FACULTAD DE INGENIERIA DE PROCESOS

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

CURSO: ANALISIS DE ALIMENTOS

TEMA: LA UTILIZACION DE LAS ENZIMAS EN EL ANALISIS DE

LOS ALIMENTOS

DOCENTE: QCO. MAGNOLIA ZUÑIGA OLAGUIBEL

ALUMNA:

 CARBAJAL MORA IVONNE MILAGROS……………...............131975

QUILLABAMBA-LA CONVENCION-CUSCO
2017
 1. INTRODUCCION

Las enzimas son catalizadores proteicos que son capaces de una especificidad y una

reactividad muy grande bajo condiciones fisiológicas. El análisis enzimático en la

determinación de los compuestos con la ayuda de las enzimas añadidos o la medida de la

actividad de las enzimas endógenas para dar una indicación del estado de un sistema

biológico, incluidos los alimentos. El hecho de que la catálisis enzimática pueda tener lugar

bajo condiciones relativamente suaves, permite la medida de compuestos relativamente

inestables, no susceptibles de ser estudiados por medio de algunas de las otras técnicas.

Además, la especificidad de las reacciones enzimáticas puede permitir la medida de los

componentes de las mezclas complejas, sin los costes de tiempo y el gasto económico de las

complicadas técnicas de separación cromatografías.

Hay varias aplicaciones para los análisis enzimáticos en la ciencia y la tecnología de los

alimentos. En algunos casos, la actividad enzimática es una medida útil del procesado

adecuado de un producto alimentario. La estabilidad térmica de las enzimas ha sido utilizada

extensamente como una medida del tratamiento térmico; por ejemplo, la actividad de la

peroxidasa se utiliza como una medida de la adecuación del escaldado de las verduras y las

hortalizas. Los ensayos de actividad de las enzimas son utilizados también por los etnólogos

de los alimentos para valorar la potencia de las preparaciones enzimáticas utilizadas como

ayudas al procesado.

Para medir los componentes de los alimentos que sean sustratos enzimáticos, el científico

de los alimentos puede utilizar también los preparados de enzimas disponibles

comercialmente. Por ejemplo, el contenido de glucosa puede ser determinado en una matriz

alimentaria compleja que contenga otros monosacáridos, utilizando enzimas fácilmente

disponibles. Un uso evidente de las enzimas disponibles comercialmente es medir el

contenido de inhibidores enzimáticos presentes en un alimento en función de la actividad

enzimática. Los insecticidas organofosforados son potentes inhibidores de la enzima

acetilcolinesterasa y, por consiguiente, la actividad de dicha enzima en presencia de un

extracto alimentario es una medida de la concentración de insecticidas organofosforados en el

alimento. Igualmente de interés es la medida de la actividad enzimática asociada con la

calidad alimentaria. Por ejemplo, la actividad de la catalasa se ve marcadamente aumentada

en la leche procedente de ubres mastíticas. La actividad de la catalasa también es paralela al

recuento bacteriano en la leche. Otro de los usos de los ensayos enzimáticos para determinar

la calidad de los alimentos es la estimación del valor nutritivo de las proteínas, por medio del

seguimiento de la actividad de proteasas añadidas a la muestra de proteínas alimentarias. Las

enzimas se pueden utilizar para medir la aparición de productos de degradación, tales como

la trimetilamina en el pescado, en el transcurso del almacenamiento. También se utilizan las

enzimas como herramientas preparativas en el análisis de los alimentos. Los ejemplos de este

último incluye la utilización de las amilasas y las proteasas en el análisis de la fibra y la

hidrolisis enzimática de ésteres fosfatos de la tiamina en el análisis de las vitaminas.

Para llevar a cabo con éxito los análisis enzimáticos, es necesario la compresión de ciertos

principios básicos de la enzimología. Después de una breve visión de conjunto de estos

fundamentos, se examinan ejemplos de la utilización de los análisis enzimáticos en los

sistemas alimentarios.
 2. LOS FUNDAMENTOS

2.1. La Cinética De Las Reacciones Enzimáticas

2.1.1. Una Visión De Conjunto

Las enzimas son catalizadores biológicos que son proteínas. Un catalizador

aumenta la velocidad de una reacción termodinámicamente posible. La enzima no

modifica la constante de equilibrio de la reacción y el catalizador no se consume en la

reacción. Puesto que las enzimas afectan a las velocidades de las reacciones para el

científico de los alimentos resultan necesarios algunos conocimientos sobre la cinética (el

estudio de las velocidades) de las reacciones enzimáticas, para utilizar de un modo

eficiente las enzimas en el análisis. Típicamente para medir la velocidad de una reacción

catalizada por enzimas, se mezcla la enzima con el sustrato bajo condiciones especificadas

(de pH, temperatura fuerza iónica, etc.) si se sigue la reacción midiendo la cantidad de

producto que se forma, o bien la de sustrato consumido considere lo siguiente como una

representación sencilla de una reacción catalizada por enzimas:

𝑆 + 𝐸 ↔ 𝐸𝑆 → 𝑃 + 𝐸 [1]

Donde:
S = sustrato
E = enzima
ES = complejo enzima-sustrato
P = producto

Figura 1: La Evolucion Temporal Para Una

Tipica Reaccion Catalizada Por Enzimas, Mostrando
Los Periodos Pre-Esatcionarios Y Estacionario.
P= Concentracion Del Producto
 La evolución temporal de una reacción enzimática se ilustra en la figura 1. La

formación del complejo enzima-sustrato es muy rápida, y normalmente, no se llega a

observar en el laboratorio. El breve lapso de tiempo en el cual se forma inicialmente el

complejo enzima-sustrato se encuentra en la escala de los milisegundos y se conoce como

el periodo de inducción (o periodo pre-estacionario). La pendiente de la porción lineal de

la curva que sigue al periodo de inducción nos proporciona la velocidad inicial (vₒ).

Después del periodo de inducción, existe un periodo estacionario, durante el cual la

concentración del complejo enzima-sustrato se mantiene constante. La evolución temporal

debe ser establecida experimentalmente utilizando bien sea una serie de puntos, o bien un

ensayo continuo para establecer el intervalo de tiempos apropiados para la medida de la

velocidad inicial.

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑑𝑒 𝑆𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 ([𝑆]/𝐾𝑚)

Figura 2: El efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de una reacción

catalizada por enzimas. Representada gráficamente conforme a la ecuación de Michaelis-Menten.

La velocidad de una reacción catalizada por enzimas depende de la concentración

de la enzima y del sustrato. Con una concentración dada de la enzima, una concentración

creciente del sustrato tendrá como resultado un aumento de la velocidad (véase Figura 2).

Conforme la concentración del sustrato se incrementa más aun, el aumento en la velocidad

 se desacelera hasta que, con una concentración muy grande el sustrato, ya no se observa

un mayor aumento dela velocidad. La velocidad de la reacción a esta, muy grande,

concentración del sustrato es la velocidad máxima (Vm) de la reacción, najo las

condiciones de ese ensayo particular. La concentración de sustrato a la cual se observa la

mitad de Vm se define como la constante de Michaelis o Km. La constante Km es una

característica importante de una enzima. Es una manifestación de la afinidad de la unión

relativa de la enzima por un sustrato en particular. Cuanto menor es la constante Km,

tanto mayor es la afinidad de la enzima por el sustrato.

𝐾 𝐾2
𝑆 + 𝐸 ↔𝐾1−1 𝐸𝑆 → 𝑃 + 𝐸 [2]

Dónde:

𝐾1 , 𝐾−1 , 𝐾2 = constantes de velocidad de reacción, para las reacciones

indicadas.

En el estado estacionario, la velocidad de variación de la concentración del complejo

enzima-sustrato es cero:

𝑑[𝐸𝑆]/𝑑𝑡 = 0

Y:

Velocidad de consumo de 𝐸𝑆 = 𝐾−1 [𝐸𝑆] + 𝐾2 [𝐸𝑆] [3]

Velocidad de formación de 𝐸𝑆 = 𝐾1 [𝐸][𝑆] [4]

Luego :

𝐾1 [𝐸][𝑆] = 𝐾−1 [𝐸𝑆] + 𝐾2 [𝐸𝑆] [5]

[𝐸0 ] = [𝐸] + [𝐸𝑆] [6]

Donde:

𝐸0 = cantidad total de enzima

E = enzima libre

ES = complejo enzima- sustrato

 Despejando y sustituyendo,

[𝐸] = [𝐸0 ] − [𝐸𝑆] [7]

𝐾1 ([𝐸0 ] − [𝐸𝑆]) [𝑆] = 𝐾−1 [𝐸𝑆] + 𝐾2 [𝐸𝑆]

= (𝐾−1 + 𝐾2 )[𝐸𝑆] [8]

Reorganizando y despejando la concentración [𝐸𝑆]:

𝐾1 [𝐸0 ][𝑆]
[𝐸𝑆] =
𝐾1 [𝑆] + (𝐾−1 + 𝐾2 )

[𝐸0 ][𝑆]
= [9]
(𝐾−1 + 𝐾2 )/𝐾1 + [𝑆]

Si el conjunto de constantes de velocidad del denominador se define como la constante

de Michaelis (Km):

(𝐾−1 + 𝐾2 )
𝐾𝑚 = [10]
𝐾1

Obsérvese que la constante Km no se ve afectada ni por la concentración de la enzima

ni por la del sustrato. Entonces:

[𝐸0 ][𝑆]
[𝐸𝑆] = [11]
𝐾𝑚 + [𝑆]

Si definimos la velocidad (Vo) de la reacción catalizada por enzimas como:

𝑉𝑜 = 𝐾2 [𝐸𝑆] [12]

Entonces:

𝐾2 [𝐸0 ][𝑆]
𝑉𝑜 = [13]
𝐾𝑚 + [𝑆]

Cuando toda la enzima se encuentra saturado (todas las posiciones de unión de la

enzima al sustrato se encuentran ocupadas), a grandes concentraciones de sustrato en la

Figura 2, alcanzamos la velocidad max. Vm: la totalidad de la enzima añadido, 𝐸0 , se halla en

la forma ES y

𝐾2 [𝐸𝑆] = 𝐾2 [𝐸0 ], 𝑝𝑎𝑟𝑎 [𝑆] ≫ 𝐾𝑚 [14]

𝑉𝑚[𝑆]
𝑉𝑜 = [15]
𝐾𝑚 + [𝑆]

Esta es la ecuación de Michaelis-Menten, la ecuación para una hipérbola equilátera;

los datos representados en la Figura 2 se ajustan a una ecuación de este tipo. Una manera

conveniente de verificar esta ecuación es, sencillamente, recordar que Vo = ½ Vm cuando

[𝑆]= Km. Por consiguiente, por simple sustitución:

1 𝑉𝑚𝐾𝑚 𝑉𝑚
𝑉𝑚 = = [16]
2 𝐾𝑚 + 𝐾𝑚 2

2.1.2. El orden de las reacciones

La velocidad de una reacción catalizada por enzimas aumenta conforme aumenta la

concentración del sustrato (véase la Figura 2). En la región de la curva donde la

concentración del sustrato es pequeña ([𝑆] ≪ 𝐾𝑚) se cumple una reacción de primer orden

con respecto a la concentración de sustrato. Esto significa que, en esta región, la velocidad de

la reacción es directamente proporcional a la concentración de sustrato. Cuando se

incrementa más allá la concentración de sustrato, la velocidad de la reacción ya no aumenta

linealmente, y la reacción es de orden mixto. Esto se aprecia en la figura como la porción

curvilínea de la representación gráfica. Si la concentración de sustrato se aumenta aún más,

la velocidad se aproxima asintóticamente a la velocidad máxima (Vm). En esta porción lineal

de la gráfica, de pendiente casi nula, la velocidad es independiente de la concentración de

sustrato. Observe, no obstante, que a altas concentraciones de sustrato ([S] >> Km), la

velocidad es directamente proporcional a la concentración de enzima (Vm = 𝐾2 [Eo]). De

esta manera, en esta porción de la curva donde [S] >> Km, la velocidad de la reacción es de

orden cero con respecto a la concentración de sustrato (es independiente de la concentración

de sustrato), aunque de primer orden con respecto a la concentración de enzima.

Si estuviésemos interesados en medir la cantidad de enzima en una mezcla de

reacción, deberíamos trabajar, si fuese posible, a concentraciones de sustrato tales que la

velocidad observada se aproxime a Vm. A dichas concentraciones de sustrato, el enzima

está limitando directamente la velocidad hasta la observada. Por el contrario, si estuviésemos

interesados en medir la concentración de sustrato, mediante la determinación de la

velocidad inicial, debemos situarnos en concentraciones de sustrato inferiores a Km con el

fin de asegurar una velocidad de reacción directamente proporcional a la concentración de

sustrato.

2.1.3. La determinación de la constante de Michaelis (Km) y de la velocidad máxima

(Vm)

Para diseñar correctamente un experimento en el cual la velocidad sea de orden cero

con respecto al sustrato y de primer orden con respecto a la concentración de enzima o, por el

contrario, un experimento en el cual nos gustaría medir velocidades de reacción que sean

directa- mente proporcionales a la concentración de sustrato, debemos conocer la constante

Km. El método más popular para la determinación del valor de Km es la representación

gráfica de Lineweaver Burk, La inversa de la ecuación de Michaelis Menten es:

1 𝐾𝑚 1
= + [17]
𝑉𝑜 𝑉𝑜[𝑆] 𝑉𝑚

Esta ecuación es la de una línea recta, y = mx + b, donde m es la pendiente y b es

la ordenada en el origen.

Una representación gráfica de la concentración de sustrato frente la velocidad inicial,

como la mostrada en la Figura 2, se puede transformar a una forma lineal a través del uso de

la Ecuación recíproca [17] y se obtiene como resultado la Figura 3 (una representación

gráfica de Lineweaver Burk). La intersección de los datos representados con el eje de

ordenadas y (vertical) es 1/ Vm, mientras que la intersección con el eje de abscisas X

(horizontal) es -1/Km. La pendiente de la recta es Km/Vm. Por consiguiente, utilizando

este método se pueden obtener ambos valores: Km y Vm.

Un inconveniente de la representación gráfica de Lineweaver-Burk es que los datos

con los errores inherentes más grandes, recogidos para concentraciones muy bajas de sustrato

y, en consecuencia, para velocidades de reacción bajas, tienden a dictar el trazado de la

recta de mejor ajuste. Un método alternativo para la representación gráfica de los datos es el

método de Eadíe-Hofstee. Se puede reorganizar la ecuación de Michaelis-Menten para dar:

𝑉𝑜 𝐾𝑚
𝑉𝑜 = 𝑉𝑚 − [18]
[𝑆]

La ecuación [18) es, igualmente, la ecuación de una línea recta y cuando se

representa Vo frente a Vo/(S], la pendiente de la recta es -Km, la ordenada en el origen es

Figura 3: Una Representación Gráfica De Los Datos Sustrato-Velocidad Mediante

El Método Lineweaver-Burk
Vm y la intersección con el eje x es Vm/Km. Por medio de este método se consigue un

espaciado más uniforme de los datos que con la representación gráfica de Lineweaver-Burk.
 2.2. Los Factores Que Afectan A La Velocidad De La Reacciones Enzimáticas

La velocidad de tina reacción catalizada por enzimas viene afectada por una serie

de factores, que incluyen las concentraciones del enzima y del sustrato, la temperatura, el pH,

la fuerza iónica y la presencia de inhibidores y activadores.

2.2.1. El efecto de la concentración de enzima

La velocidad de una reacción catalizada por enzimas dependerá de la concentración

de enzima en la mezcla de reacción. La correlación esperada entre la actividad enzimática

y la concentración de enzima se muestra en la Figura 14. Doblar la concentración del

enzima, doblará la velocidad de la reacción. Si fuese posible, la determinación de la

actividad enzimática se debería llevar a cabo a concentraciones de sustrato mucho mayores

que Km. Bajo estas condiciones, existe una dependencia de orden cero de la velocidad con

respecto a la concentración de sustrato y una relación de primer orden entre la velocidad y

la concentración del enzima. Es crítico que la concentración de sustrato sea saturada durante

la totalidad del periodo en el que se está muestreando la mezcla de reacción y que la cantidad

medida del producto formado o de sustrato consumido sea lineal a lo largo del periodo

durante el cual se toman muestras de la reacción. La actividad del enzima se obtiene como

la pen- diente de la parte lineal de la curva de una representación gráfica de la concentración

de producto o de sustrato frente al tiempo.

Figura 4: El Efecto Esperado De

La Concentración De Enzima Sobre La
Velocidad Observada De Una Reacción
Catalizada Por Enzimas
 Con frecuencia, si se ha de ensayar un gran número de muestras, se toma una única

alícuota a un único tiempo. Esto puede ser arriesgado y solamente dará resultados buenos si

el tiempo al cual se toma la muestra queda en la porción lineal de una representación gráfica

de la concentración de sustrato o la concentración de producto frente al tiempo de reacción

(véase la Figura 5). La representación gráfica se convierte en no lineal si la concentración

de sustrato desciende por debajo de la concentración necesaria para saturar el enzima, si

el aumento en la concentración de producto ocasiona una proporción significativa de la

reacción inversa o si el enzima pierde actividad en el transcurso del ensayo. Normalmente,

se diseña un experimento en el cual la concentración del enzima se estima de tal manera

que no más del 5-10% del sustrato haya sido convertido a pro-ducto, dentro del tiempo

consumido para medir la velocidad inicial. En el ejemplo mostrado en la Figura 5, al

muestrear en un único punto, a, se produce una subestimación de la velocidad de reacción

para las curvas número 3 y número 4. Un método mejor para estimar las velocidades de

reacción es medir las velocidades inicia-les de las reacciones: en este método el cambio en la

concentración del sustrato o del producto se determina a tiempos tan próximos al tiempo cero

como sea posible. Esto se muestra en la Figura 16-5 mediante las líneas continuas trazadas

tangentes a los tramos iniciales de las curvas. La pendiente de la recta tangente proporciona la

velocidad inicial.

Figura 5: El efecto de la concentración de enzima

sobre el transcurso de una reacción catalizada por enzimas.
Las curvas de trazos son los datos determinados
experimentalmente para concentraciones de enzima crecientes,
desde el número 1 hasta la número 4. Las líneas continuas son
las tangentes trazadas a partir de las pendientes iniciales de los
datos experimentales. Si para la recogida de datos se hace uso
de un único instante de tiempo, α, se aprecia una diferencia
grande entre los datos recogidos en realidad y los predichos
a partir de las velocidades iniciales.

𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜
 Algunas veces no es posible llevar a cabo los análisis enzimáticos a concentraciones

[S] » Km. El sustrato puede ser muy caro o relativamente insoluble, o bien Km puede ser

grande (es decir, Km > 100 mM). La concentración de enzima también puede ser estimada a

concentraciones de sustrato mucho menores que Km. Cuando la concentración de sustrato es

mucho menor que Km, se puede despreciar el término del sustrato en el denominador de la

ecuación de Michaelis-Menten y V= Vm[S]lKm, que es la ecuación para una reacción de

primer orden con respecto a la concentración de sustrato. Bajo estas condiciones, una

representación gráfica de la concentración del producto frente al tiempo da una gráfica no

lineal (véase la Figura 6). Una representación gráfica de log ([So]/[S]) frente al tiempo genera

una correlación lineal (véase la representación gráfica que se muestra en el ángulo inferior

derecho de la Figura 6). La pendiente de la curva de la representación gráfica del logaritmo es

directamente proporcional a la concentración del enzima. Cuando la pendiente de una serie de

estas gráficas logarítmicas se representa, a su vez, como una función de la concentración del

enzima, debería obtenerse una correlación lineal. Si fuese posible, se debería seguir la

reacción de forma continua o bien se deberían retirar alícuotas a intervalos de tiempo

frecuentes, y se debería dejar que la reacción progrese hasta más allá de un 10% de la

reacción completa.

2.2.2. El efecto de la concentración del sustrato

En la Figura 2 se muestra la correlación entre la concentración de sustrato y la

velocidad para una reacción catalizada por enzimas, en la cual la concentración de enzima es

constante. Como se ha señalado anterior-mente, la velocidad de la reacción es de primer orden

con respecto a la concentración de sustrato cuando [S] « Km. A concentraciones [S] » Km, la

reacción es de orden cero con respecto a la concentración de sustrato y de primer orden con

respecto a la concentración [E]. A concentraciones de sustrato intermedias entre las regiones

de primer orden y de orden cero, la reacción catalizada por enzimas es de orden mixto con
respecto a la concentración de sustrato. No obstante, cuando se determinan las velocidades de

reacción iniciales, se debería apreciar una correlación lineal entre Vo y Eo.

Figura 6: La concentración del producto formado [V} en función del tiempo, para una
reacción catalizada por enzimas. La curva número 1 es una línea recta, indicando una reacción de
orden cero con respecto a la concentración de sustrato [S]. La pendiente de la curva número 1 es
directamente proporcional a la concentración de enzima. La curva número 2 no es una línea recta.
Una nueva representación gráfica (ángulo inferior derecho de la figura) de los datos de la curva
número 2, representando log ([Sol/[S]), sí es una línea recta, lo que indica que la reacción es de
primer orden con respecto a la concentración de sustrato. La pendiente de la nueva representación
gráfica es directamente proporcional a la concentración del enzima.

2.2.3. Los efectos del entorno

2.2.3.1. El efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática

La temperatura puede afectar de varias maneras a la actividad enzirnática observada.

La más obvia es que la temperatura puede afectar a la estabilidad del enzima y también a la

velocidad de la reacción catalizada por enzimas. Otros factores de las reacciones catalizadas

por enzimas que se podrían tornar en consideración incluyen el efecto de la temperatura sobre

la solubilidad de los gases, que sean o bien productos o bien sustratos de la reacción

estudiada, y el efecto de la temperatura sobre el pH del sistema. Un buen ejemplo de esto

último es la especie química amortiguadora de uso común Tris, [tris (hidroximetil)

aminometano], para la cual el p𝐾𝑎 cambia en 0,031 por cada cambio en 1 °C. La temperatura

afecta tanto a la estabilidad como a la actividad del enzima, como se muestra en la Figura 7. A

temperaturas relativamente bajas, el enzima es estable. Sin embargo, a temperaturas más

elevadas, domina la desnaturalización y se observa una actividad enzimática marcadamente

reducida, representada por la porción de pendiente negativa de la curva número 2. La línea

número 1 de la Figura 7 muestra el efecto de la temperatura sobre la velocidad de la reacción

catalizada por enzimas. Cabe esperar que la velocidad aumente conforme se incrementa la

temperatura. Tal y como muestra la línea número 1, la velocidad aproximadamente se duplica

por cada 10°C de ascenso en la temperatura. El efecto neto del aumento de la temperatura

sobre la velocidad de la transformación del sustrato en producto (curva número 1) y sobre la

velocidad de desnaturalización de los enzimas (curva número 3) es la curva número 2 de la

Figura 7. El óptimo de temperatura para el enzima es el punto máximo de la curva número 2.

La temperatura óptima no es una característica propia del enzima. Por el contrario, el óptimo

corresponde a la totalidad del sistema puesto que el tipo de sustrato, el pH, la concentración

de las sales, la concentración de sustrato y el tiempo de reacción pueden afectar al óptimo

observado. Por este motivo, los investigadores deberían describir completa-mente los sistemas

para los cuales se comunique los efectos de la temperatura sobre la actividad enzimática.

Figura 7: El efecto de la temperatura

sobre la velocidad de una reacción catalizada
por enzimas. El efecto de la temperatura
sobre la transformación de sustrato en
producto se muestra mediante la curva
número 1. La curva número 3 muestra el
efecto de la temperatura sobre la velocidad
de desnaturalización del enzima (el eje de
ordenadas del lado derecho es para la curva
número 3). El efecto neto de la temperatura
sobre la velocidad de reacción observada
está representado por la curva número 2 y el
óptimo de temperatura se encuentra en el
máximo de la curva número 2.
 Los datos de la curva número 2 de la Figura 16-7 se pueden representar gráficamente

de acuerdo con la ecuación de Arrhenius:

𝑘 = 𝐴𝑒 −𝐸𝑎/𝑅𝑇 [19]

La cual puede ser reescrita como:

Ea
log 𝑘 = log 𝐴 − [20]
2.3𝑅𝑇

Donde:

k = una constante de velocidad dada, a cierta temperatura, T (en K)

Ea = la energía de activación, la cantidad mínima de energía que una molécula de reactivo

debe poseer para ser transformada en producto

R = la constante de los gases perfectos

A = el factor de frecuencia (o factor pre exponencial)

La curva de pendiente positiva en la parte izquierda (la de alta temperatura) de la

representación gráfica de Arrhenius (véase la Figura 8) da una medida de la energía de

activación (Ea) para la desnaturalización del enzima. Observe que un pequeño cambio en la

tempera-tura provoca un efecto muy grande sobre la velocidad de desnaturalización. La

pendiente de la parte derecha de la Figura 8 da una medida de la energía Ea para la

transformación del sustrato en producto, catalizada por el enzima. Si el experimento se lleva a

cabo bajo las condiciones ([S] » Km) en las cuales se mide Vm, entonces la energía de

activación observada será la correspondiente a la etapa catalítica de la reacción.

2.2.3.2. El efecto del pH sobre la actividad enzimática

La velocidad observada de una reacción catalizada por enzimas se ve grandemente

afectada por el pH del medio. Los enzimas presentan valores de pH óptimos y, comúnmente,

muestran curvas con forma de campana para la representación de la actividad frente al pH

(véase la Figura 9). Este efecto del pH es una manifestación de los efectos del pH sobre la

estabilidad de los enzimas y sobre la velocidad de transformación del sustrato en el producto,

y también se puede deber a los cambios en la ionización del sustrato.

Figura 8: El efecto de la temperatura

sobre la constante de velocidad de una reacción
catolizada por enzimas. Los datos se
representan gráficamente como 2,3 log k frente
a 1 /T (K) de acuerdo con la ecuación de
Arrhenius, 𝑘 = 𝐴𝑒 −𝐸𝑎/𝑅𝑇

La velocidad de la transformación del sustrato en el producto se ve afectada por el pH

porque el pH puede afectar a la unión del sustrato al enzima y a la ionización de grupos

catalíticos tales como los grupos carboxilos o aminos que forman parte del centro activo del

enzima.

También la estabilidad de la estructura terciaria o cuaternaria de los enzimas depende del

pH y afecta a la velocidad de la reacción enzimática, especialmente a valores del pH

extremos, ácidos o alcalinos. El valor del pH para la máxima estabilidad de un enzima no

coincide necesariamente con el valor del pH para la máxima actividad de ese mismo enzima.

Por ejemplo, los enzimas proteolíticos tripsina y quimotripsina son estables a pH 3, mientras

que presentan su máxima actividad a valores del pH de entre 7 y 8.

 Figura 9: Una curva típica de la
velocidad frente al pH, para una reacción
catolizada por enzimas. El máximo de la
curva es el óptimo para el sistema y puede
variar con la temperatura, el sustrato en
concreto y el origen de la enzima.

Para establecer el pH óptimo para una reacción enzimática, se amortigua la mezcla de

reacción a valores del pH distinto y se determina la actividad del enzima. Para determinar las

relaciones entre el pH y la estabilidad enzimática, se amortiguan alícuotas del enzima a

diferentes valores del pH y se mantienen durante un periodo de tiempo especificada (por

ejemplo, 1 hora). A continuación, se ajusta el pH de las alícuotas al pH óptimo y se ensaya

cada una de las alícuotas. De esta manera se obtiene el efecto del pH sobre la estabilidad de

los enzimas. Estos estudios son de gran ayuda a la hora de establecer las condiciones para

manejar el enzima y también pueden ser útiles para establecer métodos para controlar la

actividad enzimática en un sistema alimentario. Observe que la estabilidad frente al pH y el

pH óptimo para la actividad enzimática no son verdaderas constantes. Es decir, éstas pueden

variar con las fuentes concretas del enzima, el sustrato rato específico utilizado, la

temperatura del experimento o incluso las especies químicas amortiguadoras utilizadas en el

experimento. En la utilización de enzimas para el análisis, no es necesario que la reacción se

lleve a cabo en el pH óptimo para la actividad, ni siquiera al pH en el cual el enzima sea más

estable, aunque es crítico mantener un pH fijo durante la reacción (es decir, utilizar una

disolución amortiguadora) y utilizar el mismo pH en todos los estudios que se vayan a

comparar.
2.2.4. Los activadores y los inhibidores

2.2.4.1. Los activadores Algunos enzimas contienen, además de una porción proteica,

pequeñas moléculas que son activadores del enzima. Algunos enzimas muestran

una necesidad absoluta por un ion inorgánico en particular para su actividad,

mientras que otros muestran una actividad incrementada cuando se incluyen

pequeñas moléculas en el medio de reacción. Dichas moléculas pequeñas pueden

desempeñar un papel en el mantenimiento de la conformación de la proteína, o

pueden formar un componente esencial- del centro activo o pueden formar parte

del sustrato del enzima.

En algunos casos, el activador forma una asociación casi irreversible con el

enzima. Estas porciones no proteicas de la enzima se conocen como grupos

prostéticos.

La cantidad formada de complejo enzima-activador es igual a la cantidad de

activador presente en la mezcla. En estos casos, la concentración del activador

puede ser estimada hasta concentraciones iguales a la concentración total de

enzima midiendo, sencillamente, la actividad enzimática.

En la mayoría de los casos, las constantes de disociación para un complejo

enzima-activador se encuentran dentro del rango de la concentración de la enzima.

Las partes no proteicas disociables de las enzimas se clasifican como coenzimas.

Cuando se añade a una enzima este tipo de activador, se obtiene una correlación

curvilínea semejante a una representación gráfica de Michaelis-Menten, haciendo

difícil la determinación de una cantidad desconocida de activador. Se puede

construir una representación gráfica recíproca, similar a una gráfica de

Lineweaver-Burk, utilizando patrones y, a partir de una gráfica tal, se puede

estimar concentraciones desconocidas de activador.

 Un ejemplo de un activador esencial es la coenzima piridinico 𝑁𝐴𝐷 + . El

𝑁𝐴𝐷 + es esencial para la oxidación de alcohol a acetalaldehido por medio del

alcohol-deshidrogenasa:

alcohol−deshidrogenasa acetalaldehido
𝑒𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙 + 𝑁𝐴𝐷 + ⇔ + 𝑁𝐴𝐷+ + 𝐻+ [21]

En esta reacción, el 𝑁𝐴𝐷 + es reducida a NADH y puede ser considerado como

un segundo sustrato. Otro ejemplo de un activador de una enzima es el ion cloruro

para las α-amilasas. En este caso, la α-amilasas presenta cierta actividad en

ausencia del cloruro. Con niveles de cloruros próximos a la saturación, la actividad

de la α-amilasa aumenta, aproximadamente, cuatro veces. Otros aniones, incluidos

el 𝐹 − , 𝐵𝑟 − y el 𝐼 − , activan también la α-amilasa. Estos aniones no deben estar

presentes en la mezcla de reaccion si se ha de utilizar la estimulación de la α-

amilasa como un método para determinar la concentración del cloruro.

2.2.4.2. Los inhibidores Un inhibidor enzimático es un compuesto que, cuando se

encuentra presente en el medio de una reaccion catalizada por enzimas, disminuye

la actividad enzimática. Los inhibidores irreversibles o reversibles. Los inhibidores

enzimáticos incluyen iones orgánicos, tales como 𝑃𝑏 2+ o el 𝐻𝑔2+ , que pueden

reaccionar con los grupos sulfhidrilos en las enzimas para desactivar la enzima,

compuestos que se asemejan al sustrato y proteínas de presencia natural que se

unen específicamente a las enzimas (tales como los inhibidores de la proteasa

encontrados en las legumbres).

 Los inhibidores irreversibles. Cuando la constante de disociación del

complejo inhibidor-enzima es muy pequeña, la disminución observada en la

actividad enzimática será directamente proporcional a la cantidad de inhibidor

añadida. La velocidad a la cual reacciona la combinación irreversible de la

 enzima con el inhibidor puede ser lenta y se debe determinar el efecto del

tiempo sobre la reducción de la actividad enzimática causada por la adición

del inhibidor, para garantizar así una reacción enzima- inhibidor completa.

Por ejemplo, para estimar con exactitud el contenido en inhibidor, el

inhibidor de la amilasa encontrado en muchas legumbres debe ser

preincubado con la amilasa, bajo condiciones especificadas, con antelación a

la medida (1).

 Los inhibidores reversibles. La mayoría de los inhibidores muestran un

constante de disociación tal que tanto la enzima como el inhibidor se

encuentran libres en la mezcla de reacción. Se conoce varios tipos de

inhibidores reversibles: los competitivos y los no competitivos y los

anticompetitivos.

Habitualmente, los inhibidores competitivos se asemejan estructuralmente

al sustrato y compiten con el sustrato por enlazarse al centro activo de la enzima; y

solamente una molécula se sustrato o de inhibidor puede estar unida a la enzima a un

mismo tiempo. Un inhibidor se puede caracterizar como competitivo mediante la

adición de una cantidad dada del inhibidor a reacciones preparadas con varias

concentraciones de sustrato, representando gráficamente los datos resultantes por

medio del método de Lineweaver-Burk y observando el efecto del inhibidor en

comparación con reacciones de control a las cuales no se han añadido inhibidor. Si el

inhibidor es competitivo, la pendiente y la intersección con el eje x de la gráfica

obtenida con el inhibidor se ven alteradas, mientras que las ordenada con el origen (o

intersección con el eje y) (1/Vm) queda inalterada. Se puede demostrar que la

proporción entre la velocidad inicial no inhibida (Vo) y la velocidad inicial inhibida

(Vi) resulta:
 Vo [𝐼]𝐾𝑚
= [22]
Vi 𝐾𝑖(𝐾𝑚 + [𝑆])

Donde:

Ki = constante de disociación del complejo inhibidor-enzima.

[𝐼] = concentración del inhibidor competitivo.

Por consiguiente, una representación gráfica de Vo/Vi frente a la concentración del

inhibidor dará una correlación lineal. A partir de esta representación gráfica, se puede calcular

la concentración de un inhibidor competitivo (2).

Un inhibidor no competitivo se une al enzima independientemente del sustrato y se

halla unido fuera del centro activo del enzima. Un inhibidor no competitivo puede ser

identificado por su efecto sobre la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas a

distintas concentraciones de sustrato y los datos se pueden representar gráficamente mediante

el método de Lineweaver-Burk. Un inhibidor no competitivo afectará a la pendiente y a la

ordenada en el origen, en comparación con un sistema no inhibido, mientras que la

intersección con el eje x, 1 /Km, queda inalterada. De manera análoga a los inhibidores

competitivos, se puede elaborar una curva de calibrado de v0/vi frente a la concentración del

inhibidor y utilizarla para determinar la concentración de un inhibidor no competitivo (2).

Los inhibidores anticompetitivos se unen solamente al complejo enzima-sustrato. La

inhibición anticompetitiva se pone de manifiesto mediante la adición de una cantidad

determinada de inhibidor a reacciones con diferentes concentraciones de sustrato y

representando gráficamente los datos por medio del método de Lineweaver-Burk. Un

inhibidor anticompetitivo afectará tanto a la intersección con el eje x como a la intersección

con el eje y de la representación gráfica de Lineweaver-Burk, en comparación con el sistema

no inhibido, mientras que conserva una pendiente igual a la del sistema no inhibido (es decir,

resultará una línea paralela). Se puede construir una representación gráfica de v0/vi frente a la
concentración del inhibidor para utilizarla como curva de calibrado para la determinación de

la concentración de un inhibidor anticompetitivo.

2.3. Los Métodos De Medida

2.3.1. Una visión de conjunto

Para el análisis práctico de los enzimas, es necesario estar familiarizado con los métodos

de medida de la velocidad de reacción. Cualquier propiedad física o química del sistema, que

esté relacionada con la concentración del sustrato o del producto, puede ser utilizada para el

seguimiento de una reacción enzimática. Hay disponible una amplia diversidad de métodos

para estudiar las reacciones enzimáticas, incluyendo la espectrometría de absorción, la

fluorimetría, los métodos manométricos, la volumetría, la medida de isótopos y la viscosidad.

Un buen ejemplo de la utilización de la espectro fotometría como un método para el

seguimiento de las reacciones enzimáticas es el uso de los espectros de los coenzimas

piridínicos NAD (H) y NADP (H), en los cuales se produce un cambio marcado a 340 nm en

el transcurso de la oxidación-reducción (véase la Figura10). Muchos métodos dependen del

aumento o la disminución de la absorbancia a 340 nm, cuando estas coenzimas son los

productos o los sustratos en una reacción acoplada.

Figura 10: Las curvas de absorción de los NAD

(H) y los NADP (H); λ= longitud de onda. Muchos
métodos enzimáticos de análisis se basan en la
medida de un aumento o una disminución de la
absorbancia a 340 nm, causada por los NAD (H) o
los NADP (H).
 Un ejemplo de la utilización de varios métodos para medir la actividad de un enzima se

encuentra en el ensayo de la actividad de la α-amilasa. La α-amilasa fragmenta el almidón por

las uniones α-1,4 del almidón y es un endoenzima. Un endoenzima fragmenta un sustrato

polímero por sus uniones internas. Esta reacción puede ser seguida por medio de una serie de

métodos, incluidos la disminución de la viscosidad, el aumento de los grupos reductores tras

la hidrólisis, la reducción del color del complejo almidón-yodo y la polarimetría. Sin

embargo, es difícil distinguir entre la actividad de la a-amilasa y la de la β-amilasa utilizando

un único ensayo.

La a-amilasa corta la maltosa del extremo no reductor del almidón. Mientras que se

esperaría que tuviese lugar un descenso marcado en la viscosidad del almidón o una reducción

en la coloración del yodo, debido a la actividad de la α-amilasa, la β-amilasa también puede

ocasionar cambios en la viscosidad y en el color del yodo, si se encuentra en concentraciones

elevadas. Para establecer si se está midiendo la α-amilasa, o bien la β-amilasa, el analista debe

determinar la variación en el número de grupos reductores, como una base de comparación.

Puesto que la a-amilasa es un endoenzima, la hidrólisis de unos pocos enlaces cerca del centro

del sustrato polímero causará una marcada disminución en la viscosidad, mientras que la

hidrólisis de un número igual de enlaces por parte del exoenzima, la β-amilasa, tendrá poco

efecto sobre la viscosidad.

Cuando se desarrolla un ensayo enzimático, es juicioso escribir, en primer lugar, una

ecuación completa y equilibrada para la reacción concreta catalizada por enzimas. Con

frecuencia, una inspección de las propiedades físicas y químicas de los productos y los

sustratos, que sean fácilmente mensurables con los equipos disponibles, resultará en una

elección obvia del método para el seguimiento de la reacción en el laboratorio.

 Si se disfruta de opciones respecto de la metodología, se debería escoger el método que

sea capaz de realizar el seguimiento de la reacción en forma continua, sea el más sensible y

sea específico para esa reacción catalizada por enzimas.

2.3.2. Las reacciones acopladas

Las enzimas se pueden utilizar en ensayos a través de reacciones acopladas. Las

reacciones acopladas implican la utilización de dos o más reacciones enzimáticas con el fin de

que la concentración de un sustrato o de un producto pueda ser seguida fácilmente. Cuando se

hace uso de una reacción acoplada, hay una reacción indicadora y una reacción auxiliar. Por

ejemplo:
𝐸1
(Reaccion auxiliar) 𝑆1 → 𝑃1 [23]

𝐸2
(Reaccion indicadora) 𝑃1 → 𝑃2 [24]

El papel del enzima indicador (E2) es producir P2, el cual es fácilmente mensurable y, por

consiguiente, resulta una indicación de la cantidad de P1 producida por E1. Por otra parte, la

misma secuencia puede ser utilizada en la determinación de S 1, el sustrato de El. Cuando se

utiliza una reacción acoplada para medir la actividad de una enzima (por ejemplo, el E 1.

anterior) es crítico que el enzima indicador E2 no sea el limitante en la velocidad de la

secuencia de reacción: la reacción auxiliar debe ser siempre la reacción limitante de la

velocidad. Por consiguiente, para un ensayo eficiente, la actividad de E2 debería ser mucho

mayor que la actividad de El. Las reacciones enzimáticas acopladas pueden presentar

problemas con respecto al pH del sistema si los óptimos de pH de los enzimas acoplados son

completamente diferentes. Puede ser necesario dejar que la primera reacción (por ejemplo, la

reacción auxiliar catalizada por El, como se indica más arriba, Ecuación [23]) progrese

durante algún tiempo y, a continuación, detener la reacción por medio del calentamiento para

desnaturalizar la enzima El. Se ajusta el pH, se adiciona el enzima indicador (E2, Ecuación

[24]) y se completa la reacción. Si se emplease un método de punto final con un sistema

acoplado, los requisitos de compatibilidad del pH no serían tan rigurosos como para un

ensayo de la velocidad de reacción, puesto que se podría utilizar un periodo de tiempo,

prolongado para permitir que la secuencia de reacción llegase a su conclusión.

3. ALGUNAS APLICACIONES

Como se ha descrito previamente, es necesaria cierta información con antelación a la

utilización analítica de los ensayos enzimáticos. En general, es deseable poseer algunos

conocimientos sobre el valor de Km, el desarrollo temporal de la reacción, la especificidad

del, enzima por el sustrato, el óptimo del pH y la estabilidad del enzima frente al pH, y los

efectos de la temperatura sobre la reacción y la estabilidad del enzima.

Muchas veces, esta información está disponible en la literatura. No obstante, pueden ser

necesarios unos pocos experimentos preliminares, especialmente en, el caso de experimentos

en los cuales se miden las velocidades. La realización de un desarrollo temporal para

establecer la linealidad de la formación del producto o el consumo del sustrato en el

transcurso de la reacción, es una necesidad. Se recomienda llevar a cabo un experimento para

demostrar la linealidad de la velocidad de la reacción enzimática frente a la concentración de

enzima (véase la Figura 5).

3.1. Los ensayos del sustrato

Lo que sigue no es un compendio extenso de los métodos para la medida de los

componentes alimentarios por medio del análisis enzimático. En lugar de ello, está destinado

a exponer los tipos de análisis posibles. El lector puede consultar los manuales publicados por

los fabricantes de juegos de reactivos enzimáticos, por ejemplo, el de Boehringer-Mannheim,

el, artículo de revisión de Whitaker y la serie de Bergmeyer para una guía más amplia sobre

los métodos enzimáticos aplicables a los alimentos.

 3.1.1. La preparación de la muestra

A causa de la especificidad de los enzimas, la preparación de la muestra antes del análisis

enzimático es, con frecuencia, mínima y puede incluir tan sólo la extracción y la eliminación

de los sólidos por medio de la filtración o la centrifugación. A pesar de todo, debido a la

amplia diversidad de los alimentos con los que se podría encontrar el analista que haga uso de

los ensayos enzimáticos, se debería llevar a cabo una comprobación de las etapas de

extracción y de reacción enzimática por medio de las adiciones de cantidades conocidas de un

patrón del analito al alimento y al extracto, y midiendo la recuperación de dicho patrón. Si las

adiciones del patrón son recuperadas en su totalidad, esto es una indicación positiva de que la

extracción es completa, de que la muestra no contiene sustancias interferentes que requieran

su eliminación con antelación al análisis enzimático y de que los reactivos se encuentran en

buen estado. En algunos casos, se hallan presentes sustancias interferentes pero pueden ser

fácilmente eliminadas por precipitación o adsorción. Por ejemplo, se puede utilizar

polivinilpolipirrolidona (PVPP) en polvo para decolorar los zumos o los vinos tintos. Con el

advenimiento de jeringuillas provistas de pequeñas mini columnas (por ejemplo, cartuchos

C18, de sílice y de intercambio iónico), es también relativamente fácil y rápido conseguir

separaciones por grupos para eliminar las sustancias interferentes contenidas en un extracto de

muestra.

3.1.2. Los métodos del cambio total o del punto final

Mientras que las concentraciones de sustrato puede ser determinadas en ensayos de

velocidad cuando la reacción es de primer orden con respecto a la concentración de sustrato

([S] << Km), la concentración de sustrato también puede ser determinada por el método del

cambio total o del punto final. En dicho método, se deja progresar la reacción catalizada por

enzimas hasta su conclusión, de tal modo que la concentración del producto, la cual se mide,
sea directamente proporcional al sustrato. Un ejemplo de un sistema tal es la determinación de

la glucosa utilizando la glucosa oxidasa y la peroxidasa, descrito más abajo.

En algunos casos, en un método de punto final se establece un equilibrio, en el cual hay

una cantidad significativa de sustrato que permanece en equilibrio con el producto. En estos

casos, el equilibrio puede ser alterado. Por ejemplo, en los casos en los cuales se hace uso de

una reacción que libera protones, se pueden utilizar condiciones alcalinas (un aumento en el

pH). También se pueden utilizar agentes secuestrantes, en cuyo caso el producto es retirado

efectivamente del seno de la reacción y, conforme a la ley de acción de masas, la reacción

avanza hasta su conclusión. Ejemplos de esto incluyen la captura de las cetonas y los

aldehídos por la hidrazina. De esta manera, el producto es retirado continuamente y la

reacción se fuerza hasta su terminación. El equilibrio también puede ser desplazado

aumentando la concentración de cofactor o de coenzima.

Otro medio de conducir una reacción hasta su término es un sistema regenerante. Por

ejemplo, en la determinación del glutamato, con la ayuda de la glutamato deshidrogenasa, se

puede llevar a cabo lo siguiente:

𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑚𝑎𝑡𝑜−deshidrogenasa
𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑚𝑎𝑡𝑜𝑁𝐴𝐷 + + 𝐻2 𝑂 ⇔ 𝑁𝐴𝐷 + + 𝑁𝐻4 + [25]

𝑙𝑎𝑐𝑡𝑎𝑡𝑜−deshidrogenasa
𝑝𝑖𝑟𝑢𝑣𝑎𝑡𝑜𝑁𝐴𝐷𝐻 + + 𝐻 + → 𝑁𝐴𝐷 + + 𝑙𝑎𝑐𝑡𝑎𝑡𝑜 [26]

En este sistema, el NADH se recicla a NAD•E a través de la lactato deshidrogenasa, hasta

que todo el glutamato a medir ha sido consumido. La reacción se detiene calentando para

desnaturalizar los enzimas presentes, se añade una segunda alícuota de glutamato

deshidrogenasa y NADH, y se mide el α-cetoglutarato (equivalente al glutamato original) a

través de la disminución en la absorbancia a 340 nm. Un ejemplo en el que el mismo

equilibrio es desplazado en la medida del glutamato es como sigue:

𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑚𝑎𝑡𝑜−deshidrogenasa
𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑚𝑎𝑡𝑜𝑁𝐴𝐷 + + 𝐻2 𝑂 ⇔ 𝑁𝐴𝐷 + + 𝑁𝐻4 + (𝛼 − 𝑐𝑒𝑡𝑜𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑟𝑎𝑡𝑜) [27]

𝑑𝑖𝑎𝑓𝑜𝑟asa
𝑁𝐴𝐷𝐻 + 𝐼𝑁𝑇 → 𝑁𝐴𝐷 + + 𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎𝑧𝑎𝑛𝑜 [28]
 El cloruro de yodonitrotetrazolio (INT) es un reactivo aceptor final de electrones para el

NADH, producto de la reacción catalizada por la glutamato deshidrogenasa. El formazano

generado se puede determinar colorimétricamente a 492 nm.

3.1.3. Algunas aplicaciones especificas

3.1.3.1. La determinación del sulfito

El sulfito es un aditivo alimentario que puede ser medido por medio de varias técnicas,

que incluyen la volumetría, la destilación seguida de volumetría, la cromatografía de gases y

el análisis colorimétrico. El sulfito también puede ser oxidado específicamente a sulfato

mediante el enzima sulfito oxidasa (SO), disponible comercialmente:

𝑆𝑂
𝑆𝑂32− + 𝑂2 + 𝐻2 𝑂 → 𝑆𝑂42− + 𝐻2 𝑂2 [29]

El producto H2O2 puede ser medido por medio de varios métodos, incluida la utilización

del enzima NADH peroxidasa:

𝑁𝐴𝐷𝐻 𝑝𝑒𝑟𝑜𝑥𝑖𝑑𝑎𝑠𝑎
𝐻2 𝑂2 + 𝑁𝐴𝐷𝐻 + 𝐻 + → 2𝐻2 𝑂 + 𝑁𝐴𝐷 + [30]

La cantidad de sulfito presente en el sistema es igual al NADH oxidado, el cual se

determina por la disminución en la absorbancia a 340 nm. El ácido ascórbico puede interferir

con el ensayo, pero puede ser eliminado haciendo uso de la ácido ascórbico oxidasa

3.1.3.2. La determinación colorimétrica de la glucosa

La combinación de los enzimas glucosa oxidasa y peroxidasa se puede utilizar para medir

específicamente la glucosa en un sistema alimentario (véase, también, el Capítulo 10, Sección

10.3.4.3.3). La glucosa es oxidada preferentemente mediante la glucosa oxidasa para producir

gluconolactona y peróxido de hidrógeno. El peróxido de hidrógeno más la o-dianisidina, en

presencia de la peroxidasa, produce una coloración amarilla que absorbe a 420 nm

(Ecuaciones [31] y [32]).

 Normalmente, este ensayo se lleva a cabo como un ensayo de punto final y hay una

proporcionalidad entre coloración formada y la cantidad de glucosa contenida en el

extracto, la cual se establece mediante una curva de calibrado. Puesto que la glucosa

oxidasa es completamente específica para la glucosa, es una herramienta útil en la

determinación de la cantidad de glucosa, en presencia de otros azúcares reductores.

3.1.3.3. El contenido en almidón o en dextrinas

Almidón y las dextrinas se pueden determinar por medio de la hidrólisis enzimática

haciendo uso de la amiloglucosidasa, un enzima que rompe los enlaces a-1,4 y a-1,6 del

almidón, del glucógeno y de las dextrinas, liberando glucosa (véase el Capítulo 10). La

glucosa formada se puede determinar, a continuación, enzimáticamente. La glucosa puede ser

determinada mediante el método colorimétrico anteriormente descrito, en el cual la glucosa es

oxidada por medio de la glucosa oxidasa y acoplada a un tinte coloreado a través de la

reacción del producto de la glucosa oxidasa, el peróxido de hidrógeno, mediante la

peroxidasa. Un método alternativo para la determinación de la glucosa es a través del

acoplamiento de las reacciones de la hexoquinasa (HK) y la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa

(G6PDH):
 La cantidad de NADPH formado se determina a través de la absorbancia a 340 nm y

es una medida estequiométrica de la glucosa que tiene su origen en la dextrina o el almidón

hidrolizados por la amiloglucosidasa. La cantidad de almidón determinada por medio de este

método se calcilla como sigue:

Obsérvese que la HIC cataliza la fosforilación de la fructosa, además de la de la glucosa.

La determinación de la glucosa es específica gracias a la especificidad de la segunda reacción,

catalizada por la G6PDH, en la cual el sustrato es la glucosa-6-fosfato.

Esta secuencia de ensayos se puede utilizar para detectar las dextrinas del jarabe de maíz

empleado para endulzar un producto de zumo de frutas. Sin embargo, sería necesario un

segundo ensayo, sin el tratamiento con la amiloglucosidasa, para tener en cuenta la glucosa

presente en el producto. La glucosa determinada en dicho ensayo se sustraería del resultado

del análisis en el cual se utiliza la amiloglucosidasa.

La misma secuencia HK-G6PDH empleada para determinar la glucosa puede ser utilizada

también para medir otros hidratos de carbono presentes en los alimentos. Por ejemplo, la

lactosa y la sacarosa pueden ser determinadas a través de la hidrólisis específica de estos dos
disacáridos por medio de la 0-galactosidasa y la invertasa, respectivamente, seguidas por la

utilización

3.1.3.4. La determinación del ácido D-málico en el zumo de manzanas

Existen dos configuraciones estereoisómeras del ácido málico. El ácido L-málico se

presenta naturalmente mientras que la forma D no se encuentra, normalmente, en la

naturaleza. El ácido málico producido sintéticamente es una mezcla de estos dos isómeros. En

consecuencia, el ácido málico sintético puede ser detectado por medio de una determinación

del ácido D-málico. Una manera de detectar el ácido málico es a través de la utilización del

enzima descarboxilante D-malato deshidrogenasa (DMD) (8). La DMD catalizala

transformación del ácido D-málico de la siguiente manera:

La reacción puede ser seguida mediante la medida fotométrica del NADH. Puesto que el

CO2 es un producto de esta reacción y se desprende, el equilibrio de la reacción está

desplazado hacia la derecha y el proceso es irreversible. Este ensayo es de gran valor puesto

que la adición del ácido -málico sintético se podría utilizar para aumentar ilegalmente el
D/L

contenido en ácido del zumo de manzanas y de los productos de zumo de manzanas.

3.2. Los ensayos de la actividad enzimática

3.2.1. La actividad de la peroxidasa

La peroxidasa se encuentra en la mayor parte de las materias vegetales y es

moderadamente estable frente al calor. Un tratamiento térmico que acabe completamente con

la actividad de la peroxidasa en una materia vegetal se considera, habitualmente, más que

adecuado para destruir los demás enzimas y la mayoría de los microbios presentes. Por
consiguiente, en el procesado de las verduras, la idoneidad del proceso de escaldado puede ser

observada siguiendo de cerca la desaparición de la actividad de la peroxidasa (9). La

peroxidasa cataliza la oxidación del guayacol (incoloro), en presencia de peróxido de

hidrógeno, para formar el tetraguayacol (de color amarillo-marrón) y agua (Ecuación [37]). El

tetraguayacol presenta un máximo de absorbancia alrededor de 450 nm. Se puede utilizar el

aumento de la absorbancia a 450 nm para determinar la actividad de la peroxidasa en la

mezcla de reacción.

3.2.2. La lipooxigenasa

Se ha señalado recientemente que, para medir la idoneidad del escaldado de las verduras,

la lipooxigenasa puede ser un enzima más apropiado que no la peroxidasa. El término

lipooxigenasa hace referencia a un grupo de enzimas que cataliza la oxidación por el oxígeno

molecular de los ácidos grasos que contienen un sistema cis, cis-1,4-pentadieno, produciendo

derivados hidroperóxidos conjugados:

Se pueden utilizar una diversidad de métodos para medir la actividad de la lipooxigenasa

contenida en los extractos vegetales. Se puede seguir la reacción por medio de la medida de la

desaparición del sustrato ácido graso, de la absorción de oxígeno, de la presencia del dieno

conjugado, a 234 nm, o de la oxidación de un cosustrato tal como el caroteno. Todos estos

métodos han sido utilizados y cada uno de ellos presenta sus ventajas. El método del electrodo
de oxígeno es ampliamente empleado y sustituye al método manométrico, más engorroso. El

método del electrodo es rápido y sensible, y proporciona un registro continuo. Normalmente,

es el método de elección para los extractos brutos, aunque hay que eliminar las reacciones

secundarias que supongan una oxidación, o bien tenerlas en cuenta para corregir los

resultados. Zhang y colaboradores han presentado una adaptación del método del electrodo de

0, al ensayo de la lipooxigenasa en homogeneizados de judías verdes, sin necesidad de

extracción. Gracias a la rapidez del método (< 3 minutos, incluida la homogeneización), el

control en conexión del proceso, haciendo uso de la actividad de la lipooxigenasa como un

parámetro de control, es una verdadera posibilidad para el escaldado de las judías verdes. La

formación de los ácidos grasos con dienos conjugados, con un grupo cromóforo a 234 nm, se

puede seguir de forma continua. Sin embargo, son necesarias mezclas ópticamente

límpidas.La decoloración de los carotenoides también ha sido utilizada como una medida de

la actividad de la lipooxigenasa. Sin embargo, la estequiometría de este método es incierta y

no todas las lipooxigenasas presentan la misma actividad en la decoloración de los

carotenoides.

Williams y colaboradores han desarrollado un ensayo semicuantitativo de prueba de

mancha para la lipooxigenasa, en el cual el 𝐼 − es oxidado a 𝐼2 , en presencia del producto

hidroperóxido del ácido linolénico, y el 𝐼2 se detecta en forma del complejo yodo-almidón.

3.2.3. El ensayo de la fosfatasa

La fosfatasa alcalina es un enzima relativamente estable al calor, el cual se encuentra en la

leche cruda. La estabilidad térmica de la fosfatasa alcalina contenida en la leche es mayor que

la de los patógenos microbianos que no formen esporas, presentes en la leche. El ensayo de la

fosfatasa ha sido aplicado a los productos lácteos para determinar si la pasteurización se ha

llevado a cabo correctamente, o no, y para detectar la adición de leche cruda a la leche

pasteurizada. Un ensayo común de la fosfatasa se basa en la hidrólisis del fenilfosfato de

disodio, catalizada por la fosfatasa, para liberar fenol. El fenol producido se determina

colorimétricamente después de reaccionar con la CQC (2,6-dicloroquinona-cloroimida) para

formar un indofenol azul. El indofenol es extraído a n-butanol y se mide a 650 nm. Este es un

ejemplo de una separación física del producto para permitir la fácil medición de una reacción

enzimática. Más recientemente, fue desarrollado y comercializado un ensayo fluorimétrico

rápido para la determinación de la fosfatasa alcalina, en el cual se puede seguir directamente

la velocidad de la producción del fluoróforo, sin la extracción con butanol empleada para

medir el indofenol cuando se utiliza como sustrato el fenilfosfato. Se demostró que el ensayo

fluorimétrico proporciona una mayor repetibilidad, en comparación con el ensayo típico en el

cual se utiliza como sustrato el fenilfosfato, y que era capaz de detectar un 0,05% de leche

cruda en una muestra de leche pasteurizada. Una reactividad química similar ha sido aplicada

a la medida de la actividad de la fosfatasa ácida en las carnes, como un medio de garantizar

una cocción adecuada, a través de la correlación de la actividad enzimática hasta la

temperatura de punto final.

3.2.4. La actividad de la α-amilasa

La actividad de la amilasa en la malta es un parámetro crítico de la calidad. Con

frecuencia, se alude a la actividad de la amilasa en la malta como la actividad diastásica, un

término que hace referencia a la producción de sustancias reductoras mediante la acción de la

α-amilasa y la β-amilasa sobre el almidón. La medida de la actividad diastásica supone la

digestión del almidón soluble con una infusión (un extracto) de malta y el seguimiento del

aumento de las sustancias reductoras mediante la medida de la reducción con la disolución de

Fehling o con ferricianuro. La medida específica de la actividad de la a-amilasa (denominada,

a menudo, la actividad dextrinizante) en la malta es más complica- da y se basa en la

utilización de una dextrina límite como sustrato. La dextrina límite se prepara por la acción

de la (β-amilasa (libre de actividad de la α-amilasa) sobre el almidón soluble. La β-amilasa

recorta las unidades de maltosa del extremo no reductor de la molécula de almidón hasta que

se encuentra con un punto de ramificación α-1,6. El producto final es una β-dextrina límite, la

cual sirve como sustrato para la fragmentación endo producida por la α-amilasa. Se añade una

infusión de malta al sustrato de dextrina límite previamente preparado y se transfieren

periódicamente alícuotas a una disolución diluida de yodo. La actividad de la a-amilasa se

determina por medio del cambio de coloración del complejo yodo-almidón, en presencia de

un exceso de la β-amilasa utilizada para preparar la dextrina limite. La coloración se compara

contra un disco coloreado, en un comparador. Esto se continúa hasta que la coloración se

empareja con un color en el comparador. El tiempo necesario para alcanzar esta coloración es

el tiempo de dextrinización y es una medida de la actividad de la α-amilasa, donde un tiempo

más corto representa un preparado más activo.

Puesto que la α-amilasa es un endoenzima, cuando actúa sobre una pasta de almidón la

viscosidad de la pasta se reduce dramáticamente, influyendo enormemente en la calidad de la

harina. En consecuencia, la actividad de la α-amilasa es de gran importancia en el trigo

integral. Normalmente, el trigo presenta pequeños valores de actividad de la a-amilasa,

aunque cuando se humedece en el campo puede tener lugar en el trigo la germinación antes

del cosechado (la germinación en la espiga o pregerminación), con un incremente dramático

en la actividad de la a-amilasa. La germinación antes de la recolección no puede ser detectada

fácilmente de manera visual, de modo que la determinación de la actividad de la α-amilasa se

puede utilizar como una estimación sensible de la germinación antes de la cosecha. El método

del índice de caída es un procedimiento en el cual el trigo molido se calienta con agua para

formar una pasta y se registra el tiempo que tarda un émbolo en caer a través de la pasta. Por

consiguiente, el tiempo en segundos (el índice de caída) está inversamente relacionado con la

actividad de la α-amilasa y el grado de germinación antes de la recolección. Este método de

medida de la actividad enzimática es un buen ejemplo de la utilización de la variación en una

propiedad física de un sustrato como una manera de estimar la actividad enzimática.

3.2.5. La actividad del cuajo

El cuajo, un extracto del estómago bovino, se utiliza como un agente coagulante en la

fabricación del queso. La mayor parte de los ensayos de la actividad del cuajo están

basados en la observación de la capacidad de un preparado para coagular la leche. Por

ejemplo, se dispersa leche en polvo desnatada del 12% en una disolución de cloruro de

calcio 10 mM y se calienta a 35ºC. Se adiciona una alícuota del preparado de cuajo y se

observa visualmente el tiempo de coagulación de la leche. La actividad del preparado se

calcula en proporción a un cuajo normalizado. En contraposición con la capacidad de

coagulación, los preparados de cuajo pueden ser evaluados también en cuanto a su

actividad proteolítica mediante la medida de la liberación de un tinte procedente de la

azocaseína (una caseína a la cual ha sido enlazado covalentemente un tinte). En este ensayo

se incuba el preparado de cuajo con azocaseína al 1 %. Después del periodo de reacción, la

reacción se detiene por adición de ácido tricloroacético. El ácido tricloroacético precipita

la proteína que no se encuentra hidrolizada. Los pequeños fragmentos de azocaseína

coloreada producidos por la hidrólisis del cuajo se dejan en la disolución y se toma la

lectura de la absorbancia a 345 nm. Este ensayo se basa en el aumento en la solubilidad

de un sustrato tras la degradación por un enzima.

3.3. Los biosensores o enzimas inmovilizados

La utilización de enzimas .inmovilizados como herramientas analíticas está

recibiendo, actualmente, una atención creciente. Un enzima inmovilizado, en

combinación con un dispositivo sensor, es un ejemplo de biosensor. Un biosensor es un

dispositivo formado por un elemento sensor biológico (por ejemplo, un enzima, un

anticuerpo, etc.) acoplado a un transductor adecua do (por ejemplo, óptico, electroquímico,

etc.). Las enzimas inmovilizados, gracias a su estabilidad y la facilidad de su

extracción de la reacción, pueden ser utilizados repetidas veces, eliminando de esta

manera uno de los principales costes del análisis enzimático. El electrodo enzimático

más ampliamente utilizado es el electrodo de glucosa, en el cual se combina la glucosa

oxidasa con un electrodo de oxígeno, para determinar la concentración de glucosa (18).

Cuando se introduce el electrodo en una disolución de glucosa, la glucosa se

difunde a través de la membrana, donde es transformada en gluconolactona por la glucosa

oxidasa, con absorción de oxígeno. El consumo de oxigeno es una medida de la

concentración de glucosa. Igualmente, se puede medir la glucosa mediante la acción de

la; glucosa oxidasa con detección del peróxido de hidrógeno, en la cual el peróxido de

hidrógeno se detecta amperométricamente por medio de un electrodo polarizado.

Recientemente, se han presentado un gran número de electrodos enzimáticos

(biosensores) en la literatura. Por ejemplo, ha sido desarrollado un detector de glicerina, en

el cual fue inmovilizada la glicerina deshidrogenasa, para la determinación de la glicerina

en el vino. El NADH producido por el enzima fue observado mediante un electrodo de

platino.

4. RESUMEN

Los enzimas, a causa de su especificidad y sensibilidad, son especies analíticas

valiosas para la cuantificación de compuestos que sean sustratos, activadores o inhibidores

enzimáticos. En las reacciones catalizadas por los enzimas, el enzima y el sustrato se mezclan

bajo condiciones específicas (de pH, temperatura, fuerza iónica, concentración de sustrato y

concentración de enzima). Las modificaciones en estas condiciones pueden afectar a la

velocidad de reacción del enzima y, de esta manera, al resultado del ensayo. La reacción

enzimática se sigue mediante la determinación bien sea la cantidad de producto generada,

o bien del consumo de sustrato.

 5. PREGUNTAS DE REPASO

 La ecuación de Michelis-Menten define matemáticamente, la naturaleza hiperbólica de

una representación gráfica que relación la velocidad de reaccion con la concentración del

sustrato, para una reaccion mediada por enzimas. La inversa de esta ecuación proporciona

la fórmula de Lineweaver-Burk y una correlación lineal, tal como se muestra más abajo.

a) Defina a que se refiere Vo, Km, Vm y [𝑆]en la fórmula de Lineweaver-Burk.

b) Basándose en los componentes de la fórmula de Lineweaver-Burk, ponga la

leyenda al eje de ordenadas y, el eje de abscisas x, la pendiente y la intersección

con el eje y (ordenada en el origen) en la gráfica.

c) ¿Qué factores que controlan o influyen en la velocidad de las reacciones

 Explique basándose en la química, porque los valores extremos de pH y de temperatura

pueden reducir la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas.

 Distinga entre inhibidores enzimáticos competitivos, no competitivos y anti competitivos.

 Usted cree que el producto alimentario con el cual está trabajando contiene un inhibidor

enzimático en concreto. Explique cómo cuantificaría la cantidad de un inhibidor

enzimático presente en un extracto del alimento. El inhibidor en cuestión puede ser

adquirido comercialmente, en una forma purificada, a una compañía de productos

químicos. Es sabido que el inhibidor inhibe a la enzima específica E, el cual reacciona

con el sustrato S para generar el producto P, el cual puede ser cuantificado

espectrofotométricamente.

 ¿Qué métodos pueden ser utilizados para cuantificar la actividad enzimática en las

reacciones catalizadas por enzimas?