Dozarea acidului piruvic din ficat

Principiul metodei:
- acidul piruvic este dozat cu 2,4-dinitrofenilhidrazină, iar hidrazona formată dă o
coloraţie roşie în mediu alcalin.

Reactivi şi soluţii:
- soluţie piruvat de sodium 2 mM – standardul folosit pentru curba de calibrare (masa
moleculară = 110 g/mol)
- soluţie 2,4-dinitrofenilhidrazină 1 mM în HCl 1N (masa moleculară = 198,14 g/mol)
- soluţie NaOH 0,4 N – asigură pH alcalin (masa moleculară = 40 g/mol)
- soluţie acid tricloracetic 10% - precipită proteinele (se cântăresc 10 g la 100 ml apă)

Modul de lucru:
1). Prepararea curbei etalon
ml soluţie piruvat Conc. piruvat Densitatea optică
Nr. crt. ml apă distilată
de sodiu 2 mM (µmol/ml) (DO) la 546 nm
1 0 1 0
2 0,1 0,9 0,2
3 0,2 0,8 0,4
4 0,3 0,7 0,6
5 0,4 0,6 0,8
6 0,5 0,5 1

- La 1 ml soluţie piruvat de sodiu diluată conform tabelului se adaugă 1 ml soluţie 2,4-

dinitrofenilhidrazină 1 mM în HCl 1N.
- Se omogenizează şi se lasă 20 minute la temperatura camerei.
- Se adaugă 10 ml NaOH 0,4 N, apoi se omogenizează şi se lasă 10 minute la temperatura
camerei.
- Se citeşte densitatea optică la 546 nm faţă de apă distilată (adică primul punct din
curbă).

2). Dozarea piruvatului din ficat

Două grame de ficat se mojarează cu nisip de cuarţ şi se trece cantitativ prin adăugarea a
5 ml apă distilată într-un pahar (tub de centrifugă) în care se adaugă 5 ml soluţie acid
tricloracetic 10%.
Se răceşte pe gheaţă şi se centrifughează 15 minute la 4000 rpm.
Se ia 1 ml supernatant şi se prelucrează la fel ca soluţia de piruvat din curba etalon.

Calcularea rezultatelor:
Se determină cantitatea de acid piruvic per gram de ţesut prin extrapolarea densităţii
optice a probei din ficat pe curba etalon.