UNIVERSIDAD DEL VALLE DE MEXICO

LAUREATE INTERNATIONAL UNIVERSITIES

Carrera: QUÍMICO FARMACÉUTICO BIOTECNÓLOGO

Grupo: 01B Materia: Biología Celular Fecha:08/06/16

INTRODUCCIÓN
Para la extracción del DNA del núcleo de las células, es necesario el hidróxido de sodio
(NaOH) y sodio duo-decil sulfato (SDS). Este tratamiento favorece a la ruptura de la pared y de
la membrana celular, además de contribuir a la desnaturalización de las proteínas. El DNA se
encuentra en el núcleo de las células asociado a proteínas. Con el fin de liberar el DNA de las
proteínas, se utilizan una serie de agentes desnaturalizantes, como el perclorato de sodio y la
mezcla de cloroformo y alcohol isoamilo. Después de agregar los agentes desnaturalizantes se
centrifuga la solución y se obtienen dos fases: una orgánica y una acuosa se encuentra el
DNA. La mezcla de cloroformo y alcohol no solo desnaturaliza las proteínas, sino que disuelve
los lípidos de la muestra y aumenta la separación de las fases.

El DNA de la fase acuosa se recupera por precipitación. La precipitación con etanol absoluto en
presencia de una sal es un método muy utilizado en los procesos de extracción de DNA, luego
el DNA se disuelve en solución salina.

OBJETIVO
• Conocer la metodología básica para la extracción de ADN

• Adquirir destreza en la manipulación de diversas muestras biológicas para la extracción de

ADN

HIPOTESIS
Si el medio preparado es óptimo para la extracción y preparación de la muestra, entonces podremos
obtener el grado de pureza de DNA en la muestra preparada, así como también su concentración.

MATERIAL RIESGOS A LA SALUD :

Etanol estabilizado ACS 2-Peligroso.
3-Muy peligroso.
4- Mortal
Fenol INFLAMABILIDAD:
0-No se inflama
2-Debajo de 93°C
Cloroformo REACTIVIDAD:
2-inestable en caso de
cambio químico violento
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Grupo: 01B Materia: Biología Celular Fecha:08/06/16

PROCEDIMIENTO
Extracción de ADN de E. coli

 Propagar un cultivo de E. coli en medio LB (3 mL) durante toda la noche

(14-16 h) a37°C con agitación constante de >200 rpm.
 Resuspender E. coli en 500 μL de 𝐻2 𝑂 dest esteril.
 Centrifugar 2min 7000 rpm
 Descartar el sobrenadante
 Resuspender en 250 μL con TE
 Poner en vortex 30 seg
 Agregar 500 μL de fenol equilibrado con Tris
 Agitar vortex 30 seg.
 Agrega cloroformo-isoamilico 500 μL
 Centrifugar a 15000g durante 7 min
 Recuperar fase acuosa y agregar etanol al 100 %
 Incubar 30 min
 Centrifugar a 15000g durante 5 min
 Recuperar fase acuosa
 Adicionar etanol al 70% 1ml
 Centrifugar a 15000g durante 5 min
 Recuperar fase acuosa
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DATOS/RESULTADOS
Lectura en el 260 nm. 280 nm.
espectrofotómetro.
Tubo 1 .000 .000
Tubo 2 -.191 -.083
Tubo 3 .291 .319
Tubo 4 .051 .062
Tubo 5 .061 .083

Se observa que los valores obtenidos en el espectrofotómetro en

cada tubo, no variaron entre sí mismos al ser leídos a 260 y 280 nm, sin
embargo, las cantidades obtenidas entre tubo 2, 3, 4 y 5 muestran
variación evidente, por lo que se entiende que en algunos se encuentra
mayor cantidad de ADN puro, mientras que los que presentan valores
negativos, se sabe que no hay presencia de ADN, tomando como base del
espectrofotómetro el Tubo 1, que contenía agua destilada.
Para saber la cantidad de ADN, fue necesario dividir el valor obtenido al ser
leído el tubo a 260 nm, entre el valor obtenido al ser leído el mismo a 280
nm. Siendo que la presencia de ADN puro, se expresaría con valores de
1.65 a 1.9.
Por lo que en el tubo 3, fue una obtención exitosa de ADN, sin embargo no
es una muestra completamente pura.

Para la obtención de la concentración de ADN obtenida, fue necesario hacer los siguientes
cálculos:

A260= .291
𝟐𝟎 𝒎𝒊𝒄𝒓𝒐𝒍
Factor de dilución= ( 𝟓𝟎𝟎𝒎𝒊𝒄𝒓𝒐𝒍)

𝟐𝟎 𝒎𝒊𝒄𝒓𝒐𝒍 𝟏𝟎𝟎𝟎 𝒎𝒊𝒄𝒓𝒐𝒍

(.291) ( 𝟓𝟎𝟎𝒎𝒊𝒄𝒓𝒐𝒍)(50ng/microl)= .582 || .582ng/microl ( ) = 5.82x𝟏𝟎−𝟒 ng/ml
𝒎𝑳
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DISCUSIÓN
Principalmente, consideramos los conceptos necesarios para comprender la elaboración de
esta práctica, tales como lo son purificación y concentración – cuantificación. El concepto de
purificación se entiende como el proceso por el cual se realiza la separación del ADN, de otras
moléculas constitutivas de la célula. La concentración – cuantificación se entiende como el
proceso por el cual se realiza un análisis de la cantidad de análisis presente en una muestra o
solución.

Una vez obtenido el material genético, lo importante es determinar el rendimiento mediante

espectrofotometría. La Ley de Beer-Lambert nos indica que la concentración de una molécula
en solución depende de la cantidad de luz absorbida de las moléculas disueltas en la muestra.
Una característica del ADN es que absorbe la luz ultravioleta (UV) a 260nm y permite estimas
su concentración mediante espectrofotometría. Cuando la longitud de la celda en que se
disuelve el ADN, es de 1cm, la absorbancia es igual a la densidad óptica (DO).

Para estimar la pureza del ADN se considera la proporción de la absorbancia a 260nm y

280nm. Una proporción de 1.8 es aceptada como ADN puro, proporciones menores a este
valor indican la presencia de proteínas. Una segunda valoración de la pureza de ácidos
nucleicos es la proporción 260/230, los valores aceptados se encuentran en el rango 22.0 a
2.2, si la relación es menor indican la presencia de contaminantes como proteínas.

Los cálculos que realizamos presentan resultados no dentro de las referencias de pureza, por
lo cual podemos considerar que la muestra realizada para cuantificación de DNA no es 100%
pura.
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CONCLUSIÓN
Concluimos que, en el momento de realizar los cálculos correspondientes al nivel de pureza
conseguidos en el ADN de la muestra, nuestros datos mostraron una concentración baja de
ADN presente en el tubo #3, lo que nos da a concluir que hubo presencia de factores de error
tales como proteínas o carbohidratos.
El ADN tiene su absorbancia máxima en 260nm (al igual que el ARN y las proteínas tienen un
rango de absorción aproximado de 210nm a 300nm). Normalmente para ver si el ADN está
bien purificado hacemos una estimación recurriendo al cociente de absorción A260/A280. Con el
primer cociente vemos el posible contenido en proteínas de la muestra, ya que la absorbancia
máxima de estas es a 280nm. Entonces concluimos que cuanto mayor sea este cociente
menos cantidad de proteínas tiene la muestra. Se considera puros cuando tienen un ciciente
sobre 1.8 – 2.0
La extracción de ADN íntegro y sin contaminantes es esencial para tener éxito en la obtención
de datos genéticos, esto es importante ya que es el primer paso en la lista de técnicas
moleculares que nos llevaran a comprender mejor y conservar la diversidad biológica a partir
del conocimiento de genes y genomas.

BIBLIOGRAFÍA

Silvia Quesada Mora, “Manual de experimentos de laboratorio para Bioquímica”, Ed. Universidad
Estatal a Distancia, ISBN: 978-9968-31-616-3

Laura Patricia Alejos Velázquez, 2000, “Extracción y purificación de ADN”, edit.

Practicas estudiantiles, pág. 5-7