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MANUAL DE LABORATORIO
MICROBIOLOGÍA
QYFA 0025
CONSIDERACIONES GENERALES DE BIOSEGURIDAD
EN EL LABORATORIO.
Respete siempre las indicaciones que se darán durante las primeras actividades
prácticas respecto al uso del mechero, asas, tubos u otros materiales.
No haga bromas, ni permita que sus compañeros las hagan, con cultivos bacterianos
o material contaminado.
¡¡Recuerde!!
El principal responsable de su seguridad es usted
INTRODUCCIÓN AL TRABAJO DE LABORATORIO
OBJETIVO
a) Mechero:
El mechero es el principal elemento que nos ayuda a trabajar en forma estéril, este
sirve para esterilizar el asa microbiológica, la boca de tubos de ensayo, pipetas,
portaobjetos, etc. y para mantener un ambiente de trabajo estéril.
b) Placas de Petri:
Placas de vidrio o de plástico en las cuales se deposita una determinada cantidad
de medio de cultivo sólido (altura ≈ de 4 mm). Consta de una base y una tapa, debe
mantenerse cerrada, excepto en los breves momentos en que debe sembrarse el medio
de cultivo.
c) Asas:
Instrumento con un mango y un alambre (nicrom) en la punta. Existen dos tipos:
asa recta (que termina en punta), y asa en anillo (un pequeño círculo en el extremo).
Sirven para sembrar muestras bacterianas en superficie y en profundidad (asa recta) y
para sembrar en superficie y trasladar pequeñas gotas (asa en anillo).
d) Pipetas Pasteur:
Es un tubo angosto que termina en punta, puede ser de vidrio o de plástico,
estériles o no. Sirve para trasladar material líquido (gotas) o bien para diseminar siembras
acodando un extremo o formando un rastrillo. Debe romperse la punta y esterilizarse
antes de ser utilizada.
e) Pipetas Graduadas:
Son las pipetas corrientes utilizadas en química, pero que para el uso
microbiológico deben esterilizarse en horno Pasteur envueltas en papel. Al desenvolverse
deben flamearse al mechero.
f) Tubos de ensayo:
En microbiología los tubos de ensayo deben esterilizarse en horno Pasteur y
taponarlos con algodón hidrófobo o con tapas especiales de goma o plástico. Debe
flamearse la boca del tubo cada vez que se saque la tapa y antes de volver a colocársela.
g) Matraces:
Son los matraces corrientes, que se deben taponar con algodón hidrófobo o tapón
especial, y esterilizados al horno Pasteur. Debe flamearse la boca después de sacar la
tapa y antes de volver a ponerla.
h) Microscopio:
En microbiología se emplea el objetivo 40 X para observaciones sin tinción (al
fresco) y el objetivo 100 X para observaciones por inmersión (con aceite) en
preparaciones teñidas. El microscopio debe quedar perfectamente limpio después de
finalizada la observación correspondiente.
i) Estufa de Cultivo:
Los productos biológicos o siembras de bacterias en medios de cultivo deben
cultivarse en estufas que se encuentran generalmente a una temperatura de 35 - 37°C.
j) Baño María:
Consiste en un recipiente con agua de la llave que tiene una fuente de calor para
mantener una determinada temperatura. Generalmente se hace hervir el agua, por
ejemplo, para fundir el agar en los tubos con medio de cultivo sólido.
l) Autoclave:
Es un aparato que sirve para esterilizar medios de cultivo (agares, caldos, etc.) y
también para esterilizar material contaminado (placas de Petri con cultivos positivos,
caldos con crecimiento, muestras patológicas, etc.). La esterilización se realiza a 120°C
por 15 min y es una esterilización húmeda.
Material de Laboratorio en Microbiología
1. cañón
2. base
3. anillo que regula entrada de aire (virola)
4. entrada de gas (chiclé)
5. tubo de gas
6. llave de paso
Mechero Bunsen
Medios de cultivo
Autoclave
Microscopio óptico
Sistema óptico
Ocular: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo
Objetivo: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta
Condensador: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación
Diafragma: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador
Foco: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador
Sistema mecánico
Soporte: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo
Platina: Lugar donde se deposita la preparación
Cabezal: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular
Revólver: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los
objetivos
Tornillos de enfoque: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que
consigue el enfoque correcto
5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser
suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar
de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el
objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy
poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances:
incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo
con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo
de inmersión
6. Empleo del objetivo de inmersión:
a. Bajar totalmente la platina
b. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica
la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite
c. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste
y el de 40x
d. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz
e. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión
f. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca
la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara
a la lente
g. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el
objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por
lo que el riesgo de accidente es muy grande
h. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede
volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por
tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación
desde el paso 3
i. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el
objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar
la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en
posición de observación
j. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para
óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio.
ACTIVIDAD PRACTICA N° 1
Objetivos
a) medios líquidos o caldos: aquellos que contienen, disueltos en agua los nutrientes
necesarios para el crecimiento microbiano. La multiplicación bacteriana se manifiesta
generalmente por la turbidez del medio
c) Medios semisólidos, son similares a los medios sólidos, pero la concentración del
agar es menor, por lo que mantiene una consistencia gelatinosa. La multiplicación
bacteriana se manifiesta por turbidez del medio.
Colonias húmedas
Colonias secas
Colonias coloreadas
Observación macroscópica
Objetivos
- Al fresco: permite observar a la bacteria en estado vivo. En este caso se coloca una
suspensión bacteriana efectuada en caldo, agua o suero fisiológico estéril en un
portaobjetos. La observación se realiza con aumento 10x ó 40x, sin inmersión,
disminuyendo la iluminación, bajando el condensador del microscopio.
En este caso se utilizan técnicas de coloración, lo que implica la muerte de las bacterias y,
por lo tanto, algunas alteraciones en su constitución, pero permite visualizar forma,
agrupación, etc.
- extensión
- secado
- fijación
Procedimiento
1. Limpiar un portaobjeto con alcohol y pasarlo rápidamente por la llama del mechero,
dejar enfriar.
2. Colocar una gota de agua, suero fisiológico o caldo estéril en el centro del portaobjeto.
3. Con el asa esterilizada en la llama tomar una asada del cultivo en placa, dispersar el
material en la gota y extender suavemente en una superficie adecuada (1cm2), esterilizar
el asa en la llama del mechero.
4. Secar el frotis pasándolo suavemente por la llama del mechero, en la estufa de cultivo o
a temperatura ambiente. Este procedimiento tiene como objeto "fijar" la preparación
(adherir las bacterias a la superficie del vidrio) y el frotis queda en condiciones de ser
teñido.
5. Colocar la lámina en la vasija de tinción y verter sobre ella el colorante escogido
dejándolo actuar por 1ó 2 minutos.
6. Lavar el frotis con agua.
7. Secar el portaobjeto colocándolo sobre papel absorbente en forma inclinada y luego
pasarlo rápidamente por la llama del mechero para terminar con el secado.
8. Observar al microscopio, con objetivo de inmersión.
Tinciones diferenciales: estas tinciones permiten agrupar a las bacterias de acuerdo a
su afinidad por los diferentes colorantes que se utilizan. Así, bacterias que quedan teñidas
de diferente color pertenecen a grupos también diferentes. Estas tinciones son de gran
importancia, debido a que existe una correlación entre la capacidad tintorial de la bacteria
y algunas propiedades basadas en diferencias estructurales principalmente a nivel de la
pared bacteriana. Entre estas tinciones están la tinción de Gram y la tinción de Ziehl -
Neelsen.
Procedimiento
Esta tinción al igual que la de Gram emplea dos colorantes, la fucsina y el azul de
metileno (o amarillo victoria), con una decoloración intermedia basado en el uso de un
decolorante enérgico (alcohol ácido). Esta tinción es empleada para bacterias que poseen
una membrana cérea lo que hace que sea difícil de teñir, por lo que se emplean
colorantes fuertes y decolorantes ácidos. Las bacterias alcohol-ácido resistentes son
aquellas que no pierden la coloración inicial con fucsina por acción del alcohol - ácido y se
observarán de color rojo, el resto de la preparación se observará de color azul.
Procedimiento
Tinciones especiales: estas tinciones, cuyas técnicas son más complejas que las
tinciones anteriores, tienen por objeto destacar algunas de las partes que constituyen a la
bacteria, por ejemplo tinciones de flagelos, cápsulas, esporas, etc. En general no son de
uso rutinario y encuentran su aplicación en trabajos de investigación bacteriológica
TAMAÑO CELULAR
Las bacterias son organismos unicelulares, cuyo tamaño varía de acuerdo a la especie y
las condiciones de cultivo. Aquellas bacterias que se relacionan con el ser humano tienen
un tamaño que varía entre 0,5 y 5 µm.
Dos ejemplos:
a) las células individuales de Staphylococcus y de Streptococcus, bacterias comúnmente
asociadas a cuadros infecciosos de tipo piógeno, tienen forma esférica con diámetro
que varía entre 0,75 y 1,25 µm.
b) Escherichia coli, bacteria considerada como habitante normal del intestino humano y
animal, tiene la forma de cilindro con un diámetro de 0,5-1,0 µm y un largo de 2-3 µm.
MORFOLOGIA CELULAR
A pesar de su pequeño tamaño las bacterias, pueden presentar una variedad morfológica
prácticamente infinita. Sin embargo, la gran mayoría de ellas se limitan las siguientes
formas básicas:
i) Cocáceas, células bacterianas de forma esférica o aproximadamente esféricas
ii) Bacilares, células en las cuales uno de sus ejes es mucho mayor que el otro,
adoptando la apariencia de un bastón o cilindro
iii) Espiraladas, células largas que presentan una torsión alrededor de un eje central
iv) Curvas, células retorcidas pero que no alcanzan una torción completa
Bacterias cocáceas
Bacterias bacilares
Bacterias espirales
Bacterias
espiroquetas
Bacterias de formas
no tradicionales
Bacterias
filamentosas
Tétradas: las células en forma de diplococo de dos células juntas se dividen en ángulo
recto al primer plano de división
Cubos o sarcina: se producen cuando una tétrada se divide en un tercer plano
formando un paquete cúbico de ocho células que asemejan un cubo. Esta agrupación
es característica del género Sarcina (cocácea).
Racimos: en este caso la división celular se produce en tres planos, de forma irregular,
dando origen a masas de células que en la observación microscópica semejan
racimos. Esta agrupación es característica del género Staphylococcus.
Cadenas: las células se ubican en línea formando cadenas de longitud variable. Esta
agrupación se presenta porque la división celular se produce en un solo plano y las
células no se separan después de la división. La agrupación en cadena es
característica del género Streptococcus (forma cocácea) pero la presentan también
algunas bacterias bacilares como Bacillus y Lactobacillus.
Letra china: también se presenta sólo en bacilos. Las células se disponen formando
diferentes ángulos que dan la idea de letras chinas Ej. Corynebacterium.
La agrupación de las células de cada especie es una propiedad constante que, por esta
razón, facilita su identificación en el laboratorio.
Agrupación: en pares
Agrupación: en cadenas
Agrupación: empalizada y letra china
Agrupación: en pares
Agrupación: en cadenas
Agrupación: en tétradas
Agrupación: sarcina
Agrupación: racimo
TRABAJO PRACTICO
Observación microscópica