PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG

Nguyên tắc
Cách tiến hành
Đánh giá
Nguyên tắc: Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng để định tính, thử tinh khiết và đôi khi để
bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất thuốc.
Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua
pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp
theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến
kính hoặc phiến kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với
nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các
cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những
tốc độ khác nhau. Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Cơ chế của sự chia tách có
thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của
nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động.
Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính
bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi:
trong đó:
a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng
cm.
b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng
đường đi của vết, tính bằng cm.
Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l.
Cách tiến hành
Dụng cụ
Bình triển khai, thường bằng thuỷ tinh trong suốt có kích thước phù hợp với các phiến kính cần
dùng và có nắp đậy kín.
Ðèn tử ngoại, phát các bức xạ có bước sóng ngắn 254 nm và bước sóng dài 365 nm.
Dụng cụ để phun thuốc thử.
Tủ sấy điều nhiệt để hoạt hóa và sấy bản mỏng và sắc ký đồ, hoặc để sấy nóng đối với một số
phản ứng phát hiện.
Tủ hút hơi độc.
Máy sấy dùng để sấy khô sắc ký đồ và cho phép chấm nhanh nhiều lần những dung dịch pha
loãng chất cần phân tích.
Một máy ảnh thích hợp (với ống kính Macro) có thể chụp lưu giữ sắc ký đồ ở ánh sáng ban ngày
với khoảng cách 30-50 cm.
Tủ lạnh để bảo quản những thuốc thử dễ hỏng.
Micropipet nhiều cỡ từ l, 2, 5, 10 đến 20 ml, các ống mao quản hoặc dụng cụ thích hợp.
Bản mỏng tráng sẵn chất hấp phụ có chất phát quang thích hợp.
Trường hợp phòng thí nghiệm không có điều kiện trang bị các loại bản mỏng tráng sẵn thì tự
chuẩn bị lấy bản mỏng với các dụng cụ sau đây:
Các tấm kính phẳng có kích thước phù hợp đã được xử lý trước bằng hóa chất rồi rửa sạch bằng
nước và sấy khô.
Thiết bị trải chất hấp phụ lên tấm kính thành một lớp mỏng đồng đều, có chiều dày thích hợp.
Giá để xếp các tấm kính đã trải.
Chuẩn bị bản mỏng
Sắp xếp các bản mỏng và chuẩn bị thiết bị: Các phiến kính phải được lau chùi cẩn thận và tẩy
sạch hoàn toàn các chất béo bằng cách ngâm trong dung dịch sulfocromic. Sau đó, cọ kỹ bằng
bàn chải dưới tia nước máy rồi tráng nước cất và sấy khô trên giá ở nhiệt độ thường hay trong tủ
sấy.
Ðiều chế vữa của chất hấp phụ: Chất hấp phụ được chọn lọc sao cho phù hợp với yêu cầu phân
tích như: Silicagel G, kieselguhr, cellulose, nhôm oxyd, trong số đó silicagel G được dùng thông
dụng nhất. Trộn 25g silicagel G với 50 ml nước cất và nhào trong cối hoặc lắc mạnh trong bình
nón có dung tích 200 - 250 ml, nút kín, trong 30 - 45 giây. Dịch treo tạo được ở dạng lỏng và
đồng nhất, se lại trong vài phút sau đó, vì có bột bó. Rót ngay vào thiết bị trải đã điều chỉnh độ
dày cho bản mỏng khoảng 0,25 mm (nếu không có chỉ dẫn trong chuyên luận riêng).
Ðể nguyên các phiến kính tại chỗ khoảng 10 phút tới khi mặt trên hết bóng, hoặc để khô tự nhiên
qua đêm tại nhiệt độ phòng.
Hoạt hóa: Cho các bản mỏng đã khô mặt vào tủ sấy và sấy ở 105 - 110oC trong 30 phút (nếu
không có chỉ dẫn ở chuyên luận riêng). Ðể nguội rồi bảo quản trong bình hút ẩm. Khi dùng, nếu
cần thì hoạt hóa lại bằng cách sấy ở 105-1100C trong 1 giờ rồi cạo bỏ một dải mỏng chất hấp phụ
dọc hai bên cạnh của tấm kính.
Chuẩn bị bình khai triển: Các bình khai triển thường là bình thủy tinh, hình hộp hay hình trụ, có
nắp đậy kín, kích thước thay đổi tùy theo yêu cầu của các bản mỏng sử dụng. Bão hòa hơi dung
môi trong bình bằng cách lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình, rồi rót một lượng vừa đủ
dung môi vào bình, lắc rồi để giấy lọc thấm đều dung môi. Lượng dung môi sử dụng sao cho sau
khi thấm đều giấy lọc còn lại một lớp dày khoảng 5 mm đến 10 mm ở đáy bình. Ðậy kín nắp
bình và để yên 1 giờ ở nhiệt độ 20 - 25oC. Muốn thu được những kết quả lặp lại, ta chỉ nên dùng
những dung môi thật tinh khiết, loại dùng cho sắc ký. Những dung môi dễ bịến đổi về hóa học
chỉ nên pha trước khi dùng. Nếu sử dụng những hệ pha động phức tạp phải chú ý đến những
thành phần dễ bay hơi làm thay đổi thành phần của hệ pha động dẫn đến hiện tượng không lặp lại
của trị số Rf.
Chấm chất phân tích lên bản mỏng: Lượng chất hoặc hỗn hợp chất đưa lên bản mỏng có ý nghĩa
quan trọng đối với hiệu quả tách sắc ký, đặc bịệt ảnh hưởng rất lớn đến trị số Rf. Lượng chất quá
lớn làm cho vết sắc ký lớn và kéo dài, khi đó, vết của các chất có trị số Rf gần nhau sẽ bị chồng
lấp. Lượng chất nhỏ quá có thể không phát hiện được do độ nhạy của thuốc thử không đủ (thông
thường độ nhạy của các thuốc thử trên 0,005 mg). Lượng mẫu thông thường cần đưa lên bản
mỏng là 0,1 - 50 mg ở dạng dung dịch trong ether, c1oroform, nước hay dung môi thích hợp
khác. Thể tích dung dịch từ 0,001 ml đến 0,005 ml đối với trường hợp đưa mẫu lên bản mỏng
dưới dạng điểm và từ 0,l - 0,2 ml khi đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng vạch như trong trường
hợp sắc ký điều chế. Ðối với sắc ký điều chế thì lượng chất có thể lên tới 10 - 50 mg. Ðối với các
dung dịch có nồng độ rất loãng thì có thể làm giàu trực tiếp trên bản mỏng bằng cách chấm nhiều
lần ở cùng một vị trí và sấy khô sau mỗi lần chấm.
Ðường xuất phát phải cách mép dưới của bản mỏng 1,5cm - 2 cm và cách bề mặt dung môi từ
0,8 - 1 cm. Các vết chấm phải nhỏ, có đường kính 2 - 6 mm và cách nhau 15 mm. Các vết ở bìa
phải cách bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm để tránh hiệu ứng bờ. Khi làm sắc ký lớp mỏng bán
định lượng, độ chính xác của kết quả phân tích phụ thuộc rất nhiều vào độ chính xác của lượng
chất thử đưa lên bản mỏng, tức là thể tích dung dịch chấm lên bản mỏng. Do đó, với những
trường hợp phân tích bán định lượng phải dùng các mao quản định mức chính xác. Khi không
cần định lượng dùng micropipet hoặc ống mảo quản thường.
Triển khai sắc ký: Ðặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở
trên bề mặt của lớp dung môi khai triển. Ðậy kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi. Khi dung
môi đã triển khai trên bản mỏng được một đoạn theo quy định trong chuyên luận, lấy bản mỏng
ra khỏi bình, đánh dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng rồi hiện
vết theo chỉ dẫn trong chuyên luận riêng.
Đánh giá: Quan sát các vết xuất hiện, tính giá trị Rf hoặc Rr và tiến hành định tính, phát hiện tạp
chất hoặc định lượng như quy định trong chuyên luận riêng.
Việc sắc ký lớp mỏng được tiến hành trong điều kiện chuẩn hoá cho kết quả có độ tin cậy cao
hơn. Hiện nay người ta thường tiến hành sắc ký với sự giúp đỡ của hệ thống sắc ký lớp mỏng
hiệu năng cao (Planar chromatography - HPTLC).

Sắc kí lớp mỏng (thin layer chromatography - TLC) là một kĩ thuật sắc kí được dùng để tách các
chất trong hỗn hợp[1]. Phương pháp sắc kí lớp mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất
hấp phụ, thường là silica gel, aluminium oxide, hoặc cellulose được phủ trên một mặt phẳng chất
trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp và
được hút lên bản sắc kí bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các
thành phần trong dung dịch.

Sắc kí lớp mỏng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực:

• xét nghiệm độ tinh khiết của các hóa chất phóng xạ trong dược khoa
• xác định các sắc tố trong tế bào thực vật
• phát hiện thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng trong thức ăn, hoặc
• nhận biết những hóa chất trong một chất cho sẵn
• giám sát các phản ứng hữu cơ

Một số cải tiến có thể kết hợp phương pháp truyền thống để tự động hóa một vài bước, làm tăng
độ dung giải của sắc kí lớp mỏng và cho số liệu chính xác hơn. Phương pháp này được gọi là sắc
kí lớp mỏng hiệu năng cao (high performance TLC - HPTLC).

Chuẩn bị bản sắc kí

Bản sắc kí được làm bằng cách trộn chất hấp phụ, như silica gel, với một lượng nhỏ chất trơ để
kết dính, như calcium sulfate (thạch cao), và nước. Hỗn hợp này được trải ra như một lớp vữa
đặc trên một bề mặt chất trơ, như thủy tinh, nhôm, hoặc nhựa. Bản sắc kí này sẽ được để khô và
kích hoạt bằng cách nung nóng trong lò trong 30 phút ở nhiệt độ 110°C. Độ dày của lớp hấp phụ
thường là 0.1-0.25 mm cho hóa học phân tích, và khoảng 1-2mm cho sắc kí lớp mỏng dự bị.
Trong mọi kĩ thuật sắc kí đều bao gồm 1 pha động và 1 pha tĩnh.

Kỹ thuật

Phương pháp tiến hành giống với sắc kí giấy với lợi thế là nhanh hơn, tách hỗn hợp hiệu quả
hơn, và có sự lựa chọn giữa các "pha tĩnh" khác nhau. Bởi tính đơn giản và nhanh, sắc kí lớp
mỏng thường được dùng để giám sát các phản ứng hóa học và phân tích chất lượng sản phẩm của
phản ứng.

Một vệt nhỏ dung dịch chứa mẫu thử được thấm lên bản sắc kí, khoảng 1 cm từ dưới lên. Bản
sắc kí sau đó được nhúng vào một dung môi thích hợp, như ethanol hoặc nước, và được đặt vào
trong một vật chứa có nắp. Dung môi di chuyển lên bản sắc kí bởi mao dẫn, gặp phải mẫu thử và
dịch chuyển mẫu thử lên bản sắc kí. Các hợp chất khác nhau trong hỗn hợp mẫu thử dịch chuyển
với tốc độ khác nhau do chúng có sức hút khác nhau đối với pha tĩnh, và độ tan khác nhau trong
dung môi.

Các hợp chất được tách ra dựa trên sự cạnh tranh của chất tan và pha động để có được chỗ liên
kết với pha tĩnh. Thí dụ, nếu silica gel được dùng như pha tĩnh, nó được xem là phân cực. Cho
trước 2 hợp chất có tính phân cực khác nhau, chất nào có tính phân cực lớn hơn sẽ có sự liên kết
với silica gel lớn hơn và vì thế sẽ có khả năng đẩy pha động ra khỏi các chỗ liên kết. Do đó, hợp
chất có tính phân cực nhỏ hơn sẽ di chuyển lên cao hơn trên bản sắc kí (kết quả là hệ số lưu Rf sẽ
lớn hơn). Nếu pha động được thay bằng một dung môi phân cực hơn hoặc là một hỗn hợp các
dung môi, nó sẽ có khả năng để đẩy các chất tan ra khỏi chỗ liên kết với silica gel, và tất cả các
hợp chất trên bản sắc kí sẽ dịch chuyển lên cao hơn. Trên thực tế, nếu chúng ta dùng một hỗn
hợp ethyl acetate và heptane như là pha động, tăng thêm ethyl acetate sẽ cho hệ số lưu Rf cao
hơn cho tất cả các hợp chất trên bản sắc kí. Thay đổi độ phân cực của pha động sẽ không làm các
hợp chất có thứ tự di chuyển ngược lại trên bản sắc kí. Nếu muốn có một thứ tự ngược lại trên
bản sắc kí, một pha tĩnh không phân cực sẽ được sử dụng, như là C18-chức năng hóa silica.

Quá trình sắc kí lớp mỏng: một hỗn hợp của một ho85p chất đỏ và một hợp chất lam được tách
biệt trong quá trình sắc kí (dung môi màu xanh nhạt di chuyển lên trên bản sắc kí.

Dung môi thích hợp dùng trong sắc kí lớp mỏng sẽ là một dung môi có tính phân cực khác với
pha tĩnh. Nếu một dung môi phân cực được dùng để hòa tan mẫu thử trên một pha tĩnh phân cực,
vệt nhỏ mẫu thử sẽ lan tròn do mao dẫn, và các vệt khác nhau có thể trộn lẫn vào nhau. Do đó, để
hạn chế sự lan tròn của các vệt mẫu, dung môi được sử dụng để hòa tan mẫu thử phải không
phân cực, hoặc phân cực một phần, nếu pha tĩnh phân cực, và ngược lại.

Phân tích

Do một số hóa chất khi được tách ra sẽ trở nên không màu, một vài phương pháp được sử dụng
để quan sát những vệt này:

• Thông thường, một lượng nhỏ chất huỳnh quang, thường là maganese-activated zinc
silicate, được cho thêm vào chất hấp phụ để có thể quan sát được những vệt này dưới ánh
sáng đen (tia cực tím UV254). Lớp hấp phụ vì thế sẽ tự phát ra ánh sáng lục, nhưng các vệt
mẫu sẽ làm tắt ánh sáng này.
• Hơi Iodine cũng là một loại thuốc thử cho màu giống nhau.
• Một số thuốc thử cho màu riêng biệt được dùng để nhúng bản sắc kí vào, hoặc phun lên
bản sắc kí.
 • Trong trường hợp của chất béo, sắc phổ có thể sẽ được chuyển qua một màng
polyvinylidene fluoride (PVDF) và sau đó sẽ được phân tích sâu hơn, chẳng hạn như khối
phổ.

Một khi đã trở nên quan sát được, hệ số lưu Rf của mỗi vệt mẫu sẽ được xác định bằng cách chia
khoảng cách di chuyển được của hợp chất cho khoảng cách di chuyển được của dung môi.
Những số liệu này phụ thuộc vào các loại dung môi được sử dụng và các loại bản sắc kí, và
không phải là hằng số.

[sửa] Ứng dụng

Trong hóa học hữu cơ, phản ứng được giám sát chất lượng bởi sắc kí lớp mỏng. Các mẫu thử
được thấm lên bản sắc kí bằng một ống mao dẫn: một vệt nhỏ chất ban đầu, một vệt nhỏ từ hỗn
hợp phản ứng, và một vệt nhỏ gồm cả 2 chất. Một bản sắc kí nhỏ (3 cm x 7 cm) sẽ mất khoảng
khoảng hai, ba phút để vận hành. Quá trình này phân tích chất lượng và sẽ chỉ ra nếu chất ban
đầu biến mất, sản phẩm được tạo thành, và bao nhiêu sản phẩm được tạo thành. Đáng tiếc rằng
sắc kí lớp mỏng đối với các phản ứng xảy ra ở nhiệt độ thấp có thể cho ra kết quả không đúng,
bởi vì các mẫu thử sẽ được làm ấm lên trong mao dẫn. Một trong những phản ứng như vậy là
phản ứng khử ester bởi DIBALH thành aldehyde.

Một ví dụ là sắc kí được áp dụng cho một phần lá xanh (ở đây là rau chân vịt) qua 7 bước.
Carotene tách ra nhanh chóng và chỉ quan sát được cho đến bước 2. Chlorophyll A và B hiện rõ
ở giữa bản sắc kí trong bước cuối cùng và lutein là hợp chất đầu tiên nhuộm màu vàng lên bản
sắc kí.

Trong một nghiên cứu, sắc kí lớp mỏng đã được sử dụng để lọc phản ứng hóa học hữu cơ[2], như
tổng hợp BINAP từ 2-naphtol. Trong phương pháp này, cồn và dung dịch xúc tác (chẳng hạn
như iron(III) chloride được đặt riêng rẽ trên đường gốc, sau đó phản ứng với nhau và được phân
tích ngay lập tức.