Professional Documents
Culture Documents
• được tạo thành ban đầu bởi từ 20 đơn vị nhỏ gọi là amino acids (monomers). Chú ý là
các amino acids này có thể bị biến đổi (ví dụ: acetylation – là việc thêm acetyl group vào
amino group ở một đầu cuối N-terminal residue) trong chu trình sống của protein.
• các phân tử amino acids này sẽ liên kết với nhau để tạo thành chuỗi proteins (polymer)
với hình dáng và kích thước khác nhau – gọi là polypeptide.
Ví dụ: chỉ với chuỗi gồm 4 amino acids thuộc từ 20 loại amino acids đó, ta có thể tạo ra 20^4 =
160000 sự kết hợp. Do đó, có thể nói rằng proteins có đủ mọi kích cỡ và hình dáng khác nhau.
Vì trong nitrogenous base cũng có nguyên tố Carbon và được đánh số 1,2… nên nguyên tố
Carbon trong phân tử đường được đánh số từ 1-5 kèm theo kí hiệu primer (‘). Theo hình vẽ,
nitrogenous base luôn gắn vào C-1′, (với RNA, C-2′ sẽ gắn với -OH, thay vì proton -H như trong
DNA), nhóm hydroxil -OH (hydroxil group) thì gắn vào C-3′ (nơi sẽ diễn ra liên kết
phosphodiester với nucleotide khác để tạo ra chuỗi polymer), và gốc phosphate thì gắn vào C-5′.
Như vậy, sự khác nhau giữa 4 nucleotides là ở nitrogenous base, được phân làm 2 loại: purine
(Guanine, Adenine) và pyrimidine (Cystosine, Thymine).
Để tạo thành DNA, Leuvene phát hiện rằng các phân tử nucleotides liên kết với nhau bằng liên
kết phosphodiester (phosphodiester bond): 1 nhóm phosphate liên kết với hai phân tử đường:
sugar thứ nhất là cùng nằm trên một phân tử nucleotide chứa bản thân gốc phosphate đó (gốc
phosphate liên kết với C5′ của sugar) và sugar thứ hai thuộc một nucleotide khác (gốc phosphate
liên kết với C3′ của sugar). Và ta lấy C5′ của sugar thuộc nucleotide có chứa gốc phosphate làm
đầu (head) – tức là nơi sẽ không tiếp tục nhận thêm residue, còn C3′ của sugar còn lại làm đuôi
(tail) – nơi có thể nối thêm residue. Như vậy, hướng liên kết trên chuỗi DNA là từ C5′ tới C3′
hay 5′ (5 prime) đến 3′ (3 prime).
V. Thu nhận protein mục tiêu dựa trên độ hoà tan, kích thước, điện tích, và
liên kết ái lực
Hàng ngàn protein đã được tinh sạch ở dạng có hoạt tính dựa trên những đặc tính
căn bản như độ hòa tan, kích thước, điện tích và liên kết ái lực. Thông thường, một
hỗn hợp protein sẽ trải qua nhiều giai đoạn phân tách, mỗi giai đoạn dựa trên một
đặc tính nhất định, để cuối cùng là một protein tinh sạch. Ở mỗi bước phân tách,
thử nghiệm xác định hoạt tính và xác định nồng độ protein đều được thực hiện.
Lượng đáng kể protein tinh sạch, khoảng vài miligram, có thể giúp ta biết được cấu
trúc không gian ba chiều và cơ chế phản ứng của nó. Vì vậy, sản lượng toàn phần
là một điểm quan trọng của quá trình tinh sạch. Các kỹ thuật tinh sạch thường
dùng: tủa bằng muối, màng bán dẫn, sắc ký.
Ở nồng độ muối cao, phần lớn protein sẽ giảm tính hòa tan, hiện tượng này gọi là
tủa bằng muối (salting out). Mỗi loại protein sẽ kết tủa ở một nồng độ muối nhất
định. Vì vậy, hiện tượng tủa bởi muối có thể được dùng để phân đoạn protein. Ví
dụ như fibrinogen tủa ở nồng độ muối ammonium sulfate 0.8 M trong khi phải đến
nồng độ 2.4 M, albumin mới kết tủa. Hiện tượng này được sử dụng để tăng nồng
độ của một dung dịch protein loãng chứa các phân đoạn có hoạt tính của các bước
tinh sạch trước. Nếu cần thiết, lượng muối có thể được loại bỏ bằng sự thẩm tách
Protein có thể được phân tách bằng sự thẩm tách thông qua màng bán dẫn, chẳng
hạn màng cellulose với nhiều lỗ. Những phân tử có cấu trức không gian nhất định
lớn hơn dường kính của lỗ sẽ bị giữ lại bên trong túi thẩm tách, trong khi đó,
những phân tử nhỏ hơn và các ion sẽ đi qua các lỗ đó ra ngoài túi. Kỹ thuật này
dùng để loại bỏ muối hay tách những phân tử nhỏ, nhưng với kỹ thuật này không
phân biệt được các loại protein với nhau.
IV.3 Sắc ký
Sắc ký là một phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân tử vì nó
thích hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể được sử dụng ngay
cho việc định lượng và định danh.
Một hệ sắc ký gồm pha tĩnh, pha động và mẫu cần phân tách. Trong đó, tùy vào
loại mẫu cần phân tách ta có thể lựa chọn loại sắc ký cũng như nguyên liệu cho pha
cố định và pha di động.
Trong tinh sạch protein, có bốn phương pháp được ứng dụng nhiều nhất là sắc ký
lọc gel dựa vào kích thước của phân tử (size exclusion chromagraphy), sắc ký trao
đổi ion dựa vào điện tích của phân tử (ion exchange chromagraphy), sắc ký ái lực
dựa vào ái lực của phân tử với một loại phân tử khác (affinity chromagraphy) và
sắc ký lỏng cao áp dựa vào kích thước của phân tử nhưng có độ phân giải cao nhờ
vào áp suất (high pressure liquid chromagraphy).
IV.3.1 Sắc ký lọc gel
Phương pháp này tốt hơn các phương pháp trên vì nó dựa vào kích thước phân tử.
Mẫu sẽ được nạp vào đầu một cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từ polymer không tan
nhưng có tính hydrate hóa cao như dextran, agarose (những dạng cabohydrate) hay
polyacrylamide. Sephadex, Sepharose, và Bio-gel là những loại gel phổ biến trên
thị trường có sẵn những hạt có lỗ với đường kính chuẩn là 100µm (0.1mm). Những
phân tử nhỏ có thể ở cả bên trong lẫn giữa các hạt, trong khi đó những phân tử lớn
hơn chỉ có thể ở bên ngoài các hạt. Vì vậy, những phân tử có kích thước lớn trong
cột sẽ chảy nhanh hơn và ra ngoài trước . Phân tử có kích thước trung bình, có thể
thỉnh thoảng vào được bên trong hạt sẽ rời khỏi cột ở vị trí giữa; còn những phân
tử nhỏ sẽ phải đi qua đoạn đường dài hơn, quanh co nên sẽ ra sau cùng.
IV.3.2 Sắc ký trao đổi ion
Tại bất kỳ một điểm pH nào trừ điểm đẳng điện, các protein đều có mang một điện
tích tương ứng với điểm pH đó. Dựa vào điện tích thực của chúng tại một điểm pH
nhất định, ta có thể phân tách hỗn hợp protein. Phương pháp này gọi là phương
pháp sắc ký trao đổi ion. Trong phương pháp này, pha tĩnh là những hạt mang sẵn
một điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang
điện tích trái dấu với chúng. Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cột
carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion
dương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương. Ngược lại, nếu
hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose)),
gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm. Vì thế,
những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu
bị giữ lại cột. Để phóng thích những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động,
những ion này sẽ thế phân tử protein tương tác với các hạt mang điện tích. Ví dụ,
trong sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác trong
dung dịch tách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột với các protein có điện
tích dương, do đó, những protein mang điện tích dương được phóng thích ra ngoài
cột lần lượt theo độ lớn về điện tích.
Hình 1: minh họa sắc ký trao đổi ion
Hình 2: minh họa cơ chế giữa protein trong hệ sắc ký trao đổi ion
(a) Những hạt mang điện tích dương sẽ trao đổi ion âm với dung dịch đệm. Protein
tích điện âm cũng ion dương tương tác với nó
(b) Khi protein gắn với hạt, protein thay thế những ion âm tương tác với hạt cũng
như hạt thay thế những ion dương tương tác với protein
IV.3.3 Sắc ký ái lực
Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh
sạch protein. Kỹ thuật này dựa trên ái lực cao của nhiều protein với những nhóm
hóa học chuyên biệt. Ví dụ, concanavalin A, một loại protein thực vật, có thể được
tinh sạch khi cho qua cột mang những phân tử glucose bằng liên kết cộng hóa trị.
Concanavalin A gắn vào cột bởi vì nó có ái lực cao với glucose, trong khi đó
những protein khác thì không. Concanavalin A có thể được tách giải khỏi cột khi ta
cho thêm dung dịch glucose đậm đặc vào. Phân tử đường trong dung dịch sẽ gắn
với Concanavalin A thay thế những phân tử glucose nối với cột.
Hình 3: minh họa cho cơ chế tinh sạch Concanavalin A bằng sắc ký ái lực
Sắc ký ái lực còn là một công cụ hữu hiệu trong việc tách các yếu tố phiên mã,
những protein điều hòa sự biểu hiện gen thông qua việc gắn đặc hiệu với trình tự
DNA. Hỗn hợp protein thấm qua cột có chứa những trình tự DNA đặc hiệu được
gắn vào thể mang; những protein có ái lực cao với trình tự DNA sẽ bắt vào các
trình tự và được giữ lại. Trong thí dụ này, yếu tố phiên mã sẽ được phóng thích khi
rửa cột với dung dịch có hàm lượng muối cao. Ngoài ra, hiện nay người ta dựa vào
tính đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể để tinh sạch kháng nguyên hay
kháng thể. Nhìn chung, sắc ký ái lực có thể được dùng để tách một protein vốn có
khả năng nhận biết một nhóm X bằng nối cộng hóa với nhóm này hay những chất
dẫn xuất của nó được gắn trên một cái cột, sau đó nạp hỗn hợp protein vào cột, cột
này sẽ được rửa lại để loại bỏ những protein không tạo được nối, cuối cùng là tách
giải protein mục tiêu bằng dung dịch X với nồng độ cao hay thay đổi điều kiện để
làm giảm lực liên kết. Sắc ký ái lực là phương pháp tinh sạch hiệu quả nhất khi
tương tác giữa protein và phân tử được dùng như mồi bắt protein có độ chuyên biệt
cao.
ADN không tan trong nước đâu, vì
giữa hai mạch có liên kết hidro, A liên kết với T bằng hai liên kết Hidro, G liên kết
với C bằng hai liên kết Hydro, Vì liên kết Hydro là liên kết yếu nhưng số lượng
cực kỳ lớn nên phải nhờ đến enzim mới tách hai mạch ra được. Hơn nữa giữa các
đơn phân của ADN lại có liên kết Photphodieste.
Thuốc nhuộm thì bạn trả lời đúng rồi, ngoài xanhmetylen có thể dùng giemsa,
carmin hoặc hematoxylin
Một số nguyên tắc cơ bản Tách chiết ADN
Các dung môi hữu cơ làm mất nước, thay đổi môi trường điện môi ?? kết tủa các
phân tử như protein & ADN, trong đó các phân tử protein bị ảnh hưởng rõ hơn.
Độ pH thường trung tính hoặc hơi kiềm (7,0 - 8,5).
Phenol, chloroform, isoamylalcohol thường được dùng để kết tủa protein (vd.
Chloroform/isoamylalcohol 24/1).
Một số hợp chất chống oxy hóa như 2-mercapthoethanol, DTT (dithiothreito), 8-
hydroxyquinoline làm giảm nguy cơ gây biến tính axit nucleic. SDS làm vỡ màng
tế bào.
Các dung môi alcohol (vd. EtOH, MeOH, 2-propanol) được dùng để kết tủa axit
nucleic. Các muối (vd. acetate) trung hòa điện tích và làm giảm khả năng hòa tan
của các axit nucleic. To kết tủa -20oC / 0oC (1/2h - 24h).
Để tách chiết mARN, người ta thường dùng cột Oligo dT - celluloza, hoặc cột hấp
thụ từ tính với biotin-oligo(dT).
Định tính và định lượng ADN dựa trên phương pháp điện di và đo quang phổ ở các
bước sóng 260 và 280 nm.
- Việc chọn alcohol nào là phụ thuộc vào thời gian và thể tích của mẫu.
Có nghĩa là: nếu bạn có ít thời gian và tổng thể tích mẫu cần tủa lại lớn
(mà thể tích ống Effendorf có hạn) thì nên dùng Isopropanol.
� �- Việc dùng isopropanol cũng cho hiệu quả cao hơn trong việc loại
bỏ các primer và các đoạn cắt nhỏ khi dùng phản ứng cắt enzyme giới
hạn. Đặc biệt là khi muốn tủa các đoạn DNA có kích thước lớn hơn 6kb
thì nên dùng isopropanol. Trong khi đó, nếu muốn thu nhận các đoạn có
kích thước nhỏ (có thể chỉ 10bp) thì nên dùng Ethanol.
� - Giải thích nguyên nhân vì sao Isopropanol lại tủa nhiều muối hơn
ethanol: Do Isopropanol kém bay hơi hơn ethanol (hay là kém linh động
hơn), do đó nhiều muối kém hoà tan hơn trong Isopropanol và sẽ bị kết
tủa theo DNA.
Lipid là lớp hợp chất hữu cơ phổ biến trong tự nhiên và trong cơ thể động vật, thực
vật và vi sinh vật. Lipid có đặc tính không hoà tan trong nước, chỉ hoà tan trong
các dung môi hữu cơ như đe, cloroform, benzen, cồn, aceton... (nhưng không phải
mọi lipid đều hoà tan như nhau trong tất cả các dung môi nói trên, mà mỗi lipid
hoà tan trong dung môi tương ưng của mình, nhờ đặc tính này người ta có thể phân
tích riêng từng loại).
Tên gọi lipid (bắt nguồn từ chữ Hy-lạp lipos: mỡ) dùng để chỉ chung các loại mỡ,
dầu và các chất béo giống mỡ ở động vật và thực vật.
Về mặt hoá học lipid là những este giữa alcol và acid béo điển hình là chất
triglycerid.
2.1)Tính chất vật lí của Lipit
• Ở nhiệt độ phòng, lipit động vật (mỡ), thường ở trạng thái rắn (mỡ bò,mỡ cừu...)
. Lipit loại này chứa chủ yếu các gốc axit béo nó. Một số ít lipit động vật ở trạng
thái lỏng (dầu cá ...), do thành phần gốc axit béo không no tăng lên.
• Lipit thực vật (dầu thực vật) hầu hết ở trạng thái lỏng (dầu lạc,dầu dừa...) do
chứa chủ yếu gốc axit béo không no.
• Các lipit đều nhẹ hơn nước,không tan trong nước,nhưng tan nhiều trong chất
hữu cơ benzen,xăng, clorofom...
2.2))TÍNH CHẤT HÓA HỌC:
là chất kỵ nước không tan trong nước nhưng tan trong các hợp chất dung môi hưu
cơ không phân cực:ether etylic,ether petrol (ether dầu
hỏa),hexan,toluen,acetone,ben zen…các phản ưng cơ bản:phản ứng xà phòng
hóa,phản ứng khử,tạo ester,oxy hóa,halogen hóa
• Lipid hay là chất béo là nhóm hợp chất hữu cơ tự nhiên rất phổ biến trong tế
bào động vật và thực vật. Đặc biệt nhiều trong bơ, mỡ, dầu, thức ăn tự nhiên
như sữa, trứng, thịt, cá…]
• \
•
• Lipid là nguồn cung cấp năng lượng nhiều nhất trong bộ ba glucid, protein,
lipid. 1g lipid cho 9Kcal. Do vậy, thức ăn giàu lipid rất tốt cho người lao
động nặng, người cần hồi phục dinh dưỡng cho người ốm.
• Là dung môi cho các vitamin tan trong chất béo như vitamin A, D, E, K và
F. Phần lớn các vitamin này vào trong cơ thể là từ chất béo của thực phẩm.
• Chất béo là nguồn cung cấp nhiều chất quan trọng cho cơ thể, các acid béo
chưa no cần thiết và nhiều hợp chất sinh học quan trọng khác.
• Lipid đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc tế bào cũng như trong mọi hoạt
động sống của tế bào. Vai trò của lipid còn là dự trữ năng lượng bảo vệ cơ
thể trước những thay đổi về nhiệt độ và những va chạm cơ học.
• Lipid còn được sử dụng để chế biến thức ăn tạo ra hương vị thơm ngon cho
món ăn, chúng còn gây cảm giác no lâu vì thức ăn chứa nhiều dầu mỡ ở lại
lâu hơn trong dạ dày.
cung cấp chủ yếu các chất trao đổi trung gian và
năng lượng cho tế bào.
•Tham gia vào cấu trúc của thành tế bào thực vật, vi khuẩn; hình thành bộ khung
(vỏ) của nhóm động vật có chân khớp.
•Tham gia vào thành phần cấu tạo của nhiều chất
quan trọng như: AND, ARN…
Đối với công nghệ thực phẩm, vai trò của glucid
cũng đa dạng và vô cùng quan trọng:
- Cung cấp năng lượng chủ yếu cho cơ thể hoạt động.
- Glucid còn chuyển hóa thành các chất khác như chất béo để tích lũy năng lượng dưới dạng lớp
mỡ dưới da và trong nội tạng.
- Glucid tham gia cấu tạo ra glucid phức tạp như Glucoprotein, chất nhầy.
- Trong cấu trúc xơ có tác dụng như là chất độn: chất xơ kích thích nhu động ruột, nhuận tràng,
chống lại táo bón, giúp cơ thể đào thải các độc tố trong ruột ra ngoài dễ dàng.
- Glucid ở dạng chất xơ lk với cholesterol và chất béo đào thải ra ngoài theo phân, có tác dụng
làm giảm cholesterol xấu trong máu chống lại bệnh tim mạch, cao huyết áp, giữ cho cơ thể ở
trạng thái sinh lý bình thường.
- Glucid có cấu trúc mạch ngắn như là oligosaccharide có tác dụng như một prebiotic, kích thích
vk trong ruột già lên men sinh ra acid hữu cơ như acid lactic, acid butyric có tác dụng chống lại
sự lên men thối, bảo vệ niêm mạc ruột chống lại ung thư trực tràng.
- Glucid có tác dụng ổn định hệ vsv có ích trong đường ruột, chống lại các loại vsv gây bệnh
trong đường ruột.
- Ăn uống đầy đủ glucid sẽ làm cho việc phân hủy protein đến mức tối thiếu. Ngược lại khi lao
động nặng nhọc, nếu cung cấp không đầy đủ glucid sẽ làm tăng phân giải protein để sinh năng
lượng.
- Nếu ăn quá nhiều glucid thì dễ sinh ra béo phì do tích nhiều mỡ và nếu ở những người lớn tuổi
ăn nhiều đường sẽ có nguy cơ sinh chứng bệnh tiểu đường.