Họ và tên: Nguyễn Thị Cẩm Vân

MSSV : 0714027
MSTT : T7-E2
Báo cáo kết quả thực tập học phần thực tập hóa phân tích 3
Bài: SẮC KÝ LỎNG (LC)

I/Sơ lược :
- Trong lỉnh vực hóa học, việc tách , định danh, định lượng môt chất là một trong
những việc rất quan trọng. Có khá nhiều phương pháp để tiến hành các công việc trên. Sắc kí
là một trong những phương pháp hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi nhất cho tới hiện nay.
Hai phương pháp thông dụng nhất là sắc ký lỏng và sắc ký khí , sắc ký lỏng ngày nay càng
chứng tỏ ưu thế của mình trong việc phân tích các sản phẩm nói trên . Việc nghiên cứu và
phát triển kỹ thuật sắc ký là một trong những lĩnh vực đang được cả thế giới tiến hành nhất
nhằm tối ưu hóa phương pháp và mở rộng phạm vi ứng dụng
- Trong bài thực tập này ta sẽ khảo sát khả năng tách một hỗn hợp chứa các chất của sắc kí
lỏng bằng cách thay đổi dung môi động qua cột .
II/Nội dung , dụng cụ hóa chất :
Nội dung :
- Tiến hành tách một hỗn hợp gồm Methyl parahydroxybenzoate, Ethyl parahydroxybenzoate ,
propyl parahydroxybenzoate và butyl parahydroxybenzoate .
- Tiến hành tối ưu hóa bằng cách tiêm hỗn hợp 4 chất vào cột , rửa và thay đổi thành phần pha
động để các chất này tách ra tốt nhất .
- Chọn dung môi động tách tốt nhất và tiến hành chạy dung môi động đó với các chất chuẩn để
xác định thời gian lưu của mỗi chất suy ra được thứ tự giải rửa của các chất trong hỗn hợp ,
tính toán xác định hiệu năng tách của cột
Dụng cụ , hóa chất :
- Máy đánh siêu âm
- Máy sắc ký lỏng với đầu dò UV, hệ thống tiêm mẫu bằng tay
- Các dung dịch mẫu Methyl parahydroxybenzoate, Ethyl parahydroxybenzoate ,
propyl parahydroxybenzoate và butyl parahydroxybenzoate 10mg/l
- Dung dịch hỗn hợp của 4 chất trên
- dung dịch MeOH 100% , MeOH/nước (80/20) , MeOH/nước (65/35) ,
MeOH/nước (55/45)
III/ Tiến hành :
- Khởi động máy siêu âm đánh tan khí trong pha động
- Mở máy LG , chọn tốc độ dòng là 1ml/phút, chỉnh bước sóng đo của đầu dò UV
về 254nm

- để máy ổn định trong vòng 10 phút

- hút mẫu vào piston , gạt cần gạt về vị trí LOAD , tiêm mẫu vào buồng tiêm
- Tiêm đến khi nào dung dịch chảy ra ở ống xả khoảng 30 giọt .
- Hiệu chỉnh máy integrator tốc độ giấy , tốc độ ghi và độ phân giải
- Khi thấy dung môi qua cột đã ổn định , gạt thật nhanh cần gạt về vị trí INJECT .
kết hợp nhấn nút START trên máy integrator ..
Khi cần thay đổi pha động ta nhấn nút Standby. Tiến hành thay rồi nhấn nút RESET. Chờ
cho ổn định rồi mới tiêm mẫu

Nhận xét :
- Tiến hành đuổi khí để ổn định tốc độ dòng, đường nền sẽ ít rung và quá trình tách
xảy ra dễ hơn, ổn định hơn
- Ta gạt cần gạt một cách dứt khoát để tránh hiện tượng áp suất tăng đột ngột trong
bơm
- Khi thay đổi pha động phải tắt bơm và sau khi thay đổi mới chờ ổn đính thời gian
mới tiếp tục đo
Sau đây là các sắc ký đồ đo được với các hỗn hợp
o Sắc ký đồ của hỗn hợp 4 chất với dung môi MeOH 100%
Với pha động là dung môi MeOH 100% thì các mũi sắc ký chập vào nhau thành một mũi nên không thể
tách rời các chất trong hỗn hợp không được
Vì vậy đê tách được các chất trong hỗn hợp thí ta phải thay đổi thành phần pha động
o Pha động dung dịch MeOH/H2O 85/15

Có dấu hiệu tách chất khi thay đổi thành phần nhưng với dung dịch này vẫn không tách được các
chất trong hỗn hợp
Với pha động dung dịch MeOH/H2O 75/25

Với thành phần pha động này ta đã thấy các mũi sắc ký đã dược tách ra nhưng vẫn không tách các
chất trong hỗn hợp vì các mũi gần nhau chưa tách rời ra ( thời gian lưu của các chất gần nhau)
 o Với thành phần pha động MeOH/H2O 65/55

Các mũi sắc ký tuy tách rời nhưng vẫn chựa tách được các chất có trong hỗn hợp

o Sắc ký đồ của Metyl+ Etyl với pha động là MeOH/H2O 55/45

o Sắc ký đồ của Metyl+ Propyl với pha động là MeOH/H2O 55/45
 o Sắc ký đồ của hỗn hợp 4 chất với pha động là MeOH/H2O 55/45

Nhận xét :
Dựa vào các mũi so sánh ta thấy thứ tự được giải rửa ra khỏi cột sắc ký sẽ là :Methyl ,Ethyl, propyl ,và
butyl đúng như dự đoán theo lý thuyết .
Nguyên nhân của thứ tự trên có thể dự đoán được:
- Chất có nhóm hidrocacbon càng lớn thì độ phân cực của chất càng thấp sẽ ra sau
- nhận danh các chất bằng phương này có độ chính xác khá cao vì mỗi chất có thời gian lưu
trong cột là khác nhau
- Sắc ký pha đão tách tốt các chất trong cùng một dãy đồng đẳng .
- Sắc ký pha đảo tốt dối với các chất đồng đẳng
Tính toán một vài thông số cần thiết để cho thấy khả năng tách của cột :
Tính K’ của từng mũi :
Chọn sắc ký đồ của dung môi MeOH/H2O 55/45 để xác định vì đồ thị này cho các mũi tách nhau với
khoảng cách lớn nhất dễ tính toán các thông số có liên quan . Từ đồ thị ta chọn 1 vị trí trên đường nền để đặt
cho nó là giá trị t0 vì việc chọn này sẽ không làm ảnh hưởng đến kết quả tính nhiều nên có thể chọn tùy ý
những tốt nhất nên chọn ở nơi mà đường nền ổn định .
t r − t0
Tính K’ : K =
'
,
t0
Chọn t0 =1.430 và t1=2.565, t2 =3.418, t3 =5.087, t4 =2.491
2.565 − 1.430
Peak 1 : K1 = = 0.7937
'

1.430
3.418 − 1.430
Peak 2 : K 2' = = 1.390
1.430
5.087 − 1.430
Peak 3 : K 3' = = 2.557
1.430
7.491 − 1.430
Peak 4 : K 4' = = 4.238
1.430

Hệ số chọn lọc
K ' 1.390
α = 2' = = 1.751
K1 0.7937

Số đĩa lý thuyết :
Mũi 1:
2
  2
 t   2.565 
: N = 5.56  r  = 5.56 ×  0.200  = 2631
 W1   
 2 
N =2631 đĩa
Mũi 2:
2
 3.418 
N = 5.56   = 3503 đĩa
 0.231 
Mũi 3:
2
 5.087 
N = 16 ×   = 4336 đĩa
 0.309 
Mũi 4:

2
 7.491 
N = 16 ×   = 6666
 0.367 
L 50
Chiều dày đĩa lý thuyết : mũi 1: H = = = 0.019 mm.
N 2631
 50
Mũi 2: H = = 0.01427 mm
3503
50
Mũi 3: H = = 0.01153 mm
4336
50
Mũi 4: H = = 0.0075 mm
6666
2
 tγ − t0 
Số đĩa hiệu dụng được tính theo công thức N = 16 ×  
 Wb 
Số đĩa lý thuyết Số đĩa hiệu dụng
Mũi 1 2631 515
(t=2.565,t0=1.430,Wb=0.200)
Mũi 2 3503 1185
(t=3.418,t0=1.430,Wb=0.231)
Mũi 3 4336 2241
(t=5.087, t0=1.430,Wb=0.309)
Mũi 4 6666 4363
(t =7.491, t0=1.430,Wb=0.367)

Với cột dùng trong phòng thí nghiệm có độ dài 50mm

Lấy từ đường nền lên 10% chiều cao peak vẽ đường ngang cắt mũi tại A và B, từ đỉnh kẻ đường thẳng
vuông góc với đường nền cắt đoạn AB tại O .
Xác định :
Peak 1 2 3 4
BO/AO 1.000 0.846 0.933 0.818

Nhận xét : :
- Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:Bản chất sắc ký của pha tĩnh,cấu trúc và
tính chất của chất phân tích, bản chất và thành phần của pha động, trong một số
trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động
- Hệ số dung lượng (K’) của 1 chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai
pha cộng với sức chứa cột
- Nếu K’ nhỏ thì tr cũng nhỏ thì sự tách kém, nếu K’ lớn thì peak bị doãng
- Số nguyên tử C trên dây ankyl ester càng nhiều thì tr càng lớn thì lúc đó K’ củng
lớn theo nên peak sẽ doing và độ lặp lại rất kém, thời gian phan6n tích rất dài,
dồng thời kéo theo vấn đề khác như tốn dung môi hóa chất, độ chính xác của phép
phân tích kém.
- Hệ số chọn lọc α cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký
- α càng lớn hơn thì khả năng tách càng rõ ràng
- Giá trị K’ nằm trong khoảng 1 – 6 là tốt ,
- Vận tốc dòng l1ml/phút là hợp lý vừa có thể tách tốt mặc khác vừa có thời gian
tách hợp lý .
 - Giá trị Rs ở cả 4 mũi đều lớn hơn 1 nên có thể tách ra hơn 95%.
- Tỉ lệ kéo chân peak và kéo đuôi peak thể hiện ở tỉ số OB/OA . Nếu OB/OA >1 thì
có hiện tượng kéo đuôi peak (tailing) còn ngược lại thì hiện tượng (fronting) .
- Do pha động là MeOH/H2O là đều 2 chất phân cực. Vì vây khi thay đổi
thành phần pha động không thay đổi nhiều, thứ tự rửa giải của từng chất
không thay đổi
Trả lời câu hỏi:
Ta có : K’ tỉ lệ nghịch với N
1) Khi K’ tăng thì tr tăng( thời gian lưu dài) lúc đó peak bị doãng ra làm cho chiều cao của cột nhỏ. Vì
vậy số địa lý thuyết nhỏ dẩn đến khả năng phân tích kém ( N càng lớn mũi sắc ký càng nhọn).
2) Ta không thể sử dụng cột 1m trong LC vì cột sử dụng trong LC là cột nhồi. Các hạt pha tĩnh xếp khít
nhau trong cột, vì thế khi dung môi chảy qua ma sát rất lớn. Chính vì điều này nên ta thường phải sử dụng
bơm áp suất khi chạy LC. Nếu cột LC dài 1m thì hiệu năng tách của cột sẽ tăng lên. Song, ta cũng phải dùng
1 áp suất rất lớn để đẩy pha động, thời gian lưu sẽ rất dài và các hạt pha tĩnh do bị nén dưới áp suất quá lớn
sẽ bị dẹp lại và có thể mất hoạt tính.
Mức độ kéo dài tức B/A >1 thường là vấn đề thưc nghệm. Vì có thể do : do tương tác giữa chất tan và
pha động mạnh hơn tương tác giữa chất tan và pha tĩnh.
3/. Trước khi nạp pha động để rửa giải, ta cần phải đánh sóng siêu âm để đuổi khí. Lý do là vì để tránh các
chất khí hòa tan trong dung môi khi đi vào máy bơm sẽ làm cho áp suất bơm tăng lên rất nhiều, có thể làm
hư trong đường ống dẫn, hoặc có thể nổ (nhỏ) đường ống dẫn làm rò rỉ dung môi.

4/. Các loại detector hay dùng trong HPLC :

- Đầu dò quỳnh quang để phân tích Alflatoxin, Mycotoxin, Amino acid, những loại thuốc trừ sâu họ
Carbamate, …
- Đầu dò chỉ số khúc xạ ( RI ) dùng để phân tích các loại đường đơn, đường kép, …
- Đầu dò độ dẫn để phân tích các ion vô cơ, hữu cơ, …
- Đầu dò khối phổ ( MS ) để xác định phần lớn các hợp chất hữu cơ, …
- Ngoài ra còn có các loại đầu dò ELSD, đầu dò điện hóa, …

5/. Hiện tượng tailing (sự kéo đuôi) là do sự tương tác quá mạnh giữa các chất cần phân tích với tâm hoạt
tính của những hạt pha tĩnh và thành cột làm cho các chất này bị giữ lại trên các hạt pha tĩnh quá chặt chẽ
nên làm cho sự giải hấp các chất xảy ra chậm.
- Hiện tượng fronting (sự kéo đầu) là do chất cần phân tích có nồng độ cao, chất cần phân tích được rửa giải
trước chưa kịp rửa giải hết (do có nồng độ lớn) thì có chất cần phân tích tiếp theo lại phân bố lên lớp chất
cần phân tích đi trước. Vậy, ở đây có 2 tương tác : lớp dưới là tương tác giữa chất cần phân tích đi sau và
các hạt pha tĩnh, lớp trên là tương tác giữa các chất cần phân tích. Thường thì tương tác giữa các chất cần
phân tích mạnh hơn nên rửa giải chậm hơn. Đến khi rửa giải hết các lớp trên thì sẽ rửa giải đến lớp tiếp xúc
với pha tĩnh ( lớp dưới ). Lớp dưới này liên kết ít chặt hơn so với tương tác dung môi chất tan nên peak
giảm đột ngột.

6/. Solvent dip ( tạm dịch là hố trũng dung môi ) là hiện tượng rất hay gặp lúc trước khi chất đầu tiên trong
hỗn hợp mẫu cần phân tích ra khỏi cột xuất hiện 1 peak nhỏ, có đầu ngược xuống dưới so với đường nền
chuẩn của dung môi ( được chọn có A=0 ).
+ Ta nhận thấy rằng cường độ quang phổ hấp thu của 1 chất được đưa sang máy vẽ sắc ký đồ dưới dạng
peak, nồng độ chất càng lớn thì độ hấp thu quang A càng lớn ( A=ε*ℓ*C ), nồng độ chất tăng thì A cũng
tăng theo và ngược lại, từ đây ta có được peak sắc ký.
+ Lý giải theo nguyên lý vừa trình bày, trước khi chất chính cần phân tích ra khỏi cột thì có 1 ít các tạp chất
( mà ta không kiểm soát được hoặc do có khí vẫn còn hòa tan 1 ít vào trong dung dịch ) ra trước. Song, do
các chất này có A nhỏ hơn A của dung môi nền nên làm cho peak có chiều đi xuống.
+ Cũng có thể là do sự bẻ cong các tia sáng khi nó đi qua mặt phân cách 2 môi trường chất lỏng khác nhau.
Một vùng là dung môi động, 1 vùng còn lại là do sự pha trộn giữa dung môi động và dung môi pha mẫu tạo
nên 1 vùng dung môi có tính chất đặc biệt. Hoặc cũng có thể là do vùng dung môi pha trộn này có A nhỏ
hơn A của dung môi nền

Có nhiều phương pháp để nhận biết các thành phần trong hỗn hợp sau khi đi qua cột. Phương pháp hay
được sử dụng là phương pháp hấp thụ tia cực tím (tia UV). Các hợp chất hữu cơ thường hấp thụ tia UV, mỗi
chất hấp thụ mạnh nhất đối với một bước sóng nhất định. Chiếu tia UV xuyên qua dòng hỗn hợp ở đầu ra, ở
phía đối diện đặt một máy dò ta có thể đo được mức độ hấp thụ tia UV. Từ đó có thể tính toán nồng độ các
chất. Nên nhớ dung môi cũng hấp thụ tia UV, vì vậy nên lựa chọn bước sóng sao cho thích hợp.vì vậy trong
bài này các dung dịch chuẩn của các chất có nồng độ 10ppm được pha sẵn và được đo tai bước sóng 254nm