UNIVERSIDAD DE COLIMA

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia

Posgrado Interinstitucional en Ciencias Pecuarias

ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE CORIZA INFECCIOSA AVIAR EN AVES

DE POSTURA COMERCIAL PROVENIENTES DE LA REGION DE LOS
ALTOS DE JALISCO, DURANTE EL PERIODO 1998-2001

TESIS PROFESIONAL
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS

PRESENTA

J. ALEJANDRO GARCIA FLORES MVZ.EPA

DIRECTOR:
Ph.D. ARIEL ORTIZ MUÑIZ

ASESOR
Ph.D. PATRICK BLACKALL

Tecomán Colima. Marzo del 2000.

 1

INDICE
Páginas

Resumen 1

Introducción 2

Planteamiento del problema 6

Hipótesis 7

Objetivos 8

Material y Métodos 9

Resultados 14

Discusión 23

Conclusión 30

Anexo 32

Bibliografía 36
 2

Dedicatoria

A mi Sra. Madre: Gracias por haberme apoyado en los momentos

difíciles, admiró tu tenacidad y esfuerzo. Tu amor fue lo que me motivó a
seguir estudiando y finalizar con el presente trabajo.

A mi Esposa Luz : Gracias por comprenderme y orientarme en los

momentos difíciles, la finalización del presente estudio, se debió al amor
que existe entre nosotros. Recuerda que nos entierren juntos.

A mis Hijos Haik, Dimitri, Lesly y Tehui: Por haber cedido parte de su
tiempo en mi formación profesional, mi reconocimiento y amor, además
son mi principal motivación y mi energía para mi actividad diaria.

A mis Hermanos y Sobrinos: Por los buenos momentos que hemos

vivido, y por el amor que nos han inculcado.

A mi Universidad: Por haberme cedido un espacio en sus aulas y

permitirme tener una formación profesional adecuada, además de haberme
enseñado a amar sus colores.

PORQUE SOY DE SANGRE AZUL Y DE PIEL DORADA POR

SIEMPRE LO SERE.
 3

Agradecimientos

Dr. Patrick Blackal. Por ser mi guía y maestro en el estudio de microbiología,

además de su amistad.

Dr. Ariel Ortíz M. Por su confianza, orientación y amistad

Sr. Ignacio Castillo A. Por apoyarme en mi formación profesional y por darme la

oportunidad de contribuir al desarrollo del grupo VITEP.

MVZ. Héctor Johnson G. Por creer en mi, y por ser parte importante en mi
desarrollo profesional, además de haberme enseñado la palabra del SEÑOR.

A mi apreciable jurado. Por haberme orientado en el manejo de la investigación.

A los colegas y amigos que contribuyeron para la realización del presente, a todos
ellos mi agradecimiento.
 4

Resumen

Durante 17 meses que comprende el periodo 1998-

2000, se analizaron 45 muestras avícolas de la región de
los Altos de Jalisco México, con manifestaciones clínicas
de Coriza Infecciosa Aviar, aislándose e identificándose
por pruebas bioquímicas, serológicas y de biología
molecular (PCR y ERIC-PCR), 39 cepas de Haemophilus
paragallinarum . Con el esquema de Page, se identificó al
serovar C en 18 ocasiones (46.1), el B en 12 (30.7%) y A
en 9 casos (23%)
El otro sistema de clasificación serologica es el de
Kume, en donde se encontró en 18 casos al serovar C2, al
B1 en 12 (30.7%) y A2 en 7 casos. Dos cepas de
Haemophilus paragallinarum del serovar A, no mostraron
títulos superiores a 1:40 con antisueros absorbidos para los
cuatro serovares de A, por lo cual se considera que estas
dos cepas pueden ser nuevos serovares del serogrupo A.
Se identificaron por primera vez en México dos cepas
de Haemophilus paragallinarum NAD independientes, una
corresponde al serovar C (AZUL y ORO) y la otra al B
(PUMA), este serovar no ha sido reportado en la literatura
cientifíca, por lo cual se considera como primera aparición
a nivel mundial.Estas cepas se caracterizaron y se
compararon con las cepas de referencia de Sudáfrica,
mediante las pruebas de biología molecular PCR y ERIC-
PCR.
Para el control de la Coriza Infecciosa Aviar, el uso
de bacterinas que incluyan cepas regionales de
Haemophilus paragallinarum serotipificadas, sería una
medida acertada para controlar la enfermedad.
 5

INTRODUCCION

La coriza infecciosa es una enfermedad infectocontagiosa de distribución

mundial, que afecta en forma aguda las vías respiratorias de las aves y es importante en
la especie Gallus gallus debido a las considerables perdidas económicas que provoca,
estas se basan en el incremento de la selección de pollo de engorda y a la disminución
en la producción de huevo (10-40%) en reproductoras y ponedoras, particularmente en
granjas multiedades (13).

El agente causal de la infección de coriza infecciosa es la bacteria Haemophilus

paragallinarum (Hp), esta se agrupa como Gram negativo que tiene requerimientos in
vitro de nicotin adenin dinucleotido (NAD) o factor V, recientemente se han observado
que algunas cepas de Haemophilus paragallinarum (Hp) aisladas en Sudáfrica ya no
requieren de este factor, conociéndoseles como factor V independiente, estas bacterias
se consideran una mutación de las cepas típicas de Haemophilus a través de algún
plasmido (43) y es común que se encuentren en zonas avícolas muy densamente
pobladas (3, 4, 17, 23, 24, 25, 35, 36, 40).

El sistema de serotipificación mas ampliamente usado es el esquema de Page

(37), el cual agrupa tres serovares ( A, B y C), algunos reportes han puesto en duda la
validez del serovar B de Page, sugiriendo que los miembros de este serovar son
realmente variantes de los serovares A y C (48), sin embargo recientemente se ha
demostrado que serovar B de Page es un verdadero serovar y que con excepción de la
cepa de referencia 0222, los aislamientos del serovar B son completamente patógenos
(57), además de que existe poca protección cruzada entre ellos (9, 44, 45, 46, 59)

El esquema de serotipificacion de Kume es otro sistema alternativo del esquema

de Page (29). Este reconoce tres serogrupos los cuales recientemente han sido
demostrádo que corresponden a los serovares A, B y C de Page (9), actualmente se
reconocen 9 serovares de Kume (10, 21, 28, 32).

La enfermedad se caracteriza por producir conjuntivitis, sinusitis, inflamación

periorbital y secreción nasal, siendo común las complicaciones con microorganismos
gram negativos independientes de NAD, los cuales facilitan la magnitud de las lesiones
a todo el aparato respiratorio y a otros órganos internos, en estas situaciones se observa
una enfermedad más severa, denominada coriza complicada, que puede ocasionar
mortalidades (13).

Por lo general la enfermedad provoca cuadros agudos con estados febriles que
determinan la pérdida de apetito y, como consecuencia de esto se produce bajas en la
producción que acompañan al proceso y pueden tardar hasta cuatro semanas en
recuperarse. En los brotes complicados, estas bajas de producción pueden prolongarse
durante mayor tiempo (20).
 6

Las aves que se recuperan de la infección natural de coriza infecciosa poseen

varios grados de inmunidad. Ha sido demostrado que inmunidad homóloga se
desarrolla tan rápido como en dos semanas después de iniciada la exposición (42) a
demostrado que como resultado de una infección hay inmunidad homóloga, así como
también algún grado de inmunidad heterologa que ofrece cruzamiento a los serovares de
Page. En consideración a la literatura en el grado de protección cruzada de los serovares
conferida por bacterias las cuales utilizan la célula completa, hay dos problemas que
pueden confundir la interpretación de resultados, primeramente estudios diversos han
definido protección en diferentes formas, algunos investigadores han evaluado
protección solo en términos de presencia o ausencia de signos clínicos, ausencia de
moco en los senos y la ausencia del organismo en los senos después del desafío, la
última definición es más confiable que la simple ausencia de signos clínicos (15, 41)

Investigadores quienes han usado bacterias a partir de cultivo de tejidos o a base

de yema de embrión de pollo han reportado algún grado de protección cruzada entre los
serovares de Page . En contraste bacterias basadas en crecimiento del antígeno en caldo
han demostrado proporcionar poca protección cruzada de los serovares de Page (14,33).
La explicación de la diferencia entre bacterias a base de yema y la de caldo en términos
de protección cruzada de los serovars, esto parece probable que al antígeno producido
en yema debe parecerse más a la composición natural de la bacteria en el ave, que el
antígeno elaborado en caldo. De hecho las bacterias desarrolladas en yema
proporcionan algún grado de protección de serovars, esto no debería ser tomado como
una amplia recomendación para usar este tipo de bacterina, diversos estudios han
demostrado que las bacterias a base de caldo son más efectivas que las de yema en
términos de protección homóloga (8).

La presencia de coriza infecciosa en la República Mexicana se remonta a los

años 60, en donde al igual que en otros países, el uso de bacterinas era limitado, de esa
fecha a la actual se ha mejorado en el uso de biológicos, pasando desde las
“exposiciones controladas”, que a decir verdad nunca han sido controladas hasta el uso
de bacterinas a base de yema de embrión de pollo.

En los últimos años la mayoría de las bacterinas comerciales usadas en las aves
de las principales regiones avícolas del país habían controlado la enfermedad, a pesar de
que la mayoría de las granjas cuentan con multiedades, además el ciclo productivo de
las aves se ha prolongado más de lo acostumbrado aunado al crecimiento avícola que se
esta observando, todo lo anterior, además de otras situaciones tanto de manejo,
higiénicas y climáticas ha propiciado la aparición de cepas de Hp antigénicamente
diferentes a las ya conocidas, lo anterior se ha reflejado en el hecho de que la
presentación de Coriza Infecciosa Aviar sea permanente en aves inmunizadas con las
principales bacterinas comerciales tanto Nacionales como Internacionales de coriza
infecciosa disponibles ahora en México han sucumbido a la presencia de Haemophilus
paragallinarum

Referente al estado de Jalisco, es de mencionar que este cuenta con una

población avícola de 35 millones de aves de postura comercial, esto significa el 23% del
 7

total de la población avícola Nacional , 20 millones de pollo de engorda , 100,000

reproductoras ligeras y 50,000 reproductoras pesadas.
Los 35 millones de aves postura comercial, se encuentran basicamente en la zona de
los Altos de Jalisco, que según la división política del Estado de Jalisco está integrada
por 19 municipios: Acatic, Arandas, Encarnación de Díaz, Jalostotitlán, Jesús María,
Lagos de Moreno, Ojuelos de Jalisco, San Diego de Alejandría, San Julián, San Miguel
el Alto, Tepatitlán, Teocaltiche, San Juan de los Lagos, La Unión de San Antonio; Villa
Hidalgo, Villa Obregón, Valle de Guadalupe, Yahualica y Zapotlanejo.

La denominación de los Altos se debe a su mayor altitud, de 1750 a 2100 metros

sobre el nivel del mar, en contraste con la región media (Lago de Chapala y sus
alrededores) y la costa. Abarca una superficie de 15,053 km2 y representa el 19.1% de
la superficie del Estado de Jalisco.

En la actualidad el estado de Jalisco es el principal productor de huevo a nivel

Nacional ya que participa con el 33% de la producción de la República (52).
Dentro de la región de los Altos, los municipios de Tepatitlán y San Juan de los Lagos,
sobresalen del resto por concentrar el 80% de la población total del Estado de Jalisco.
Tepatitlán cuenta con una superficie de 100 Km2, en donde alberga, además de
población humana a 20 millones de aves de postura comercial, alrededor de 3,200,000
de pollitas en crianza, y cerca de 3,500,000 aves en crianza y estas pertenecen a 27
empresas avícolas.

El crecimiento de la población avícola en la región de los Altos de Jalisco data

desde los años 60, en donde de esa fecha se incremento el censo avícola debido a los
subsidios que había en ese entonces por el gobierno Federal, además de la tenacidad, y
dedicación de los avicultores en sus granjas, aunado a que sanitariamente todavía no se
presentaban tantas enfermedades infectocontagiosas como es estos tiempos.
El crecimiento se ha dado en forma poco planificada por parte de los avicultores, ya que
en ese entonces no consideraban la opinión técnica de un especialista en avicultura,
tampoco estaban reglamentadas las disposiciones sanitarias ni la regulación territorial
por parte del gobierno Federal. Esta situación a provocado que existan granjas de
diferentes propietarios y de distintas edades a una distancia muy cercana, compartiendo
entre estas sus enfermedades, la distribución de las granjas da la impresión de que es
una sola granja, pero la realidad es de que gran parte de las empresas tienen un
calendario de vacunación distinto, además de que manejan diferentes laboratorios de
producción de biológicos, y no existe una estratificación en el manejo zootecnico de las
aves, ya que se pueden encontrar granjas de crianza cerca de una de postura o granjas
de postura con aves al inicio de la postura y otras al final del ciclo, o en otros casos la
misma empresa tiene sus crianzas lejos de sus posturas, pero a un lado de sus crianzas
existen granjas de postura de otro avicultor, se hace referencia a lo anterior ya que esto
a llevado a la aparición de enfermedades infectocontagiosas (Síndrome de baja postura,
Bronquitis infecciosa, Influenza aviar, Anemia infecciosa aviar, Marek,
Laringotraqueítis entre otras) las cuales han sido difícil de controlar y erradicar (52).

La presencia de la enfermedad de Coriza infecciosa aviar en esta región data

desde los años 60´, y de esta fecha a la actual se ha complicado su control debido a las
 8

situaciones sanitarias antes mencionadas, ya que como todo organismo viviente este a
tenido una tendencia a la modificación de su genética, y esto se observa con la poca
efectividad de las bacterinas comerciales así como la aparición de Hp atípicos, los
cuales ya no requieren el factor V de crecimiento, obviamente esto ha dificultando el
control de la enfermedad en esta región avícola.

La frecuencia y magnitud de los brotes de coriza infecciosa en las aves de este

región, propicio que se realizará una investigación epizootiológico, en donde se incluía
el aislamiento de las cepas así como la serotificación, para su posterior selección de
estas cepas regionales que pudieran ser empleadas en la producción de inmunógenos
específicos contra la coriza.
 9

Planteamiento del Problema

La presencia de coriza infecciosa aviar en las aves de la República Mexicana

data de los años 60´s, en donde en ese entonces la enfermedad se empezó a controlar
con el uso de bacterinas a base de yema, además era una practica muy común el
exponer a las aves a la presencia del Haemophilus paragallinarum, para que las aves
desarrollaran la enfermedad, el objetivo de lo anterior era que las aves desarrollaran una
inmunidad sólida, y esta les durara durante la producción, conllevando con esto a evitar
perdidas económicas durante la producción, observando bajas de producción que
oscilan entre un 2% al 40%. En los siguientes años se desarrollaron bacterinas las cuales
hacían crecer al microorganismo en medios de cultivo artificiales agregando como
adyuvante gel de hidróxido de aluminio, la mayoría de las bacterinas comerciales
contienen los 3 serovars reconocidos por Page ( A, B y C ), la enfermedad había sido
controlada con el uso de estas bacterinas, pero a partir de los 90´s empezó a resurgir la
enfermedad en las principales zonas avícolas del País con la misma intensidad que
antes, a pesar de que en la mayoría de las granjas se aplican como mínimo dos
bacterinas y en la mayoría tres, estas se aplican previo a que las aves entren a
producción, lo anterior a motivado a que se realicé un estudio microbiológico de la
enfermedad de coriza infecciosa aviar en la región de los Altos de Jalisco.
 10

Hipotésis

Las manifestaciones clínicas de la enfermedad de Coriza infecciosa, así como la

disminución en la producción de huevo , serán más manifiestas en las aves que son
expuestas a serovares de Hp direntes al que contienen las bacterinas comerciales.
 11

Objetivo

General: Aislar, identificar y serotipificar los Haemophilus paragallinarum

provenientes de aves afectadas por Coriza infecciosa aviar en la región de los Altos de
Jalisco.
 12

Material y Métodos

Aves

Se remitieron aves que presentaban la fase inicial de la enfermedad de Coriza

infecciosa aviar y estas no recibieron ningún tratamiento antimicrobiano, estas aves
procedían del Estado de Jalisco, siendo una zona avícola importante del país.

Las aves provenientes de granjas de la región de los Altos de Jalisco se

remitierón al Laboratorio de diagnostico llamado LIPEPSA el cual esta acreditado en
las campañas zoosanitarias por la Secretaria de Agricultura y Ganadería. Se recopiló
información de los brotes lo que incluye la ubicación de la granja, edad de las aves,
estirpe, mortalidad, morbilidad, % de producción, duración del brote, # de animales
existentes en la granja, signos clínicos y calendario de vacunación. Los datos antes
mencionados se registraran en una base de datos.
Las aves se sacrificaron mediante dislocación cervical, realizando la examinacion post-
mortem de órganos internos, anotando las alteraciones patológicas. Las cabezas fueron
removidas para el aislamiento bacteriano.

Aislamiento e identificación bacteriana

Las cabezas de las aves fueron flameadas para evitar contaminación alguna, para
posteriormente hacer una incisión facial y con ello exponer los senos infraorbitarios, en
este sitio es donde el Hp se reproduce en mayor cantidad, razón por la cual se introdujo
un hisopo de algodón el cual estuvo impregnado con medio de cultivo, para
posteriormente hacer el estriado en los siguientes medios de cultivo sólido : gelosa
sangre 10% de sangre desfibrinada de borrego con y sin nodriza de Staphylococcus
aureus, agar chocolate suplementado con 1% suero de ave mas 25 microgramos de
NADH/ml, agar infusión cerebro y corazón, y agar Mc conkey.
Las placas fueron incubadas durante 48 h, a una temperatura de 370 grados y con una
atmósfera del 5% de bióxido de carbono, transcurrido este tiempo se seleccionaron las
bacterias que presentaron el fenómeno de satelitismo y catalasa negativo, estas se
resembraron en medios de cultivo sólido para purificarlas (tres subcultivos) y hacerlas
crecer en forma masiva (3).

Pruebas de caracterización

El inoculó de todas las pruebas de caracterización fue preparado en placas de

agar infusión cerebro corazón suplementado, e incubadas por dos días a 370C, bajo una
atmosfera microaerofilica, excepto para las pruebas enzimáticas, las cuales fueron
incubadas en condiciones aeróbicas. Todas las muestras fueron incubadas por 48h, a
excepción de la fermentación de carbohidratos que se incubaron hasta por 7 días.
 13

La actividad de catalasa se realizó en medio liquido con crecimiento de hp, al

cual se le agregó peróxido de hidrógeno al 3%, la formación de burbujas en forma
inmediata fue indicativo de la presencia de esta enzima. La prueba de oxidasa fue
desarrollada por el método de Kovac’s (18)
Se inoculó una colonia bacteriana por cada prueba bioquímica, las cuales incluyen:
Gram, catalasa, oxidasa, sim, galactosa, glucosa, lactosa, manitol, mannosa, sorbitol,
sucrosa, xylosa, arabinosa, trealosa y maltosa ( 26, 49, 50).

Fermentación de carbohidratos

La fermentación de carbohidratos fue desarrollada usando una modificación del

método de Blackall (5). El medio usado fue TM/SN sin glucosa y almidón (TMF), este
fue suplementado con 0.004% de rojo de fenol, 25 μg NADH/ML, 1% (vol:vol) suero
inactivado de pollo, y 2% del apropiado carbohidrato (3). Los tubos fueron incubados
con la tapa floja en atmósfera microaerofilica, tubos sin inocular fueron anaranjados,
mientras que tubos inoculados fueron amarillos (fermentación de carbohidratos) o
ligeramente rojos (no fermentación de carbohidratos). Todas las cepas fueron
examinadas usando el método de replica en placa descrito por Blackall.(5).

Serotipificación

-Medio de cultivo

TM/SN se uso para el crecimiento general en los aislamientos de Hp TMB que

es la versión en caldo de TM/SN fue usado para la producción de antígeno. La
incubación se realizó en condiciones microaerofilicas para las placas conteniendo agar y
en condiciones aeróbicas para el medio líquido (16).

-Glóbulos rojos fijados

Los glóbulos rojos fijados (GRF) fueron preparados por la modificación de la

técnica de Bing et al. Glóbulos de ave fueron colectados en solución Alsevers y lavados
tres veces con 0.15 M NaCl. Un porcentaje de glutaraldehído a partir de una solución
stock al 25% fue diluido con solución de Na3PO4 (pH8.2) (1 volumen) y 0.15 M NaCl
(9 volúmenes) en agua destilada (5 volúmenes). Al 1 o 2% de glóbulos rojos de ave
GRA, se le adicionó una solución al 1% de glutaraldehído e incubándose a 4oC por 30
min con movimientos ocasionales. Las células fijadas fueron centrifugadas a 400 x g y
lavadas cinco veces con 0.15 M NaCl y cinco con agua destilada. Las células fueron
suspendidas al 30% de concentración en agua destilada conteniendo 1:10,000 de
thimerosal y almacenadas en pequeños volúmenes a 4oC (2).
 14

-Obtención de antígeno

- Método físico

Las colonias bacterinas de Haemophilus paragallinarum se crecieron en forma

masiva en medios de cultivo liquido (TM/SN) durante toda la noche, posterior a la
incubación las bacterias fueron centrifugadas a 4000 g, durante 15 minutos, el pellet fue
lavado con PBS(pH 7.4) y resuspendido en PBS conteniendo 0.01% de thimerosal, el
pellet bacteriano fue almacenado durante tres días a 4C antes de su análisis (9).

- Método químico

Posterior a que el antígeno fue lavado se le agregó 15 ml de una solución de

tiocianato de potasio y solución salina conteniendo 0.5 M KSCN y 0.425 M NaCl (pH
6.3).
La suspensión fue ajustada a una densidad óptica de 1.6 a 650 nm, agitando por
2 h a 4oC, sonificandose (30, 60% pulsaciones de salida, 120W; Ultrasonic modelo
W373). Finalmente el antígeno fue lavado tres veces con PBS conteniendo 0.001% de
thimerosal, suspendiendo en 5 ml de PBS con thimerosal y almacenando el antígeno a
4oC (9, 22)

-Método enzimático

Cuando la actividad hemaglutinante no pudo ser detectada por el simple lavado

de las células bacterianas, estas se trataron con hialuronidasa, usando la modificación
del método de yamaguchi et al. A 200 μl de células bacterianas fueron centrifugadas y
resuspendidas en PBS (pH 6.0) conteniendo 100 unidades de hialuronidasa/ml a una
densidad óptica equivalente al tubo No. 3 de McFarland. La suspension fue mantenida a
370 C por 2 h y lavada dos veces en PBS (pH 7.4), y las células bacterianas fueron
resuspendidas en 200 μl de PBS (pH 7.4) conteniendo 0.01% ( peso/vol) de thimerosal
(29).

Antisueros para el esquema de hemaglutinación

Antisueros para las cepas de referencia fueron elaborados en conejos por la

técnica descrita por Kume et al. Los conejos fueron desangrados una semana después de
la última inoculación (29).

Prueba de hemaglutinación

Los títulos de hemaglutinación del antígeno fue determinado con 50-μl de

volumen usando el método de microdilución. Diluciones dobles del antígeno fueron
hechas con PBS (pH 7.2) conteniendo 0.1% (peso/vol) sueroalbumina de bovino y
 15

0.001% (peso/vol) de gelatina. GRF al 0.5% fueron agregados a cada pozo, y las placas
fueron incubadas por 1 h a temperatura ambiente. El titulo de la hemaglutinación fue la
dilución mayor de antígeno causando aglutinación de GRF en glutaraldehído (37).

Prueba de Inhibición de la Hemoaglutinación para el esquema de Page y Kume

En una microplaca de 96 pozos con capacidad para 500 microliltros cada uno ,
se depositaron 50 microlitros de cada antisuero A, B, y C, realizándose diluciones
dobles hasta llegar a la dilucion 1:512, en cada dilucion se adicionó 50 microlitros del
antígeno preparado a partir de la cepa aislada de Hp, el cual contiene 4 unidades
hemoaglutinantes, las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos,
transcurrido este tiempo, se adicionó a cada pozo 50 microlitros de glóbulos rojos de
ave fijados al 0.5%, las placas se incubaron a temperatura ambiente, la lectura se realizó
transcurridos 40 minutos. Se considera positivo a determinado serovar cuando el
antisuero se une a las hemaglutininas del Hp y los glóbulos rojos de ave fijados se
depositan en el fondo del pozo formando un botón, las muestras negativas formaran un
halo de hemoaglutinacion en el fondo del pozo (1, 11, 12, 51, 56).

Absorción de antisueros

El antisuero de conejo fue absorbido con hemaglutininas de las cepas de

referencia, para producir reactivo monoespecificos. Cinco volumen de antígeno
conteniendo 64 unidades hemaglutinantes fue centrifugado y suspendido en 1 volumen
de una dilución de antisuero 1:40 en PBS con albumina-gelatina. La suspensión fue
agitada a temperatura ambiente por 2 h y entonces a 4oC toda la noche. Después de la
centrifugación, el antisuero absorbido fue removido, y el título HI para homologo y
heterelogo antígeno fue determinado. Antisuero fue absorbido hasta tres veces, hasta
que todas las reacciones con heterologos antígeno fue removido. Finalmente, todos los
antisueros fueron absorbidos con cinco volúmenes de GRF en glutaraldehído y fueron
almacenados a –20oC como una dilución 1:40 de antisuero absorbido (55).

ERIC-PCR

PCR fue llevado a cabo en volúmenes de 50 μl. La reacción mezclada consistió

de 10 nM Tris-Hcl (pH 8.3), 50 mM KCL, 2 mM MgCl2, 0.01% (peso/vol) gelatina,
200 μl de dATP, dGTP, dTTP y dCTP, 0.4 μl de cada primer y 1.25 U de Taq
polimerasa. La apropiada cantidad de DNA template (10-200 ng) fue agregado.
El MgCl2 y la concentración de los primers fue determinada por optimización de
experimentos. La amplificación fue desarrollada usando Hybaid OmniGene thermal
cycler (Hybaid, Middlesex, U.K) en el cual las muestras fueron desnaturalizadas a 980 C
por 2.5 min antes Taq y aceite mineral fue agregado. Las condiciones de reacción
consistio en 25 ciclos de 940 C por 1 min, 650 C por 1 min, y 720 C por 2 min seguido
por un ciclo final de 940 C por 1 min, 650 C por 1 min, y 720 C por 10 min. El producto
del PCR fue detectado por corridas de 10 μl de la muestra en 0.7% en gel de agarosa
conteniendo ethidium bromide por 30 min a 80 V y la visualización fue bajo luz UV
(19, 34, 53, 54).
 16

Laboratorios de trabajo

1.- Laboratorio de Patología Aviar (LIPEPSA). Av. Avicultores S/N Tepatitlán,

Jalisco México.
2.- Laboratorio en Investigación Animal. Yeronpilly, Brisbane, Australia.
 17

Resultados

Aves

Durante el período 1998 –2000 se recibieron en el Laboratorio de Patología

Aviar (LIPEPSA) 45 casos clínicos en donde se remitieron aves con signología de la
enfermedad de Coriza Infecciosa Aviar (Cuadro 1).

Cuadro 1

Total de casos clínicos de Coriza Infecciosa Aviar, por

año

Periodo 98 99 00 Total
Casos 7 24 14 45

El año en donde se recibieron más casos clínicos para aislamiento de Coriza Infecciosa
Aviar fue en 1999 con un total de 24 y 1998 tuvo el menor numero con 7 (Cuadro1).

1998
En este año se analizaron un total de 7 parvadas aviares, de las cuales seis
resultaron positivas al aislamiento de Hp , lo cual corresponde a un 15.38% del total de
los aislamiento durante los 17 meses que duró la investigación (Cuadro1) y un caso
negativo. Además fue el año en donde se recibieron menos muestras para intentar el
aislamiento de Hp en comparación a los otros años (Cuadro 2).

1999
Se recibieron 24 casos clínicos sospechosos de la enfermedad de Coriza
Infecciosa Aviar , de los cuales 19 fueron positivos al aislamiento (48.71 % del total de
aislamientos, durante los tres años de investigación) y 5 negativos (Cuadro 2).
En este año se recibieron el mayor número de casos para aislamiento de Hp en
comparación a los otros años (Cuadro2).
 18

Cuadro 2

No. de parvadas estudiadas para aislamiento de Haemophilus

paragallinarum , y su porcentaje de casos positivos y
negativos

No. Parvadas enviadas, por No. parvadas

periodo + % Neg %
1998 6 85.7 1 14.3
1999 19 79.1 5 20.9
2000 14 100 0 0
Total 39 86.6 6 13.4

En los primeros cinco meses del año es donde se observa el mayor numero de
asilamientos positivos a Hp en comparación al resto de los meses y a los otros años en
estudio (Gráfica 1).
 19

Gráfica 1

Aislamientos de Hpg
4
3
Número 2
1
0
E F M AM J J A S O N D
Meses

1998 1999 2000

2000
14 casos clínicos se recibieron en este año, siendo todos positivos (35.89% del
total de aislamientos, durante los tres años de investigación), como se muestra en el
cuadro 2

Aislamiento e identificación bacteriana

La técnica diagnóstica así como el sitio seleccionado (senos infraorbitarios) para

la búsqueda de Hp en las aves remitidas durante la investigación y que presentaban
manifestaciones clínicas de coriza Infecciosa Aviar, fue la adecuada ya que de 45 casos
clínicos emitidos durante los 17 meses, el agente etiológico se aislaron en 39 ocasiones
lo que significó un (86.6%).
 20

Pruebas de caracterización

La mayoría de la cepas de Haemophilus paragallinarum presentaron las

características metabólicas de la bacteria, cuando estas se inocularon en pruebas
bioquímicas, la excepción fue en la dependencia del NAD. Dos cepas de Hp no
requirieron de este factor para su crecimiento (Cuadro 3).

Cuadro 3

Pruebas de caracterización de Haemophilus paragallinarum

Oxidasa Requerimiento
No.Hp Catalasa Positiv Negati NADH
os. vos. Positivos. Negativos
39 39 positivos 35 4 37 2

Fermentación de carbohidratos

El método de placa resultó confiable sin presentar algún error en su lectura, y los
patrones de fermentación de carbohidratos que presentan los Hp fueron los que reporta
la literatura, la excepción la presentó el serovar B de Haemophilus paragallinarum para
el carbohidrato sucrosa, en donde se debería observar acidez en los patrones de
fermentación (Cuadro 4).
 21

Cuadro 4

Fermentación de carbohidratos por serovar de Haemophilus

paragallinarum

Carbohi- A B C
drato Pos. Neg. Pos. Neg. Pos. Neg.
Galactosa 0 9 0 12 0 18
Glucosa 9 0 12 0 18 0
Maltosa 9 0 12 0 18 0
Lactosa 0 9 0 12 0 18
Manitol 9 0 12 0 18 0
Sorbitol 8 1 12 0 18 0
Sucrosa 9 0 0 12 18 0
Trehalosa 0 9 0 12 0 18
Xylosa 0 9 0 12 0 18

Obtención de antígeno

La mayoría de las cepas de Hp que se identificaron durante la investigación

aglutinaron glóbulos rojos de ave fijados en glutaraldehído al 0.5% mediante el proceso
físico, solamente dos requirieron del tratamiento enzimático y estas correspondieron al
serovar A de Hp (Cuadro 5).
 22

Cuadro 5

Métodos para la obtención de antígenos de

Haemophilus paragallinarum

Serovar Hpg Físico Químico Enzimático

A 7 2* 2
B 12 S/T S/T
C 18 S/T S/T
• No se obtuvo actividad hemaglutinante por este medio.
• S/T= Sin tratamiento.

Prueba de hemaglutinación

Las 39 cepas de Haemophilus paragallinarum , fueron primeramente

serotipificadas por el esquema de Page, en donde se encontró que la mayoría
correspondió al serovar C con un total de 18, lo que corresponde a un 46.1%, seguido
del serovar B con 12, equivalente a un 30.7% y por último al serovar A con 9
aislamientos, correspondiéndole un 23% (Cuadro 6)

Cuadro 6

Serotipificación de Haemophilus paragallinarum mediante el

esquema de Page, durante el periodo 1998-2000

A B C Total
+ % + % + % + %
9 23 12 30.7 18 46.1 39 100
 23

Serotipificación de Haemophilus paragallinarum mediante el esquema de Kume

De los 39 aislamientos de Haemophilus paragallinarum 18 correspondieron al

serovar C2, 12 al serovar B1 y 7 al serovar A2, dos aislamientos de Hp pudieron
serotipificar en los 4 serovares del serogrupo A (Cuadro 7).

Cuadro 7

Serotipificación de Haemophilus paragallinarum mediante el

esquema de Kume, durante el periodo 1998-2000

A1 A2 A3 A4 B1 C1 C2 C3 C4 NI
0 7 0 0 12 0 18 0 0 2
NI: No identificadas, posible nuevo serovar
 24

PCR

Los 39 aislamientos de Haemophilus paragallinarum tuvieron el mismo peso

molecular, apreciándose la misma banda de identidad (0.5 KD), que las cepas de
referencia, cuando estas se observaron en un gel de electrofóresis (Fig. 1)

Figura 1

Comportamiento de las cepas de Haemophilus

paragallinarum provenientes de México, con el uso de PCR

La flecha indica la banda la cual tiene el peso molecular

que corresponde a Hpg, observandose que todos los
aislamientos Mexicanos de Hpg estan en esa banda.
 25

EIRC-PCR

Las dos cepas de Hp que no requirieron del factor NAD para su crecimiento
fueron comparadas entre ellas, de igual manera con las cepas provenientes de Sudáfrica,
las cuales tampoco requieren de NAD para su crecimiento.
Las cepas nacionales mostraron diferentes pesos moleculares entre ellas, observándose
diferentes bandas de identidad en el gel de electroforesis, de igual manera fue muy clara
la diferencia en las bandas de identidad entre las cepas de Hp de ambos países (Fig 2 ).

Figura 2

Comportamiento de las cepas NAD independiente de

Haemophilus paragallinarum provenientes de México y
Sudáfrica, mediante la prueba de ERIC-PCR.

Columna 1, Marcador., 2, cepa Puma (B1), 3, cepa AZUL y ORO (C2)

4., cepa Sudáfrica A, 5., cepa Sudáfrica C.
La flecha indica la banda en donde existe diferencia entre las cepas.
 26

DISCUSION

Se consideró que los 39 aislamientos de Hp que se identificaron de los 45 casos

trabajados durante los 17 meses correspondientes al periodo 1998-2000, y que
provenían de aves de diferentes edades las cuales manifestaban signos clínicos
característicos de Coriza Infecciosa Aviar, fue un porcentaje alto (86.6), y que el hecho
de no poder aislar el Hp de seis casos sospechosos, pudo deberse a que las aves
pudieron haber venido con tratamiento antimicrobiano, la cronicidad de la enfermedad
permite que las bacterias saprofitas crezcan más rápido que Hp y por ende este
microrganismo es sobrepasado y con ello se dificulta su aislamiento o que las
manifestaciones clínicas correspondieran a otro agente o agentes infecciosos como
Pneumovirus en asociación con Staphylococcus aureus u Ornitobacterium
rhinotracheale, Mycoplasma gallisepticum y synoviae, Bronquitis infecciosa entre
otros. Por tanto se considera que la técnica de aislamiento así como el sitio elegido para
la toma de muestras fue el indicado (senos infraorbitarios), aunque se ha reportado que
Hp también se ha podido aislar de órganos internos, a raíz de esta información se ha
sugerido que cuando se intente el aislamiento de Hp se consideré órganos internos para
su aislamiento ya que esta información servirá para conocer la conducta del
microorganismo (patogenia) (3).

La razón por la cual el año de 1999 tuvo el mayor número de aislamientos de Hp

en comparación a los otros dos años, se debió a que en este año se muestreo durante
más meses (ocho en total), a diferencia del año 98 en donde solo se trabajó en cuatro
meses y en el 2000 en cinco meses.

El mayor número de aislamientos de Hp que se identificaron en los primeros

cinco meses del año, durante el periodo de tres años que duró el estudio, en
comparación al resto de los meses, se debió a que en estos meses se intensificó la
búsqueda de casos sospechosos de Coriza Infecciosa Aviar , además es de recordar que
en los primeros meses del año (Enero, Febrero, Marzo) la temperatura es inferior al
resto de los meses, lo que facilita la penetración y replicación del microorganismo en
las células huésped del ave, ya que el frío provoca que los cilios de la tráquea queden
inmovilizados en forma temporal , lo cual permite el acceso de la bacteria, al igual que
los movimientos del aire el cual facilita la difusión del microorganismo de una parvada
a otra o de una granja a otra, y como se menciono la región de los Altos de Jalisco,
alberga a 35 millones de aves de postura comercial en un circunferencia de 100 Km a la
redonda, lo cual da la impresión de que existe en esa región una mega granja con
megaproblemas (20).

Después de 17 meses de estudio se encontró que la edad de las aves en donde se

aisló con más frecuencia Hp fue entre 16 y 30 semanas (Cuadro 8), que en teoría a esta
edad es cuando las aves deben estar mejor protegidas contra las manifestaciones clínicas
de la enfermedad y las bajas de producción, ya que mínimo a esta edad ya recibieron
dos bacterinas de Coriza Infecciosa Aviar ya sea en aceite o en gel de hidróxido de
aluminio, y en algunos casos hasta 3 bacterinas, la mayoría contiene los tres serovares
de Hp y solo un laboratorio vende su biológico con dos serovares (A y C), (anexo 1),
 27

esta empresa argumenta que estos dos serovares protegen contra el serovar B, los
resultados en el campo demuestran que no existe protección cruzada.(49, 58).

Cuadro 8
Serogrupos de Haemophilus paragallinarum por semanas de
edad

Serovar 6 – 10 11-20 21- 35 36 – 60

A 3 7 6 1
B 0 1 2 0
C 1 2 4 1
NT* 0 0 2 0
NT* No tipificables

Otra de las posibles causas de la presentación de Coriza Infecciosa Aviar en esta

edad , es el hecho de que las aves se crían y se desarrollan en ambientes mejor
controlados sanitariamente en comparación a las posturas (anexo 1, en donde se observa
que solo un Hp se aíslo de aves de 6 semanas de edad), ya que en muchos casos las aves
que provienen de los desarrollos y son alojadas en las casetas de postura, sufren de
inmediato un desafío severo por parte de Hp , ya que cuando llegan a la granja, aquí ya
existen aves de diferentes edades las cuales han presentado la enfermedad de Coriza
Infecciosa Aviar (granjas multiedades) (13).

La presentación de Coriza Infecciosa Aviar a esta edad es de importancia

económica, ya que las aves de postura comercial alcanzan su máxima producción a las
26 semanas de edad (Hy-line) , y algunas parvadas vuelven a recuperar sus parámetros
de producción de dos a tres semanas posterior al brote, lo anterior depende de la
morbilidad con la que afecta a las aves y la oportunidad en el tratamiento
antimicrobiano

Estos resultados son similares a los que describen los investigadores argentinos
(46), en donde mencionan que en su país la Coriza Infecciosa Aviar se ha venido
presentando en aves inmunizadas y en granjas multiedades, ellos consideran que existe
poca protección cruzada entre las cepas que se usan para la producción de biológicos y
las cepas de desafío (44, 45, 49,50).

El hecho de aislar un solo Hp en aves de 6 semanas de edad (anexo 1), se

correlaciona a que en esta edad las aves son criadas en ambientes más limpios, por lo
tanto no existe exposición temprana al Hp , ya que muchas crianzas están alejadas de las
posturas, creemos que esta es la principal razón para que se presenten escasos casos
clínicos en esta edad, ya que solo algunas empresas empiezan a inmunizar contra Coriza
 28

Infecciosa Aviar a la edad de 4 semanas, por lo tanto a la edad de 6 semanas de edad

(que es cuando se aisló Hp ), en teoría todavía el ave no desarrolla por completo la
respuesta inmune hacia la bacterina de Coriza Infecciosa Aviar , no existiendo una
protección total (6, 8, 27, 30, 31).

Referente a las pruebas de caracterización, lo más sobresaliente fue la

dependencia del NAD, ya que las cepas típicas de Hp requieren este factor para su
crecimiento, y en este estudio se identificaron dos cepas de Haemophilus
paragallinarum que no requieren de este factor (Haemophilus NAD independientes),
una de ellas corresponde al serovar B (cepa PUMA) no reportada en la literatura
cientifíca mundial, y la otra es el serovar C (AZUL y ORO), ya que los investigadores
de Sudafrica (Braggs et., al) han reportado la presencia de estas bacterias en aves de
postura comercial y en pollo de engorda, pero los serovares que han identificado son A
y C, no el B (cepa PUMA), además reportan que estos serovares atípicos no dan
reacción cruzada con los serovares típicos de Hp lo cual provoca fallas en la
vacunación, por consiguiente es difícil el controlar Coriza Infecciosa Aviar en parvadas
aviares que son inmunizadas con bacterinas que contienen las cepas de referencia de Hp
(17, 39, 40).

Es de mencionar que estas cepas de Hp atípicas (NAD independientes) que se

identificaron en este estudio provenían de una parvada que había recibido dos bacterinas
en emulsión utilizando aceite como adyuvante, las cuales contenían cepas de referencia
de Hp que incluían los tres serovares (A, B, C) y que fueron elaboradas por un
Laboratorio de producción de biologicos transnacional (anexo 1), la última aplicación
fue a las 16 semanas de edad, y el primer brote de Coriza Infecciosa Aviar en esta
parvada se presento a la edad de 24 semanas, observándose un 10% en el descenso de la
producción, el serovar de Page que se identificó en está ocasión fue el B, referente a
este serovar los investigadores japoneses (Yamaguchi et.,al) mencionan que este es el
serovar más difícil de controlar en una parvada, ya que entre las cepas de este mismo
serovar existe poca protección cruzada lo cual dificulta el control de la enfermedad con
bacterinas que contienen cepas internacionales y no regionales, está característica se
presume que se da en la conformación de la hemaglutinina, esta pudiera ser la
explicación por la cual la parvada que recibió dos bacterinas y que contenía el serovar B
presentó manifestaciones clínicas características de Hp.

Está misma parvada volvió a presentar manifestaciones clínicas de Coriza

Infecciosa Aviar a la edad de 48 semanas, 24 semanas posterior al primer brote de
Coriza Infecciosa Aviar , en esta ocasión el descenso en la producción de huevos fue de
15%, es de mencionar que la virulencia en este brote fue más severo que el que se
observó en los otros 38 casos clínicos, ya que en ellos no hubo mortalidad debido a Hp ,
pero en este caso se observó mortalidad de1% , Lo sobresaliente en esta ocasión fue el
aislamiento e identificación de dos serovares en el mismo brote uno correspondió al B
(cepa PUMA) y el otro al C (AZUL y ORO), ambos NAD independientes. No es muy
común que en un brote de Coriza Infecciosa Aviar se aíslen dos serovares distintos,
esto posiblemente se debe a que la morfología macroscópica y microscopica son
similares, conllevando con ello a que en el Laboratorio de diagnóstico se dificulte la
identificación de diferentes serovares en la misma muestra clínica. La recurrencia en las
 29

manifestaciones clinicas de Coriza Infecciosa Aviar en esta parvada se debio

posiblemente a que no existe reacción cruzada con estos Hp atípicos (NAD
independientes) con los tipìcos, lo anterior debe ser demostrado en experimentos de
Laboratorios tal como lo demostró el Dr. Braggs (17), lo cual resulta en fallas en la
vacunación, aunque la literatura menciona que dos semanas después de que existe un
brote por Coriza Infecciosa Aviar las aves generan anticuerpos neutralizantes, lo que
les permite enfrentar desafíos posteriores a la bacteria , esto se refiere a los
Haemophilus paragallinarum típicos, el serovar B también es la excepción en este caso.
Esta es la explicación por lo cual estas aves volvieron a sufrir de la Coriza Infecciosa
Aviar y con mortalidad.
La razón por la cual los Hp que se identificaron en esta parvada se volvieron atípicos,
ya que como se menciono párrafos atrás, el primer brote en esta parvada fue provocado
por el serovar B típico, se desconoce con certeza, los autores de Sudáfrica (Braggs)
consideran que se debe a una mutación genética o algún plásmido (17, 39, 40, 43).

Es de mencionar que si el serovar B típico de Hp es difícil de controlar en las

parvadas avícolas, como lo mencionan los investigadores argentinos (44), los cuales
observaron que parvadas aviares que habían sido inmunizadas con bacterinas de Coriza
Infecciosa Aviar de diferentes laboratorios de producción y que contenían los tres
serovares, seguían presentando manifestaciones clínicas características de Coriza
Infecciosa Aviar y con bajas en la producción de huevos (44, 45). Reportando por
primera vez que Hp la aislaron de órganos internos (hígado, pulmón, líquido sinovial).
El serovar B NAD independiente representa más dificultad que el serovar típico de Hp ,
manifestándose como un desafío para la avicultura y un grán reto para el control de la
enfermedad. (45, 49, 50).

Los resultados en el patrón de fermentación de carbohidratos para Hp , indican

un comportamiento metabólico normal de las bacterias en estudio. Es de mencionar que
la literatura describe que los carbohidratos son importantes para que el Hp se adhiera a
la célula huésped, permitiendo con ello su adherencia y replicación.
Además el método de placa utilizado, confirmó que es un método confiable (Blackall)
(5).
Referente a la exposición de la hemaglutinina por parte de Hp mediante
diferentes tratamientos (físico, químico y enzimático), se encontró los mismos
resultados por Blackall et al. En donde describen que la mayoría de los Hp expondrán
sus hemaglutininas mediante procesos físicos (frio). En este estudio se observó que el
94.8% de las cepas expusieron sus hemaglutininas por este medio (físico). Dos cepas de
Hp no expusieron sus hemaglutininas mediante el uso de tiocianato de potasio y
sonificación (químico), estas mismas cepas se trataron mediante proceso enzimático,
obteniendo resultados positivos, este hallazgo es normal encontrarlo en las cepas de Hp,
ya que algunas hemaglutininas son muy cortas y si la cápsula no es removida por
completo, las hemaglutininas que emergen de la membrana celular no podrán ser
identificadas mediante el uso de glóbulos rojos fijados en glutaraldehído.
Definitivamente con el uso del proceso enzimático (hialuronidasa) es el más efectivo
para la exposición de las hemaglutininas ya que este remueve por completo la cápsula
dejando al descubierto a las hemaglutininas, el inconveniente es el costo de la enzima,
 30

esta es la razón por la cual solo se utiliza en algunas cepas de Hp , afortunadamente la

mayoría de las cepas hemaglutinan mediante el proceso físico (7).

La serotipificación de Hp mediante el esquema de Page, fue el primer método

descrito para la clasificación y este se basa en la aglutinación de la bacteria, el cual
utiliza como indicador glóbulos rojos de ave fijados en glutaraldehído. Esta es la prueba
que la mayoría de los laboratorios de diagnóstico en el mundo emplean para clasificar a
los Hp , ya que es sensible y de rápida ejecucción (37).

El más reciente método para serotipificar los Hp es el descrito por Kume, el cual
utiliza antisueros absorbidos para la identificación , esta es una técnica poco trabajada
en los laboratorios del mundo, ya que requiere de mucho tiempo para su desarrollo.
Existe una correlación entre los serovares de Page y Kume, este último subdivide a los
Hp , en base a la neutralización de las hemaglutininas con antisueros que son absorbidos
con diferentes serovares de Hp , de ahí que con este método surgan nuevos serovares,
como fue la última modificación que sufrió la clasificación del esquema de Kume , en
donde se agregó un nuevo serovar el cual se identificó en Australia (10).
Este esquema permite que se identifiquen serovares de Hp, de localización
continental, como es el caso del serovar C3 de aparición solo en Sudáfrica y del serovar
C4 en Australia (10, 39).

Actualmente se reconocen 9 serovares de Haemophilus paragallinarum mediante

el esquema de Kume, los cuales son A1, A2, A3, A4 , B1, C1, C2, C3 y C4. (9).

En este estudio y utilizando el esquema de Kume, se identificaron dos cepas de

Hp que corresponden al serogrupo A de Page, y que mostraron escasa reacción
serologica cuando fueron enfrentadas con antisueros absorbidos de los serovares A1,
A2, A3 y A4 , presumiendo con esto que estas dos cepas de Hp son candidatas a nuevos
serovares del serogrupo A, con la posible alteración en la clasificación de las cepas de
Hp mediante el esquema de Kume. Esto requiere de estudios posteriores.

El serovar de Hp más frecuente que se identificó mediante el esquema de

Kume fue el C2 (46.6%), la cepa de referencia de este serovar es Modesto, la mayoría
de los laboratorios de producción de biológicos incluyen esta cepa. Una de las posibles
causas de que se aisle con frecuencia este serovar (C2), a pesar de que las bacterinas la
incluyen, se puede deber al manejo de la semilla madre por parte de los laboratorios de
producción, ya que esta cepa tiene años de su aislamiento y con el tiempo puede
modificar su estructura y sus determinantes antigénicos, por lo anterior los
investigadores que tienen más trabajos en Coriza Infecciosa Aviar , como lo es el Dr.
Patrick Blackall (Australia) y Robert Braggs (Sudáfrica), recomiendan el empleo de
cepas regionales serotipicadas en la producción de la bacteria de Coriza Infecciosa
Aviar . Otras causas pueden deberse a fallas en la vacunación y a exposiciones
tempranas de las aves al organismo (granjas multiedades) (38, 47 ).

Este serovar (C2) no se ha modificado en esta región de los Altos de Jalisco

desde el año 1998 al 2000 (Cuadro 9),. a diferencia de lo encontrado por Braggs et
al.(17), en donde observaron que los serovares de C, se han estado sustituyendo por
 31

otros con el tiempo (ejemplo C2 por C3), lo cual propicio que los brotes de Coriza
Infecciosa Aviar en Sudáfrica se siguieran presentando, razón por la cual, los
laboratorios de producción de biológicos de ese país tuvieran que sustituir las cepas de
referencia por cepas tipificadas regionales, obteniendo resultados satisfactorios (40).

Cuadro 9
Serovares de Haemophilus paragallinarum por
años

Serovar 98 99 00 Total
A2 2 5 2 9
B1 2 6 4 12
C2 2 8 8 18
El segundo serovar de Hp que se identificó mediante este esquema fue el B1
(30.7%), este serovar como se menciono en párrafos anteriores, es el que presenta
moderada reacción cruzada entre los integrantes del mismo serovar, lo cual dificulta su
control en las granjas avícolas, además es más agresivo en la presentación de las
manifestaciones clínicas de la enfermedad y en las bajas de producción en comparación
al resto de los otros dos serovars (A y C). La recomendación para el control de este
serovar en aves, es realizar pruebas de protección cruzada con los aislamientos de este
serovar, además de incluir cepas regionales en la bacterina en vez de referencia (56, 58).

La Prueba de Reacción de la Polimerasa (PCR), que se les practicó a los 39

aislamientos de Hp , mostraron estar en la banda de los 0.5KD la cual corresponde a las
cepas de Hp. Esta técnica también identificó a las dos cepas de Hp que fueron NAD
independiente, todas las cepas de Hp fueron primeramente identificadas por pruebas
bioquímicas y serologicas. (fig 1).
PCR demostró ser una herramienta de biología molecular útil y rápida, en la
identificación de Hp , ya que con esta técnica se puede identificar al microorganismo en
6h, a diferencia de los métodos convencionales los cuales requieren de 1 a 2 semanas
(53, 54).

La prueba de biología molecular denominada ERIC-PCR, es una técnica útil

para estudios epidemiológicos , ya que permite conocer el comportamiento de los Hp en
cierta regiones avícolas o granjas, mediante la separación de ciertas proteínas las cuales
tienen un conocido peso molecular (0.5KD) y tienen un patrón de comportamiento
conocido en un gel de electroforesis, esto permite comparar si los patrones
electrofóreticos de Haemophilus paragallinarum son iguales o diferentes.

Las dos cepas de Haemophilus paragallinarum atípicas que no requirieron de la

presencia de NAD para su crecimiento fueron comparadas entre si, una de ellas del
serovar B (PUMA) y la otra del serovar C (AZUL y ORO), presentaron una sola
diferencia entre sus pesos moleculares, lo cual las hace diferentes, de igual manera se
 32

compararon con las cepas de Hp provenientes de Sudáfrica, las cuales también son
NAD independientes y que corresponden a los serovares A y C, observando una
diferencia significativa en los pesos moleculares en las cepas de Haemophilus
paragallinarum de México y Sudáfrica (fig. 2), por lo tanto no existe ninguna conexión
genética entre ambas cepas, y se desconoce cual pudó ser el origen para la presentación
por vez primera en México de este tipo de Hp atípicos.
 33

CONCLUSIONES.

1.- De 45 casos sospechosos de Coriza Infecciosa Aviar , se aislaron e identificaron 39

cepas de Haemophilus paragallinarum durante los 17 meses de muestreo y que abarca
el periodo de 1998-2000.

2.- El año de 1999 fue en donde se aislaron e identificaron más cepas de Hp en

comparación a los otros periodos.

3.- Los meses de Enero a Mayo, durante los 17 meses que duro el estudio, fue en donde
hubo más aislamientos de Haemophilus paragallinarum .

4.- La edad de las aves en donde se aíslo con más frecuencia Hp durante el estudio,
comprendido la edad de 16 a 30 semanas

5.-Se aislaron dos cepas de Hp atipicos que no requieren la presencia de NAD para su
crecimiento .( serovar B (PUMA) y C (AZUL y ORO)., en aves de postura comercial en
la misma granja y en el mismo brote en el región de los Altos de Jalisco

6.-La cepa de Hp PUMA, la cual corresponde al serovar B, es la primera vez que se

reporta en el MUNDO.

7.- El serovar B de Hp fue el que presentó en aves de postura comercial la más

significativa baja de producción y mortalidad, en comparación con los otros dos
serovares.

8.- Los patrones en la fermentación de carbohidratos que se encontraron en este estudio,

son los característicos de Hp.

9.- El método físico (frío) fue el mejor para que los Haemophilus paragallinarum en
estudio manifestarán sus hemaglutininas en comparación a los otros medios de
extracción de la cápsula..

10.- Mediante el esquema de Page se identificaron los tres serovares (A, B, C) en aves
de postura comercial en la región de los Altos de Jalisco.

11.- Los serovares A2, B1 y C2 fueron identificados mediante el esquemas de Kume en

aves de postura comercial.

12.- El serovar C2 fue el que se identificó con más frecuencia (46.6%) en aves de
postura comercial, durante el periodo de 1998-2000.

13.- Dos cepas del serovar A, mostraron una reacción débil a los antisueros absorbidos
con el serogrupo A, cuando se utilizó el esquema de Kume, por lo que se consideran
como posibles nuevos serovares del serogrupo A.
 34

14.- Mediante la prueba de biología molecular ERIC-PCR, se demostró que las cepas de
Hp NAD independientes aisladas en México, y que corresponden al serovar B (PUMA)
y serovar C (AZUL y ORO), no guardan ninguna relación genética con las cepas de Hp
NAD independientes que provienen de Sudáfrica.
 35

Anexo 1

Datos epidemiologicos de los aislamientos de

Haemophilus paragallinarum

Aislamientos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Fecha Sep, Sep, 98 Nov,98 Nov,98 Nov,98 Dic,98 Ene,99 Ene,99 Ene 99 Ene ,99 Feb, 99
Aislamiento 98
Serotipo A A B C C B C C C B B
identificado
Edad 9 19 Sem 24Sem 6 Sem. 12 Sem 32 Sem 22 Sem 26 Sem 8 Sem 25 Sem 11 Sem
Sem.
Morbilidad 40 % 25% 50% 70% 40% 40% 60% 70% 20% 40% 25%
Mortalidad 0 0 1% 0 0 0.2% 0 0.3% 0 0 0
Disminución 0 0 15% 0 0 8% 17% 30% 0 10% 0
producción
Duración 3 2 Sem. 3 Sem 1.3 3 Sem 3 Sem 2 Sem 2 Sem 2 Sem 3 Sem 2 Sem
brote Sem. Sem
# Bacteri- 2 2 3 0 2 3 3 2 1 3 2
nizacion.
Lab.Nac. o Nac Nac Trasn Ningu- Trasn Trasn Nac Trasn Nac Trans Nac
Trasnac. no
Emulsión y/o Gel Gel Aceite Ningu- Aceite Aceite Aceite Gel Gel Aceite Gel
Gel no
# Serotipos en 3 2 3 - 3 3 3 2 3 3 3
bacterina
 36

Datos epidemiologicos de los aislamientos de

Haemophilus paragallinarum

Aislamientos 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Fecha Mar.99 Mar.99 Mar.99 Mar.99 Abr.99 Abr.99 May.99 May.99 May.99 Jul.99 Jul.99
Aislamiento
Serotipo A A C C C B A C B C A
identificado
Edad 22 sem 16 18 11 24 32 24 Sem 27 Sem 48 Sem 32 Sem 17 Sem
. Sem Sem Sem Sem Sem
Morbilidad 20% 10% 65% 10% 5% 75% 10% 15% 25% 10% 30%
Mortalidad 0 0 0.3% 0 0 0.2% 0 0 0 0 0
Disminución 10% 0 0 0 0.5% 30% 3% 5% 8% 5% 0
producción
Duración 2 Sem. 2 Sem. 3 Sem. 2 Sem. 2 Sem. 3 Sem. 2 Sem. 3 Sem. 3 Sem. 2 Sem. 3 Sem.
brote
# Bacteri- 3 2 3 1 3 3 3 3 2 3 2
nizacion.
Lab.Nac. o Nac. Nac. Trans. Trans. Nac. Nac. Nac. Trans. Nac. Trans. Trans.
Trasnac.
Emulsión y/o Gel Aceite Gel Gel- Gel- Aceite Gel Gel- Aceite Gel- Gel
Gel Aceite Aceite Aceite Aceite
# Serotipos 3 3 2 3 3 3 3 3 3 3 2
en bacterina
 37

Datos epidemiologicos de los aislamientos de

Haemophilus paragallinarum

Aislamientos 23 24 25 26 27 28 29 30
Fecha Jul.99 Jul.99 Dic, 99 Ene,00 Ene, 00 Feb, 00 Feb, 00 Feb, 00
Aislamiento
Serotipo A B B C C B A B
identificado
Edad 9 Sem. 20 Sem 11 Sem 25 Sem 36 Sem 52 Sem 15 Sem 33 Sem
Morbilidad 25% 10% 10% 5% 2% 15% 8% 5%
Mortalidad 0 0 0 0 0 0 0 0
Disminución 0 0 0 2% 5% 10% 0 5%
producción
Duración 2 Sem. 2 Sem. 3 Sem. 2 Sem. 3Sem. 4 Sem. 2 Sem. 2 Sem.
brote
# Bacteri- 1 3 1 3 2 3 2 2
nizacion.
Lab.Nac. o Nac Nac Trasn. Trasn. Trasn. Nac. Nac. Trasn
Trasnac.
Emulsión Gel Aceite- Gel Aceite Gel Aceite Gel Aceite
y/o Gel Gel
# Serotipos 3 3 2 3 2 3 3 3
en bacterina
 Datos epidemiologicos de los aislamientos de
Haemophilus paragallinarum

Aislamientos 31 32 33 34 35 36 37 38 39
Fecha Mar.00 Mar. 00 Abri.00 Abri.00 Abri. 00 May. 00 May. 00 May. May.00
Aislamiento 00
Serotipo C C C C C C B B A
identificado
Edad 19 Sem. 25 Sem 41 Sem 22 Sem 36 Sem 62 Sem 11 Sem 33 Sem 22 Sem
Morbilidad 15% 10% 5% 5% 2% 10% 25% 45% 8%
Mortalidad 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Disminución 0 0 0 2% 5% 10% 0 5% 5%
producción
Duración 2 Sem. 2 Sem. 3 Sem. 2 Sem. 3Sem. 4 Sem. 2 Sem. 3 Sem. 2 Sem
brote
# Bacteri- 2 3 2 3 2 3 1 2 3
nizacion.
Lab.Nac. o Trasc Nac Trasn. Trasn. Trasn. Nac. Nac. Trasn Nac.
Trasnac.
Emulsión y/o Gel Aceite- Gel Aceite Gel Aceite Gel Aceite Gel-Ac.
Gel Gel
# Serotipos 2 3 2 3 2 3 3 3 3
en bacterina
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