Estudio de la fragilidad osmótica de los hematíes

1. Fundamento:

El estudio de la fragilidad osmótica de los hematíes valora la resistencia de los

eritrocitos a soluciones de presión osmótica decreciente, en condiciones constantes de
pH y de temperatura. Para ello, se enfrentan los hematíes problema a soluciones
tamponadas de cloruro sódico cuya concentración es decreciente a partir de 9 gramos
por mil (soluciones hipotónicas).

Cuando los eritrocitos están en contacto con soluciones hipotónicas, penetra

agua a través de su membrana y se hinchan. Al hincharse los hematíes, una parte de la
hemoglobina que contienen puede salir al exterior a través de los poros de su
membrana. Si la entrada de líquido es excesiva, los hematíes se rompen y dejan libre
toda la Hb que engloban (hemólisis).

En condiciones normales, un eritrocito puede aceptar sin hemolizarse una

entrada de agua que incremente su volumen en un 70% como máximo.

Esta prueba evalúa por tanto la capacidad que tienen los glóbulos rojos de
soportar un incremento de su contenido acuoso (resistencia osmótica eritrocitaria o
ROE).

2. Material necesario:

 Pipetas Pasteur.
 Tubos de centrífuga iguales entre sí.
 Un reloj.
 Una centrífuga.
 Un espectrofotómetro.
 Cubetas de espectrofotómetro.
 Una gradilla.

3. Reactivos:

a) suero fisiológico, preferiblemente tamponado a pH fisiológico (7,4).

b) agua destilada.

4. Muestra:

Sangre venosa completa y adecuadamente anticoagulada. Se puede usar la

heparina, ya que otros anticoagulantes, como el oxalato y el citrato aportan unos iones
suplementarios al medio hipotónico, que pueden alterar la concentración salina de éste.

No debe haber pasado más de 2 horas desde la extracción de la sangre hasta su

utilización. En el caso de que la muestra se haya conservado a 4ºC, puede prolongarse
este tiempo a 6 horas.
 5. Técnica:

a) Preparar una batería de soluciones de cloruro sódico, a concentraciones

decrecientes, de la forma indicada a continuación:

Tubo número 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Gotas Agua 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
destilada
Gotas Suero 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
fisiológico
Concentración 9 8,5 8 7,5 7 6,5 6 5,5 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5
(g/l)

b) Añadir a cada tubo 1 gota (0,05ml = 50μl) de sangre completa. Esto ha de

hacerse de forma que la gota llegue a la solución de cloruro sódico sin que toque
la pared interna del tubo.

c) Agitar suavemente los tubos.

d) Dejar los tubos en reposo, al menos 30 minutos, a temperatura ambiente.

e) Centrifugar los tubos a 2.000 rpm durante 5 minutos. En vez de centrifugar

los tubos, también se pueden dejar simplemente en reposo, durante 3 horas.

6. Lectura de los resultados:

La lectura de los resultados puede ser visual o espectrofotométrica. En ambos

casos, lo que se valora es la presencia o la ausencia en los tubos de hemólisis.

Si la lectura es visual, se considera que no hay hemólisis cuando en el tubo se

observa un sedimento en forma de botón rojizo y un líquido sobrenadante incoloro y
transparente. Sin embargo, se estima que hay una hemólisis parcial cuando se advierte
la presencia de un botón sedimentario, pero que se acompaña de un sobrenadante rojizo
y transparente. Y, finalmente, se considera que la hemólisis es total cuando sólo se
aprecia la existencia de un líquido rojizo y transparente.

Para realizar la lectura espectrofotométrica, se recoge de forma separada el

líquido contenido en todos los tubos, y se mide la absorbancia (A) de cada uno de ellos,
en un espectrofotómetro ajustado a una longitud de onda de 540 nm.

El blanco utilizado consiste en el líquido presente en el tubo nº1, ya que se

supone que la hemólisis debe haber sido nula y, por tanto, que la A medida en él no ha
de ser valorada.

Los resultados espectrofotométricos de cada tubo se ofrecen en forma de

porcentaje (%) de hemólisis. Para ello se considera que la A medida en el líquido
procedente del tubo nº 18 corresponde a un 100% de hemólisis, ya que al haber sido
preparado con la solución más hipotónica, debe ser el más hemolizado. Por tanto, el
porcentaje de hemólisis que corresponde a cada tubo se calcula con la siguiente
fórmula:
 A
% de hemólisis = ------- x 100
AM
A = Absorbancia del líquido presente en el tubo analizado.
AM = Absorbancia del líquido contenido en el tubo nº 18 (A máxima).

Espectrofotométricamente, la ROE suele valorarse mediante la determinación de

la concentración de ClNa que se precisa para producir un 50% de hemólisis.

7. Interpretación clínica de los resultados obtenidos:

En condiciones normales, debe apreciarse visualmente una hemólisis parcial

clara a partir del tubo nº10 (el preparado con solución salina a 4,5 g/l) y una hemólisis
prácticamente total a nivel de los tubos 12, 13 o 14 (los que contienen, respectivamente,
solución salina a 3,5, 3 y 2,5 g/l)

Además, generalmente, el 50% de hemólisis se produce a nivel de los tubos 10 u

11 (los que contienen, respectivamente, solución salina a 4,5 y 4 g/l).

Cuando la ROE baja, aumenta la hemólisis en los tubos que contienen solución
salina a mayor concentración. Esto sucede en la esferocitosis hereditaria, en la
eliptocitosis u ovalocitosis congénita y en la estomatocitosis hereditaria, debido a que en
estas enfermedades la superficie de los hematíes está disminuida con respecto a su
volumen, por lo que éstos toleran peor la entrada de agua y tienen aumentada su
fragilidad osmótica.

Cuando la ROE sube, la aparición de la hemólisis se retarda y empieza a nivel de

tubos que contienen solución salina a una concentración menor que lo previsto. Esto
acontece con los reticulocitos y con los glóbulos rojos propios de la talasemia minor y
de la anemia ferropénica, debido a que estas células tienen incrementada su superficie
en relación a su volumen, por lo que toleran mejor la entrada de agua y tienen
disminuida su fragilidad osmótica.