencia de EOF,, la medida de la movilidad se llama movilidad
aparente (μa). La μe puede ser obtenida de la μa. La movilidad del
EOF se puede medir en forma independiente, a través del uso de un
marcador neutro que se mueve a una velocidad igual al EOF.
Marcadores: acetona, dimethyl sulfoxide (DMSO) etc
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analito TM μa (cm2/Vs) μe (cm2/Vs)
catión 38 4
38,4 3 05* 10-3
3,05 7 40*10
7,40 10-4
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μa = l/ t E = l L/tV (9)
Donde μ μa = μ
μe + μEOF
μ
V = voltaje aplicado
l = largo efectivo del capilar ( al detector)
L = largo total del capilar
t = tiempo de migración
E= Campo eléctrico
N t
Neutro μEOF =(50*58,5)/(25.000*50,7)
(50*58 5)/(25 000*50 7) = 2,31*
2 31* 10-33
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Fuentes de amplitud de la zona:
a) Difusión longitudinal
-Define el límite fundamental de la eficiencia
b) Calor de Joule
-Permite una gradiente de temperatura y el flujo laminar
c) Longitud de la inyección
- Debería ser menor que la longitud de la zona controlada por
la difusión
d) Adsorción de la muestra
- Interacción
ó del
d l analito
l con las
l paredes
d d dell capilar
l
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a)) Electrodispersión
- Conductividades desiguales de la muestra y el buffer
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B ++ B B +++ + B
B + +++ B
+ ++ +
+ ++ +
Electrodispersión:
Electrodispersión:
- Formas del peak sesgadas
- Alta conductividad ( desenfoque) o baja conductividad de la muestra
( f
(enfoque) )
- Estados isotacoforéticos temporales, debido al exceso
de un ión determinado.
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Siistema Electrolito
Requerimientos básicos:
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Variables que afectan la eficiencia y selectividad que dependen de las
siguientes
i i t propiedades
i d d d dell b
buffer:
ff
* pH
* fuerza iónica
(la movilidad puede duplicarse si la fuerza iónica
es incrementada 4 veces)
puede provocar:
aumento de la temperatura, cambios en la viscosidad
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Buffers pK Rango
Borato HCl
Borato-HCl 9 14 (12
9,14 (12,73/13,8)
73/13 8) 8 0 9 1
8,0-9,1
TRIS 8 7,0-9,0
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Análisis Químico
- ¿Cuál es la composición de la muestra?
- ¿Cuál es la concentración de los componentes de una muestra?
→ Fortificar la muestra
→
→ Contrastar con otra técnica
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“tener presente los siguientes parámetros y procedimiento”
pH del buffer
Fuerza iónica
P t t
Pre-tratamiento
i t ddell capilar
il
Temperatura
Análisis cuantitativo:
área- altura
La Cx puede ser calculada por:
• estándar externo
• estándar interno
Validación: p
precisión,, exactitud,, linealidad,, límite de detección,,
límite de cuantificación, selectividad
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CE-MS aumenta la utilidad de la separación a través de CE. El
complemento con un espectrómetro de masa (MS) permite tener
una información segura del peso molecular de un analito y
también provee la información de su estructura que ayudan a la
identificación de compuestos. Sin embargo todavía la interfase de
las dos técnicas no es tan simple.
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Entonces se necesita un flujo de un líquido extra que debe ser
agregado al sistema de CE para obtener iones de los analitos en
fase gaseosa.
Por tanto la interfase es crítica para obtener resultados
eficientes en la separación a través de CE
CE--MS con una interfase
común..
común
CE MS sprayer (image
CE-MS (i courtesy
t off Agilent
A il T h l i )
Technologies)
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APLICACIONES
ANIONES
Hidróxido de dodecil-
dodecil-trimetilamonio; bromuro o hidróxido de
trimetilamonio
(TTAB o TTA-
TTA-OH), bromuro de cetil-
cetil-trimetilamonio (CTAB), Bromuro o
hidróxido de hexametonium, dietilentriamina.
Ejemplo 1:
, mM TTAB
electrolito: 5 mM cromato 0,5
I. Hidrodinámica
V= - 20 kV
254 nm 4 minutos
CATIONES
Metales de transición:
Separación
ó de:
Capilar 60 cmx 75 μm
Electrolito:
- creatinina 5 mM pH 4,4 con CH3COOH- ácido α- hidroxi
hidroxi--isobutírico
(HIBA) 6,5 mM
Ejemplo
j p 3.
C1--C7 alquilsulfonatos
C1
Capilar 60 cm x 75 μm –
10 mM benzoato, 0,5 mM NICE
NICE--pak OFM Anion BT, pH 6,0
Inyección Hidrotática
V= 20 kV a 254 nm tiempo de corrida = 5,5 min.
ESPECIES ORGANOMETÁLICAS
•Capilar 60x 75 μm
•Electrolito: NaH2PO4 a pH 9 ajustado con Na2B4O7 + SDS (sulfato
dodecil sódico)
•Toma de muestra: Hidrostática
• V: 18 kV ;
• L.onda: 214 nm
• tiempo = 14 minutos
Ejemplo 5 Enalapril
Capilar de 57(LD=50)
57(LD 50) cm x 75 μm
electrolito: – 80 mM Na2B4O7 pH 8,5 + 100 mM SDS
V= 16 kV LO=254 nm Tiempo= 4 minutos
Capilar de 100 cm x 75 μm
electrolito: 6 mM Na2B4O7 pH 8,5 + 50 mM SDS
Inyección hidrostática V= 30 kV 200 nm 4 minutos
COMPUESTOS NEUTROS
Hidrocarburos alifáticos o aromáticos no pueden ser separados
electroforéticamente
( Usar
U MEKC)
Herbicidas
Capilar
C il d de 50 cm x 75 μm – 10 mM M NaH
N H2PO4 pH
H 8,5
8 5 + 25 mM
M SDS
pH 8 Inyección hidrostática V= 10 kV 225 nm
10 minutos
AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS
Derivatización
Ejemplo 88. Aminoácido 23PTH
Capilar de 50(LD=30) cm x 50 μm
50 mM Na2B4O7 + NaH2PO4 -pH 9,0 + 100mM SDS
4,3 mM urea
Inyección hidrostática
V= 10,5 kV
Long.
g Onda 210 nm,, corrida 30 minutos
Ejemplo
j p 8 -7p proteínas
•Capilar = 100cm x 50 μm
electrolito 50 mM Na2B4O7 pH 9,5
•V
V 22 kV LO=
LO 200 nm Tiempo=14
Ti 14 mini
Después de cada corrida el capilar es lavado con NaOH 1 M y luego
con el buffer
Capilar 40 (Ld=20) x 50 μm
electrolito=Gel 75% en TRIS 50mM +50 mM ácido bórico + 7 mM urea
inyección electrocinética 1s,
4 kV; 260 nm 12 min