Universidad Santiago de Cali

Facultad de Ciencias Básicas

Programa de Microbiología

Manual de prácticas
Laboratorio de Biología Celular y Molecular

Estudiante _______________________

2018
 TABLA DE CONTENIDO Y CRONOGRAMA DEL CURSO

N° Guía de trabajo Página Fecha

Practica
1 Calibración y uso de micropipetas 3
2 Transporte a través de membrana 10
3 Recuento en cámara de Neubauer y preparación de 16
inóculos
4 Mitosis en el meristemo radicular de cebolla (Allium 22
cepa)
5 Extracción de ADN de Saccharomyces cerevisiae 27

6 Evaluación de la cantidad y calidad del ADN 29

7 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR): 32
Amplificación la región ITS1-ITS2 de
Saccharomyces cerevisiae

8 Introducción al uso de herramientas 36

bioinformáticas

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 GUIA DE TRABAJO N°1
CALIBRACION Y USO DE MICROPIPETAS

OBJETIVOS
 Identificar las distintas partes de una micropipeta monocanal y adquirir destreza en la utilización de la
misma para la medición de volúmenes entre 0,5 y 1000 µL.
 Determinar de la precisión y la calibración de la micropipeta por medio del cálculo de la exactitud (E%) y
el coeficiente de variación (CV%).

FUNDAMENTOS TEÓRICOS
Las pipetas son dispositivos que se utilizan para medir o transvasar pequeños volúmenes de líquido de un
recipiente a otro con gran exactitud. Las pipetas tienen gran diversidad de modelos; inicialmente se fabricaron en
vidrio, pero en la actualidad existe una amplia gama de opciones, entre las que se destacan las pipetas de volumen
fijo y las de volumen variable que disponen de controles mecánicos. También se han introducido recientemente
en el mercado pipetas que disponen de controles de tipo electrónico (Equipos y laboratorios de Colombia, 2011).
En el presente laboratorio se tratarán los aspectos del buen uso y la calibración de la micropipeta.

Principios de operación de una Micropipeta

La micropipeta de pistón funciona transmitiendo la fuerza que un operador ejerce de forma manual sobre el
émbolo, el cual se encuentra unido a un pistón mediante un eje que lo desplaza a lo largo de un cilindro de longitud
fija, forzando un volumen predefinido de líquido fuera de la micropipeta (Figura 1). Las micropipetas son de dos
tipos: las de volumen fijo, que dispensan un volumen predeterminado de líquido (el cual es conocido como
volumen nominal [Vn]), y las de volumen variable, que permiten ajustar el volumen a ser dispensado dentro de
un rango determinado en las especificaciones de la micropipeta, lo cual ocurre modificando la longitud de la
carrera del pistón dentro del émbolo. (Equipos y laboratorio de Colombia, 2011).

Figura 1. Esquema la Micropipeta monocanal (Blues, et al. 2004)

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Las pipetas de volumen fijo y las de volumen variable se pueden subdividir en dos subtipos: A y B. Las pipetas
del subtipo A, se denominan pipetas de desplazamiento por aire, debido a que existe un volumen de aire entre la
cabeza del pistón y el líquido en el cilindro (Figura 2.1). Por su parte, las pipetas del subtipo B son denominadas
pipetas de desplazamiento positivo o de desplazamiento directo, debido a que el pistón se encuentra en contacto
directo con el líquido (Figura 2.2).

Figura 2. Partes internas una micropipeta de desplazamiento por aire y una de desplazamiento positivo.
(Tomado de Equipos y Laboratorios de Colombia).

Las micropipetas de desplazamiento de aire tienen la ventaja de presentar menos riesgos de contaminación cuando
se usan continuamente, pero no son tan exactas como las de desplazamiento positivo cuando se trabaja con
volúmenes muy pequeños de líquido, debido a la compresibilidad del aire. Todas las micropipetas de pistón
disponen de puntas desechables para minimizar los riesgos de contaminación. Sin embargo, se recomienda utilizar
las puntas suministradas por el fabricante, para garantizar el ajuste de las mismas al cuerpo de la pipeta, así como
la exactitud de los volúmenes a dispensar (Equipos y laboratorios de Colombia, 2011).

Recomendaciones para el uso de la micropipeta

 Asegúrese que está usando la micropipeta correcta para el volumen que necesita. NO TRABAJAR LA
MICROPIPETA CON VOLUMENES INFERIORES O SUPERIORES AL ESPECIFICADO POR EL
FABRICANTE. Esto descalibrará y dañará la micropipeta.
 Tener en cuenta que hay referencias de micropipetas que poseen un seguro, por lo cual este debe de ser
removido antes de ingresar el volumen a medir.
 Toda micropipeta utiliza puntas desechables, asegúrese que se usa la adecuada para cada volumen y
que esta correctamente ajustada.
 No utilizar la micropipeta con líquidos que destruyan el polipropileno.
 No utilizar líquidos que estén emitiendo vapores.
 La temperatura de los líquidos a pipetear deben estar entre 15 y 40ºC.
 Existe un código de color de acuerdo al volumen de las puntas: generalmente para P1000 las puntas
son azules, para P200 y P100 son amarillas, para P20 pueden ser amarillas o blancas y para P10 son blancas.

4
¿Cómo usar una micropipeta?
A continuación, se describen las actividades generales requeridas para utilizar la micropipeta.

1. Colocar una punta nueva en el porta-puntas de la pipeta, ejerciendo suave presión y girando. Evitar
contaminar la punta con otras sustancias o manipularla con la mano. Verificar que la misma quede bien ajustada
(Figura 3).

Figura 3. Inserción de la punta en el porta- puntas de la Micropipeta. (Tomado de Transferpette, 2016)

2. Presionar el émbolo suavemente hasta el primer tope. La micropipeta posee dos topes: el primero
corresponde al volumen deseado y el segundo al volumen nominal (total) de la micropipeta. Hasta este momento
la punta de la pipeta no debe estar sumergida en el líquido.
3. Sumergir la punta de la micropipeta en el líquido. Mantener la micropipeta en posición vertical, para evitar
la introducción de líquido al sistema. Este proceso corresponde al mostrado en la posición 1B (primera a la
izquierda) (Figura 4).
4. Liberar el émbolo suavemente para que la micropipeta absorba el líquido (posición 2A). Verificar que el
émbolo se desplace hasta la posición del límite superior. Esperar al menos dos segundos, antes de retirar la punta
de la micropipeta del líquido.
5. Colocar la punta de la Micropipeta contra la pared del recipiente en el cual será dispensado el líquido.
Verificar que el ángulo formado entre la punta de la pipeta y la pared del elemento receptor esté entre los 30° y
los 45°. Si el recipiente receptor ya tiene algún nivel de líquido, evitar que la punta de la pipeta quede
sumergida en el mismo (posición 3A).
6. Dispensar el contenido de la micropipeta presionando el émbolo de forma suave pero firme, hasta el primer
tope (posición 4B). Mantener en todo momento el contacto entre la punta de la pipeta y la pared del recipiente
receptor. Se recomienda frotar la punta de la micropipeta contra la pared de 8 a 10 mm, para asegurar que no
quede ninguna gota de líquido pegado a la punta.
7. Presionar el émbolo suavemente hasta que alcance el segundo tope en la carrera del pistón
(posición 5C). Esto expulsa cualquier fracción de líquido que hubiera podido quedar en la punta de la micropipeta,
al forzar el aire de la cámara a través del orificio de la punta de la pipeta. Mantener el émbolo presionado en el
segundo tope, mientras le retira la micropipeta del recipiente receptor. Una vez retirada la
micropipeta, liberar suavemente el émbolo hasta la posición límite superior.
8. Desechar la punta de la pipeta. Para esto accionar el botón del mecanismo de expulsión (posición 6)
(Contreras,ND).

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 Figura 4. Fases del uso de la micropipeta monocanal. (Tomado de Equipos y Laboratorio de Colombia,
2011)

MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES REACTIVOS
Balanza analítica Solución Colorante
Pipeta de 1 µL –10 µL
Pipeta de 10 µL –100 µL
Pipeta de 100 µL –1000 µL
2 Beaker de 100 mL
1 Beaker de 25 mL
1 Frasco lavador
Termómetro digital
Puntas para cada tipo de micropipeta

PROCEDIMIENTO

1. Instalar una punta nueva en la micropipeta.

2. Succionar con la micropipeta agua destilada del recipiente de almacenamiento y desecharla en el recipiente de
desperdicio al menos 5 veces, con el fin de estabilizar la humedad del volumen de aire en el interior de la
micropipeta.
3. Añadir agua al recipiente que se utilizará para pesar (beaker de 25 mL), hasta que se obtenga una altura del
líquido de al menos 3 mm.
4. Registrar la temperatura del agua, la presión ambiental y la humedad relativa (Opcional).
5. Introducir el beaker en la balanza y efectuar la tara para que la lectura de la misma quede en cero (0)
6. Llenar la micropipeta con el volumen deseado de agua (con colorante) del recipiente de almacenamiento y
dispensarla en el recipiente de pesado. Expulsar la totalidad del agua.
7. Registrar el nuevo peso detectado por la balanza en la Tabla 1 (Anexo).
8. Repetir los pasos 5, 6 y 7 por nueve (9) veces adicionales, registrando al final de cada ciclo el peso que registra
la balanza. La densidad del agua es 1 g/mL a 25 ºC, por lo tanto, un volumen de 1 mL corresponde
aproximadamente a una masa de 1 g, 300 μL a 0.3 g, 200 μL a 0.2 g y así sucesivamente.

6
10. Registrar la temperatura del líquido en el recipiente de pesado al final del décimo ciclo y medir el tiempo
transcurrido desde el inicio de las mediciones.
11. Evaluar si la evaporación ha sido significativa, (caso crítico cuando se trabaja con micropipetas de volumen
muy pequeño). Si así se estima, se debe permitir que trascurra un período de tiempo adicional [Ta], igual al
utilizado durante las diez mediciones, y cuando se complete, efectuar una nueva lectura del peso que registra la
balanza.
12. Dividir la masa de agua perdida por evaporación en el tiempo adicional [Ta] por el número total de muestras
analizadas (diez). Esto dará un indicativo promedio de la masa de líquido perdida, debido a evaporación por ciclo,
cifra que debe añadirse a cada una de las lecturas de masa realizadas (Contreras, ND)

CÁLCULOS
Para cada micropipeta revisar el porcentaje de exactitud (E%) y el coeficiente de variación (CV%) en todo el
rango usando al menos dos volúmenes diferentes. Ejemplo: Para la micropipeta P1000 revisar los volúmenes de
300 µL y 1000 µL, para P200 revisar los volúmenes de 60 y 200 µL y para P10 revisar 3 y 10 µL.

Calculo de la exactitud (E%) y del coeficiente de variación (CV%)

Los valores de las pesadas del control gravimétrico son sólo la masa del volumen dosificado. Para obtener el
volumen real se debe efectuar un cálculo corrector. El cálculo corrector se realiza por multiplicación del valor
medio de los valores de las pesadas (X) con el factor Z (mL/g que es lo mismo que µl/mg), que toma en
consideración la densidad del agua, la temperatura de control y la presión atmosférica.
Se puede considerar que Z equivale a 1,0032 µl/mg, cuando se tiene 21,5 °C, 1013 mbar (hPa) y se ha utilizado
agua destilada o Z es igual a 1,0029 µl/mg cuando se tiene 20,5 °C y 1013 mbar (hPa) o 1,0039 a 25 °C. El factor
Z es igual a 1/densidad (Transferpette, 2016)

Ejemplo:
Se tienen las siguientes condiciones:
 Valores del control a 21,5 °C que corresponde a Z = 1,0032
 Volumen controlado Vo (µL): 200,0000
Volumen controlado 200,0000
 Valor nominal (mg) = = =199,3620
𝑍 1,0032
 Mediciones (mg):
X1 =200,2000
X2=199,6000
X3= 199,4900
X4= 199,7000
X5= 199,7000

 Valor medio
∑ 𝑥𝑝
𝑋̅ =
𝑛

xp: resultado de las pesadas

n: número de pesadas

7
 Volumen medio:
̅ =𝑋̅* Z
𝑽
̅ = 200,2+199,6+199,49+199,7+199,7* 1,0032
𝑽
5
̅ = 199,738 ∗ 1,0032
𝑽
̅ = 200,3772
𝑽

 Exactitud (E%)
𝑉̅ − 𝑉 𝑛𝑜𝑚𝑖𝑛𝑎𝑙
𝑬 [%] = ∗ 100
𝑉 𝑛𝑜𝑚𝑖𝑛𝑎𝑙
200,3772 − 200
𝑬 [%] = ∗ 100
200
𝑬 [%] = 0,189

 Desviación estándar

∑(𝑋𝑖 − 𝑋̅ 2
𝑺=𝑍∗√ 𝑛−1 )

√(200,2 − 199,74)2 + (199,6 − 199,74)2 + (199,49 − 199,74)2 + (199,7 − 199,74)2 + (199,7 − 199,74)2
𝑺 = 1,0032 ∗
4

0,29688
𝑺 = 1,0032 ∗ √
4

𝑺 = 0,279

 Coeficiente de variación
𝑆∗100
CV[%]= ̅
𝑉
0,273∗100
CV[%]= 200,3772

CV[%]= 0,136

Según el ejemplo citado, se obtienen los siguientes resultados:

Volumen controlado (μL) = 200,0000

Volumen medio (μL) = 200,3772
E [%] = 0,189
CV [%] = 0,136

8
Partiendo de la exactitud E [%] y el coeficiente de variación CV [%], se pueden calcular los límites de tolerancia
de las instrucciones de manejo:
E [%] nominal* 0,500
CV [%] nominal* 0,200

Si los valores calculados de exactitud (E [%]) y coeficiente de variación (CV [%]) son menores que los valores
de tolerancia o iguales a éstos, entonces la micropipeta está en orden.

CV% nominal
Volumen (μL) E% nominal CV% nominal
5-10 1 0,8
20-50 0,7 0,4
100-1000 0,5 0,2

Tabla 1. Cálculos para la calibración de micropipetas

Micropipeta Micropipeta Micropipeta

0,5-10 µL 10-100 µL 100-10000 µL
Vol. Vol. Vol. Vol. Vol. Vol.
Peso 1
Peso 2
Peso 3
Peso 4
Peso 5
Peso 6
Peso 7
Peso 8
Peso 9
Peso 10

BIBLIOGRAFIA
Contreras, J. ND. Práctica: El uso de micropipeta. Biología Celular y Molecular Médica I.
Equipos y Laboratorio de Colombia. 2016. [en línea].
https://www.equiposylaboratorio.com/sitio/contenidos_pagina_mo.php?c=500

ESTADO LEGAL INTERNO DEL CURSO

Elaboró Alba Rocío Corrales, PhD E-mail rocio.corrales050@gmail.com
Valeria Pérez Luna MSc. valeriaperez@usc.edu.co
Revisado Sandra P. Rivera MSc. Departamento Ciencias Básicas
Aura Falco, PhD
Aprueba x Área Microbiología

9
 GUIA DE TRABAJO N°2
TRANSPORTE A TRAVÉS DE MEMBRANA

OBJETIVO GENERAL

 Comprender las propiedades osmóticas de la membrana plasmática tanto en células animales como
vegetales e identificar los diferentes tipos de transporte que se pueden presentar.

FUNDAMENTOS TEÓRICOS

La membrana plasmática es una de las estructuras de la célula que no es visible con el microscopio óptico. Es tan
delgada que solo se pudo obtener imágenes de la misma a finales de los años 50, con el uso combinado del
microscopio electrónico y técnicas de tinción. La membrana plasmática encierra el contenido de toda la célula y
así mismo, en el interior de la célula los organelos se encuentran delimitados por membranas. Todas estas
membranas tienen varias funciones en común, entre ellas está proveer una barrera con permeabilidad selectiva y
con la capacidad de transportar determinados solutos de un lado a otro de la membrana, a veces en contra del
gradiente de concentración (Karp, 2009).

El movimiento de sustancias a través de las membranas se puede clasificar en dos tipos básicos: mecanismos de
transporte PASIVO que ocurren por difusión, y mecanismos de transporte ACTIVO que ocurren gracias a un
gasto energético. Tres tipos básicos de transporte pasivo son: 1-Difusión simple a través de la membrana lipídica,
2-Difusión simple por un canal proteico acuoso y 3-Difusión facilitada por un transportador proteico.
Tres ejemplos de transporte a través de la membrana plasmática que incurren en un gasto energético son: 1-
Endocitosis, 2- Exocitosis y 3- Transporte Activo. La endocitosis y la exocitosis son procesos que involucran un
gran número de proteínas encargadas de armar el mecanismo por el cual se genera una vesícula a partir de la
membrana plasmática (endocitosis) o se funciona una vesícula interna con la membrana plasmática (exocitosis).
El transporte activo por el contrario requiere solo una proteína, llamada una “bomba”, la cual transporta sustancias
en contra del gradiente de concentración. La energía requerida para este tipo de transporte la obtiene la “bomba”
de procesos exergónicos como la hidrólisis de ATP. Entre los tipos de transporte pasivo está el proceso de ósmosis,
por el cual el agua se mueve a través de membranas celulares de una región de menor concentración de solutos a
una región de mayor concentración de solutos. Tomando como referencia la concentración del citoplasma, la
concentración de un medio extracelular puede ser: 1-Isotónico: cuando la concentración de los fluidos
extracelulares e intracelulares son iguales. 2-Hipertónico: cuando la concentración del fluido extracelular es
mayor a la concentración del fluido intracelular. 3-Hipotónico: cuando la concentración del fluido extracelular es
menor a la concentración del fluido intracelular.

Las células vegetales casi siempre están expuestas a medios acuosos y por lo tanto hipotónicos. Es así como se
genera una presión interna llamada “turgencia” generada por la tendencia del agua a entrar a la célula y la
resistencia de la pared celular en contra de la expansión de la membrana plasmática. La presión de turgencia
provee el soporte a las estructuras vegetales no leñosas como las hojas. Las células animales, por el contrario, casi
siempre se encuentran expuestas a medios isotónicos. Una importante excepción son las células que recubren la
pared del intestino y las que conforman los túbulos colectores del riñón. Estas células están encargadas de
reabsorber agua desde el lumen de los conductos (intestinal o renal) hacia el cuerpo. Muchas de estas células que

10
quedan expuestas a medios hipotónicos son más permeables al agua de lo que podría explicarse por difusión
simple a través de la bicapa lipídica. Esto se debe a la presencia de canales de agua, llamados “acuaporinas”, cuya
existencia fue recientemente comprobada por el investigador Peter Agre quien ganó el premio Nobel de Química
en el 2003 por elucidar la estructura de estos canales (Karp, 2009).

MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES REACTIVOS
Microscopio Tinción de Giemsa (diluida con buffer
Portaobjetos y cubreobjetos (láminas y fosfato)
laminillas) Metanol
Micropipetas 10-100 µL y 0.5-10 uL Soluciones salinas (NaCl) al 0.4% 0.9%
Caja de puntas blancas y amarillas y 2%.
Marcador Sharpie Elodea (Estudiante)
Gotero Muestra de sangre
Guantes de látex Alcohol antiséptico
Lanceta
Algodón
Toallas secante
Bandeja de tinción

PROTOCOLOS

A) Medio hipotónico, isotónico e hipertónico.

1. Divida dos láminas portaobjetos en tres secciones con un marcador Sharpie y rotule con 0.4%, 0.9% y 2%
respectivamente.
2. Adicione 20 µL de cada solución en la sección de la lámina respectiva (OJO: agregar cada una con puntas
diferentes).
3. Limpie una lámina (sin marcar) con alcohol.
4. Luego de lavarse las manos, limpie una de las yemas de sus dedos con alcohol antiséptico. Usando una
lanceta estéril puncione la yema SIN CAUSAR UNA HERIDA PROFUNDA.
5. Presione el dedo hasta obtener una gota pequeña de sangre y deposítela sobre la lámina.
6. Usando la micropipeta de 0.5-10 uL, transfiera 5uL de la muestra de sangre y deposítela en cada sección
de la lámina portaobjetos al lado de la gota de solución (sin mezclar). DEPOSITAR LA LANCETA JUNTO CON
LA PUNTA DE MICROPIPETA IMPREGNADA DE SANGRE EN EL TARRO GUARDIAN QUE SE
ENCUENTRA EN EL LABORATORIO.
7. Mezcle la solución al 2% y la sangre resuspendiendo suavemente con la micropipeta. Repita para las
soluciones 0.9% y 0.4%
8. Espere 5-10 minutos.
9. Extraiga 5 µL de la mezcla de la sección de la lámina 2% y póngala HACIA UN EXTREMO de una lámina
nueva marcada con 2%.
10. Use una laminilla o cubre-objetos y haga un extendido de la gota de sangre siguiendo el método descrito
en la Figura 1.

11
 Figura 1. Correcta realización del extendido de sangre. Tomado de
https://www.pinterest.es/pin/381328293426346792/

11. Con una toalla de papel secante limpie la lámina con la que hizo el extendido para usarla con las otras dos
muestras.
12. Repita los pasos 9, 10 y 11 para las muestras 0.9% y 0.4%. Deje secar las muestras entre 10-15 min.
13. Una vez seca aplique 1 a 2 gotas de metanol absoluto para cubrir el extendido. Deje secar.
14. Aplique 2-3 gotas de colorante de Giemsa y deje sobre el extendido aproximadamente 15 min.
15. Desechar el exceso de colorante inclinando el portaobjetos sobre una hoja de papel secador.
16. Lave la muestra agregando gotas de agua con un gotero y deseche el exceso de líquido inclinando el
portaobjetos sobre hojas de papel secador.
17. Deje secar por 5 min y observe en el microscopio SIN USAR LAMINILLA.
18. Empiece por la muestra 0.9%, esta solución se conoce como solución salina normal (fisiológica) porque es
isotónica con respecto al citoplasma de las células sanguíneas.
19. Con el objetivo de menor aumento en posición (4x), mueva el anillo macrométrico para enfocar las células.
20. Cambie el objetivo por el de 10x y enfoque las células. Haga un recorrido general por la muestra para
identificar zonas con diferentes tipos de células. Observará muchas células teñidas de color rosa pálido (glóbulos
rojos o eritrocitos) y otras menos numerosas teñidas intensamente de color púrpura (glóbulos blancos o
leucocitos).
21. Ahora cambie el objetivo por el de 40x. Dibuje al menos tres tipos de célula haciendo una representación
realista de la proporción del campo visual que las células ocupan (Figura 2).
22. Usando una guía para los tipos de leucocitos, indique en su dibujo los nombres de las células que usted
encontró.
23. ¿Qué estructura de la célula (que está teñida en los leucocitos), está ausente en los eritrocitos.

12
 Figura 2. Observación a 40x. Tipos celulares observados

24. La tinción de los eritrocitos es mucho más débil en el centro, al punto que parecen tener un hueco. Explique
¿Por qué los eritrocitos se ven así.
25. Esta forma particular de los eritrocitos los hace mejor en su trabajo, que es llevar el oxígeno a los tejidos
corporales. Explique ¿Por qué?
26. Ahora observe la muestra con solución salina al 2%, los solutos están más concentrados que en el
citoplasma de las células. ¿Por lo tanto la solución es: hipertónica, hipotónica o isotónica con respecto a las
células?
27. ¿En esta solución salina al 2%, usted espera que el agua salga de la célula o entre a la célula?
28. Enfoque la muestra con los objetivos 4x, 10x y 40x. Dibuje los eritrocitos a 40x haciendo una representación
realista de la proporción del campo visual que las células ocupan (Figura 3).

Figura 3. Observación de los eritrocitos a 40x en solución salina al 2%.

29. Ahora observe la muestra al 0.4%. En esta solución los solutos están menos concentrados que en el
citoplasma de las células. ¿Por lo tanto la solución es hipertónica, hipotónica o isotónica con respecto a las células?
30. En la muestra con la solución al 0.4%, ¿Usted espera que el agua salga o entre a la célula?

13
31. Enfoque la muestra con los objetivos 4x, 10x y 40x. Dibuje los eritrocitos a 40x haciendo una representación
realista de la proporción del campo visual que las células ocupan (Figura 4).

Figura 4. Observación de los eritrocitos a 40x en solución salina al 0.4%

32. ¿Qué espera usted que le pase al volumen de las células en esta solución?

B) Osmosis y plasmólisis en la planta acuática Elodea

1. Coloque una hoja de Elodea sobre un portaobjetos y adicione una gota de agua.
2. Cubra la muestra con un cubreobjetos acercándolo en un ángulo de 45 grados y dejándolo caer lentamente
intentando que no se formen burbujas.
3. Con el objetivo de menor aumento en posición (4x), mueva el anillo macrométrico para enfocar las células.
4. Cambie el objetivo por el de 10x. Usando el anillo micrométrico enfoque la muestra.
5. Haga un recorrido por la hoja hasta lograr enfocar una sola capa de células, generalmente esta se encuentra
en el borde o el centro de la hoja.
6. Ahora cambie el objetivo por el de 40x. Usando el anillo micrométrico enfoque la muestra. Dibuje lo
observado (Figura 5a).
7. Las células de esta hoja están expuestas a un medio acuoso y por lo tanto hipotónico. ¿En estas condiciones
el agua está tendiendo a salir o a entrar a la célula?
8. ¿Qué estructura evita que la célula se explote?
9. ¿Cómo se llama la presión que la pared celular ejerce en contra de la presión del agua moviéndose por
ósmosis?
10. Cambie el objetivo por el de 4x y retire la muestra del microscopio.
11. Adicione una o dos gotas de solución salina al 10% al borde del cubreobjetos. Para acelerar la llegada de
la solución salina a la muestra puede usar un papel secante y tocar el lado opuesto del cubreobjetos.
12. Ahora enfoque la muestra nuevamente. Con el objetivo de 40x observe el proceso de plasmólisis. Dibújelo
(Figura 5b).

14
 Figura 5a. Células de Elodea a 40x en agua Figura 5b. Células de Elodea a 40x en solución salina 10%

13. ¿Qué estructura de la célula que era invisible antes se hace evidente luego de unos minutos en solución
salina 10%?
14. La solución hipertónica (solución salina al 10%) está forzando al agua a moverse. ¿En qué dirección se está
moviendo el agua y por qué?

BIBLIOGRAFÍA

Karp, G. (2009). Biología Celular y Molecular. Ed. MCGRAW-HILL (5° edición). Capitulo 4-5.

ESTADO LEGAL INTERNO DEL CURSO

Elaboró Mauricio Ramírez Castrillón PhD. E-mail mauricio.ramirez00@usc.edu.co
Carlos Andrés Aranaga MsC. carlos.aranaga00@usc.edu.co
Modificado Valeria Pérez Luna MsC E-mail valeriaperez@usc.edu.co
Revisado Aura Falco PhD. Departamento Ciencias Básicas
Aprueba X Área Microbiología

15
 GUIA DE TRABAJO N°3
RECUENTO EN CÁMARA DE NEUBAUER Y PREPARACIÓN DE INÓCULOS

OBJETIVOS
 Realizar e interpretar la técnica para el recuento de levaduras y esporas de hongos en la cámara de Neubauer.
 Aprender a preparar y estandarizar inóculos a partir de cultivos de levaduras.
 Determinar tanto la densidad como la viabilidad celular de un cultivo y/o inóculo.

FUNDAMENTOS TEÓRICOS

Una suspensión celular se caracteriza por presentar un número de partículas microscópicas dispersas en un fluido.
Habitualmente será necesario determinar tanto la densidad de las células en la suspensión como el porcentaje de
éstas que son viables. Para determinar la densidad celular se emplean diferentes técnicas, entre ellas la Cámara de
Neubauer que permite determinar el número de partículas (levaduras, bacterias, eritrocitos, etc.) por unidad de
volumen de un líquido a través del microscopio. La cámara de Neubauer consiste de un bloque de cristal del
tamaño de un porta objetos, que contiene dos canales transversales que flanquean una zona central la cual se
encuentra deprimida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista
de la superficie 0.1 milímetro, siendo el volumen comprendido entre la superficie y el cubreobjetos de 0.1
microlitro. La cuadrícula de recuento de la cámara muestra 9 cuadrados grandes, cada uno de 1 mm2 (Figura 1).
Los 4 cuadrados grandes de las esquinas están divididos en 16 cuadrados con aristas de 0,25 mm, los cuales
generalmente se utilizan para el recuento de leucocitos. El cuadrado grande central está dividido en 16 cuadrados
medianos con aristas de 0,2 mm estando cada cuadrado mediano subdividido en 16 cuadrados pequeños con aristas
de 0,05 mm y una superficie de 0,0025 mm2 (BRAND, ND).

Habitualmente será necesario determinar tanto la densidad de las células en la suspensión como el porcentaje de
éstas que son viables. Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes métodos. El más común es el
método de tinción con azul de metileno, este colorante es uno de varios empleados para evaluar la viabilidad de
células por exclusión de captación, ya que no puede penetrar y teñir a las células vivas con membranas íntegras,
de manera que las células muertas se observan azules al microscopio (Standard Operating Procedures, 2013).

.
Figura 1. Vista superior y lateral de la cámara de Neubauer
16
MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES REACTIVOS
1 Micropipeta 100-1000 µL con puntas Cultivo de S. cerevisiae (Liquido o sólido)
1 Micropipeta 10-100 µL con puntas Cultivo de hongo esporulado (A. tamarii)
1 Cámara de Neubauer Cultivo de alga (Prototheca sp.)
Cubreobjetos Agua destilada
5 Tubos eppendorf Azul de metileno al 1% (agua)
1 Micropipeta de 0,5-10 µL con puntas Alcohol antiséptico
1 Microscopio
1 Gradilla para tubos eppendorf
1 Gradilla para tubos de ensayo
1Tubo de ensayo
1 Frasco lavador
Asa de argolla
Papel toalla

PROTOCOLOS

1- Conteo de levaduras

1.1- Preparación de la Muestra.

 Cultivo líquido: Tomar 100 µL del cultivo líquido de levadura y transferir a un tubo eppendorf que
contiene 900 µL de agua destilada estéril. Añadir 10 µL de azul de metileno. Tapar y agitar cuidadosamente.
Hasta aquí se ha realizado una dilución 1:10.
 Cultivo sólido: Con un asa de argolla tomar una colonia y resuspenderla en 5 mL de diluyente.
Homogenizar bien. Tomar 100 µL de la dilución y transferir a un tubo eppendorf con 900 µL de agua destilada
estéril. Añadir 10 µL de azul de metileno. Tapar y agitar cuidadosamente. Si es necesario, realizar otra dilución
1:10.

1.2- Llenado de la cámara y conteo celular.

1. Limpie la cámara y la lámina cubre objetos con alcohol.
2. Coloque la laminilla cubre objetos sobre la cámara, esta debe quedar centrada.
3. Llenar la cámara con una micropipeta pequeña (0,5-10 ul). El llenado debe ser continuo en un solo intento. No
se deben observar porciones secas en las esquinas del recuadro de llenado, tampoco se debe inundar, ni quedar
burbujas de aire.
4. Llevar la cámara al microscopio y enfocar el cuadro de conteo con el ocular de 4X. Observará una imagen
similar a la Figura 2.

17
 Figura 2. Vista de la cámara de Neubauer en un aumento de 4X.

5.Si las células que va a contar son pequeñas como las levaduras, bacterias, etc. Ubicarse en la cuadricula central
y pasar al ocular de 10X. Este se visualizará de la siguiente manera:

A B
A

E
C

D C

Figura 3. Vista de la cuadricula central de la cámara de Neubauer en un aumento de 10X.

6.En esta cuadricula se visualizan 25 cuadros, de los cuales se cuentan las células presentes en 5 campos,
generalmente se cuentan los cuadros de las esquinas y el central (señalados de color rojo en la Figura 3), lo que
garantiza un conteo aleatorio. Para realizar el conteo se pasa al ocular de 40X, donde se visualiza cada uno de los
campos y con ayuda del carro del microscopio se desplaza la cuadricula hasta contar en todos los cuadros. El
conteo en estos campos de la cámara de conocer como AP (alto poder). Con el lente de 40X cada cuadro se ve de
la siguiente manera:

Figura 4. Cámara de Neubauer en 40X

18
Las células se cuentan cuadro por cuadro y se hace un total. Se recomienda realizar el conteo siguiendo las flechas
de la Figura 5 para evitar que se cuenten las células dos veces o que no se cuenten. Alrededor de cada cuadricula
se observa que hay tres líneas que delimitan el cuadro, estas son fundamentales en el momento del conteo ya que
definen cuales células son contables o cuales están fuera del campo de conteo. Las células que no tocan la segunda
línea son contables, si la tocan o están encima de ella no se incluyen (Figura 6).

Figura 5. Señalización para una correcta realización del conteo.

A continuación, en la Figura 6 se expone un ejemplo, las células que tiene una X son las que no se deben contar.

Figura 6. Demostración de células contables y no contables en cuadros terciarios.

7. Después de contar las células se procede a calcular el número de células por unidad de volumen. Para esto se
debe tener en cuenta el área de cada cuadro y el espacio que hay entre la cuadricula de la cámara y la laminilla
cubre objetos. La cámara tiene una profundidad de 0,1 mm y las dimensiones mostradas en la Figura 7.

Las suspensiones celulares deben ser diluidas lo suficiente para que las células u otras partículas no se
sobrepongan y deben estar uniformemente distribuidas. Para células pequeñas se recomiendan contar cuatro
esquinas y el cuadro del centro.

Cada cuadro tiene un volumen de 0,2*0,2*0,1= 0.004 mm3. Si se contaron 25 cuadros, se tiene un volumen de 0,1
mm3 que corresponde a 1mm*1mm*0.1mm (Figura 7).

19
 Figura 7. Dimensiones de la cuadricula de la Cámara de Neubauer. Tomado de
https://hematologiauis2013.es.tl/Recuento-Camara-de-Neubauer.htm

Una actividad que facilita los cálculos es contar solo 5 cuadros dentro del cuadrante central, como se muestra en
la Figura 3. De esta forma, se pueden realizar dos cálculos: 1) se obtiene el promedio de los 5 conteos y se
multiplica el valor x 25, o 2) se suman los conteos de los 5 cuadros y se multiplica el valor x 5. El valor obtenido
serán los conteos en un volumen de 0.1mm3 (0.0001 mL).

Ejemplo: Si se contaron en total 187 células por los 5 cuadrantes (A-E, Figura 3), y la muestra original fue diluida
1:100, entonces la fórmula se aplica así:

𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑑𝑎𝑠 𝑥 5 𝑥 𝐹.𝐷.

Células/mL =
0.0001𝑚𝐿

Donde F.D. es el factor de dilución: una dilución 1:100 tendrá un factor de dilución de 100.

Células/ mL = 187𝑐𝑒𝑙 𝑥 50000 𝑥 100⁄𝑚𝐿

6
Células/ mL = 187𝑐𝑒𝑙 𝑥 5 𝑥 10 ⁄𝑚𝐿 = 935 x106 cel/mL
Células /mL = 9.35 x 108 cel/mL

1.2- Determinación de la viabilidad celular

El colorante azul de metilo es capaz de penetrar la pared de las células muertas, tiñéndolas completamente, de tal
manera que las células vivas se observan sin teñir. Para determinar la viabilidad celular del cultivo es necesario
aplicar la siguiente fórmula:

células totales− células muertas

Viabilidad % = ( células totales
)* 100

20
Es importante hacer el conteo lo más pronto posible después de realizada la tinción, debido a que algunas células
pueden morir por procesos oxidativos, alterando el recuento.

EJERCICIOS:

1.Cada grupo tendrá a disposición diferentes tubos de ensayo con concentraciones determinadas de células de
levadura, esporas de hongos o algas. Ordene los tubos de mayor a menor concentración celular.

Tubo 1: _______ Tubo 2: _______ Tubo 3: ________

2. El profesor le otorgará un tubo de ensayo que contiene células de Saccharomyces cerevisiae en una
concentración desconocida:

 Determine la concentración celular en el tubo de ensayo (células/mL, en notación científica)

 Determine la viabilidad de la muestra
 Prepare un inóculo de 1 mL que contenga 1x106 cel/mL viables de S. cerevisiae a partir del tubo de ensayo
problema. Utilice la fórmula C1V1 = C2V2

BIBLIOGRAFÍA

Cámaras de recuento. Laboratorio clínico. BRAND [en línea].

https://www.brand.de/fileadmin/user/pdf/GK900/Zaehlkammern/GK900_05_Clinical_Lab_Zaehlkammern_s.pd
f.

Libkind, D., Tognetti, C. & M, Moliné ´Curso teórico-práctico sobre microscopia y recuento de levaduras para
productores de cerveza´ [en línea], Laboratorio de Microbiología aplicada y biotecnología, Instituto de
investigaciones en biodiversidad y medioambiente, Bariloche- Argentina, http://www.somoscerveceros.com/wp-
content/uploads/2014/11/Teorica-Curso-Microscopio-La-Plata-2014-V5.pdf

Moreno, A., Ibarra, D., Ballesteros, I., González, A. & M. Ballesteros. (2013). Comparing cell viability and
ethanol fermentation of the thermotolerant yeast Kluyveromyces marxianus and Saccharomyces cerevisiae on
steam-exploded biomass treated with laccase. Bioresource Technology, 135, pp. 239-245.

Standard Operating Procedures (SOPs) Laboratorio de Genómica Viral y Humana. Facultad de Medicina UASLP.
Capitulo Conteo celular y evaluación de viabilidad Created on: Mar 10, 2008; Last modified by: Oct 13, 2013,
Version: 2.0

ESTADO LEGAL INTERNO DEL CURSO

Elaboró Valeria Pérez Luna, MSc. E-mail valeriaperez@usc.edu.co
Modificado Mauricio Ramírez, PhD. E-mail mauricio.ramirez00@usc.edu.co
Santiago Ortiz Monsalve, MSc santiago.ortiz00@usc.edu.co
Revisado Aura Falco, PhD. Departamento Ciencias básicas
Aprueba X Área Microbiología

21
 GUIA DE TRABAJO N°4:
MITOSIS EN EL MERISTEMO RADICULAR DE CEBOLLA (Allium cepa)

OBJETIVO GENERAL

 Identificar morfológicamente las características de cada una de los estadios de la Mitosis y la Interfase en
células del meristemo radicular de la cebolla.

FUNDAMENTOS TEÓRICOS

Las células vivas tienen una propiedad muy notable: su capacidad de multiplicarse con fidelidad casi perfecta y
no solamente uno o dos veces, sino por centenares y millares de generaciones. La mayoría de las células se
reproducen por división binaria cuyo resultado son dos células hijas casi idénticas.
Uno de los procesos de división celular más importantes es la mitosis, mediante la cual se distribuye precisa y
ordenadamente el material genético ya duplicado para formar así dos núcleos hijos con igual tipo y número de
cromosomas. Uno de los principales aportes de este proceso es la conservación idéntica de la constitución genética
de las células hijas y por tanto de la misma organización estructural y funcional con respecto a la célula madre.
Este proceso también es en parte el responsable de la herencia o transmisión de caracteres de célula a célula en
los organismos pluricelulares y de generación en generación en los organismos en los cuales la mitosis es también
su medio de reproducción. La división celular también es necesaria para el mantenimiento del individuo. En el
organismo, existen células que poseen un ciclo vital corto, tales como las células del epitelio del tubo digestivo,
de la capa externa de la piel y los glóbulos rojos, las cuales deben ser reemplazadas eficientemente por células
nuevas producidas mediante mitosis.
El ciclo celular además de la mitosis incluye una etapa de “reposo” denominada INTERFASE, dentro de la cual
existen varios estadios:
Estadio G1 (del inglés Gap, que significa Intervalo) durante el cual el núcleo se encuentra sin división. En este
momento se da la síntesis de ARN y proteínas.
Estadio S (del inglés Synthesis), durante el cual ocurre la síntesis del ADN.
Estadio G2 (que se presenta tras la síntesis del ADN), y durante el cual se da la reparación del ADN y la
preparación de la célula para entrar en mitosis. De manera que cuando la célula llega a G2 contiene dos copias
idénticas de cada cromosoma, cada uno compuesto por dos cromátidas hermanas. Por tanto, el ciclo celular
consiste en la secuencia continua de interfase y mitosis (Figura 1) (Jorde, et al. 2011).
El primer estadio de la mitosis es la PROFASE, durante la cual ocurren tres eventos importantes: la cromatina se
condensa lentamente formando cromosomas bien definidos y las cromátides hermanas de cada cromosoma se
encuentran juntas, unidas en un punto denominado centrómero. Desde los centriolos ubicados en los dos polos
de las células, empieza a emerger el huso mitótico y desaparece la envoltura nuclear y el nucléolo (Figura 2)
(Jorde, et al. 2011).

22
Figura 1. Proceso de Interfase compuesto por las etapas G1, S y G2 previas al inicio de la Mitosis. Tomado de
http://www.cuentosdedoncoco.com/2015/08/fases-interfase-celular-resumen.html

Figura 2. Condensación de la cromatina durante la profase. Tomado de

http://www.maph49.galeon.com/mitosis/prophase.html

Durante la METAFASE, los cromosomas pueden visualizarse como pequeñas “X” alcanzando su máximo grado
de condensación. En este caso a cada “X” se le denomina “cromosoma metafásico” y son más fáciles de visualizar
al microscopio. Por esta razón, el diagnóstico clínico de los trastornos cromosómicos se realiza en cromosomas
en metafase. Los cromosomas se sitúan en el ecuador celular (Figura 3) y se encuentran unidos por medio de sus
centrómeros a las fibras del huso.
A continuación, en la ANAFASE las cromátidas hermanas se separan y mueven hacia los polos celulares (Figura
4). Comienza a formarse un surco en la membrana celular (en animales) o una placa celular (en vegetales).
Durante la TELOFASE desparece el huso y los cromosomas quedan libres en ambos extremos celulares. En ese
momento, los cromosomas comienzan a descondensarse y la envoltura nuclear se reintegra alrededor de cada

23
grupo de cromosomas (Figura 5), se observa la reaparición del nucleolo y finalmente ocurre la citocinesis o
división del citoplasma marcando el término de la mitosis (Jorde, et al. 2011).

Figura 3. Cromosomas metafásicos alineados en el ecuador. Tomado de

http://www.maph49.galeon.com/mitosis/meta.html

Figura 4. Migración de las cromátidas hermanas hacia los polos celulares. Tomado
dehttp://www.maph49.galeon.com/mitosis/anaphase.html

Figura 5. Desaparición del huso mitótico y formación de la membrana nuclear. Tomado de

http://www.maph49.galeon.com/mitosis/telo.html

Por último, en la CITOCINESIS se divide el citoplasma para dar lugar a dos células hijas completamente
independientes. Sin embargo, esta inicia desde la anafase, cuando por debajo de la membrana plasmática a nivel
del ecuador celular, un cinturón de proteínas filamentosas (principalmente actina y miosina) se contraen y dan

24
lugar a un surco de división, el cual se va haciendo progresivamente más profundo hasta que la célula se estrangula
y da lugar a dos células (Rodríguez & Frías, 2014).
También existe otro tipo de ciclo celular denominado MEIOSIS por medio del cual se reduce el número de
cromosomas a la mitad, y las líneas celulares germinales diploides dan lugar a los gametos haploides
(espermatozoide y ovulo) a partir de los cuales se da el proceso de fecundación y desarrollo de un nuevo
organismo. Consiste en una ronda de síntesis de ADN seguida de dos rondas de segregación cromosómica y
división celular (Nussbaum, 2008).

MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES REACTIVOS
1 Microscopio Raíces de cebolla (estudiante)
Portaobjetos y cubreobjetos Alcohol al 70%
1 Cuchilla de bisturí Solución fijadora (ácido acético-etanol 1:3)
Papel toalla Solución hidrolítica (HCl- etanol 95% 1:1)
1 Frasco lavador Orceína acética HCl
1 Pinza metálica con garra Aceite de inmersión
3 cajas Petri de vidrio

PROTOCOLOS

Nota: Las raíces de cebolla deben ser proporcionadas por los estudiantes. Introducir SOLO la zona radicular de
una cebolla cabezona (preferiblemente morada) en un frasco de boca delgada que contenga agua. Dejar por
aproximadamente diez días o hasta que observe el crecimiento de la raíz. Es importante dejar la cebolla en un
lugar iluminado y cambiar el agua día de por medio.

24 horas antes de la práctica, se deben traer las cebollas con las raíces al almacén de laboratorios para introducirlas
en solución fijadora.

1. Con ayuda de una pinza metálica colocar las raíces en una caja de Petri con solución hidrolítica por un
período de 8 minutos.
2. Lavar las raíces con suficiente agua destilada.
3. Colocar las raíces en una caja de Petri con alcohol al 70% por 5 minutos.
4. Con ayuda del estereoscopio realizar un corte limpio a la altura del meristemo radicular de la raiz (extremo
romo de aspecto blanquecino). Descartar el resto de raíz sobrante.
5. En un portaobjetos colocar una gota de orceína acética HCL y sobre ella macerar el meristemo haciendo
uso de una cuchilla de bisturí.
6. Colocar sobre el preparado anterior un cubre objeto y ejercer presión hasta aplastar las raíces maceradas,
procurando que no queden burbujas en su interior.
7. Observar al microscopio la placa usando los aumentos de 10X, 40X y 100X (en este último caso se debe
emplear aceite de inmersión).

25
INFORME

1. Realiza esquemas de la interfase y de cada una de las etapas de la mitosis.

2. Calcular el índice mitótico, profásico, metafásico, anafasico, telofásico.

# 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑒𝑛 𝑚𝑖𝑡𝑜𝑠𝑖𝑠
Índice mitótico= # 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠
* 100

# 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑒𝑡𝑎𝑝𝑎 𝑑𝑒 𝑚𝑖𝑡𝑜𝑠𝑖𝑠

Índice de cada etapa de la mitosis= # 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑒𝑛 𝑚𝑖𝑡𝑜𝑠𝑖𝑠
* 100

3. ¿Qué otras técnicas para la observación de los diferentes estadios de la mitosis son usadas? Discuta sobre
las ventajas y desventajas del método usado en este laboratorio.

BIBLIOGRAFIA

Jorde, L., Carey, J. & M., Bamshad. (2011). Genética médica. 4° Edición. Elsevier. España.

Nussbaum, RL. (2008). Genética en medicina. Elsevier. España. pp 16.

Rodríguez, AJ & S. Frías. (2014). “La mitosis y su regulación” Acta Pediátrica de México, Vol. 35, pp. 55-68,
http://www.medigraphic.com/pdfs/actpedmex/apm-2014/apm141i.pdf.

ESTADO LEGAL INTERNO DEL CURSO

Elaboró Valeria Pérez Luna, MSc. E-mail valeriaperez@usc.edu.co
Revisado Iván González, MSc Departamento Ciencias Básicas
Sandra P. Rivera, MSc
Aura Falco, PhD
Aprueba x Área Microbiología

26
 GUIA DE TRABAJO N°5
EXTRACCIÓN DE ADN DE Saccharomyces cerevisiae

OBJETIVO GENERAL

 Efectuar e identificar los pasos necesarios para la extracción de ADN de levadura, además de adquirir
experiencia en el manejo de equipos y reactivos relacionados con la técnica de extracción.

FUNDAMENTOS TEÓRICOS

Para aprovechar de manera eficiente todas las propiedades de las levaduras a escala industrial se requiere
identificar tanto las características físico químicas, como la identidad taxonómica de la cepa. Ni la morfología
celular de las levaduras, ni las características macroscópicas de las colonias, son suficientes para la identificación
a nivel de especie del microorganismo; las características morfológicas y sexuales permiten generalmente
identificar el género, mientras que el comportamiento fisiológico y las características bioquímicas si permiten la
determinación a nivel específico. Dentro de esta caracterización bioquímica, la prueba rutinaria más utilizada es
la fermentación de diversos azucares o fuentes de carbono (galactosa, inositol, lactosa, lisina, maltosa, manitol,
melibiosa, α-metilglucósido, rafinosa, ramnosa, sacarosa, trehalosa, xilosa), crecimiento sobre diferentes fuentes
de nitrógeno (nitrato, nitrito y glucosamina), vitaminas, perfiles de crecimiento a diversas temperaturas, hidrolisis
de urea y resistencia a antibióticos. Actualmente, las principales técnicas de identificación de levaduras están
basadas en la aplicación de métodos de biología molecular como la PCR (Reacción en cadena de la polimerasa),
permitiendo resultados más específicos, extremadamente sensibles y en corto tiempo. De acuerdo con lo anterior,
los análisis moleculares surgen como una alternativa a los métodos bioquímicos tradicionales, ya que se analiza
una porción del genoma, el cual no depende del estado fisiológico de la levadura o del medio del cultivo del cual
se aisle, reduciendo la aleatoriedad (Kurtzman, 1999).
Para la aplicación de técnicas moleculares, el punto de partida es la extracción del material genético. A lo largo
del tiempo se han diseñado distintos protocolos con la finalidad de obtener una cantidad y calidad de ADN
adecuados, así como garantizar la eliminación de inhibidores potenciales que dificulten el tratamiento posterior
de la molécula. Los métodos tradicionales, desarrollados en los años 50, utilizan solventes orgánicos para separar
a las proteínas del ADN y, una vez suspendido en la fase acuosa, aislarlo por precipitación con etanol. Sin
embargo, independientemente del método a utilizar, siempre será necesaria la realización de estas cinco etapas:
homogeneización del tejido, lisis celular, separación de proteínas y lípidos, y por último, precipitación y
redisolución del ADN (Alejos, et al. ND).

MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES REACTIVOS
1 Balanza analítica
1 Sobre de levadura activa seca (estudiante)
1 Microcentrifuga
EDTA 0,5 M
1 Baño Maria
Tris-HCl 50 mM, EDTA 20 mM, pH 7,4
1 Baño de hielo

27
 5 tubos eppendorf de 1,5 mL SDS 10%
1 Gradilla para tubos eppendorf Acetato de Potasio (KAc) 5 M
1 Micropipeta de100-1000 µL con puntas Isopropanol FRIO
1 Micropipeta de10-100 µL con puntas Etanol 70% FRIO
1 Mortero con mazo Agua grado biología molecular
1 Vidrio reloj
1 Microespatula

PROTOCOLOS

1. Tomar 200 mg de levadura activa seca en un mortero, añadir 2 mL de solución EDTA 0.5 M y macerar
hasta homogenizar muy bien.
2. En un tubo eppendorf tomar 1 mL de esta maceración y centrifugar a 8000 rpm durante 10 minutos.
3. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 0.5 mL de Tris-HCl 50 mM, EDTA 20 mM, pH
7.4.
4. Añadir 50 µL de SDS al 10% e incubar en baño maría a 65ºC por 30 minutos.
5. Añadir 200 µL de Acetato de potasio (KAc) 5M, resuspender y dejar en baño de hielo por 30 minutos.
6. Centrifugar a 14000 rpm por 5 minutos y trasladar el sobrenadante a otro tubo.
7. Centrifugar el sobrenadante por 5 minutos para eliminar otras impurezas. trasladar el sobrenadante a otro
tubo.
8. Añadir 500 µL de isopropanol (FRIO) e incubar por 5 minutos a temperatura ambiente agitando
suavemente.
9. Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos y descartar el sobrenadante.
10. Añadir 500 µL de etanol al 70% (FRIO), homogenizar y posteriormente centrifugar a 14000 rpm por 5
minutos. Descartar el sobrenadante y dejar secar el precipitado.
11. Resuspender el precipitado en 50 µL de agua grado biología molecular (Libre de DNAsa). Conservar a -
20°C hasta su próximo uso.

BIBLIOGRAFIA

Alejos, LP., Aragón MDC., & A., Cornejo. (ND). Herramientas Moleculares aplicadas en ecología. Capitulo:
Extracción y purificación de ADN.

Kurtzman, C. &J., Fell. (1999). The yeast, A taxonomic study. 4° Edicion. Elservier.

ESTADO LEGAL INTERNO DEL CURSO

Elaboró Ivan Gonzalez, MSc. E-mail valeriaperez@usc.edu.co
Valeria Pérez Luna MSc.
Revisado Iván González, MSc. Departamento Ciencias Básicas
Aura Falco, PhD.
Aprueba X Área Microbiología

28
 GUIA DE TRABAJO N°6
EVALUACIÓN DE LA CANTIDAD Y CALIDAD DEL ADN

OBJETIVO GENERAL

 Cuantificar y determinar la pureza del ADN extraído de S. cerevisiae mediante espectrofotometría y

electroforesis en gel de agarosa, para el desarrollo posterior de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).

FUNDAMENTOS TEÓRICOS

Es de vital importancia verificar tanto la presencia como la cantidad y calidad del ADN extraído, para lo cual
existen diversas metodologías, entre ellas, la técnica de electroforesis en gel de agarosa. La agarosa es un polímero
lineal compuesto de residuos alternantes de D-galactosa y 3,6-anhidro-L-galactosa unidos por enlaces
glucosídicos α (1-3) y β (1-4), los cuales forman fibras helicoidales que al solidificar conforman una malla
tridimensional de canales que permiten separar fragmentos de ADN y ARN en función de su tamaño (Kirkpatrick,
1990). Durante la electroforesis, una combinación de fuerzas eléctricas y de fricción permitirán el desplazamiento
y la separación de las moléculas de ADN en función de su tamaño y topología. Las moléculas de ADN debido a
su carga neta negativa, se desplazarán hacia el ánodo, migrando con mayor rapidez las moléculas de menor
tamaño. Adicionalmente, para la visualización del material genético en el gel de agarosa, es necesario el uso de
agentes intercalantes como el bromuro de etidio (BrEt) o el Sybr Green, los cuales se unen a la molécula de ADN
y al ser expuestos a luz ultravioleta emiten fluorescencia (Cornejo, et al. 2014).

El material genético también puede ser cuantificado mediante espectrofotometría. La ley de Lambert-Beert indica
que la concentración de una molécula en solución depende de la cantidad de luz absorbida por las moléculas
disueltas. Una característica del ADN es que absorbe la luz ultravioleta a 260 nm, lo que permite estimar su
concentración mediante el uso de un Espectrofotómetro UV-Visible. Cuando la longitud de la celda en que se
disuelve el ADN es de 1 cm, la absorbancia es igual a la densidad óptica (DO), por tanto, una densidad óptica (1)
equivale a: 50 ug/mL de ADN genómico o de doble cadena, 33 µg/mL de ADN cadena sencilla, 20-30 µg/mL de
oligonucleótidos entre 20 a 40 bases y a 40 µg/mL de RNA (Cornejo, et al. 2014). Para estimar la pureza del ADN
se consideran dos factores: la proporción de la absorbancia a 260 nm y 280 nm (una proporción de 1.8 es aceptada
como ADN puro, proporciones menores a este valor indican la presencia de proteínas) y la proporción 260 nm/230
nm (los valores aceptados se encuentran en el rango de 2.0 a 2.2, si la relación es menor indican la presencia de
contaminantes como carbohidratos). En caso de contaminación, es necesaria la purificación del ADN (Cornejo,
et al. 2014).

MÉTODOS

A) Verificación de la extracción de ADN por electroforesis en gel de agarosa al 0,8%

MATERIALES REACTIVOS

29
 1 Balanza TBE 1X
1 Beaker 250 mL Agarosa en polvo
1 Vidrio reloj Buffer de carga
1 Microespátula Sybr Green
1 Probeta de 50 mL Marcador de peso molecular
Microondas Muestra de ADN
Cámara de electroforesis horizontal
Fuente de poder
Cinta de enmascarar
1 Micropipeta de 0,5-10 µL con puntas
Trans iluminador UV

PROTOCOLOS
1. Tomar 0.32 gramos de agarosa y disolver en 40 mL de TBE 1X.
2. Calentar hasta disolver completamente y servir en la cámara de electroforesis. Colocar el peine para el
diseño de los pozos y dejar solidificar.
3. Mezclar y servir:

A. 5 µL del ADN (muestra) +1 µL de Buffer de carga 6X+ 1 µL de Sybr Green.

B. 1uL de marcador de peso molecular +1 µL de buffer de carga + 1 µL de Sybr Green.
C. Control positivo: ADN (verificado anteriormente) +1 µL buffer de carga +1 µL de Sybr Green.
D. Control negativo: 1uL de buffer de carga + 1uL de Sybr Green.

4. Conectar la fuente de poder y correr el gel a 100-110 V durante 1 hora.

5. Desmontar el gel y visualizar bajo luz UV.

B) Evaluación de la cantidad y calidad del ADN por espectrofotometría

MATERIALES REACTIVOS
Espectrofotómetro UV-VIS Agua MiliQ
Celdas de cuarzo Muestra de ADN
Micropipeta de 0,5-10 µL con puntas
Micropipeta de 100-1000 µL con puntas
Calculadora

PROTOCOLOS
1. En una celda adicionar 2 mL de agua MiliQ doblemente estéril.
2. Seleccionar en el espectrofotómetro el botón de Blanco.
3. Reemplazar 2 µL de agua por 2 µL de muestra de ADN (dilución 1000 veces)
4. Medir la absorbancia a 230, 260 y 280 nm
5. Calcular:

Cantidad de ADN =

30
 A260nm*50 ug/mL= ug/mL

Ejemplo:
Se tiene una dilución de ADN de 1:100 (Factor de dilución 1001) cuya absorbancia a 260 nm fue de 0.050. Por lo
tanto (0.050*100)* 50 ug/mL = 250 ug/mL = 0.25 g/uL = 250 ng/uL.

1
El factor de dilución del ADN dependerá de la intensidad de la banda observada en el gel de agarosa

Calidad de ADN=
A260nm⁄
A280nm = 1.8

Nota: Un valor obtenido de aproximadamente 1.8 es considerado puro para ADN y de aproximadamente 2 para
ARN. Si es menor hay contaminación con proteínas, fenoles u otras sustancias que absorben en una longitud de
onda cercana a 280 nm.

A260nm⁄
A230nm = 2.0- 2.2

Nota: Se considera que el ADN es puro si se obtiene un valor de entre 2.0- 2.2. Si la relación es menor indica la
presencia de contaminantes que absorben a una longitud de onda de 230 nm (Thermo Scientific, ND)

INFORME
1. Calcular la cantidad y calidad del ADN extraído
2. Discutir acerca de la calidad de ADN, ¿Se observa contaminación y de qué tipo?
3. ¿Como podría disminuirse la contaminación del ADN por proteínas y carbohidratos?
4. ¿Qué otros métodos de cuantificación de ADN existen?
5. ¿Qué es el NanoDrop y en qué consiste?

BIBLIOGRAFIA

Cornejo, A., Serrato, A., Rendón, B. & M., Rocha-Munive (2014). Herramientas moleculares aplicadas en
ecología: aspectos teóricos y prácticos. SEMARNAT. pp.75-100

Kirkpatrick, E. (1990). Overview of agarose gel properties. Current Communications in Cell Molecular Biology
1: 9-22.

Thermo Scientific. ND. T042 Technical Bulletin Nanodrop Spectrophotometers. 260/280 and 260/230 Ratios

ESTADO LEGAL INTERNO DEL CURSO

Elaboró Valeria Pérez Luna, MSc. E-mail valeriaperez@usc.edu.co
Revisado Sandra P. Rivera MSc. Departamento Ciencias Básicas
Aura Falco, PhD.
Aprueba x Área Microbiología

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 GUIA DE TRABAJO N°7
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR):
Amplificación la región ITS1-ITS2 de Saccharomyces cerevisiae

OBJETIVO GENERAL

 Estudiar los principios básicos de la técnica de Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), por medio de
la amplificación la región ITS1-ITS2 de Saccharomyces cerevisiae.

FUNDAMENTOS TEÓRICOS

La PCR o Polymerase Chain Reaction es una técnica usada para sintetizar muchas copias de un fragmento de
ADN utilizando la enzima polimerasa de la bacteria termófila Thermus aquaticus (vive a altas temperaturas, entre
79ºC a 85ºC), de la cual deriva su nombre comercial: Taq polimerasa. La PCR es una simulación in vitro de la
síntesis de ADN en la célula, en la cual se mezcla en tu tubo: la polimerasa, el ADN, los oligonucleótidos
necesarios para que se inicie la transcripción (llamados también primers, iniciadores, cebadores, “oligos”, etc.),
dinucleótidos (dNTPs), y las condiciones para que la enzima trabaje adecuadamente (cierto pH, determinadas
cantidades de magnesio en forma de MgCl2, KCl, u otras sales o reactivos dependiendo del tipo de polimerasa)
(Espinosa, ND). A continuación, se realiza una breve descripción de cada uno de ellos:

 El ADN molde es necesario para que la enzima polimerasa sintetice las nuevas cadenas
 Los primers u oligonucleótidos son secuencias cortas que flanquean y delimitan la secuencia de ADN que
se desea amplificar y son complementarios a ésta, se utilizan dos primers: uno denominado forward o directo y
otro reverse o reverso. Ambos están diseñados para que hibriden con el ADN molde y las cadenas puedan ser
extendidas por la Taq polimerasa en dirección 5’-3’.
 los dNTPs son las bases nitrogenadas con los que la Taq polimerasa construye las nuevas cadenas de ADN.
Son factores importantes que contribuyen a la especificidad de la reacción, por ello es importante que su
concentración sea la adecuada ya que de lo contrario puede afectar la función de la Taq polimerasa.
 El magnesio es un cofactor enzimático que influye en la especificidad de la reacción, por lo que debe estar
a una concentración adecuada para que no afecte al rendimiento de la Taq polimerasa, generalmente suele ser
entre 0.5 y 2.5 mM.
 El agua es el disolvente de la reacción y se usa en forma ultrapura libre de nucleasas (enzimas que degradan
los ácidos nucleicos).

La reacción de PCR se lleva a cabo en un equipo denominado termociclador, el cual esta diseñado para establecer
un rápido cambio de temperatura entre cada una de las etapas de la reacción, manteniendo optimas las condiciones
de temperatura y tiempo necesarias en cada ciclo de PCR. Cada ciclo se lleva cabo en tres etapas:
desnaturalización, hibridación y extensión. En la desnaturalización o separación de la doble hélice de ADN se
produce el calentamiento de la muestra a una temperatura entre 94 y 96°C para romper los puentes de hidrogeno
que las unen, de esta manera cada cadena queda como molde para la síntesis de una nueva cadena complementaria
de ADN. Después, ocurre la hibridación. En esta etapa, los primers se alinean en el extremo 3’ del templado e
hibridan con su secuencia complementaria. Para que se dé el correcto alineamiento, es importante que la
temperatura de hibridación o temperatura melting de los oligonucleótidos primers sea la óptima. Generalmente

32
oscila entre los 50-60 ºC. Finalmente, se sintetiza una nueva cadena en sentido 5’ a 3’ para lo cual se incrementa
la temperatura, por lo general a 72 °C, porque es la temperatura optima a la cual la ADN polimerasa se une a los
primers y comienza la replicación (Figura 1) (Tamay de Dios, et al. 2013).

Figura 1. Etapas que conforman un ciclo de PCR 1) desnaturalización, 2) alineamiento y 3) extensión.

Estas tres etapas se repiten sucesivamente, en cada nuevo ciclo se amplifica simultáneamente la región de interés
de las dos cadenas complementarias. Los productos generados aumentan su concentración de manera exponencial,
de manera que cada nueva copia sirve de molde en los ciclos subsecuentes, dando origen a millones de copias del
fragmento seleccionado.
Los análisis moleculares más usados para la caracterización e identificación taxonómica y filogenética de los
hongos (incluyendo las levaduras) consisten la amplificación por PCR de un gen o una región del genoma, en
general, el ITS. El ITS, es una región que se encuentra repetidamente entre los genes del ARN ribosomal de la
subunidad mayor (28S) y menor (18S) del ADN nuclear. El ITS contiene dos regiones separadas por el gen 5,8S,
obteniendo la región ITS1 e ITS2 (Figura 2) (Guevara, et al. 2004). la región ITS generalmente presenta un
tamaño de entre 600 y 800 pb y puede ser fácilmente amplificado con primers universales que son
complementarios a las secuencias de los genes de ARNr, además, estos genes al poseer múltiples pueden ser más
fáciles de amplificar a partir de muestras de ADN pequeñas, diluidas o muy degradadas (Gardens & Bruns, 1993).
De acuerdo con lo anterior, en el presente laboratorio, se realizará la amplificación de esta región del genoma de
S. cerevisiae.

Figura 2. Agrupación de genes 18S, 5.8S y 28S junto con los transcriptos internos ITS y los primers a
utilizar para su amplificación (Higgins, 2012).

33
MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES REACTIVOS
Termociclador Taq polimerasa
Micropipeta de 0,5-10 µL con puntas Buffer Taq polimerasa
Micropipeta de 10-100 µL con puntas dNTPs Mix
Vortex Muestra de ADN
Microtubos para PCR (200 uL) Primer forward ITS1
Gradilla para microtubos de PCR 5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’
Microcentrifuga Primer reverse ITS4
5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’
MgCl2
Agua libre de DNAsa

PROTOCOLOS

1. Descongelar el ADN y agitar en el vortex (procurar que el ADN tenga una concentración aproximada de
100 ng/uL).
2. Agregar a cada tubo (tubos tipo PCR de 200 uL) 5 µL de ADN y luego el coctel de PCR según la Tabla 1.
Recuerde preparar el control negativo (C-): PCR mix sin adición de ADN.
3. Mezclar en el vortex.
4. Centrifugar brevemente para llevar la mezcla al fondo
5. Encender el termociclador y dejar calentar.
6. Seleccionar el programa ITS_ FUNGI, o introducir manualmente las siguientes condiciones:

Initial denaturing 94ºC 5min

Denaturing 94ºC 1min
Annealing 55ºC 1min 30 ciclos
Extension 72ºC 2min
Final extension 72ºC 10min

7. Verificar la PCR en un gel de agarosa al 1,5% con marcador de peso molecular de 100 pb.

Tabla 1. Coctel de PCR

Reactivo [STOCK] [ Final x tubo] Vol. final x tubo Vol final x N

(uL) tubos (uL)
Primer forward 20pmoles/uL 0,64pmoles/uL 0.8
Primer reverse 20pmoles/uL 0,64pmoles/uL 0.8
Taq Polimerasa Buffer 10X 1X 2.5
MgCl2 50mM 3mM 1.5
Taq Polimerasa 5U/uL 1U 0.2
dNTPs Mix 1mM 10uM 0.3
Agua - - 13.9
ADN - - 5
Vol. total 25

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BIBLIOGRAFÍA

Espinoza L. Las Herramientas Moleculares. Capítulo 17 Guía práctica sobre la técnica PCR.
https://www.google.es/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&ved=0ahUKEwjvm_7pn5jcAhUFqlkK
HR8yBmoQFggpMAA&url=http%3A%2F%2Fwww.publicaciones.inecc.gob.mx%2Flibros%2F530%2Fcap16.
pdf&usg=AOvVaw1--QYP-2J1Ly6P3L6DHczl

Gardes, M., Bruns, T. D. (1993). ITS primers with enhanced specifity for basidiomycetes- application to the
identification of mycorrhizae and rusts. Molecular Ecology 2, 113-118.

Guevara, G., Garza, F. & E., Cázares. (2004). Estudio del ITS nuclear en algunas especies del género Cantharellus
de México. Ciencia UANL, 3, pp: 371-378.

Tamay de Dios, L., Ibarra, C. & C., Velasquillo, (2013). Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigación en Discapacidad. Vol: 2. Nº: 2, pp: 70-78.

ESTADO LEGAL INTERNO DEL CURSO

Elaboró Valeria Pérez Luna, MSc. E-mail valeriaperez@usc.edu.co
Mauricio Ramírez C, PhD mauricio.ramirez00@usc.edu.co
Revisado Aura Falco, PhD Departamento Ciencias Básicas
Aprueba x Área Microbiología

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 GUIA DE TRABAJO N°8
INTRODUCCIÓN AL USO DE HERRAMIENTAS BIOINFORMÁTICAS

OBJETIVO GENERAL

 Adquirir habilidades para para la obtención de secuencias de ácidos nucleicos de interés biológico en bases
de datos como el GenBank, y la aplicación de herramientas de alineamiento para comparación de las mismas
(similitudes y diferencias) por medio de la generación de árboles filogenéticos.

FUNDAMENTOS TEÓRICOS

La bioinformática se define como el campo interdisciplinario que desarrolla métodos y herramientas de software
para entender datos biológicos. Es una disciplina que surge de la interacción entre la biología, la estadística y las
ciencias de la computación. Tiene como principales objetivos el manejo y análisis de grandes volúmenes de datos,
principalmente producto de las nuevas tecnologías en biología molecular, como la genómica, la proteómica y la
metabolómica, especialmente con el surgimiento de nuevas tecnologías de secuenciación de ácidos nucleicos que
están revolucionando la forma de como se estudian los genomas. Otro aspecto importante incluye el desarrollo de
nuevos métodos computacionales, algoritmos y software para el análisis de estos datos (Gómez, et al., 2010).
En la presente práctica de laboratorio se utilizará una pequeña parte de la gran cantidad de herramientas de
bioinformática disponibles para el desarrollo de un protocolo de investigación bastante útil en la microbiología.
Primero se realizará la búsqueda de una secuencia desconocida utilizando el algoritmo BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool), posteriormente con el resultado obtenido, se procederá a hacer una búsqueda en la base
de datos de secuencias del NCBI, por último, por medio de la herramienta de alineamiento Clustal Omega se
analizarán las diferencias entre las secuencias de ADN de las diferentes especies. También se afianzará en la
búsqueda de genes de interés dentro del cromosoma bacteriano.

MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES REACTIVOS
Computador con acceso a Internet

PROTOCOLOS

A) Identificación de la especie a la cual pertenece una secuencia desconocida y creación de árbol

filogenético con especies cercanas.

1. Acceder al documento de texto llamado DatoGuiaBioinfo.txt (proporcionado previamente por el docente).

2. Acceder al navegador de internet, preferiblemente Internet Explorer, Google Chrome o Mozilla Firefox con
la última actualización en cada caso.
3. En la barra de navegación introducir la siguiente dirección web: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
4. Acceder al enlace “nucleotide blast” señalado en la siguiente imagen:

36
5. Una vez acceda al enlace, tome el texto del archivo “DatoGuiaBioinfo.txt”, cópielo y péguelo en el
recuadro que se ve en la siguiente imagen, y de click al botón “BLAST” que se encuentra en la parte inferior
(Tenga cuidado, al pegar el texto no incluya el primer renglón “>refData”)

6. Espere por el resultado, según la congestión del servidor puede tardar varios minutos. Una vez termine el
análisis usted verá un resultado similar al que se ve en la siguiente imagen:

37
7. Una vez terminado, en la parte de abajo se verán los distintos resultados, del primero al último irán
ordenados de acuerdo al grado de similitud, escoja el resultado más similar haciendo click en el enlace, como se
muestra en la siguiente imagen:

8. Una vez realizado esto, hacer doble click sobre el primer resultado obtenido.

9. Ya teniendo ese primer resultado proceda con la siguiente parte del laboratorio. En una nueva ventana o
pestaña del navegador acceda a la siguiente dirección: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/

10. En vez haya accedido a la página, en la barra de búsqueda (mostrada en la siguiente imagen) coloque los
siguientes criterios “Especie Type XX complete genome”. La especie y el tipo son los que usted encontró en la
búsqueda anterior. Junto con el tipo hallado busque por separado tipo 16 y tipo 18. Recuerde que este motor de
búsqueda solo acepta parámetros en inglés.

38
11. Al obtener los resultados, seleccione la primera opción y localice el término “/gene="L1". Una vez lo
encuentre, haga click en el enlace que dice CDS que está en la parte izquierda como se muestra en la siguiente
imagen:

12. Cuando haga click en ese enlace, inmediatamente una parte se señalará en color café. Haga click en el
enlace FASTA que aparece en la parte inferior derecha como se muestra a contunuación:

13. Este enlace lo llevará a una página que contiene una secuencia, similar a la que se le asignó al principio en
el documento DatoGuiaBioinfo.txt. Abra un nuevo archivo en bloc de notas y copie ahí la secuencia que obtuvo.
Este mismo proceso se debe de repetir para tipo 16 y tipo 18, y las secuencias halladas deben ser pegadas en este
mismo archivo de bloc de notas tal cual como se muestra en la imagen. En este caso incluya el renglón que lleva
el símbolo “>” , sin dejar espacio entre las palabras.

39
14. Ya con este documento, abra una nueva ventana o pestaña en el navegador y acceda al siguiente enlace:
http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/

15. Dentro de la página seleccione CLUSTAL OMEGA. Una vez en esta página seleccione la opción DNA.
Copie y pegue todo el contenido del archivo del bloc de notas en el recuadro como se muestra en la siguiente
imagen, luego busque el botón “submit” de la parte inferior y haga click.

16. Espere por el resultado, según la congestión del servidor puede tardar varios minutos. Una vez termine el
análisis usted verá un resultado similar al que se observa en la siguiente imagen:

40
Los resultados que obtuvo corresponden al alineamiento de tres secuencias de ADN: si el nucleótido presente en
la misma posición en las tres secuencias coincide, se observara un *

17. Seleccionar Phylogenetic Tree y observar el cladograma.

B) Análisis de genomas depositados en Genbank

1. En una nueva ventana o pestaña del navegador acceda a la siguiente dirección:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/

2. Una vez haya accedido a la página, seleccione en la barra de búsqueda la opción GENOME (mostrada en
la siguiente imagen) y coloque los siguientes criterios “Bacillus cereus complete genome”. Recuerde que este
motor de búsqueda solo acepta parámetros en inglés.

Y obtendrá una imagen como la siguiente:

3. Ingresar en el link del microorganismo y dar clic en la accesión correspondiente al cromosoma bacteriano,
señalado en la siguiente figura:

41
Se debe abrir una ventana como la siguiente:

4. Al abrir la página, localice el término “/product="DNA Polymerase III". Una vez lo encuentre, haga
click en el enlace que dice CDS que está en la parte izquierda como se muestra en la siguiente imagen:

42
5. Cuando haga click en ese enlace, abrirá una nueva ventana mostrando la secuencia de nucleótidos y de
aminoácidos de la proteína

6. Para obtener la secuencia en formato Fasta, haga click en el enlace FASTA que aparece en la parte
superior izquierda como se muestra en la siguiente imagen:

43
8. Copiar y pegar en un bloc de notas. Guardar en formato FASTA. A partir de este momento puede utilizarse
esta secuencia para realizar análisis filogenético, etc.

INFORME

Defina la región codificante, el nombre y descripción del producto del gen, la secuencia de nucleótidos y
traducción predicha y su posición en el genoma.

C) Análisis de genes

1. De forma similar a los genomas, se puede buscar un gen específico y analizarlo, como se muestra en la
siguiente figura al buscar sobre la ATP citrato liasa en humanos:

44
45
2. Dar clic en Genbank (señalado en rojo) y observar las características del gen que codifica para ATP citrato
liasa en humanos.

46
INFORME

1. Con la información obtenida responder:

¿Cual es el tamaño del gen de la ATP citrato liasa?
¿ Cual es su localización y cromosoma en el genoma humano?
¿Se encuentra localizado en la posición sentido (5’-3’) o antisentido (3’-5’)?
¿Cuantos exones e intrones tiene?
¿Cual es la actividad de este gen?
¿En cuales órganos presenta mayor expresión?

2. Analizar los resultados obtenidos en la práctica del uso de herramientas bioinformáticas. Discutir su utilidad
y su aplicabilidad en la investigación.

BIBLIOGRAFIA

Gómez, C., Silva HV. & P., Pérez. (2010). Bioinformática: aplicaciones a la genómica y proteómica. Colegio de
Postgraduados. Mexico.

Goujon., M, McWilliam., H., Li., W., Valentin., F., Squizzato., S. & J., Paern. A new bioinformatics analysis
tools framework at EMBL-EBI. Nucleic acids research. 2010;38(Web Server issue):W695-9. Epub 2010/05/05.

Hogeweg P. The roots of bioinformatics in theoretical biology. PLoS computational biology. 2011;7(3):e1002021.
Epub 2011/04/13.

Johnson., M, Zaretskaya., I, Raytselis., Y, Merezhuk., Y, McGinnis S. & TL., Madden. NCBI BLAST: a better
web interface. Nucleic acids research. 2008;36(Web Server issue):W5-9. Epub 2008/04/29.

Larkin., MA, Blackshields., G., Brown., NP., Chenna., R, McGettigan., PA. & H., McWilliam H. Clustal W
and Clustal X version 2.0. Bioinformatics. 2007;23(21):2947-8. Epub 2007/09/12.

ESTADO LEGAL INTERNO DEL CURSO

Elaboró Iván González, MSc E-mail ivangonzalez@usc.edu.co
Valeria Pérez Luna, MSc valeriaperez@usc.edu.co
Modificó Mauricio Ramírez, PhD E-mail: mauricio.ramirez00@usc.edu.co
Revisado Sandra Rivera, MSc. Departamento Ciencias Básicas
Aura Falco, PhD
Aprueba x Área Microbiología

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