Purificación de enzimas

La purificación es un paso obligado en el estudio de las macromoléculas, pero no

es necesariamente fácil. En los casos típicos una sustancia que constituye menos
del 0.1% del peso seco de un tejido debe llevarse a una pureza del 98%. Los
problemas de purificación de esta magnitud podrían ser considerados
irrazonablemente difíciles por la mayoría de los químicos de síntesis. Aquí se
resumen algunas de las técnicas más comunes para la purificación de las proteínas
y otras macromoléculas. La mayoría de estas técnicas puede usarse a veces en
una forma modificada, para los ácidos nucleicos y otros tipos de moléculas
biológicas.
Enfoque general de la purificación de proteínas
La tarea de purificar una proteína presente sólo en cantidades de traza fue alguna
vez tan ardua que muchas de las primeras proteínas caracterizadas se estudiaron
en parte debido a que eran abundantes y se aislaban con facilidad. Por ejemplo, la
hemoglobina, que constituye alrededor de un tercio del peso de los eritrocitos,
históricamente estuvo entre las proteínas más estudiadas. La mayoría de las
enzimas que median los procesos metabólicos básicos o que están involucradas en
la expresión y la transmisión de la información genética es común a todas las
especies. Por esta razón una proteína dada con frecuencia se obtiene de una fuente
elegida principalmente por su conveniencia, por ejemplo, tejidos de animales
domésticos o microorganismos fáciles de obtener como E. culi y Saccharomyces
cerevisiae (levadura de cerveza). El desarrollo de técnicas modernas de clonación
molecular permite que casi cualquier gen que codifique a una proteína se aísle de
su organismo original, se altere específicamente (por ingeniería genética) si se
desea y se exprese en grandes cantidades en un microorganismo. Sin dudas, la
proteína donada puede constituir hasta el 40% del total de proteínas celulares del
microorganismo. Por lo general este nivel elevado de producción hace que la
proteína donada sea mucho más fácil de aislar de lo que sería en su organismo
original (en el que podría aparecer en cantidades muy pequeñas). El primer paso
en el aislamiento de una proteína o de otra molécula biológica es extraerla de la
célula e incluirla en una solución. Muchas células requieren algún tipo de ruptura
mecánica para liberar su contenido. La mayoría de los procedimientos para lograr
la lisis de las células se basa en alguna forma de aplastar o moler, seguida de una
filtración o una centrifugación para retirar las partículas insolubles más grandes. Si
la proteína donada está estrechamente asociada con una membrana lipídica, puede
usarse un detergente o un solvente orgánico para solubilizar los lípidos y recuperar
la proteína.
Estabilización de proteínas. Una vez que la proteína se extrajo de su entorno natural
se expone a varios agentes que pueden dañada en forma irreversible. Estas
influencias deben controlarse con cuidado en todos los pasos de un proceso de
purificación. Deben considerarse los factores siguientes:
1. pH. Los materiales biológicos se disuelven habitualmente en soluciones
reguladoras eficaces en el rango de pH en el cual los materiales son estables. Si no
se hace de esta manera, puede causarse su desnaturalización (alteración de su
estructura), si no su degradación química.
2. Temperatura. La estabilidad térmica de las proteínas varía. Aunque algunas de
ellas se desnaturalizan a bajas temperaturas. la mayoría lo hace a temperatura
elevada, a veces sólo unos pocos grados por sobre la de su en-torno natural. La
purificación de proteínas normalmente se lleva a cabo a temperaturas cercanas a
0°C.
3. Presencia de enzimas de degradación. Cuando los tejidos se destruyen para
liberar la molécula de interés se liberan también enzimas de degradación. Entre
éstas se incluyen las proteasas y las nucleasas (enzimas que degradan ácidos
nucleicos). Estas enzimas pueden inhibirse si se ajustan el pH o la temperatura a
valores que las inactiven (siempre que no se afecte de manera adversa la proteína
de interés) o si se agregan compuestos que bloqueen específicamente su acción.
4. Adsorción a superficies. Muchas proteínas se desnaturalizan por contacto con la
interfaz aire-agua o con las superficies de vidrio o plástico. Por ende, las soluciones
con proteínas se manipulan de manera que sea mínima la formación de espuma y
se mantienen relativamente concentradas.
5. Almacenamiento a largo plazo. Todos los factores mencionados antes de-ben
tomarse en cuenta se necesite mantener estable cuando una muestra de proteína
purificada. Además, deben prevenirse los procesos como la oxidación lenta o la
contaminación microbiana. Las soluciones de proteínas a menudo se almacenan
bajo gas nitrógeno o argón (más que bajo aire, que contiene 21% de Oxigeno). o
congeladas a -80°F o -196°F (la temperatura del nitrógeno líquido), o bajo ambas
condiciones. Sin embargo, algunas de las llamadas proteínas lábiles al frío son
inestables por debajo de una temperatura característica.
Técnicas de separación.
Las proteínas se purifican mediante procedimientos de fraccionamiento. En una
serie de etapas independientes, las diversas propiedades fisicoquímicas de la
proteína de interés se usan para separarla de manera progresiva de otras
sustancias. La idea no es necesariamente llevar al mínimo la pérdida de la proteína
deseada, sino eliminar en forma selectiva los demás componentes de la mezcla de
manera que quede sólo la sustancia buscada. La purificación de proteínas se
considera tanto un arte como una ciencia, y hay varias opciones para cada paso.
Mientras que una aproximación del tipo ensayo-error puede funcionar, saber algo
sobre la proteína (o las proteínas de las cuales debe separarse) simplifica la
elección del procedimiento de separación. Algunos de los procedimientos que
planteamos y las características de la proteína de las cuales dependen son los
siguientes:
 Característica de la proteína Procedimiento de purificación
Solubilidad Disminución de la solubilidad (salting out)
Carga Iónica Cromatografía de intercambio de iones
Electroforesis
Polaridad Cromatografía de interacción hidrófoba
Tamaño Cromatografía por filtración en gel
SDS-PAGE
Ultracentrifugación
Especificidad de unión Cromatografía de afinidad

Cuadro comparativo
Método Descripción Ventajas Desventajas
Cromatografía de Las moléculas cargadas se Cualquier La unión de una
intercambio de unen a grupos con cargas proteína puede proteína a la
iones opuestas que están unirse a columna de
inmovilizados en la matriz. columnas de intercambio iónico
Los aniones se unen a los intercambio tanto debe ser
grupos catiónicos de los catiónico como determinada por
intercambiadores de aniones aniónico si el pH prueba y error,
y los cationes se unen a del búfer se utilizando
grupos aniónicos de los ajusta solventes en un
intercambiadores de adecuadamente rango de valores
cationes. para esa de pH, para
proteína. determinar el pH
optimo
Salting out Consiste en la manipulación Puede lograr una Ninguna.
de la solubilidad de la purificación y una
proteína por la concentración concentración
de sales disueltas, la significativas de
polaridad del solvente, el pH la proteína.
y la temperatura. La
solubilidad de una proteína Las proteínas no
en una concentración baja de sufren
iones aumenta a medida que desnaturalización.
se agrega sal, un fenómeno
llamado salting in. Si se Es uno de los
agrega más sal, la métodos más
solubilidad disminuye utilizados.
nuevamente, a esto se le
llama salting out.
Cromatografía de Utiliza las interacciones Puede ser Solo sirve como
interacción hidrófobas entre las realizada un paso
hidrófoba proteínas y la matriz inmediatamente intermedio del
cromatográficas para después de la esquema de
purificarlas. cromatografía de purificación.
A altas concentraciones de intercambio iónico
sales, los grupos no polares sin necesidad de
de la superficie de las una dilución o
proteínas “interactúan” con cambio de búfer
los grupos hidrófobos, o sea, de por medio
ambos tipos de grupos son
excluidos por el solvente la CFR puede ser
polar. un método
valioso para la
purificación de
proteínas que
pueden
renaturalizarse
espontáneamente
a partir de una
disminución de la
fuerza iónica,
Ultracentrifugación Este método usa una No requiere de Solo puede
ultracentrífuga, la cual puede solventes. manejarse en
alcanzar velocidades volúmenes
rotacionales de hasta Se usa solamente pequeños. (unos
100,000 rpm. Esto genera un la diferencia de pocos mL)
campo centrifugo en exceso densidades para
de 800,000g siendo capaz de separar las
afectar la sedimentación moléculas.
imperceptible de las
macromoléculas como las
proteínas debido a su
movimiento browniano.
Electroforesis Se basa en la filtración por el La movilidad de Solo sirve como
gel (tamaño y forma) asi las moléculas método analítico
como en la movilidad más pequeñas es para
electroforética (carga mayor que la caracterización de
eléctrica) movilidad de las enzimas.
más grandes.

Las moléculas de
tamaño similar se
agrupan.
Cromatografía de En este método, las Habilidad de Su rendimiento es
filtración en gel moléculas se separan de separar las muy sensible al
acuerdo con su forma y diferentes empaque de la
tamaño. La fase estacionaria especies de una columna.
está formada por esferas de proteína. Puede haber
gel que contienen poros de Especies interacciones no
un rango de tamaño oligoméricas, específicas entre
relativamente estrecho. Si moléculas de la proteína y la
una solución acuosa de proteínas resina, lo que
moléculas de tamaños desplegadas, y disminuye la
diversos pasa a través de especies resolución.
una columna que contiene truncadas Baja resolución
este tamiz molecular, las para mezclas
moléculas que son es compatible complejas de
demasiado grande como con una gama de proteínas.
para pasar a través de los solventes más La muestra debe
poros se excluyen del amplia y además ser sembrada en
volumen del solvente dentro requiere de un volumen
de las esferas de gel y, por menos búfer pequeño para
ende, atraviesan la columna obtener una
más rápido que las No depende de resolución
moléculas pequeñas. ninguna adecuada. Esto
propiedad puede ser
específica de la problemático para
proteína para su proteínas que
retención y precipitan en altas
elución. concentraciones.

Cromatografía de Se utiliza la capacidad de las Capacidad para Algunas proteínas

afinidad proteínas para unirse explotar las no pueden
fuertemente a moléculas propiedades separarse por este
específicas, pero de manera bioquímicas método.
no covalente. Cuando una únicas de la
solución de proteína impura proteína deseada
pasa a través del material en lugar de las
cromatográfico, la proteína pequeñas
deseada se une al ligando diferencias en las
inmovilizado, mientras que propiedades
otras sustancias se lavan de fisicoquímicas
la columna con la solución entre proteínas.
reguladora.
Gran poder de
separación.
 Bibliografía

Alicia Hernández Peñaranda. (2003). Microbiología Industrial. Costa Rica: EUNED.

Teijón, J. M. Fundamentos de bioquímica estructural. 2006. Editorial Tebar.
Donald Voet, Judith G. Voet, Charlotte W. Pratt. Fundamentos De Bioquimica.
2007. Ed. Médica Panamericana.