LABORATORIO N° 2

TECNICAS DE OBSERVACIÓN DE BACTERIAS

YASMITH CORONADO WARNE

ELKIN ESMERAL PÉREZ
ANA CAROLINA RIVERA
YEIDY MEZA PÉREZ

TUTOR: ELKIN AGAMEZ RAMOS

FACULTAD DE EDUCACIÓN Y CIENCIAS HUMANAS

LIC. CIENCIAS NATURALES Y EDUCACIÓN AMBIENTAL
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA
SEDE SAHAGÚN
VI SEMESTRE
2018
 INTRODUCCIÓN
Las bacterias son microorganismos unicelulares procariotas, es decir, tienen su
material genético disperso en el citoplasma. Las células bacterianas presentan unas
estructuras constantes: pared celular, membrana citoplasmática, citoplasma y
material nuclear, y otras estructuras externas facultativas: fimbrias o pilis, flagelos y
capsula. A pesar de variar morfológicamente de una especie a otra, pueden
diferenciarse formas fundamentales en las bacterias: cocos (esférica), bacilos
(cilíndrica recta), y espirilos (cilíndrica curvada). Adicional a esto, al dividirse, las
células pueden quedar unidas o próximas unas a otra dando origen a agrupaciones
típicas que ayudan a su estudio morfológico. Los cocos se agrupan en parejas
(diplococos), en cadenas más o menos largas (streptococos), en racimos
(estafilococos) y en tétradas o paquetes cúbicos (micrococos; los bacilos se agrupan
en parejas (diplobacilos), raramente en cadenas (streptobacilos), en empalizada,
los espirilos no suelen agruparse, pero suelen distinguirse formas con una sola
curvatura semejantes a una coma (vibrios) y con varias curvaturas y aspecto
ondulado (campilobacterias).

La mayoría de las bacterias pueden visualizarse al microscopio óptico, bien

directamente o tras tinciones con colorantes apropiados.

Los objetivos del presente son determinar la presencia de bacterias y clasificarlas

según sus características, en muestras de origen natural (yogurt, vinagre, frotis
bucal), entre otras con la ayuda de técnicas básicas de tinción para aumentar el
contraste entre las células y el medio para así facilitar su visualización.
 OBJETIVOS
 Utilizar correctamente las partes del microscopio
 Diferenciar con base en la aplicación de esta técnica las bacterias Gram
positivas de las Gram negativas.
 Conocer los diferentes campos de aplicación de esta técnica
 Aplicar la técnica con diferentes reactivos observando los resultados y
diferencias.
 Observar la morfología bacteriana y aprender a distinguir los distintos tipos
de agrupaciones que existen.
 Practicar con el microscopio al máximo aumento y con el correcto empleo del
aceite de inmersión
 EQUIPOS Y MATERIALES

 Frasco gotero con agua destilada

 Frasco gotero con lugol
 Microscopio compuesto
 Porta y Cubre objetos
 Asa bacteriológica
 Mechero de alcohol
 Cristal violeta solución acuosa (1%)
 Sulfato de cobre (solución al 20%)
 Cultivo de Staphylococcus aureus y E. coli
 Solución salina isotónica
 Tapabocas y polainas, bata manga larga, Guantes descartables
 Yogurt con cultivos probióticos
 Papel secante
 Vinagre de plátano
 Cristal violeta
 Alcohol acetona
 Azul de metileno
 Tinta china
 Solución de safranina
 Aceite de inmersión
 Puente de coloración
 Encendedor
 TEORIA RELACIONADA

TÉCNICAS DE OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS

El examen microscópico es el primer paso para el

estudio de las muestras microbiológicas. Es un
examen orientativo que nos proporciona datos como la
presencia de bacterias, su morfología, movilidad y
características tintoriales y estructurales. Los
microorganismos obtenidos a partir de una muestra
clínica pueden verse vivos o muertos, aunque para la
investigación de algunas características biológicas
como la movilidad, es necesario observarlos vivos.

Las técnicas de observación microscópica de

microorganismos pueden dividirse en:

A. Examen en fresco (preparaciones sin teñir)

 preparación entre porta y cubre

B. Examen de preparaciones coloreadas:

 tinciones

EXAMEN DE PREPARACIONES COLOREADAS

Las técnicas de coloración permiten la observación morfológica con un mejor

contraste que en el examen en fresco, así como la observación de estructuras
celulares.

COLORACIÓN O TINCIÓNES DE MICROORGANISMOS:

 Permite diferenciar distintos tipos morfológicos

 Establecer una información complementaria sobre sus estructuras internas y/o
externas.
 Conocer sus características tintoriales orientándonos hacia un grupo taxonómico
para la clasificación de las bacterias.
 La tinción consiste en cubrir la preparación con uno o varios colorantes de forma
secuencial durante un tiempo determinado.
 La adición de un colorante a un frotis sin enfriar puede provocar la precipitación
del colorante y la visualización de artefactos que pueden confundirnos en el
proceso de observación al microscopio.
 Tras la tinción, la preparación se lava con agua, procurando que el chorro no
caiga con fuerza sobre la preparación y finalmente se seca al aire o mediante
absorción con papel.

El examen microscópico de preparaciones teñidas tiene una serie de pasos

comunes previos a la tinción, que son:

Preparación del frotis:

 La extensión del material sobre el portaobjetos se

hará de diferentes formas, en función de la procedencia
del producto a examinar. Si el producto es líquido, se
depositará una pequeña (muy pequeña) cantidad de
material en el centro del porta, extendiéndolo con el asa
hasta conseguir una capa fina y homogénea.
 Si la extensión debe hacerse a partir de un cultivo en medio sólido, la colonia
que vayamos a estudiar se mezclará con una gotita de agua destilada estéril
colocada en el centro del porta. Conviene recordar que no es necesario depositar
una gran cantidad de producto, pues se dificultaría la visualización, y que un
exceso de agua solo contribuye a aumentar el tiempo en secar la preparación
 Por último, si el producto se ha recogido con una torunda (exudados) debe
extenderse directamente sobre el portaobjetos, procurando que el algodón
"ruede", en vez de "frotar" el porta; de esta manera se consigue preservar mejor
los elementos celulares que pudiesen acompañar a las bacterias, a la vez que
se conserva la agrupación de éstas, en caso de que la hubiere.
Secado:

 Una vez efectuada la extensión del frotis debemos dejar secar al aire la
preparación.
 Cuando la preparación está seca, la superficie del frotis pasa de ser brillante a
mate.
 El secado se puede acelerar calentando ligeramente la parte inferior del porta.

Fijado:

 El último paso antes de proceder a la tinción es la

fijación de la preparación al portaobjetos,
mediante la coagulación rápida de las proteínas
citoplasmáticas. Con esto conseguimos que el
producto adherido al portaobjetos no sea
eliminado, ni vea alteradas sus características
morfológicas y estructurales en los
procedimientos de tinción posteriores.
 La fijación puede hacerse por calor suave, pasando el porta sobre una llama o
mediante la utilización de placas calefactoras especiales a 37ºC.
 Tras la fijación por calor es muy importante esperar a que la preparación se
enfríe antes de proceder a realizar cualquier procedimiento de tinción.
 Si el material que vamos a teñir puede poseer abundante material celular
(leucocitos, células epiteliales, etc.) que conviene visualizar también, es
preferible recurrir al alcohol metílico para fijar la preparación.
 Una vez cubierta de alcohol la preparación, se deja actuar durante un minuto,
eliminando después el exceso y dejando secar a temperatura ambiente.
 FACTORES QUE AFECTAN LAS TECNICAS DE TINCIÓN

Las técnicas de coloración constituyen una práctica diaria en el laboratorio de

microbiología por los cuales se deberá considerar una serie de factores que puedan
alteras los resultados de los mismos. Así pues, los principales factores son:
 Pureza del colorante: a mayor grado de impurezas mayor error y menor calidad
de tinción.
 Concentración del colorante: a mayor concentración mayor error en la tinción;
igual que a menor concentración.
 El pH del colorante: este es un factor fundamental ya que depende de las
estructuras que se desee observar para elegir el pH adecuado.
 Conservación del colorante: se debe conservarse en lugares frescos, secos,
y obscuros; envasados y etiquetados.
 Técnica Empleada: se deberá seguir rigurosamente paso a paso cada técnica
de tinción.
 Temperatura: en la mayoría de los casos se utiliza la temperatura ambiental,
pero si existe algunas técnicas que requieran de temperatura adecuada.
 Cantidad de la muestra: deberá ser representativa y homogénea pero no muy
grande.
 Realizar correctamente el frotis: se debe fijarse bien para que cuando se les
añada los colorantes mordientes y decolorantes no arrastren a los
microorganismos que se desee observar.
 Soluciones mordientes: en ciertos casos son necesarios ya que actúan como
fijadores y ayudan a la fijación del colorante a las correspondientes estructuras.
 Tiempos de Tinción: es necesario que todas las sustancias se mantengan en
la preparación un tiempo preciso y variable según la tinción. (Obando Patricia).
COLORANTES
La mayoría de los colorantes son derivados de la Anilina, están compuestos
generalmente, por uno o más anillos bencénicos por uniones químicas bien
definidas (Cromóforos) que están asociadas a la producción del color. Cómo no se
conoce el mecanismo básico del desarrollo del color, es posible que ciertos
radicales químicos tengan la propiedad de absorber luz de diferentes longitudes de
onda, actuando como prismas químicos; algunos de estos grupos cromóforos más
comunes de los colorantes son: C=C, C=O, C=S, C=N, N=N, N=O y NO2. La
intensidad de coloración de un colorante es directamente proporcional al número de
radicales cromóforos de los compuestos. Los colorantes se clasifican en base a los
cromóforos presentes, se designan como ACIDOS o BASICOS, términos
relacionados no con el pH, sino una porción significativa de la molécula si es
anionica o catiónica. Los colorantes básicos tiñen estructuras de naturaleza ácida,
como la cromatina nuclear de las células, los colorantes ácidos, reaccionan con
sustancias básicas tales como: las estructuras citoplasmáticas. De acuerdo a su
composición pueden ser simples o compuestos: los simples son aquellos que se
disuelven en agua o alcohol; los compuestos son los formados por varios colorantes
y soluciones como el Colorante de GRAM.
COLORACION DE GRAM: composición, fundamento, utilidad y técnica de
laboratorio.
COMPOSICIÖN: Está constituido por: Cristal Violeta: colorante primario o básico,
que se une a la pared celular bacteriana. (color azul o violeta); lugol: solución de
yodo, utilizado como mordiente, el cual facilita la adhesión del cristal violeta a la
pared celular; alcohol acetona: decolorante; safranina o fucsina de gram:
colorante secundario, que imparte una coloración de contraste o contracolor (color
rojo o rosado).
 TIPOS DE TINCIONES BACTERINAS

TINCION SIMPLE
Se basa en la afinidad del colorante por
los componentes celulares. La tinción
puede ser uniforme o presentar algunos
gránulos en su interior. Utiliza un solo
colorante (azul de metileno, violeta de
genciana, fuscina diluida). La tinción
simple se utiliza para destacar el microorganismo completo para que se vean las
formas y las estructuras celulares básicas. En las tinciones simples se usa un único
reactivo, que preferentemente es de tipo básico y contiene un cromógeno
(compuesto que da color al tinte) con carga positiva, ya que la pared celular de las
bacterias posee componentes con carga negativa que atraen y enlazan el
cromógeno. Se utilizan solamente para incrementar el contraste; todas las células
absorberán el colorante y quedarán teñidas del mismo color. Por tanto, la tinción
simple mejora la observación de la célula completa.

TINCION NEGATIVA
Es una técnica que permite contrastar las
muestras mediante una sustancia opaca a
los fotones (microscopía óptica) o a los
electrones (microscopía electrónica). Este
método de tinción utiliza colorantes neutros
o ácidos ya que tienen poca afinidad por la
célula bacteriana.
La tinción negativa facilita las observaciones
de la morfología y tamaño de las bacterias,
así como la observación de la cápsula en
algunas especies bacterianas. La cápsula
es una estructura superficial mucosa, más o menos gruesa que envuelve la pared
celular formada por polisacáridos o polipéptidos, que confiere protección a las
bacterias contra la desecación y la fagocitosis. A consecuencia de su elevado
contenido en agua, se tiñen débilmente por los colorantes.

TINCIONES DIFERENCIALES
Consisten en aplicar una combinación de colorantes, mordentes y decolorantes que
permiten poner de manifiesto alguna diferencia importante en la composición de los
microorganismos. De este modo, se pueden distinguir microorganismos que aun
cuando tengan igual morfología, presenten diferencias en su composición química.
Las dos tinciones diferenciales más importantes que se aplican en bacteriología son
la de Gram y la de Ziehl Neelsen. Usando cualquiera de éstas es posible clasificar
a las bacterias por lo menos en dos categorías ya que las células resultarían
positivas o negativas con respecto a la tinción empleada.
Las tinciones diferenciales presentan las siguientes características:
 Se necesita de fijación previa generalmente por calor.
 se utilizan dos colorantes siendo el ultimo colorante el de contraste
 Nos permite visualizar su morfología otras características como puede ser la
composición de la pared bacteriana. Dentro de las tinciones diferenciales
tenemos:
Tinción de Gram: también conocida como
coloración de Gram, es una técnica de
laboratorio que se utiliza rutinariamente en los
estudios microbiológicos de las bacterias. Fue
diseñada por Christian Gram, un científico
danés, en el año 1884. El objetivo de Gram era
conseguir una prueba con la que fuera posible
diferenciar diferentes grupos de bacterias para
así poder estudiarlas y clasificarlas. La prueba
resultó todo un éxito y pronto se convirtió en
una técnica muy útil no solo para el estudio de
las bacterias, sino también para poder identificarlas rápidamente en una
infección y seleccionar el antibiótico más adecuado para tratarla. Es el método
más empleado en bacteriología gracias a esta tinción las bacterias se pueden
clasificar en dos grandes Grupos (Gram+, Gram-). La técnica se basa en aplicar
una serie de colorantes a una muestra de cualquier origen que supuestamente
contenga bacterias no identificadas. Los colorantes tiñen la pared de las
bacterias de color morado y, tras unos minutos, se realiza un lavado del
colorante. Después de eso puede que el colorante permanezca en la pared
bacteriana o que se haya ido. En el primer caso permanecería el color morado,
y se trataría de bacterias Gram positivas y, en el segundo, la pared tendría un
color rosado, y serían Gram negativas.
 PROCEDIMIENTO
Realizar los siguientes procedimientos de acuerdo con las muestras biológicas
indicadas por el docente.

1. TINCIÓN DE GRAM:
Para Escherichia Coli.

Tomar un porta
Agregar una muestra Extender la muestra y
objetos y agregarle
de E.Coli, fijar.
una gota de solución
homogenizar.
isotónica.

Teñir:
decolorar con alcohol- con cristal violeta
Agregar lugol (1 min)
acetona y lavar con (1min) y lavar la
y lavar la muestra.
h20. muestra.

Agregar safranina por Colocar la placa sobre Secar con el secador

1 minuto y lavar. el papel absorvente.

Montar el
Realizar las
microscopio en
respectivas
4x,agregar aceite de Obsevar
anotaciones de las
inmersión para luego
imagenes observadas.
enfocarlo en 100x.
PARA STAPHYLOCOCCUS

Tomar un porta Esterilizar el asa y

objetos y agregarle agregar una muestra Extender la muestra y
una gota de solución de Staphylococcus y fijar.
isotónica. homogenizar.

Teñir:
decolorar con alcohol- con cristal violeta
Agregar lugol (1 min)
acetona y lavar con (1min) y lavar la
y lavar la muestra.
h20. muestra.

Agregar safranina por Colocar la placa sobre Secar con el secador

1 minuto y lavar. el papel absorvente.

Montar el
Realizar las
microscopio en
respectivas
4x,agregar aceite de Obsevar
anotaciones de las
inmersión para luego
imagenes observadas.
enfocarlo en 100x.
2. TINCIÓN SIMPLE:
(VINAGRE)

Tomar un porta Agregar unas gotas de

objetos y agregarle la muestra de vinagre Extender la muestra y
una gota de solución de plátano y fijar.
isotónica. homogenizar.

Teñir:
Observar al
Explicar las microscopío con Con azul de metileno,
observaciones. obejetivos de 4X y por 1 minuto, lavar
100X. con H2O y secarla
muestra

Realizar el mismo procedimiento con: Yogurt con cultivos prebióticos (Sólido y

liquido), Sarro Dental y Cultivo Bacteriano.

3. TINCIÓN NEGATIVA:

Tomar un porta Esterilizar el asa y Agregar una gota de

objetos y agregarle agregar el cultivo tinta china a un ladito
una gota de solución bacteriano. del porta objetos.
isotónica.

Observar al
Tomar un porta
microscopio y Secar la muetra con el
objetos y expandir la
explicar las secador.
muestra.
observaciones.
 ANALISIS Y RESULTADOS
1. TINCIÓN DE GRAM: Para Escherichia Coli.

Inicialmente tomamos un porta objetos y le agregamos una gota de solución

isotónica, luego esterilizamos el asa bacteriológica y la dejamos enfriar,
seguidamente tomamos una muestra del cultivo bacteriano (Escherichia Coli) con
mucha precaución, la extendimos por todo el porta objetos y la fijamos con la ayuda
del mechero. Después teñimos la muestra inicialmente con cristal violeta por un
minuto, para luego lavarla con agua, posteriormente le agregamos lugol, esperamos
un minuto y lavamos con agua, seguidamente con mucho cuidado decoloramos la
laminilla con alcohol-acetona hasta que el color azul se tornará en celeste claro,
luego aplicamos la solución de safranina por un minuto, lavamos con agua y
secamos la laminilla con papel filtro, por ultimo secamos bien la muestra con la
ayuda de un secador y llevamos al microscopio.
En las variaciones de esta
técnica podemos decir que en la
tinción inicial las células se tiñen
con cristal violeta el cual es el
colorante primario, y por ende
todas las células se tiñen de
morado, seguidamente al
adicionar lugol que reacciona
con el cristal violeta y forma el
complejo cristal violeta y las
células aún continúan de morado, pero luego se adiciona un solvente no polar el
cual actúa lavando el complejo formando de las células Gram negativas. De esta
manera q las gram positivas continúan moradas ya que se deshidratan las paredes
celulares y se contraen los poros, por lo tanto el complejo cristal violeta no sale de
las célula, mientras que las gram negativas quedan incoloras debido a la
eliminación por extracción de grasas de las paredes celulares, por lo que aumenta
la porosidad y el complejo cristal violeta se separa se separa de la célula, por lo
tanto se vuelve a teñir con safranina de manera que las que habían sido decoloradas
(gram negativas) se tiñen de color fucsia, en tanto las bacterias gram positivas no
se afectan con la contratincion por lo tanto permanecen moradas.
La observación microscópica, con la ayuda del aceite de inmersión en el objetivo de
100X fue la siguiente:

Escherichia Coli. 100X Staphylococcus Aereus100X

Los resultados en esta experiencia muestran efectivamente como las bacterias

Gram negativas (Escherichia coli ) en forma de bacilos de diferentes formas y
colonias como estreptobacilos y dibacilos, en la muestra se pueden notar algunos
vibrios, los cuales se tiñeron de color fucsia, mientras que las bacterias Gram
positivas(Staphylococcus aureus) en forma de cocos se lograron diferenciar
colonias de estafilococos, de manera separadas y esparcidas por toda la muestra,
tornándose de color violeta. Con lo anterior podemos notar que ambos tipos de
bacterias se tiñeron de manera diferente debido a las características que
constituyen la pared celular, evidenciando que las Gram negativas poseen una capa
delgada de peptidoglicano (mureina) junto con la abundancia de lípidos en la
membrana externa de la pared celular que incrementan la porosidad y por ello,
contribuyen a la pérdida del colorante fundamental después de la decoloración con
alcohol. Es decir, la membrana externa es soluble en solventes orgánicos como el
alcohol y la capa de peptidoglicano es demasiado delgada como para retener el
complejo cristal violeta se formó, por lo que va perdiéndose el color azul-violeta y
forma el color fucsia.

Mientras que las Gram positivas poseen una capa gruesa de peptidoglicano con
abundantes entrecruzamientos lo que parece contribuir a la retención del colorante
fundamental, cristal violeta, es decir que no tienen su capa susceptible a la acción
de solventes orgánicos, se deshidratan los poros y se cierran, por lo tanto, se retiene
el complejo cristal violeta y por consiguiente el color azul-violeta.

2. TINCIÓN SIMPLE: (VINAGRE)

Primeramente, tómanos un porta objetos y le agregamos una gota de solución

isotónica, adicionamos varias gotas de Vinagre de plátano y homogenizamos.
Seguidamente extendimos toda la muestra y la fijamos con la ayuda del mechero
de alcohol. Una vez seca la muestra procedimos a teñirla con azul de metileno por
un minuto, pasado este tiempo lavamos la muestra con agua y la secamos.
Nuestros resultados son los siguientes:
4X 100X
Como bien sabemos el vinagre es una solución acuosa rica en ácido acético
resultante de la fermentación espontánea del vino o de bebidas alcohólicas de baja
graduación. La acetificación del vino es producida por bacterias aeróbicas del ácido
acético, principalmente Acetobacter aceti, aunque también Gluconobacter. Gracias
a esta técnica pudimos observar la estructura y la forma de algunas bacterias tales
como: estreptococos, estafilococos, diplococos, espiroquetas y bacilos rectos con
flagelos polares. Podemos decir que las bacterias del vinagre se caracterizan por
su habilidad de convertir el alcohol (etanol) en ácido acético en presencia de aire.
Hay muchas especies en este género (Acetobacter) y también otras bacterias son
capaces de formar ácido acético bajo varias condiciones; pero todas son
reconocidas por esta habilidad característica.

OBSERVACIONES DEL YOGURT

YOGURT LIQUIDO YOGURT SOLIDO:

Podemos decir que durante este procedimiento tras fijar la muestra y dejarla secar,
en el microscopio se logran observar bacterias con dos tipos de morfología, pues
se ven cocos y bacilos. Las primeras se observaron en filamentos organizados en
forma de cadena. se trataba de varios cocos unidos entre sí a lo largo de un eje, y
las segundas se observaron solas o formando diplo bacilos, pues estaban dos
unidas o próximas entre sí.
Estas bacterias fueron visibles debido a que sólo dos tipos de bacterias son las
encargadas de la fermentación para obtener yogur, Streptococcus thermophilus y
Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricum. Gracias a estas bacterias, que se
encuentran activas en el producto final, la lactosa de la leche se transforma en ácido
láctico. Ahora bien, la característica que hace Streptococcus thermophilus sean
parte fundamental en la fabricación del yogur es que son facultativas, es decir,
pueden desarrollar un metabolismo aerobio o anaerobio. En este concreto caso las,
Streptococcus thermophilus de acuerdo con Bartow (2010) desarrollan un
metabolismo anaerobio mediante el cual fermentan el piruvato en ácido láctico y
acetaldehído, además al ser homofermentativa la mayoría de los productos
formados con la síntesis de piruvato serán lácticos.

OBSERVACIONES DEL SARRO BUCAL:

Se puede decir que el sarro dental es un depósito consistente y adherente localizado

sobre el esmalte de los dientes. Está constituido principalmente por restos proteicos,
sales minerales y bacterias junto con sus productos metabólicos. La flora bacteriana
de la cavidad bucal es muy variable dependiendo de las condiciones que se den en
el momento de hacer la preparación, en esta experiencia logramos observar gran
variedad de morfologías: espiroquetas, cocobacilos, diplococos y bacilos.
OBSERVACIONES DEL CULTIVO BACTERIANO: (E,COLI)

Logramos observar que las morfologías para este tipo de bacterias eran en forma
de bacilos con organización de diplobacilos y algunas streptobacilos. Estas
bacterias pueden multiplicarse tanto en condiciones aerobias como anaerobias y
son fácilmente cultivables en medios nutritivos sencillos. Catabolizan glucosa,
lactosa y otros azúcares, mientras que no pueden utilizar urea ni citratos. No se
forma hidrógeno sulfúrico. El rango de crecimiento se sitúa entre 4 y 46ºC. Al igual
que las restantes entero bacterias, las colibacterias son resistentes a las sustancias
tensioactivas.

3. TINCIÓN NEGATIVA:
Para iniciar tomamos un porta objetos y le agregamos una gota de solución
isotónica, seguidamente esterilizamos el asa bacteriológica, lo dejamos enfriar y
tomamos con mucho cuidado una muestra del cultivo bacteriano, luego en un
extremo de la laminilla agregamos una gota de tinta china, que posteriormente
extendimos con la ayuda de un porta objetos, y finalmente secamos la muestra para
llevarla al microscopio para hacer sus respectivas observaciones.
Con el objetivo de 100X observamos lo siguiente:
En esta preparación selectiva pudimos apreciar que la tinción negativa de cápsulas
es una tinción estructural, ya que pone de manifiesto las cápsulas y no tiñe los
microorganismos. Tiñe el fondo de color negruzco y permite ver los
microorganismos sin colorear sobre dicho fondo. Las caracteristicas dinamicas de
las capsulas no permiten que se tiñan concolorantes basicos como el cristal de
violeta o safranina, por tal razón se empleó una tinción negativa con tinta china. La
tinta china es un colorante compuesto por particulas finas de carbono suspendidas
en agua formandose un coloide, las particulas son demasiadas grandes para
penetrar a traves de la matriz de la capsula, motivo por el cual, solo se tiñe el medio
circundante, las celulas se mostraron sin teñir sobre un fondo decolor negro.

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

1. Explique porque las bacterias Gram negativas se tiñen de rosado a

diferencia de las Gram positivas (morado) siendo el procedimiento de tinción
el mismo
R/: Las bacterias Gram
negativas se tiñen de rosado
porque pierden un colorante (el
cristal violeta) con mayor
facilidad. La razón es la menor
cantidad de mucopéptido de las
paredes de las bacterias Gram
negativas. En realidad, la
diferencia de color no es específica de la pared bacteriana: todas las células sin
pared (como las animales) pierden fácilmente el cristal violeta (se verán de color
rosa). Todas las células con pared gruesa (como las de hongos) se verán de color
violeta. La correlación entre el color y el tipo de pared solo tiene sentido con células
bacterianas (salvo excepciones).
2. Cuál es el propósito de flamear la muestra.
R/: Se flamea la muestra para fijarla y mejorar su visión al momento de observarla
en el microscopio.

3. Cómo argumenta usted la presencia de bacterias en el yogurt

R/: Las bacterias ácido-lácticas se han empleado para fermentar o crear cultivos de
alimentos, su uso más corriente se ha aplicado en todo el mundo a los productos
lácteos fermentados, como el yogur, es por esto que pudimos observarlas en el
microscopio tomando una muestra de yogurt. La acción de estas bacterias
desencadena un proceso microbiano por el cual la lactosa (el azúcar de la leche) se
transforma en ácido láctico. A medida que el ácido se acumula, la estructura de las
proteínas de la leche va modificándose (van cuajando), y lo mismo ocurre con la
textura del producto.

PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS

1.Qué diferencias existe entre un desinfectante y un antiséptico.

R/: la diferencia que existe entre desinfectante y un antiséptico es que los

desinfectantes son sustancias que se emplean para destruir los microorganismos o
inhibir su desarrollo, y que ejercen su acción sobre una superficie inerte u objeto
inanimado. Los antisépticos son sustancias que se aplican sobre tejidos con vida,
con el objeto de matar o impedir el desarrollo de los microorganismos.

2. En qué consiste el proceso de esterilización y la importancia de este.

R/: el proceso de esterilización es la eliminación completa de toda forma de vida

microbiana de objetos inanimados, incluyendo esporas. Puede conseguirse a
través de métodos físicos, químicos o gaseosos y térmicos:

Métodos químicos
Los métodos químicos de esterilización son aquellos que involucran el empleo de
sustancias letales para los microorganismos, tales como el óxido de etileno y el
peróxido de hidrógeno. El uso de este método es muy limitado para la Industria
Alimentaria pero muy utilizado en otras industrias como la farmacéutica.

Métodos físicos

Los métodos físicos son aquellos que no involucran el empleo de sustancias letales
para los microorganismos, sino procedimientos físicos como la radiación ionizante,
el calor o la filtración de soluciones con membranas que impiden el paso de
microorganismos, incluyendo virus. El método más usado en esta categoría es el
calor que mata microorganismos por la desnaturalización de las enzimas; el cambio
resultante en la forma tridimensional de las proteínas las inactiva. La resistencia al
calor varía entre los diferentes microorganismos; esta diferencia puede ser
expresada como el punto térmico de muerte (PTM) el cual se define como la
temperatura más baja a la cual todos los microorganismos en una suspensión
líquida serán eliminados en 10 minutos.

Otro factor que debe ser considerado en una esterilización es el tiempo requerido.
Este puede expresarse como el tiempo de muerte térmica (TMT), el cual es el tiempo
mínimo para que toda bacteria en un cultivo líquido en particular sea exterminada a
una temperatura determinada.

Ambos PTM y TMT son guías útiles que indican la severidad del tratamiento
requerido para matar a una población de bacterias dada. El tiempo de reducción
decimal (TRD, o valor D) es el tercer concepto relacionado con la resistencia
bacteriana al calor. TRD es el tiempo, en minutos, en el cual el 90 % de una
población bacteriana a cierta temperatura será eliminada los tratamientos, térmicos
en resumen, son métodos para conservar los alimentos.

Métodos térmicos

Los métodos térmicos suelen englobar todos los procedimientos que tienen entre
sus fines la destrucción de los microorganismos por el calor. Los métodos son tanto
la pasteurización como la esterilización, cuya finalidad principal es la destrucción
microbiana, como al escaldado y a la cocción, procesos en los que también se
consigue una cierta reducción de la flora microbiana, pero que sus objetivos
principales son la variación de las propiedades físicas.

Su importancia radica en que evita que el ser humano conviva o se infecte de

microorganismos nocivos para su salud.

3. Explique la importancia de la pasteurización de la leche

R/: la pasteurización de la leche es importante porque previene enfermedades,

porque durante el proceso de pasteurización es posible eliminar microorganismos
patógenos existentes en los lácteos y sus derivados.

4. ¿qué dificultades se tendría si no se adiciona la safranina al final de la

tinción?

R/: si no se adiciona safranina al final de la tinción las bacterias Gran negativas no

se teñirían de rosado.

5. Explique el fundamento de la tinción negativa realizada en la práctica. ¿Qué

tipo de información se obtiene?

R/: Con la tinción negativa lo que se tiñe es el medio, el colorante no penetra porque
tiene carga negativa. En este caso las células no están coloreadas. La imagen es
similar a las del campo oscuro, que se ven objetos más pequeños, la morfología
externa, los apéndices, etc. La Tinción negativa es un modo satisfactorio de
aumentar el contraste de las células en la microscopia óptica, pero su máxima
utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células
bacterianas. Se usa in colorante sin afinidad a las células ya sea tinta china,
formando una estructura coloidal con el medio, y no se pegan a las células.
6. Investigue otra técnica de tinción selectiva que permita observar estas
estructuras bacterianas.

R/: Otra técnica de tinción selectiva que permita observar las estructuras
bacterianas son la tinción ácido alcohol resistente (Ziehl – Noelsen); se usa para
determinar la presencia de bacterias de los géneros Mycobacterium y Nocardia. Se
basa en la resistencia de estas bacterias a ser decoloradas con una mezcla ácido-
alcohol, se debe a la alta concentración de lípidos de su pared, ácidos micólicos.

7. Realiza una lista de bacterias que sinteticen cápsulas.

R/: bacterias que sinteticen capsulas:

 Neumococos
 Streptococcus
 Xhantomonas
 Corynebacterium
 CONCLUSIÓN

Durante este experimento pudimos observar las diferentes formas que tienen las
bacterias, logramos clasificar distintos tipos de microrganismos y sus estructuras a
través de la afinidad del colorante cristal violeta, también se logró aprender a realizar
algunos de los métodos que existen para cultivar bacterias y de esta manera
observar sus características tanto macroscópicas como microscópicas e
interpretación de las mismas, con lo que se observó que para cada bacteria existen
características diferentes que son las que las identifican y diferencian de otras
bacterias, por lo que de esta manera se le puede llegar a identificar con su correcta
siembra y observación para análisis posteriores o simplemente para la identificación
de una bacteria en algún medio u organismo.

Por otro lado, los microorganismos deben ser manejados con precaución y
alrededor de la llama por su potencial patogenicidad y para observar las
preparaciones en el microscopio óptico siempre tenemos que realizar de forma
correcta todos los pasos para tener un buen enfoque de nuestra muestra.

Aunque las bacterias aparecen en medios similares difieren mucho químicamente,

esta diferencia química es lo que permite distinguirlas por Tinción pues
generalmente el colorante reacciona con la célula bacteriana pero no reacciona con
su medio exterior, tanto las bacterias Gram positivas como las Bacterias Gram
negativas se presentan morfológicamente como cocos o bacilos, sin embargo al
ejecutar tinción de Gram en estas para identificar su grupo taxonómico, las Gram
positivas se tiñen de color violeta mientras que las Gram negativas se tiñen de color
rosado.
 REFERENTES BIBLIOGRAFICOS
 Microbiología. 2ª Edición. Roger Y. Stanier, John L. Ingraham, Mark L. Wheelis,
Page R. Pantier.
 http://www.bibliotecagbs.com/archivos/033_036_CAP3_GBS.pdf
 http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf
 http://www.telmeds.org/wp-content/uploads/2016/11/Tinciones-en-
Microbiolog%C3%ADa.pdf
 http://www.biorigenes.com/que-es-la-pasteurizacion/
 http://www.biologia.edu.ar/bacterias/micro4.htm
 http://academic.uprm.edu/~lrios/3725/Ejercicio4.pdf
 http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/MorfologiayEstructuraBacteriana.pdf
 Brock Biología de los Microorganismos 10ª Edición. Michael T. Madigan, John
M. Martinko, Jack Parker.
 Microbiología. 5ª Edición. Prescott, Harley, Klein.