CHƯƠNG 1: TÁCH CHIẾT VÀ LÀM SẠCH ENZYME

1 Các phương pháp phá vỡ tế bào 1.1 Phá vỡ tế bào bằng phương pháp cơ học Mục đích của phá vỡ tế bào là giải phóng các chất có trong tế bào và đảm bảo được hoạt tính enzyme nội bào. Việc phá vỡ tế bào sinh vật bao gồm cả phá vỡ tế bào động vật, thực vật và VSV. Đối với tế bào động vật, người ta thường sử dụng toàn bộ cơ quan (hay mô bào) của động vật có chứa enzyme và cần phải loại bỏ mỡ hoặc các thành phần khác bám theo mô bào đó, các mẫu cần được xử lý nhanh và phải được thu nhận enzyme trong thời gian không quá 4 giờ kể từ khi giết mỗ. Đối với tế bào và mô bào thực vật, cần phải được làm sạch và phải được trữ lạnh nếu chưa tiến hành thu nhận enzyme ngay. Tế bào động vật và thực vật thường rất dễ phá vỡ bằng các phương pháp cơ học. Riêng tế bào vi sinh vật, việc phá vỡ tế bào có những khó khăn nhất định. Tế bào vi sinh vật có kích thước quá nhỏ, việc phá vỡ tế bào bằng phương pháp nghiền nếu không có chất trợ nghiền sẽ không có hiệu quả. Vi sinh vật là cơ thể đơn bào, khi phát triển trong môi trường, đặc biệt là môi trường lỏng có nhiều cơ chất thủy phân, chúng sẽ tạo ra nhiều enzyme ngoại bào tương ứng. Các enzyme ngoại bào này được hòa tan trong môi trường và dễ dàng tách chúng ra khỏi dung dịch nuôi cấy, do đó trong công nghiệp người ta ít khi tiến hành nghiền tế bào (trừ trường hợp phải thu nhận enzyme nội bào). Tuy nhiên, trong thời gian gần đây, việc nghiên cứu enzyme nội bào ở VSV ngày càng nhiều, do đó phương pháp cơ học được ứng dụng để phá vỡ tế bào VSV ngày càng nhiều. * Phương pháp đồng hóa áp lực cao: Đây là phương pháp được ứng dụng rộng rãi nhất để phá vỡ tế bào quy mô công nghiệp. Theo phương pháp này, huyền phù tế bào sẽ được nén với một áp suất cao, chúng va chạm rất mạnh vào vành ống (máy đồng hóa maton-gaulin). Tế bào bị phá vỡ bởi lực cắt và sức nén. Tùy thuộc vào loại máy, công suất từ 50 – 5000 lít/giờ mà áp lực cần có khác nhau. Mặt khác, tính chất, cấu tạo của tế bào khác nhau đòi hỏi áp lực khác nhau. Ví dụ đối với tế bào vi khuẩn người ta cần áp lực khoảng 550 bar. Phương pháp đồng hóa áp

lực cao thường được áp dụng cho việc phá vỡ tế bào vi khuẩn. Tế bào động vật và tế bào thực vật ít khi phải dùng phương pháp này. * Phương pháp nghiền ẩm: Đây cũng là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất enzyme. Trong quá trình nghiền, người ta thường sử dụng những viên bi thủy tinh có kích thước 0.2 – 1mm để tăng quá trình phá vỡ tế bào. Trong nhiều trường hợp, người ta không dùng viên bi thủy tinh mà người ta dùng hạt thủy tinh, vì hạt thủy tinh có độ ma sát cao hơn viên bi thủy tinh nên hiệu suất nghiền tốt hơn. 1.2 Phá vỡ tế bào không phải bằng phương pháp cơ học Ngoài hai phương pháp cơ học trên, người ta còn phá vỡ tế bào bằng phương pháp không phải là phương pháp cơ học. Các phương pháp bao gồm phương pháp hóa học, phương pháp nhiệt và phương pháp enzyme (ở một số tài liệu người ta còn gọi là phương pháp hóa học, phương pháp vật lý và phương pháp sinh học). Phương pháp hóa học: Là phương pháp dựa trên khả năng tạo ra áp suất thẩm thấu mạnh, hoặc khả năng oxy hóa mạnh của các chất hóa học để phá vỡ thành tế bào. Phương pháp này không đòi hỏi áp suất cao, nên ít chi phí và dễ thực hiện. Tuy nhiên vì trong quá trình thực hiện, người ta sử dụng các hóa chất nên các hóa chất này thường lẫn vào trong hỗn hợp, đòi hỏi quá trình tách rất phức tạp. Một trong những hóa chất sử dụng nhiều là acetone. Phương pháp vật lý: Là phương pháp sử dụng siêu âm, phương pháp này thường được sử dụng trong các phòng thí nghiệm, chưa thấy sử dụng trong quy mô công nghiệp. Một phương pháp vật lý khác cũng được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu và trong sản xuất ở dạng thử nghiệm là tạo shock nhiệt hay shock thẩm thấu. Nguyên tắc của phương pháp này là, khi đưa nhiệt độ của tế bào huyền phù xuống nhiệt độ rất thấp, ngay lập tức nâng nhiệt đến 400C (thao tác nâng nhiệt rất nhanh), khi đó thành tế bào sẽ bị phá vỡ và người ta thu được huyền phù tế bào vỡ. Phương pháp này thường dễ thực hiện, đảm bảo được hoạt tính của enzyme nhưng hiệu suất phá vỡ tế bào không cao.

Phương pháp sinh học (phương pháp enzyme). Có hai phương pháp hiện đang được sử dụng rộng rãi là phương pháp tự phân và phương pháp thủy phân bằng enzyme đưa từ bên ngoài vào. Phương pháp tự phân là phương pháp tạo điều kiện tối ưu cho một số enzyme có khả năng phân giải cho một số thành phần của thành tế bào, các enzyme này phải là những enzyme có trong tế bào và là của tế bào đó. Bình thường các enzyme này không hoạt động mạnh, nhưng nếu điều kiện nhiệt độ, pH, nước ở bên ngoài tế bào mà trùng với mức hoạt động tối ưu của chúng, thì chúng sẽ hoạt động mạnh và thủy phân thành tế bào, làm chết tế bào. Tự phân là quá trình được áp dụng nhiều trong quá trình phá vỡ thành tế bào các loại nấm men. Người ta thường tiến hành quá trình tự phân huyền phù tế bào nấm men ở nhiệt độ 48 – 520C, trong khoảng thời gian 6 – 24 giờ. Phương pháp này có nhiều nhược điểm vì trong quá trình thủy phân, các enzyme có trong tế bào không chỉ thủy phân các chất ở thành tế bào mà cả những chất có trong tế bào, thậm chí các enzyme cũng bị phá hủy. Phương pháp này hiện nay không được sử dụng nhiều trong công nghiệp. Một phương pháp khác đang được nghiên cứu nhiều là phương pháp sử dụng enzyme từ ngoài tế bào. Các enzyme này được đưa vào huyền phù tế bào để tiến hành các quá trình thủy phân có định hướng các chất nhất định trong thành tế bào. Người ta thường sử dụng hệ enzyme cellulase để phá vỡ thành tế bào nấm men và thành tế bào thực vật. Phương pháp này không gây hư hỏng các chất có trong tế bào và thực hiện dễ dàng trong mọi điều kiện (phòng thí nghiệm, sản xuất thử nghiệm, và sản xuất công nghiệp). Ngoài ra, người ta còn sử dụng lysozym trong các loại tế bào khác. 2.2 Các Phương pháp cơ học tách enzyme Các phương pháp cơ học được ứng dụng nhiều để tách enzyme khỏi tế bào và các thành phần khác gồm hai phương pháp: Phương pháp ly tâm Phương pháp lọc

2.2.1 Phương pháp ly tâm

Ly tâm là quá trình tách vật chất rắn ra khỏi dung dịch. Trong công nghệ enzyme, phương pháp ly tâm thường được ứng dụng khá rộng rãi để thu nhận dung dịch enzyme, dung dịch này chứa các enzyme ngoại bào. Enzyme nội bào nằm trong tế bào sinh vật, muốn thu nhân enzyme nội bào ta phải tiến hành một giai đoạn phá vỡ tế bào. Phần lớn các enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme hòa tan. Như vậy khi tiến hành ly tâm, dung dịch được tách khỏi các thành phần rắn là dung dịch enzyme thô, dung dịch enzyme thô này còn chứa các thành phần sau: Protein có hoạt tính sinh học Các chất hòa tan khác Nước Phương pháp ly tâm chỉ tách được thành phần rắn có tỷ trọng lớn hơn dung dịch. Dịch thu được chưa phải là chế phẩm enzyme tinh khiết mà là chế phẩm enzyme thô, vì còn chứa protein không hoạt động, nước và các chất hòa tan khác. Đối với sinh khối động vật và thực vật, sau khi nghiền ta thu được hỗn hợp nhiều thành phần. Ly tâm hỗn hợp này ta thu được dung dịch enzyme thô tương tự như ở VSV. Để tránh hiện tượng biến tính của enzyme, trong những mẫu nghiên cứu, người ta thường tiến hành ly tâm lạnh, còn trong sản xuất theo quy mô công nghiệp, người ta thường tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp. Trong quy mô công nghiệp, người ta thường tiến hành ly tâm thu nhận dung dịch enzyme bằng máy ly tâm liên tục. Phương pháp ly tâm liên tục có những ưu điểm là thời gian thu nhận sản phẩm nhanh, liên tục, và không gây ảnh lớn đến hoạt tính của enzyme. Hiện nay, trong công nghệ enzyme, người ta đang sử dụng rông rãi ba kiểu ly tâm: ly tâm hình trụ thẳng đứng, ly tâm liên tục nằm ngang, ly tâm liên tục nhiều đĩa.

Ngoài ba kiểu ly tâm điển hình trên, ở một số nhà máy sản xuất enzyme có sử dụng một số kiểu ly tâm khác. Việc chọn kiểu ly tâm này hay ly tâm khác phải xem xét đến hai yếu tố rất quan trọng: nồng độ chất rắn (%), kích thước vật lắng. 2.2.2 Phương pháp lọc Trong công nghệ enzyme, sau khi phá vỡ thành tế bào sinh vật hay sau khi lên men, người ta thường sử dụng quá trình lọc để thu nhận dung dịch enzyme nội bào, enzyme ngoại bào hòa tan. Lọc cũng là phương pháp tách thành phần rắn ra khỏi dung dịch. Lọc là một phương pháp khi thực hiện thường gặp nhiều khó khăn như kích thước vật chất dưới tế bào thường rất nhỏ, và độ nhớt của dung dịch thường rất cao. Cả hai yếu tố này đều làm cản trở quá trình lọc. Tốc độ lọc phụ thuộc rất lớn vào: diện tích bề mặt vật liệu lọc; độ nhớt dịch lọc; sức đề kháng. Trong công nghiệp sản xuất enzyme người ta thường sử dụng các kiểu sau: Lọc ép: Lọc ép (lọc đĩa, buồng lọc) thường được sử dụng trong trường hợp dung dịch cần lọc có khối lượng nhỏ. Phương pháp này sử dụng để lọc enzyme rất có hiệu quả. Lọc chân không: Là phương pháp được ứng dụng nhiều nhất trong nghiên cứu và trong sản xuất các sản phẩm sinh học có hoạt tính. Trong đó, lọc chân không quay được sử dụng nhiều hơn cả. Lọc theo dòng chảy cắt ngang. Trong những năm gần đây, nhiều nhà máy sản xuất enzyme sử dụng phương pháp lọc theo dòng chảy cắt ngang. Theo đó, dòng dung dịch lọc sẽ chảy song song bề mặt nguyên liệu lọc. Phần lọc sẽ được thoát qua vật liệu lọc và đi xuống phía dưới. Phương pháp này có ưu điểm là giảm sức đề kháng quá trình lọc của vật liệu chất rắn.

sự trao đổi chất của tế bào bị ngưng trệ. hiện nay ở một số nhà máy vẫn còn sử dụng. Enzyme mất hoạt tính là một trong những nguyên nhân làm tế bào chết. Phương pháp lọc thông thường đã có từ rất lâu. bảo quản Tăng hiệu suất tác động của enzyme đối với cơ chất Để đạt được mục đích đó. Mặt khác lượng enzyme có trong dịch enzyme thô quá ít. người ta phải cô đặc dung dịch enzyme nhằm một số mục đích sau: Làm tăng hoạt tính của enzyme trong một khối lượng dung dịch enzyme Làm giảm chi phí và công sức cho việc xử lý sau này Tăng khả năng bảo quản enzyme Giảm chi phí vận chuyển. là vì khi đó các phản ứng trao đổi chất của tế bào sẽ không còn xảy ra nữa. nhưng sử dụng nhiệt để cô đặc enzyme thường gặp rất nhiều khó khăn vì enzyme là protein rất nhạy cảm với nhiệt độ. Trong cơ thể. Để xử lý một khối lớn dung dịch enzyme phải tốn rất nhiều công sức và chi phí cho xử lý này rất cao. Trường hợp nhiệt độ vượt quá nhiệt độ hoạt động của tế bào sống. . có hiệu quả hơn. tế bào không thể tồn tại.1 Phương pháp nhiệt Chúng ta có thể tiến hành cô đặc enzyme bằng phương pháp nhiệt.3 Phương pháp cô đặc Dung dịch enzyme thô thường chứa lượng enzyme không nhiều. Chính vì thế. hoạt tính enzyme không cao. 2. enzyme thường hoạt động trong điều kiện nhiệt hoạt động của tế bào sống. nguyên nhân là hầu hết enzyme đều được tổng hợp trong tế bào (trừ enzyme nhân tạo). Phương pháp lọc này đang được thay thế dần bằng những phương pháp khác nhanh hơn. người ta tiến hành cô đặc enzyme bằng một trong những phương pháp sau: 2.3. thì tế bào sẽ chết.- Lọc thông thường.

. làm cho lượng nước trong dung dịch giảm đi. người ta phân biệt hai thuật ngữ: kết tủa âm và kết tủa dương. thậm chí có thể dẫn đến triệt tiêu hoạt tính. hàm lượng enzyme trong dung dịch sẽ tăng lên.3. Quá trình cô đặc là quá trình làm bốc hơi nước. enzyme là một phức hợp protein có khả năng tạo kết tủa với một số dung môi. Tuy nhiên nếu không chú ý đến điều kiện nhiệt độ để khống chế nó trong một khoảng cho phép thì hoạt tính của enzyme có thể sẽ bị mất nhiều. Phần protein cần thiết nằm trong dung dịch chứ không nằm trong phần tủa. người ta thường sử dụng những phương pháp sau: Bốc hơi lớp mỏng Bốc hơi ly tâm lớp mỏng Bốc hơi ống dài 2. Trong quá trình kết tủa. Trong công nghiệp. Kết tủa dương thì hoàn toàn ngược lại. hiện tượng này thấy ở hầu hết các loại enzyme. việc khống chế nhiệt độ cùng với thời gian cần thiết trong quá trình cô đặc là điều rất cần thiết. Phương pháp kết tủa dựa trên nguyên tắc.2 Phương pháp kết tủa Kết tủa là phương pháp được sử dụng rất rộng rãi trong các nghiên cứu enzyme trong phòng thí nghiệm và sản xuất enzyme trong quy mô sản xuất công nghiệp. các protein cần thiết lại nằm trong phần kết tủa còn protein tạp nằm trong phần dung dịch.Khi enzyme được tách ra khỏi tế bào thường hoạt động ở nhiệt tối ưu cao hơn nhiệt độ sinh lý của tế bào. hoạt tính enzyme cũng tăng cao. Tùy theo nguồn thu nhận enzyme và tính chất của từng loại enzyme mà quyết định chế độ gia nhiệt trong quá trình cô đặc. Do đó. Kết tủa âm: là sự kết tủa protein tạp.

tương tác giữa các phân tử enzyme sẽ bị tăng lên. khoảng 20 – 80%. Người ta thường kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ từ 3 – 100C. Trong công nghiệp sản xuất enzyme. nhưng để tránh khả năng làm mất hoạt tính enzyme.* Phương pháp kết tủa bằng muối: Muối nồng độ cao có tác dụng với phân tử nước bao quanh protein enzyme và làm chuyển hóa điện tích. muối này tuy không gây hư hỏng thiết bị. * Phương pháp kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ: Dung môi hữu cơ có ảnh hưỡng rất lớn đến khả năng hòa tan của enzyme. Sau này người ta thay ammonium sulfate bằng sodium sulfate. người ta thường sử dụng ethanol và acetone để kết tủa enzyme. Tuy nhiên. enzyme. Các thiết bị dùng trong quá trình kết tủa bằng muối ammonium sulfate thường được chế tạo bằng thép không rỉ. song chúng lại không có tính hòa tan tốt. Nhiệt độ tiến hành kết tủa có thể ở 35 – 400C. Tỷ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme được xác định bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch enzyme. Do enzyme rất nhạy cảm với nhiệt độ khi có mặt của các chất như ethanol hoặc acetone. Trong công nghiệp enzyme người ta thường sử dụng muối ammonium sulfate. nên bắt buộc ta khi tiến hành kết tủa enzyme phải làm lạnh cả dung môi hữu cơ và dung dịch enzyme. Mức độ nhạy cảm nhiệt độ của enzyme khi có mặt các dung môi hữu cơ thường mạnh hơn mức độ nhạy cảm của enzyme với nhiệt độ khi có mặt của muối vô cơ. * Kết tủa enzyme bằng polymer: Polyethylene glycol là một polymer cao phân tử được ứng dụng rộng rãi trong kết tủa protein. ảnh hưởng solvate hóa của phân tử nước xung quanh phân tử enzyme bị thay đổi. Khi tiến hành kết tủa enzyme bằng những dung môi hữu cơ cần hết sức lưu ý đến nhiệt độ. làm thay đổi tính hòa tan của enzyme. Nhiều tác giả cho rằng cơ chế lắng của chúng gần giống dung môi hữu cơ. người ta thường phải làm lạnh dung dịch muối và dung dịch enzyme trước khi trộn hai loại dung dịch này với nhau. do đó nhiều trường hợp thiết bị chế tạo từ thép không rỉ cũng bị ăn mòn bởi ammonium sulfate. Khoảng tối ưu của nồng độ muối dùng trong kết tủa enzyme rất rộng. Phương pháp này có ưu điểm là ta có thể thực hiện . thép không rỉ có nhiều loại.

người ta thường sử dụng nồng độ polymer khoảng 15 – 20% để kết tủa enzyme. * Kết tủa enzyme ở điểm đẳng điện của protein-enzyme: Protein là chất lưỡng cực. Như vậy thiết bị phản ứng càng lớn. phần lớn protein có điểm đẳng điện ở khoảng acid. Phương pháp này được ứng dụng rất nhiều trong nhiều lĩnh vực khác nhau. poly-vinylidene và . Khi đó. Thời gian tạo điểm đẳng điện và thời gian lưu để tạo kết tủa bền vững thường làm thay đổi hoạt tính enzyme.000 dalton. tách vi khuẩn khỏi dung dịch enzyme.quá trình kết tủa enzyme ở nhiệt độ bình thường (nhiệt độ phòng thí nghiệm) và lượng polyethylene glycol cần sử dụng để kết tủa không nhiều (khoảng 5 – 15 %). chúng có cả nhóm acid và nhóm base. thẩm thấu ngược. Người ta sử dụng cellulose acetate và các loại polymer hữu cơ như poly sulfone. siêu lọc có thể giúp ta thu nhận các chất có khối lượng phân tử trong khoảng1.3. vì thế quá trình này gọi là kết tủa acid. mức độ này là tối thiểu khi chúng ở điểm đẳng điện.000 – 300. thời gian khuấy trộn và thời gian lắng kết tủa càng dài. Phương pháp tách vật chất bằng màng siêu lọc hiện nay có ba loại là: lọc dòng chảy cắt ngang. Phương pháp thẩm thấu ngược dùng để thu nhận các chất có khối lượng phân tử thấp và có khả năng hòa tan. chứ không thực hiện ở quy mô công nghiệp.3 Phương pháp siêu lọc Phương pháp siêu lọc là phương pháp sử dụng những màng lọc có lỗ lọc siêu nhỏ. siêu lọc. 2. Kết tủa enzyme ở điểm đẳng điện thường được thực hiện ở quy mô nhỏ. phương pháp lọc dòng chảy cắt ngang để thu nhận sinh khối vi khuẩn. Polymer được sử dụng rất rộng rãi để kết tủa enzyme cả trong nghiên cứu và trong sản xuất theo quy mô công nghiệp. Mức độ hòa tan của enzyme phụ thuộc vào pH. Nếu sử dụng nồng độ cao sẽ làm độ nhớt của dung dịch rất cao và như thế sẽ tạo ra nhiều khó khăn cho kỹ thuật làm sạch sau này. Trong công nghiệp. Trong những phương pháp trên. siêu lọc lại được sử dụng rất rộng rãi để thu nhận enzyme. Trong khi đó. Các polymer được sử dụng nhiều là polyethylenamin và polyethylene glycol với những khối lượng phân tử khác nhau. enzyme càng dễ bị biến tính.

dextran …Trong lọc gel.3 Phương pháp sắc ký * Phương pháp sắc ký lọc gel.2 Phương pháp điện di Phương pháp điện di chỉ được ứng dụng nhiều trong phòng thí nghiệm. 2. sự hấp thụ xảy ra ở nồng độ muối cao và quá . * Sắc ký trao đổi ion. người ta còn tách muối trong dung dịch enzyme bằng lọc thẩm tích.4. Phương pháp trao đỏi ion được sử dụng rộng rãi trong sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp.4 Phương pháp tinh sạch enzyme 2.1 Phương pháp kết tinh Trong nghiên cứu và trong sản xuất. * Sắc ký kỵ nước. vì vậy phương pháp này ít được phổ biến 2. người ta dùng dung dịch ammonium sulfate để kết tinh enzyme.poly propylene làm nguyên liệu màng lọc. Trừ cellulose acetate ra. acid hoặc bằng hơi nóng. các phân tử được tách ra dựa theo kích thước và hình dáng của chúng. Các loại gel được sử dụng rộng rãi trong phương pháp sắc ký cột là: polycryamide. các loại gel được nạp vào trong cột dùng để tách enzyme. Người ta cũng đã tiến hành áp dụng thử phương pháp này theo quy mô công nghiệp nhưng cho đến nay vẫn chưa được phát triển rộng rãi. Từ đó. Ngoài ra.4. Tính chất tích điện của protein chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi giá trị pH. Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa trên sự tích điện của phân tử protein. vinyl polymer.4. ararose. người ta chọn chất trao đổi là anion hay cation. Phương pháp này dựa trên sự tương tác của vùng kỵ nước của phân tử protein với nhóm kỵ nước trên chất nền. 2. các loại nguyên liệu màng lọc khác kể trên có thể rửa bằng kiềm. dung dịch ammonium sulfate để kết tinh enzyme đòi hỏi độ tinh sạch phải rất cao là rất khó. Theo phương pháp này.

000 vòng trong 20 phút. β-amylase. Dịch enzyme thô được cho kết tủa với (NH4)2SO4 (25 – 60%). glycogen và các polysaccharide đồng loại. malt thóc và ngô.5. được nhồi vào trong các cột sắc ký. Phần kết tủa thu được đem hòa tan trong 10ml dung dịch đệm A và ly tâm với tốc độ 15.5 Thu nhận enzyme từ nguồn thực vật 2. γamylase (hay glucose) thủy phân các liên kết α-1.1 Thu nhận enzyme amylase Hiện nay.5) (dung dịch đệm A). Phương pháp này dựa trên khả năng giữ enzyme bằng những chất nền không hòa tan.000 vòng trong 20 phút. 2. Hạt nảy mầm được đồng hóa trong một máy trộn và một polytron với 800ml dung dịch đệm TRIS/HCl 50mM (pH 8. * Sắc ký ái lực. Enzyme amylase được thu nhận chủ yếu từ các hạt nảy mầm như: malt đại mạch. và exoamylase (enzyme ngoại bào). Sản phẩm đồng hóa được ép qua hai lớp lưới nylon và dịch lọc thô được đưa vào ly tâm với tốc độ 15. .4-glucoside của tinh bột. * Sắc ký đồng hóa trị. trong đó α-amylase. Sáu loại amylase này được xếp thành hai nhóm: endoamylase (enzyme nội bào).6-glucoside. Liên kết đồng hóa trị được tạo thành giữa các protein ở trạng thái tĩnh. Các amylase còn lại: dextrin-6-glucanhydrolase (hay dextrinase) thủy phân các liên kết α-1.trình phân đoạn với muối. Có hai phương pháp tinh sạch enzyme amylase là phương pháp sắc ký và phương pháp điện di trên gel polyacrylamide * Tinh sạch enzyme amylase bằng phương pháp sắc ký Hạt lúa được cho hút ẩm và ủ trong tối ở 300C trong 8 ngày. Phần ở trên được xem như dịch enzyme thô. Phương pháp này đặc biệt thích hợp đối với những enzyme đã được làm cô đặc trước đó bằng phương pháp kết tủa với muối ammonium sulfate. người ta biết có sáu loại amylase.

000rpm trong 15 phút ở nhiệt độ 40C.5M. Các phân đoạn qua cột thu được sẽ được chuyển qua 12 sắc ký cột superpose. * Thu nhận enzyme amylase bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (PAGE) Hạt lúa được ngâm nước và ủ cho nảy mầm. Dung dịch được thẩm tích và được lôi cuốn qua cột CHA (ancyclodextrin). Phần nổi ở trên được chuyển sang một ống ly tâm khác và được xem là dịch enzyme. được thu nhận từ họ Bromeliaceae. Sau 14 ngày.05M (pH 8. Những phân đoạn này được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. đặc biệt ở cây dứa (thân và trái). 2. có khả năng phân giải protein. enzyme được tách rửa bằng NaCl nồng độ 0 – 0. Hỗn hợp sau khi đồng hóa được ly tâm với tốc độ 10.2 Thu nhận enzyme bromelin từ dứa Bromelin là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chứa nhóm sulfhydryl. gel được đưa ra nhuộm với dung dịch nhuộm màu để xác định sự hiện diện của amylase. Gel được chuẩn bị sẵn sàng và được đưa vào điện di với cường độ dòng điện 70V. cây mầm được xay nhuyễn với đệm Tris-HCl 0. Sau khi hoàn tất việc chạy điện di.Sau khi sử dụng phương pháp thẩm tích thì phần nổi ở trên trong dung dịch đệm A thì sẽ được cho qua cột DEAE cellulose.5.0).  Phương pháp thu nhận . DE 52 và được cân bằng với dung dịch đệm A. cột này đặc biệt được sử dụng để lôi cuốn amylase. Tỷ lệ mô đệm là 1:2 (trọng lượng/thể tích).

protein liên kết với một lượng nước khá lớn) cũng như các ion dương. vắt kỹ. Đối với enzyme protein cũng như các protein enzyme khác. do đó trong điều kiện sinh lý. để có thể kết tủa được enzyme.000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ chất xơ sẽ thu được dịch chiết có chứa bromelin.Quy trình tổng quát thu nhận và tinh sạch enzyme bromelin Thu dịch enzyme thô  Quả dứa hoặc thân được xay nhuyễn. Sự kết hợp với nước tạo ra một lớp nước bao xung quanh phân tử protein và cản trở sự kết tủa của chúng. giúp cho protein tủa xuống. . điều cần thiết là phải phá vỡ lớp nước liên kết xung quanh phân tử này bằng cách bổ sung vào dung dịch protein enzyme các dung môi hoặc các chất ưa nước có ái lực với nước mạnh hơn protein để lôi kéo nước ra khỏi phân tử protein đó. các phân tử protein có tích điện âm thừa và chính những điện tích âm thừa này đã kết hợp với các đầu mang điện tích dương của phân tử nước hữu cực (ở trong dung dịch. ly tâm dịch lọc với tốc độ 6. lọc bỏ bã và thu dịch lọc. Các phương pháp tách bromelin  Phương pháp kết tủa enzyme Nguyên tắc: điểm đẳng điện của đa số protein thấp hơn pH 7.

Tủa bằng ethanol: làm lạnh dung dịch nước dứa sau ly tâm. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút. Trình tự thực hiện tương tự nhau. Tủa bằng acetone: thêm một thể tích acetone lạnh hoặc 20% acetone lạnh vào 1 thể tích dung dịch nước dứa sau ly tâm. để 1 giờ ở 0-40C. Thêm 2 thể tích acetone lạnh vào. Để yên trong 1 giờ ở nhiệt độ 0-40C. Rửa tủa bằng acetone và thu nhận tủa. Tủa được gọi là bromelin-kaolin. sau đó ly tâm với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 5 phút để thu nhận tủa. Có thể sử dụng kaolin hay betonite để hấp phụ bromelin. Khuấy đều bằng máy khuấy từ. loại bỏ tủa. cho ethanol 96% (cũng đã được làm lạnh) vào theo tỷ lệ 4:1 (4 nước dứa. để ở nhiệt độ 00C trong 3-4 giờ. Phương pháp hấp phụ Có nhiều chất được sử dụng để làm chất hấp phụ enzyme.Cách thực hiện: Tủa bằng muối ammonium sulfate: chuẩn bị một lít dung dịch nước dứa sau ly tâm. Ly tâm hốn hợp với tốc độ 6. Phương pháp siêu lọc Siêu lọc là quá trình dung dịch lỏng chảy qua một màng lọc dưới một áp suất để tách các thành phần trong chất lỏng đó. cho từ từ 532g ammonium sulfate vào và khuấy đều (dung dịch đạt được độ bão hòa ammonium sulfate là 70%). Sự phân chia các phân đoạn phụ thuộc vào kích thước lỗ trên màng và tùy theo trọng lượng phân tử của chất thấm qua. trộn đều. Cách làm: cho kaolin khô (hoặc đã ngâm cho trương nở) vào dung dịch nước dứa sau ly tâm với tỷ lệ 25mg kaolin/ml dung dịch nước dứa. Tùy . 1 cồn).000 vòng/phút trong 5 phút. Để yên ở nhiệt độ phòng 10 – 15 phút. sau đó ly tâm để thu tủa. ly tâm thu tủa và rửa tủa bằng acetone lạnh.

vẩy sạch chất bẩn bám vào CMC. Dung dịch đệm phía ngoài túi được khuấy liên tục bằng một máy khuấy từ. Thu nhận tủa bằng cách sử dụng acetone hoặc sấy thăng hoa dung dịch cô đặc. cho sephadex từ từ vào . Sau 2 giờ lấy ra vắt kiệt.03M có pH 7. pH5.05M.000.03M.005M. Sau đó.05M. Cách thực hiện: Sử dụng màng FS 50PP có giá trị loại trừ 30. Sau khi tất cả enzyme hòa tan thì cho hỗn hợp vào túi cellophane rồi đặt túi vào cốc có chứa 1 lít dung dịch đệm sodium phosphate 0. pha trong 10ml dung dịch đệm sodium phosphate 0.9cm). tiến hành phản ứng hấp phụ lần thứ nhất. pH 7.5x0. Tiến hành thẩm tích trong 6 giờ và cứ sau hai giờ thay dung dịch đệm bên ngoài 1 lần. Dịch nước sau khi ly tâm được cho qua siêu lọc. Sau đó. Tiếp tục phản ứng hấp phụ lần thứ hai như lần thứ nhất. Túi cellophane được chuẩn bị bằng cách trước khi dùng được tráng đầy bằng dung dịch đệm tương tự như trên. Tách chiết protein từ dịch chứa bằng CMC: CMC vải màng được tẩm ướt bằng dung dịch đệm phosphate 0. Sau 2 giờ lấy ra vắt kiệt thì thu được dung dịch đậm đặc chứa bromelin. sau đó cho dịch chiết dứa vào thỉnh thoảng khuấy trộn. Đặt 1 cái phễu thủy tinh phía trên cột.6. pH 7.theo kích thước của lỗ trên màng mà sau khi thực hiện quá trình siêu lọc sẽ thu được nước và những chất có phân tử nhỏ còn những các phân tử lớn sẽ bị giữ trên màng. Rửa protein bằng đệm phosphate 0. pH 6. diện tích màng 336cm2. trong quá trình này thêm nước cất vào để tinh sạch và thu được dung dịch cô đặc.5M khuấy trộn 3-4 lần.  Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G-50 Sephadex G-50 được đun cách thủy ở 1000C trong một giờ rồi nhồi vào cột (kích thước cột 23.2. Phương pháp tinh sạch enzyme bromelin Tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích   Cân 1g enzyme thô.2.1 và NaCl 0. góp các dịch chiết lại và tủa bằng acetone hay cồn lạnh để tách lấy enzyme. cho dung dịch phản ứng hấp phụ là đệm phosphate 0.1.

pH 7.2%S.3 Thu nhận enzyme papain Papain là một endoprotease có chứa 16. là một chuỗi popeptit gồm 185 amino acid.02M. Khi sắc ký trên sephadex G-75 ở pH 7 cũng nhận được 5 thành phần có hoạt tính enzyme. Cho dung môi enzyme phân ly qua cột và điều chỉnh tốc độ chảy khoảng 2ml/7 phút.1 sẽ thu được 5 phân đoạn khác nhau về thành phần amino acid.900 dalton. Papain là một protease thiol. Quá trình lọc enzyme qua sephadex diễn ra trong khoảng thời gian 1 giờ.phễu và khuấy liên tục. Các hạt sẽ lắng từ từ xuống cột. Khi enzyme đã hòa tan hoàn toàn thì cho hỗn hợp enzyme từ từ vào cột.  Tinh sạch bromelin bằng phương pháp sắc ký Bromelin thân được cho chạy sắc ký trên Duolite CS101 ở pH 6. Quá trình lọc enzyme qua sephadex G-50 nên được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp do nhiệt độ thấp có khả năng giảm thiểu sự biến tính của enzyme.800 – 20. Dịch enzyme được thu đến khi dùng Ba(NO3)2 để thử (NH4)2SO4 và thấy có xuất hiện kết tủa trắng thì ngừng quá trình thu dịch enzyme.2. casein và glucagons. Cân 100mg enzyme thô hòa vào trong một ml dung dịch đệm sodium phosphate 0. Loại bỏ 5ml đầu tiên rồi mới bắt đầu thu dịch enzyme. Sắc ký bromelin thân trên Bio Rex ở pH 6.1%N và 1.000 Dalton. Quá trình thu nhận papain tinh khiêt gồm các bước sau: . chú ý phải khuấy liên tục cho đến khi nhồi xong cột. Trong quá trình nhồi cột vẫn phải xả cột trong một giờ. 2. Dịch enzyme thu nhận được làm đông khô. trọng lượng phân tử là 20. Khi nhồi cột phải cố gắng nhồi sao cho mật độ hạt đồng nhất và không có bọt khí. Trọng lượng phân tử của 5 thành phần này ở trong khoảng từ 17.5.05 cho hai phân đoạn khác nhau về điện tích với hoạt tính xúc tác phân giải BAEE. với vận tốc khoảng 1ml/7 phút.

600rpm trong 1 giờ. pH 6. cặn tạp lớn… Trộn 180g nhựa đu đủ khô với 100g celite và 150 cát sạch.Quá trình phân đoạn bằng NaCl: hòa tan tủa trong 600ml dung dịch cystein 0.Chuẩn bị: thành phần nhựa đu đủ tươi ngoài enzyme papain.5 sau khi cho protein vào.… và các chất tạp khác. Các bước còn lại của quá trình làm tinh sạch được tiến hành trong điều kiện lạnh.3g cystein hydrochloride trong 1. bỏ dịch lỏng hoặc có thể giử lại để lấy chymopapain.02M (pH7-7. protein.Loại bỏ các chất không tan ở pH 9: Dịch chiết thu được ở bước 1 được điều chỉnh lên pH 9 bằng cách thêm từ từ và khuấy đều một lượng khoảng 110ml dung dịch NaOH 1M. gạn bỏ lớp nổi ở trên. ly tâm ở 2500rpm thu nhận tủa.054M. chất cao su. Để có được quy trình tách và tinh sạch papain từ nhựa đu đủ có hiệu quả thì phải có quy trình hòa tan nhựa đu đủ.04M (hòa tan 6. nghiền kỹ trong cối ở nhiệt độ phòng 200-300ml dung dịch cysteine 0. chymopapain còn chứa một số loại enzyme. mục đích là để loại bỏ các chất nhựa. Dịch chiết phải trong do các tủa gây biến tính protein đã được loại bỏ. Sau một giờ ly tâm ở 2. tủa papain tạo thành khi thêm từ từ 60g NaCl rắn. .002M. pH gần 5. kiềm được sử dụng để đưa pH dịch chiết tới pH 5. chất nhựa.000 ml dung dịch NaOH 0. Thời gian lọc phụ thuộc vào nhựa khô được sử dụng và quá trình này có thể rất chậm. chất béo.500rpm trong một giờ để thu tủa. Dịch huyền phù sau cùng được lọc lạnh trên giấy lọc Whatman số 1. .7). sau 1-2 giờ.. Quá trình nghiền và trích được lặp lại với 300ml dung dịch cysteine Sau đó rửa cối với dung dịch cystein để điều chỉnh thể tích dịch chiết lên 1 lít. . Khi dịch nhựa tạo thành thể huyền phù. Nước lọc có màu trắng sữa hoặc màu xanh.5). pH của dung dịch huyền phù được điều chỉnh lại pH 6.Kết tinh: tủa được thành dịch huyền huyền phù với 400ml dung dịch cytein 0. Tủa được rửa một lần với 400-500ml dung dịch ammonium sulfate 40% độ bão hòa.7. . Giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để tinh thể tạo thành. Tủa xám tạo thành có thể được loại ra bằng lọc hoặc ly tâm ở 2. bỏ dịch lỏng.5 ở nhiệt độ phòng.Quá trình phân đoạn bằng ammonium sulfate: Cho ammonium sulfate vào dịch enzyme đến 40% độ bão hòa. .

Quá trình sơ chế dịch nhựa tươi từ cây sung thành chế phẩm enzyme ficin gồm các bước sau: . Sau đó cho vào từ từ (đồng thời khuấy đều) dung dịch NaCl bão hòa (10ml/300ml dung dịch protein).Sấy chân không: Sấy chân không ở nhiệt độ khoảng 400C.Dịch nhựa sung sau khi thu được pha theo tỷ lệ 1g dịch nhựa trong 2ml nước cất. sau đó ly tâm thu tủa như ở bước 5. thu dịch nổi bên trên. . . . Enzyme ficin dược thu nhận từ dịch nhựa tươi từ cây sung.000 vòng/phút trong thời gian 10 phút để cao su đông đặc lại và lắng xuống. 2.Nhũng phân đoạn có hoạt tính enzyme được đưa qua lọc gel để loại bỏ các tạp chất trong các phân đoạn enzyme.Tái kết tinh: Hòa tan tinh thể thu được ở bước 5 trong nước cất (tạo dung dịch protein có nồng độ khoảng 1%) ở nhiệt độ phòng. Trình tự các amino acid ở gần trung tâm phản ứng gần giống với papain và bromelin.sau đó duy trì ở 40C qua đêm.Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 3.Dùng phương pháp tủa phân đoạn enzyme bằng ethanol 96% để thu lấy các phân đoạn và xác định hoạt tính enzyme trong các phân đoạn.5. .500rpm trong 4-5 giờ để thu nhận tinh thể. Đem kết tinh dịch lỏng thu được sau siêu lọc. . . Khi 75% thể tích dung dịch NaCl đã cho vào papain đã bắt đầu kết tinh ở nhiệt độ phòng. sau đó tiến hành siêu lọc với màng lọc 4000A0.Khuấy đều dung dịch bằng máy khuấy từ trong 5 phút để enzyme ficin hòa tan hoàn toàn trong nước. thu nhận papain tinh chế. Dịch huyền phù được giữ ở 40C qua đêm.4 Thu nhận enzyme ficin Ficin là một loại protease thực vật trong cấu trúc bậc I có chứa nhóm sulfhydryl (SH). . trước khi tái kết tinh có thể hòa tan tinh thể enzyme trong dung dịch đệm phosphate chứa cystein. Loại bỏ phần lắng ở phía dưới. Để tăng hoạt tính enzyme. Hoạt độ riêng của enzyme có thể tăng nhẹ nếu tiến hành tái kết tinh thêm một lần nữa như trên. sau đó ly tâm lạnh ở 2.

Phương pháp thủ công: Trong phương pháp thủ công chế phẩm enzym thô được nghiền nhỏ( nghiền bằng cối với các thạch anh hoặc với bột thủy tinh sau khi được xử lí sạch hoặc máy nghiền. Khi tiến hành chiết rút enzym từ canh trường ta thu được không chỉ có enzym hòa tan trong nước mà còn thu được rất nhiều sản phẩm thủy phân từ cơ ché của môi trường và cà chất màu của chính nấm mốc tạo ra.1 . Chế phẩm enzyme thu được ở dạng bột sẽ được bảo quản ở nhiệt độ 0– 40C.6. Chiết và tinh chế enzyme từ vi sinh vật Tùy theo yêu cầu của ứng dụng enzym mà ta cần enzym sạch và enzym không sạch(chế phẩm thô.1. Mục đích của quá trình này là làm tăng khả năng thu nhận enzym trong dịch chiết từ tế .Chiết rút enzym từ môi trường nuôi cấy bề mặt: Công đoạn chiết rút enzym từ môi trường nuôi cấy bề mặt rất phức tạp.Thu nhận enzym sạch từ nuôi cấy bề mặt: Việc thu nhận enzym sạch từ nuôi cấy bề mặt bao gồm 2 giai đoạn: 2.6. Chế phẩm enzym thô thường chứa nhiều loại enzym khác nhau.1. Thông thường chế phẩm enzym tinh chứa một loại enzym. 2. trộn với tinh bột với tỷ lệ 1:1 rồi sấy khô ở nhiệt độ 400C. Quá trình thu nhận enzym sạch được trình bày như sau: 2. Các chế phẩm enzym tinh khiết được ứng dụng sản xuất các sản phẩm tinh khiết. sau đó được tinh sạch bằng cách kết tinh. y học và trong một số công nghệ thực phẩm. Các enzym tinh thưòng sử ụng trong công nghiệp nhẹ..Các phân đoạn sau khi qua cột gel sẽ được xác định lại hoạt tính. làm khô. vô trùng.6. Giai đoạn tinh chế dễ hay khó phụ thuộc rất nhiều vào công đoạn này. cũng có một số trường hợp enzym tinh chứa một số enzym cùng loại. chế phẩm tinh). chứa thành phần môi trường chưa được đồng hóa và vi sinh khối tế bào vi sinh vật. mỹ phẩm. Hiện nay có hai phương pháp chiết rút enzym từ canh trường nuôi cấy bề mặt: a. Chế phẩm enzym tinh là sản phẩm được tách khỏi dung dịch môi trường và tách khỏi tế bào vi sinh vật.

Quá trình khuếch tán được thực hiện như sau: Nước (dung môi) được đưa từ bể khuếch tán chứa chế phẩm nấm mốc có hàm lượng enzym và các chất tan khác thấp nhất.bào vi sinh vật. Do đó. khoảng 25 – 300C. b. Dòng chảy của dịch khuếch tán từ bể này sang bể khác sẽ làm giàu hơn lượng khuếch tán vào.6. Dịch khuếch tán cuối cùng sẽ được bơm vào bể thu nhận và từ bể khuếch tán thứ nhất. Dịch chiết thu nhận được từ phương pháp này rất đục do trong đó chứa rất nhiều chầt khác nhau. vấn đề trở nên phức tạp trong điều hành. Dung dịch sau khi khuếch tán chứa nồng độ enzym cao hơn sẽ đi từ bể khuếch tán có chế phẩm nấm mốc mới nạp vào. Trong quá trình khuếch tán. người ta áp dụng một số phương pháp thu nhận enzym từ dịch lọc của phương pháp bề mặt sâu như sau: . Phương pháp cô đặc phải sao cho hoạt tính dung môi không thay đổi. giữ chế phẩm nấm mốc trong nước một thời gian. các enzym được chuyển từ tế bào vào nước do sự chêch lệch nồng độ enzym từ tế bào vào nước. Như vậy. Dịch khuếch tán hay dịch chiết enzym được cô đặc dưới áp suất thấp trong chân không để hàm lượng chất khô ít hơn 50-55%. Lượng dịch sau cô đặc sẽ giảm 4 – 10 lần. Phương pháp chiết rút enzym bằng các thiết bị khuếch tán. để giảm chi phí dung môi hoặc muối trung tính trong quá trình kết tủa ta phải cô đặc dung dịch này. Trong phương pháp chiết rút bằng các thiết bị khuếch tán. Muốn vậy dung dịch phải được cô chân không ở nhiệt độ thấp. Để dễ hiểu ta xem cách vận hành cụ thể như sau: Chế phẩm nấm mốc được đưa vào bể khuếch tán thứ nhất. Hiện nay. Thiết bị dùng cho quá trình này bao gồm nhiều thiết bị khuếch tán được lắp đặt nối tiếp nhau.2 Thu nhận enzym từ phương pháp bề sâu: Dung dịch lên men từ phương pháp nuôi cấy bề sâu. Phương pháp tốt nhất là cho dịch qua cột nhựa trao đổi ion hoặc các chất hoạt động bề mặt. Khi đó bể khuếch tán thứ hai trong lúc này của bể thứ nhất. sau khi tháo bã nấm mốc được nối vào vị trí cuối cùng của dãy khuếch tán. 2. Tuần tự như vậy ta tiến hành với tất cả các bể còn lại. sau khi tách khối vi sinh vật chứa hàm lượng chất khô rất thấp (khoảng 1 – 3 %). đồng thời ta đưa nước vào. nhiệt độ được duy trì là 25-280 C và cho thêm focmalin để tránh nhiễm trùng.

Phưong pháp thu nhận enzym bằng phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ hoặc bằng muối trung tính từ dịch chiết của canh trường nuôi bề mặt. silicagel được tái sinh lại bằng cách nung ở nhiệt độ 160 – 1700C hoặc cũng có thể xử lí bằng HCl 1N và rửa cẩn thận bằng nước cất. Sau đó silicagen được rửa bằng photphat natri ở pH= 8 – 8. người ta phải làm lạnh dung dịch chiết enzym và dung môi để tránh biến tính enzym. Do đó.4 hoặc bằng cacbonat natri 2%. Các loại dung môi này làm giảm hằng số điện môi của môi trường. Kết tủa enzym bằng etanol người ta thực hiện trong các điều kiện kỹ thuật sau: Kết tủa trong điều kiện nhiệt độ từ 3 – 50 C. phản ứng môi trường. . 2. lực ion của dung dịch và tính chất của enzym. Khuấy đều để phân phối etanol trong dung dịch. Sau đó rút enzym ra.7 – 4. trong dung dịch toàn bộ các protein enzym và toàn bộ các protein khác cũng như các tạp chất phân tử khác đều bị kết tủa. Các yếu tố có ảnh hưởng đến hiện tượng này bao gồm nồng độ dung môi. Do sự giảm hằng số điện môi nên các phân tử tương tác với nhau tạo thành một tập hợp và đợt và sẽ lắng xuống.3 Tinh chế enzym Để tinh chế enzym người ta dùng các dung môi hữu cơ để kết tủa. Cách tiến hành được thực hiên như sau: cho dịch enzym chảy qua cột nạp đầy silicagen. Thông thường.6.Phương pháp hấp thụ hoàn toàn bởi silicagen. Phương pháp kết tủa bằng dung môi hữu cơ Dung môi hữu cơ được dùng để kết tủa enzym bao gồm: etanol. Dịch nuôi cấy từ phưong pháp bề sâu phải làm cô đặc lại. Sau đó tách silicagen ra. hoặc dùng một số trung tính kết tủa.9. Khi đó lực hút và lực đẩy tỷ lệ thuận với hằng số điện môi. Thao tác và các yêu cầu kỳ thuật tương tự như phương pháp thu nhận kết tủa enzym từ môi trường nuôi cấy bề mặt. b. axeton. Khối lượng etanol cho vào gấp 3 – 4 lần thể tích dịch chiết enzym. Dung lượng hấp thụ của 1 gam silicagel là 60 – 120 . Bằng cách này ta có thể thu được nước lọc từ canh trường nuôi cấy bề sâu xuống 8 – 10 lần. Được thực hiện ở pH 4. a. Để tăng quá trình hấp phụ.amilaza.a. nhiệt độ. người ta cho thêm 6 – 20% NaCl. izopropanol.

Nhưng trong phương pháp kết tủa bằng muối trung tính ta lại không thể tái thu hồi muối trung tính. sulfat magie.- Sau khi có kết tủa đem lọc hoặc đem ly tâm để thu nhận kết tủa.5 – 2 lần dịch chiết enzym. để giảm giá thành ta có thể thực hiện bằng cách là làm cô đặc dịch chiết enzym trước khi cho kết tủa enzym.Trong đó người ta cho biết loại tốt nhất là sulfat amon vì độ hòa tan của chúng cao.6. ta sẽ dựa trên độ hòa tan khác nhau trong hỗn hợp etanol và các enzym đó để tách. phản ứng kết tủa không phụ thuộc vào nhiệt độ và chúng không làm biến tính các enzym.4 Phương pháp thu nhận một số enzym quan trọng từ vi sinh vật(VSV): . Muối trung tính dùng để kết tủa enzym là: sulfat amon. Nhược điểm lớn nhất của phương pháp kết tủa enzym bằng phương pháp trung tính là lượng muối trung tính dùng quá nhiều. thì ngoài việc thu được kết tủa ta còn có thể tái thu hồi dung môi hữu cơ. Điều lưu ý là axetol là một chất rất dễ gây cháy nổ. Rửa kết tủa bằng rượu đậm đặc 2 – 3 lần để tách bớt lượng nước trong kết tủa và đem sấy chân không. + Các điều kiên khác thực hiện như thực hiện đối với etanol. Kết tủa enzym bằng axetol ta cần lượng axetol nhiều hơn 1. Kết tủa bằng sulfat amon thường thu được các kết tủa enzym có hoạt tính cao hơn các kết tủa enzym từ phương pháp dùng dung môi hữu cơ. thường tới 50 – 60% so với dung dịch chiết enzym. Kểt tủa thu được từ việc sử dụng etanol là một kết tủa dạng bột nhão và dính. do đó việc thực hiện phải rất cẩn thận. 2. Khi cần tách riêng biệt một enzym nào đó ra khỏi hỗn hợp enzym kết tủa trên. Do đó. Phương pháp kết tủa enzym bằng một số muối trung tính. Kết tủa enzym bằng izopropanol ta thực hiện các điều kiện kỹ thuật như sau: + Khối lượng izopropanol gấp 1. nếu trong phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ để kết tủa. Mặt khác.5 – 2 lần khối lượng dịch chiết enzym. Trong tất cả các phương pháp trên người ta cho thêm 0.2% CaCl2 để làm tăng khả năng kết tủa của enzym và làm bền cấu trúc của chúng. sulfat natri. do đo khi tiến hành sấy sễ gặp rất nhiều khó khăn. b.

cireulans. Một số VSV có khả năng tổng hợp mạnh protease: Vi khuẩn: Bac.sphaericus. Str. Khi dùng phương pháp bề sâu.brevis. Bac. do đó với mỗi VSV cần lựa chọn thời gian thích hợp nhất ( thời gian mà luợng enzym trong môi trường là lớn nhất).2 ( đối với vi khuẩn).niegr. Các enzym này có trong tế bào hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy.oryzae. Pen. Mucor.griseus. loại bỏ nhũng phần không hòa tan. Môi trường thường dùng là cám.chrysogenum. Thời gian nuôi cấy thay đổi tùy vào vi sinh vật.6-6.2( đối với nấm sợi) hoặc từ 6. Một số protease ngoại bào đã được sản xuất theo quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong quy mô công nghiệp. Pen. Asp. Str. Sau khi làm lạnh. cấy VSV vào với tỷ lệ 1-10%.Theo .… Nấm mốc: Asp.4. Nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt Là phương pháp kinh tế nên được sử dụng rộng rãi. Nói chung.6.pusillus • Các phương pháp thu nhận enzym protease a. tiến hành kiểm tra hoạt độ enzym của dịch môi trong trường cấy. muốn có kết quả tốt cần xác định cho được lượng oxy cần thiết trong thời gian sinh trưởng mỗi loài VSV. Asp. Bac. đối với đa số nấm sợi mesofil có thể nuôi từ 32-42 giờ. Thu nhận enzym protease từ VSV: • Nguồn thu nhận enzym protease: Nhiều VSV cố khả năng tổng hợp mạnh protease.2. Bac. Sau một thời gian nuôi cấy. Nuôi cấy bằng phương pháp bề sâu Chuẩn bị môi truờng thích hợp ngay trong thùng lên men và khử trùng. b. Thể tích thùng lên men càng lớn càng khó khống chế yếu tố này. kết tủa enzym bằng muối vô cơ hay dung môi hữu cơ. trong nông nghiệp và trong y học.cyaneo fulvum.1. Khi hoạt động đã đạt đến cực đại cần nhanh chóng tách enzym ra khỏi tế bào VSV bằng cách ly tâm hay lọc. có pH từ 5.satoi.subtilispha. Ở Nhật thường dùng các thùng lên men 20-30m3. Bac. Sau đó dùng nước hoặc dung dịch nuôi để chiết rút enzym khỏi môi trường.fradiae. Cho môi trường vào những khay lớn để nuôi cấy.rimous.cerus… Xạ khuẩn: Str.27.

lọc hoặc li tâm. khuấy lắc đều trên máy lắc trong một thời gian xác định. Song chỉ có một số hạt thực vật và một số loài VSV mới là những đối tượng có thể dùng làm nguồn thu các chế phẩm enzym do chúng có khả năng tích lũy một lượng lớn các enzym này trong những điều kiện xác định. trong hạt nảy mầm. Trong trường hợp nuôi cấy theo phương pháp bề sâu. Ở Nhật bản đã tìm đựoc phương hướng thích hợp để làm trong nước chiết và dịch môi trường nuôi cấy. do có ưu thế về nhiều mặt. Những nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về enzym nói chung và về amylase nói riêng được bắt đầu vào những năm 1811-1814. nấm men và vi khuẩn. nấm sợi. • Nguồn enzym amylase từ VSV Trong thiên nhiên enzym có nhiều ở hầu hết ở thực vật. dung dịch muối loãng hoặc nước để chiết rút enzym. y học và nhiều lĩnh vực kinh tế quốc dân khác. động vật và vi sinh vật. để tách enzym từ môi trường nuôi cấy theo VSV theo phương pháp bề mặt.6. Ngày nay. VSV đã trở thành nguồn thu enzym chỉ đạo. dịch tiêu hóa của người và động vật. Cho canh trường sau khi nuôi cấy vào dung dịch đã nói trên theo một tỷ lệ thích hợp. Tiến hành theo phương pháp này cho kết quả rất tốt.các tác giả Nhật nên cấy vào các thùng lên men(chứ không qua giai đoạn nuôi cấy trung gian) sẽ bảo đảm môi trường khỏi bị nhiễm. c.4. Thu nhận enzym amylase từ VSV Hệ enzym amylase là một trong số các hệ enzym đựoc sử dụng rộng rãi trong nhất trong công nghiệp. trước hết cần làm lắng tế bào VSV hoặc ly tâm để tách sinh khối khỏi dung dịch enzym. Trong sản xuất thường dùng máy để chiết rút enzym trong một giờ. Những chủng . thu lấy dung dịch trong. Người ta biết nhiều loại VSV có thể năng tổng hợp các enzym amylase. 2. Theo các tác giản Nhật thì nên lọc chứ không nên ly tâm vì khi ly tâm thường làm giảm đáng kể hoạt động enzym. có thể dùng dung dịch đệm thích hợp. vi khuẩn. Thu nhận enzym protease: Tách enzym: Như trên đã nói. Các enzym amylase có trong nước bọt.2. Quá trình này là một giai đoạn quan trọng nhất và khó khăn nhất trong kỹ thuật sản xuất chế phẩm enzym.

độ ẩm ban đầu. độ tiệt trùng. Trong số những yếu tố có ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp các enzym amylase trong quá trình nuôi VSV. Ngoài các yếu tố hóa học ( thành phần môi trường) ra. có thể dùng Bac. VSV tạo amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm sợi. cá điều kiện lý hóa của quá trình nuôi cũng có một ý nghĩa rất lớn đối với sinh tổng hợp các enzym amylase. cám gạo là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là một cấu tử duy nhất của môi trường để nuôi VSV không cần bổ sung thêm các chất khác nữa. giá nấm men và vi khuẩn. và chọn giống VSV để tuyên truyền lấy nhưng chủng hoạt động mạnh. đồng thời phải tiến hành lựa chọn cơ chất cảm ứng và thành phần môi trường tối thích cũng như tiêu chuẩn hóa các điều kiện nuôi. Ví dụ. cám gạo. dextrin). Cám mì. Chất lượng của cám mì. hydro ở dạng H2O và của các hợp chất hữu cơ. Thu nhận enzym amylase từ VSV Muốn thu được các enzym amylase với hiệu suất cao cần phải tiến hành phân lập. độ thoáng khí. nhiệt độ nuôi và pH môi trường… là những yếu tố cơ bản tối quan trọng. cám gạo có ảnh hưởng lứon tới hoạt lực của các emzym amylase. oxy ở trong thành phần cấu tử cơ bản của môi trường và ở dạng oxy phân tử. a.VSV tạo nhiều amylase thương được phân lập từ nguồn tự nhiên. Như vậy là sự tổng hợp enzym amylase không những chỉ phụ thuộc vào các tính chất di truyền của VSV mà còn phụ thuộc vào việc tuyển chọn các điều kiện nuôi đặc hiệu. Cấu tử chính của môi trường VSV tạo amylase bằng phương pháp bề mặt là cám mì. Người ta đã chứng minh rằng có thể dùng điều kiện nuôi khác nhau ở quy mô công nghiệp.sublilis để thu chủ yếu là phức hệ amylase hạơc chủ yếu là phức hệ protease.Nuôi VSV tạo amylase bằng phương pháp bề mặt Hầu hết VSV tạo amylase đều hấp carbon chủ yếu ở dạng các hợp chất hữu cơ ( tinh bột. bởi vì các loài khác và thậm chí các chủng VSV khác nhau cũng thường sản sinh ra nhiều hệ enzym khác nhau. còn xạ khuẩn thì ít hơn. Có hai phương pháp nuôi VSV là phương pháp bề mặt và phương pháp bề sâu. . • . thì thành phần môi trường tính chất cơ lý của môi trường.

05%. Khi thanh trùng cho vào 0. Các cấu tử này thường là mầm mạch (15-20%) . có thể thanh trùng loãng hơn nóng ở nhiệt độ 120 độ C trong 90 phút. có thể dùng cặn bỏ môi trường rắn( sau khi tách lyenzym) làm cấu tử chính của môi trường. trấu( 2-25%) mùn cưa(5-10%). đối với vi khuẩn 3-4 giờ thời kỳ này phải đốt nóng không khí phòng nuôi và giữ . còn giai đoạn thứ ba giảm đi còn 10-12 thể tích không khí. không hôi mùi mốc. Có thể thay thể cám bằng một số cấu tử rẻ tiền hơn. độ ẩm không quá 15%. Nhiệt độ nuôi: tòan bộ chu kỳ sinh trưởng của nấm mốc trên cám có thể chia làm 3 thời kỳ: + Thời kỳ trương và nảy mầm của đính bào tử (đối với nấm mốc 10-11 giờ đầu tiên). gián đoạn (hoặc không khí tự nhiên) tùy thuộc vào chiều dày của lớp môi trường nuôi. Các cấu tử được đưa vào có thể là chất làm xốp môi trường mà cám không có đủ. Cám và các chất phụ gia chứa nhiều bào tử VSV khác nên cần phải thanh trùng để đảm bảo nuôi phát triển bình thường và canh trường sản xuất không chứa VSV ngoại lai. còn thấp hơn 5550% thì kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của VSV cũng như tạo enzym amylase. Chế độ thông khí có thể liên tiếp. tạp chất độc không quá 0. vào khoảng cách giữa các tầng khay và dây khay thường là giai đoạn sinh truởng thứ nhất phải thông khí vào phòng nuôi khoảng 4-5 lần thể tích không khí trên một thể tích phòng trong một giờ. và giữ độ ẩm này trong suốt quá trình nuôi.2% formalin(40%) và 0.5 atm trong vòng 4-6h. còn giai đoạn thứ hai là 30-60 thể tích không khí trên thể tích phòng nuôi/1 giờ. Độ ẩm tối thích của môi trường: độ ẩm ban đầu 58-60%. nên dùng cám tốt. Cần thanh trùng dưới áp suất hơi 1-1.Yêu câu: hàm lượng tinh bột trong cám >= 20-30%.8% HCl kỹ thuật theo khối lương. Trong quá trình sinh trưởng của mình VSV tiêu thụ 25-35% chất dinh dưỡng của môi trường và thải ra một lượng lớn nhiệt sinh lý và CO2. Vì vậy cần phải thải nhiệt này bằng cách thông gió với không khí vô trùng có độ ẩm tương đối khoảng 100%. cám mới không có dư vị chua hay đắng. Độ ẩm tăng quá 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí.

Để thu glucoamylase ngưòi ta nuôi Asp.pH tối thích ban .cho nhiệt độ phòng nuôi không thấp hơn 23-30 độ C đối với nấm mốc và duy trì nhiệt độ 32-38 độ C cho vi khuẩn.9). thì trong quá trình VSV tiêu thụ anion (NO3) sẽ giải phóng ra các ion kim loại và môi trường bị kiềm hóa pH tăng lên. pH của canh trường phụ thuộc vào tính chất của nguồn nitơ vô cơ. Khi dùng các muối ammonium phosphate làm nguồn nitơ để nuôi chủng mốc này thì pH tối thích của môi trường phải nằm trong vùng 6-7. Độ acid của canh trưởng đựoc xác định bởi thành phần và tính chất của các muối vô cơ thêm vào môi trường cũng như sự tiêu thụ các muối này bởi VSV. Để tăng cường khả năng sinh trưởng của VSV và khả năng tạo enzym có thể thêm nước chiết mầm mạch.8-8. nước chiết mầm mạch và NaNO3 ). các anion được giải phóng ra sẽ acid hóa môi trường. Thời kỳ này cần hạ nhiệt độ phòng giúp sợi nấm mọc đều và đẹp. Độ ẩm tương đối của không khí 96-100% + Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi ( kéo dài trong vòng 4-18 giờ). nước cám nấu nước chiết bột đậu nành. Một trong các điều kiện quan trọng có ảnh hưởng lớn tới sinh tổng hợp các enzym amylase ở các chủng VSV nuôi chìm là nông độ ionhydro trong môi trường và sự biến đổi của nó trong quá trình sinh trưởng của chủng nuôi.2. sự kiềm hóa tự nhiên môi trường khi VSV sử dụng NaNO3 làm nguồn nitơ vô cơ có ảnh hưởng tốt tới sinh tổng hợp -amylase (là 7-8) khác hẳn giá trị pH tối thích đối với hoạt động của enzym (pH 4. Glucoamylase tích lũy cực đại trong canh trường ở ngày thứ 3 tại pH = 8. Vì thế cần phải cho thêm CaCO3 vào để trung hòa môi trường hoặc duy trì tự động giá trị pH thích hợp cho việc tổng hợp các enzym amylase. Trong quá trình nuôi môi trường bị kiềm hóa dần dần và tới cuối ký sinh trưởng canh trưởng có pH 7.oryzae 3-9-15 nhằm thu -amylase là 5.7 (môi trường sapeck cải tiến có 6% tinh bột. pH ban đầu của môi trường để nuôi Asp. Ở nhà máy ngưòi ta thổi không khí vô trùng có nhiệt độ 28-29 độ C và độ ẩm cao vào phòng nuôi.55. Nếu như thêm vào môi trường các muối ammonium.awamori 22 trong môi trường Sapeck có 6% tinh bột.7-4. Trong trường hợp này. Khi điều chỉnh pH tới giá trị ban đầu hoặc chỉ acid hóa một chút thôi (pH=6) thì họat lực -amylase cũng giảm đi nhiều (gần bằng 23%). nước chiết ngô. Khi nguồn nitơ vô cơ được dùng là các muối nitrate. Trước hết. thì khi VSV tiêu thụ ion ammonium.

Nhiệt độ nuôi tối thích đối với nấm sợi thuộc giống Aspergillus là 30-320C ( trong đó có Asp.2. còn nếu pH bằng 8. Khi kết thúc pH canh trường là 7. việc sục khí và khuấy đảo môi trường có tác dụng tốt tới sinh trưởng và tích lũy sinh khối cũng như sinh tổng hợp các enzym của VSV.5 hay thấp hơn 7. Vì nuôi ở nhiệt độ cao tạo ta điều kiện chọn lọc và cho phép giảm bớt yêu cầu khắt khe về độ tiệt trùng.0 thì vi khuẩn hầu như không phát triển.8-9. môi trường thích hợp nhất và tạo nhiều amylase ở nhiệt độ 37 0C.0-7. . Chính vì lẽ đó.6-8. đồng thời khi nuôi đỡ bị nhiễm. Silova. trong lúc đó amylase của chủng được nuôi ở nhiệt độ 55 0C chỉ bị vô hoạt có 10-12% (Campell. Nhiệt độ nuôi có ảnh hưởng rất lớn tới độ bền nhiệt của enzym tạo thành amylase của Bac. Nên pH ban đầu cao hơn 7.1960).đầu cho chủng này sinh trường là 7.coagulans và Bac. Một số vi khuẩn khác laị có nhiệt độ sinh trưởng tối thích cao hơn.9. Enzym với độ bền nhiệt cao có ưu thế lớn trong nhiều lĩnh vực sản xuất.0 (Fenikxova. Ngoài ra nuôi vi khuẩn ưa nhiệt lại rất tiện lợi cho sản xuất công nghiệp.diataticus sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 65-700C song lại tạo nhiều amylase hoạt động ở 500C vì vậy người ta thường cấy giống ở nhiệt độ 700C còn tiến hành cho tích lũy amylase ở 50 0C nuôi chủng loại này bằng môi trường lỏng có nước nấu khoai tây. Trong quá trình sinh trưởng của mình. .0 đều giảm vận tốc sinh tổng hợp enzym. Không tuân thủ đầy đủ chế độ nhiệt độ sẽ dẫn đến làm giảm hoạt lục các enzym amylase. Khi giữ ở 900C trong 1 giờ thì amylase của chủng sinh trưởng ở nhiệt độ 350C bị mất 90-94% hoạt độ ban đầu. VSV sử dụng oxy phân tử cho hoạt động sống nên lượng oxy hòa tan trong môi trường lỏng phải luôn luôn được bổ sung. Vì vậy sinh trưởng của chúng phụ thuộc vào lượng oxy phân tử hòa tan trong dịch nuôi cấy. pepton và phấn.slerothermophilus đuợc nuôi ở 350C và 550C có độ bền nhiệt khác xa nhau. Subtilis nhằm thu hút amylase thích hợp nhất là 6. Nhiệt độ nuôi: Nhiệt độ nuôi cũng là một yếu tố quan trọng đối với sinh truởng của VSV và sự tạo thành các enzym amylase.1955). Các VSV ưa nhiệt(vi khuẩn) sinh tổng hợp nên các amylase bền nhiệt.3-7. pH môi trường để nuôi vi khuẩn Bac.oryzae 3-9-15 và Asp.awarmoni 22). Sục khí và khuấy trộn: Phần lớn VSV tạo amylase là những VSV hiếu khí. Đối với -amylase.

Vận tốc tiêu thụ O2 giảm dần từ lúc bắt đầu pha ổn định.subtilis trong thùng nhân giống (15 giờ ở 370C) có cánh khuấy làm việc liên tục và sục không khí vô trùng vào môi trường với lượng là 40m3/m3 môi trường/giờ. bởi lẽ ở nhiệt độ tương đối cao (50-650C). Còn nuôi vi khuẩn này trong thùng lên men sản xuất (trong 48 giờ ở 370C) có cánh khuấy liên tục và sục không khí vô trùng với lượng 60m3/m3 môi trường/giờ. Nguời ta nuôi Bac.Bằng tác dụng hiệp đồng của cả sục khí lẫn máy khuấy .oryzae (3-9-15) phải là 30m3/m3 môi trường/ giờ đối với thùng nhân giống và 40m3/m3 môi trường/giờ cho thùng sản xuất. Đối với nấm sợi. nấm men và vi khuẩn) có hiệu suất cao thì phải khuấy đảo môi trường bằng sục khí hoặc bằng máy khuấy làm việc liên tục trong suốt quá trình nuôi.oryzae (3-9-15) tương ứng với 180 micromol O2/lít môi trường (nồng độ oxy hòa tan đo bằng máy cực phổ với điện cực kiểu clark). Việc chọn chế độ sục khí thích hợp sẽ có tác dụng khá quyết định không chỉ đối với sự sinh trưởng và phát triển của VSV hiếu khí trong điều kiện nuôi chìm mà còn đối với sự sinh tổng hợp enzym amylase nữa. Nhiều công trình nghiên cứu đã xác nhận rằng muốn nuôi VSV tạo enzym (cả nấm sợi. độ hòa tan của oxy trong môi trưòng giảm xuống.Bằng tác dụng của cả khí sinh ra khi lên men. Với thời gian nuôi ngắn hơn ở các thùng lên men nhân giống (48 giờ) thì lượng không khí cần sục vào môi trường để nuôi Asp. Thời gian nuôi VSV để có lượng amylase cực lớn trong phưong pháp . Nuôi VSV ưa nhiệt đòi hỏi nhiều không khí hơn là nuôi VSV ưa ẩm.Bằng máy các kiểu chuyên dùng . Mức độ sục khí tối ưu để nuôi Asp. Chủng này có vận tốc tiêu thụ oxy hòa tan cực lớn vào cuối pha sinh trưởng. chế độ sục khí thích hợp là 10-12m3 không khí vô trùng (có nhiệt độ cao không quá 400C ) trên 1m3 môi trường trong 1 giờ với thời gian nuôi trong khoảng 68-72 giờ.Việc khuấy đảo môi trường dinh dưỡng trong quá trình nuôi VSV có thể thực hiện bằng nhiều cách khác nhau: . mặc dù nhu cầu của VSV ưa nhiệt độ oxy cho các phản ứng oxy hóa có tăng lên. Điều này cũng dễ hiểu thôi.Sục không khí vô trùng vào thiết bị nuôi .

Khi nuôi bằng phương pháp tuần hoàn liên tục và phương pháp dòng chảy liên tục. khi nuôi nấm Aspergillus bằng phương pháp gián đoạn thì thời gian nuôi tối thích là 68-72 giờ. Những enzym này vì vậy có một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả. Việc xác minh thời gian nuôi tối thích cũng đựoc tiến hành bằng thực nghiệm. Sự phân hủy pectin trong tự nhiên thườn xảy ra khi trái cây chín. còn trong thùng sản xuất tới 48 giờ với lượng giống cho vào là 10% so với thể tích môi trường dinh dưỡng. Chẳng hạn ngưòi ta nuôi Asp. Nấm mốc A. Thời gian nuôi để có lượng amylase cực lớn phải tới 80 giờ. Thu nhận enzym pectinase từ VSV Enzym pectinase là enzym xúc tác sự phân hủy của các polymer pectin.oryzae 22 sản sinh glucoamylase cũng đựơc nuôi trong thùng nhân giống 48 giờ và nuôi trong thùng lên men sản xuất 52 giờ hay hơn nữa.6. Thu nhận chế phẩm pectinase từ canh trường bề mặt Môi trường sử dụng để nuôi cấy VSV để thu nhận pectinase thường là cám gạo.diastalicus ( để thu chế sản phẩm superbiolase dùng trong công nghiệp bia và công nghiệp dệt) trong thùng nhân giống kéo dài 15 giờ.4. sau đó giảm xuống 240C và nuôi trong 48-52h. .oryzae (3-9-15) trong thùng lên men nhân giống 48 giờ. Trong công nghiệp rượu. vào phương pháp nuôi và một số yếu tố liên quan. . Đối với Endomycopsis sp.nuôi chìm phụ thuộc vào đặc tính sinh lý của chúng. phosphoric… Độ ẩm môi trường phải nằm trong khoảng 60%. bã củ cải hoặc thóc mầm…Nguồn dinh dưỡng bổ sung thường là các muối ammonim.awamori thường được nuôi cấy ở 300C trong thời gian 40h. thời gian nuôi sez ngắn hơn rất nhiều (30-40 giờ) Asp.3. 2. Thời gian nuôi Bac. Tuổi của nấm tốt nhất là 24-30 giờ và lượng vật liệu gieo cấy là 10% so với tổng thể tích môi trường dinh dưỡng. hay cám mì. còn nuôi trong thùng lên men sản xuất thì khoảng 48-52 giờ. Lượng giống đem cấy vào thùng lên men là 8-10% so với tổng thể tích môi trưòng dinh dưỡng. Sản phẩm sau khi lên men được sấy khô thành chế phẩm enzym thô và đem tinh chế.

Khi pH dịch về phía acid.2 theo thứ tự.0 tuy sự tạo thành sinh khối khôngbị ảnh hưởng nhưng sự tạo thành enzym pectinase bị kìm hãm.5-1. 2. ly tâm để tách kết tủa khỏi dung dịch.pH kiềm hãm sự tổng hợp sinh khối và sự tích lũy enzym pectinase.awamori có thể dịch về 3. Khi kết tủa bằng rượu ethanol.Để thu được chế phẩm pectinase tinh khiết thì chế phẩm enzym thô phải được trích ly bằng phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ hay muối ammonium sulfate.4 Thu nhận chế phẩm enzym từ canh trường bề sâu a. khi môi trường bị acid hóa mạnh và khi lượng phospho vô cơ được sử dụng hoàn toàn. vật liệu gieo cấy là sợi nấm được ủ sơ bộ trong môi truờng dinh dưỡng cho đến khi bắt đầu nứt nanh bào tử. Trong quá trình nuôi cấy.8%.pH=4 ức chế hoàn toàn sự tích lũy enzym pectinase. Để thu chế phẩm khô. Đối với A. Cô đặc chân không canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5-8% rồi sấy khô trên thiết bị sấy phun.niger và A.5-3. pH của các trường nuôi cấy A. Đối với nấm mốc.2 là thích hợp. thời gian tiếp xúc với rượu càng ngắn càng tốt.pH của môi trường nuôi cấy thường đạt từ 6-7. Chế phẩm thu .8 và 2. Dung môi hữu cơ sử dụng để kết tủa enym pectinase có thể là rượu ethanol (72.79. Tuy nhiên. sấy kết tủa trong thiết bị sấy chân không hay sấy thăng hoa rồi nghiền nhỏ và đem bảo quản.9-3. ngay cả khi pH nằm trong khoảng 4. con nếu bằng muối thì độ tinh khiết đạt khoảng 75%. cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng. Muối ammonium sulfate sử dụng có độ bão hòa 0. awamori.575%) hoặc isopropanol (55-57%).4. niger và A. Lượng sợi nấm đem gieo cấy thường là 2%.32 và 48h tuổi với hàm lượng từ 2-10h. Sau đó. Thời gian ủ sơ bộ thường là 38-42h. Thời gian lưu của chế phẩm enztm trong thiết bị sấy phun phải không quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy phải không quá 400C. hàm lượng các chất hòa tan trong môi trường thường giảm từ 6% xuống còn 1.5-5. chế phẩm enzym thu đựoc có độ tinh khiết khoảng 90%.6. Nhiệt độ kết tủa tối ưu đối với rượu là 2-50C. Phương pháp yếm khí: Sự tích tụ enzum trong môi trường được bắt đầu khi sự phát triển của VSV gần đạt đến pha ổn định. Điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt 165-180% và đi ra đạt 60-70%. Vật liệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24.

với aceton theo tỷ lệ 2:1 và isopropanol theo tỷ lệ 1.75%. Nếu kết tủa bằng 2-2. nước chiết ngô: 0.Quá trình nuôi cấy được tiến hành ở nhiệt độ 350C. FeSO4: dạng viết. Khi độ bão hòa của (NH4)2SO4 bằng 0.8. hoạt độ pectinase trong kết tủa sẽ vào khoảng 88-89% so với họat độ của dịch canh trường ban đầu. Phương pháp yếm khí: Môi trường: Bã củ cải: 2%. CaCO3: 0.1%. nhưng nếu kết tủa bằng (NH4)2SO4 có độ bão hòa 1. pH ban đầu cuả môi trường dinh dưỡnglà 6. sau đó sấy khô. KH2P04:0. Có thể thu chế sản phẩm pectinase tinh khiết bằng cách kết tủa enzym trong dịch lọc canh trường với ethanol theo tỷ lệ 4:1. Sự tích lũy enzym sẽ tối đa tương ứng với pha ổn định của sự sinh trưởng qua 55-60h. cần tách muối ra khỏi enzym bằng phươn pháp thẩm tích (với nước hoặc dung dịch đệm). K2HPO4 : 0.4%. CaCO3: 0.05%. Felsineum cũng có thể được nuôi cấy yếm khí để thu pectinase.25% trọng lượng khô).5%.3%. MgSO4: 0. (NH4)2HPO4: 0.0 thì sẽ kết tủa được đoạn chỉ chiếm 0.5 thì sẽ kết tủa được đoạn có hoạt độ pectinase thấp (đoạn này chiếm 0. .11% nhưng lại có hoạt độ pectinase cao. Cl. (NH4)2HPO4: 0.5%. Clostridium pectinofermentants 15 có khả năng tổng hợp pectinase một cách mạnh mẽ ở pha tăng đồng thời với sự tích lũy sinh khối. Thành phần môi trường gồm có:Lactose:20%. ascorbic acid: 0.được cần phải được đóng gói kín để tránh hút ẩm. Vật liệu gieo cấy ban đầu được chuẩn bị ở dạng canh trường bào tử và được cấy với lượng 4% theo thể tích. dịch nấm men tự phân: 0.5%.5-7. Nếu kết tủa bằng ethanol.3:1 hoặc với muối ammonium sulfate (50-80% trong muối kết). b. Có thể tiến hành thu chế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết tủa enzym với dung môi hữu cơ hoặc với muối ammonium sulfate. Nếu kết tủa bằng dung môi hữu cơ.0. Nếu kết tủa bằng muối ammonium sulfate.5-6.pH của dung dịch đã xử lý là 6.025 %.3%. NaCl: 0.1%.5 thể tích aceton thì họat độ của enzym trong kết tủa đạt 93-95% so với hoạt độ ban đầu. pectin củ cải: 1%.

người ta thường nuôi cấy theo phương pháp bề mặt bằng môi trường xốp (còn gọi là môi trường bán rắn). Actinomycees spp… • . khi độ bão hòa là 0.Khi kết tủa bằng ammonium sulfate có độ bão hòa bằng 0. Aspergillus fumigatus. Cả xạ khuẩn và nấm sợi đều phát triển rất tốt trong môi trường có độ ẩm là 60-65%.6. Chúng thuộc nấm sợi.Tách enzym pectinase bằng alginate liên kết ngang . Phương pháp hiện đại trong chuẩn bị chế phẩm enzym pectinase thưòng theo các bước cơ bản sau đây: .5 Thu nhận enzym cellulase từ VSV  VSV sinh tổng hợp cellulase Trong điều kiện tự nhiên. 2. xạ khuẩn.2 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectinesterase và pectintranseliminase. Aspergillus flavus. Trichoderma reesei.9-1 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectintranseliminase và exopolygalacturonase.Một số loài VSV được nghiên cứu: Altenaria tennuis. có cơ chất . Các loài VSV thay phiên nhau phân hủy cellulase đến sản phẩm cuối cùng là glucose.Tinh sạch bằng FPLC Aliginate liên kết ngang hoạt động bằng cách kết hợp ái lực. người ta chủ yếu nuôi cấy sợi nấm sợi và xạ khuẩn.Khử muối bằng phương pháp lọc gel (Biogel P100) . hay trao đổi cation (CM Bilogel A) . ảnh hưởng tĩnh điện và thay thế pectate liên kết ngang. còn vi khuẩn ít được ứng dụng trong sản xuất.4. Phương pháp thu nhận enzym cellulase VSV có khả năng sin tổng hợp cellulase thuộc ba nhóm: nấm sợi.Tách protein bằng phương pháp trao đổi anion (DEAE Bilogel A). xạ khuẩn và vi khuẩn. cellulase bị phân hủy vởi VSV cả trong điều kiện hiếu khí và yếm khí. Để thu nhận enzym cellulase từ nấm sợi và xạ khuẩn. Số lượng các loài VSV tham gia sinh tổng hợp các enzym cellulase có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú. Penicillium Spp. Trong công nghiệp sản xuất sản xuất enzym cellulase hiện nay. vi khuẩn và trong một số trường hợp còn thấy cả nấm men.

Đặc biệt các chế phẩm cellulase thô được ứng dụng nhiều trong xử lý ô nhiễm môi trường. protein không hoạt động. còn nấm sợi phát triển ở môi trường acid.là cellulase. Thời gian phát triển và sinh tổng hợp enzym cellulase củ xạ khuẩn và nấm sợi cũng khác nhau. Enzym bán tinh khiết còn chứa nước.Cả hai nhóm xạ khuẩn và nấm sợi đều là những VSV hiếu khí nên trong quá trình nuôi thường xuyên phải được cung cấp oxy.2-7. trong kỹ thuật tạo tế bào trần (protoplast). Thành phần môi trường nuôi cấy cạ khuẩn và nấm sợi rất đa dạng.5-5.6. người ta thu được chế phẩm cellulase ở dạng thô. Trong khi đó. Sau khi nuôi cấy trong những điều kiện kỹ thuật tối ưu. Điểm khác biệt lớn nhất trong khi nuôi nấm sợi và xạ khuẩn là xạ khuẩn phát triển mạnh trong môi trường kiềm và môi trường acid yếu. các loài xạ khuẩn thường chịu nhiệt tốt hơn các loài nấm sợi. còn pH môi trường ban đầu cho nấm sợi từ 4. ta sẽ loại được nước. công nghiệp thực phẩm gia súc. vừa phải có cơ chất là cellulase và phải có độ xốp nhất định để không khí có thể lưu thông từ bên ngoài môi trường vào trong khối môi trường.Xạ khuẩn thường có thời gian phát triển và sinh tổng hợp cellulase dài hơn nấm sợi thông thường. Điểm khác cuối cùng là khả năng chịu nhiệt của cả hai nhóm VSV này. Hiện nay. xạ khuẩn phải mất ít nhất là 72 giờ mới tổng hợp cellulase nhiều. Enzym cellulase của xạ khuẩn cũng hoạt động ở nhiệt độ cao hơn enzym cellulase của nấm sợi. lý tách nước. protein không hoạt động và enzym. Khi đó ta thu được chế phẩm enzym tinh khiết. Do đó. enzym cellulase được ứng dụng rất rộng rãi trong công nghiệp dệt. trong đó vừa phải đủ chất dinh dưỡng. sinh khối VSV. công nghiệp giấy. Công việc tiếp theo là áp dụng các phương pháp hóa. người ta thường dùng chế phẩm enzym . thành phần môi trường và enzum. sinh khối VSV sẽ thu được enzym dạng bán tinh khiết.5. khi chế tạo môi trường cần lưu ý tạo pH môi trường ban đầu cho xạ khuẩn từ 6. nấm sợi phát triển từ 36 giờ đến 48 giờ đã cho hoạt tính enzym cellulase rất cao. Chế phẩm này chứa nước. Chế phẩm enzym cellulase tinh khiết được ứng dụng trong kỹ thuật di truyền. Bằng phương pháp hóa ký.

Ứng dụng enzym cellulase phá vỡ tế bào thực vật không làm tổn thương các cơ quan bên trong tế bào. Tuy nhiên. Nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp lipase bao gồm: Trorulopsis spp.4.6. đảm bảo sự nguyên vẹn các nhân tố di truyền. Chế phẩm thô thu nhận được sẽ được xử lý để tách enzym khỏi môi trường nuôi cấy và tiến hành loại các tạp chất. Enzym lipase được ứng dụng nhiều trong sản xuất các chất tẩy rửa. Staphylococcus spp.cellulase tinh khiết để phá vỡ thành tế bào thực vật.6.7 Thu nhận enzym glucose iso merase Enzym glucose iso merase còn gọi là D-glucoseket toisomerase Enzym này được ứng dụng rất nhiều trong công nghệ sản xuất dịch đường glucose. 2. . người ta thường sản xuất lipase chủ yếu bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt. Thu nhận enzym lipase từ VSV • VSV tổng hợp lipase Trong thiên nhiên có nhiều loài VSV có khả năng sinh tổng hợp lipase. phương pháp này đã nhanh chóng thay thế các phương pháp cơ học và hóa học. Do đó. Trong môi trường có bổ sung chất béo như một cơ chất cảm ứng. Muscor spp. Penicillium spp. • VSV tham gia tổng hợp glucose iso merase Hiện nay.6. Candia spp. Rhizopus spp. cuối cùng là làm kết tủa. Achromobacter spp.4. nếu sử dụng số lượng lớn sẽ ảnh hưởng rất lớn đến tính chất môi trường.17. Geotrichumspp. trong sản xuất phomai. các nhà khoa học đã phát hiện rất nhiều VSV có khả năng sinh tổng hợp enzym glucose iso merase. nấm men và vi khuẩn. tinh chế và thu nhận enzym tinh khiết. • Thu nhận enzym lipase Trong công nghiệp. Các loài VSV đó được liệt kê trong bảng 6. Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp lipase bao gồm: Pseudomonas spp. Nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp lipase bao gồm: Asperrgillus spp. Chúng bao gồm cả nấm sợi. hàm lượng chất béo cho vào môi trường với số lượng rất nhỏ (khoảng<1%) vì chất béo thường không hòa tan với nước. 2.

người ta sản xuất enzym glucose isomerase chủ yếu bằng vi khuẩn Bacillus coagulans. Đức. Nhu cầu về glucose/fructose trên thế giới rất lớn. Vi khuẩn này được nuôi bằng phương pháp chìm trong môi trường nuôi cấy thích hợp. . thu dịch chứa enzym ngoại bào và sau đó là áp dụng những phương pháp tinh chế để thu nhận enzym tinh khiết.5.000 tấn glucose/fructose). Trong môi trường nuôi cấy ngưòi ta thường cho muối cobalt và magie. Mỹ. Mỹ. trong đó.Trong đó các chủng thuộc Bacillus và Streptomyces được ứng dụng nhiều trong sản xuất glucose isomerase theo quy mô công nghiệp. nhiều nước còn sản xuất glucose-isomerase từ Actinoplans missouriensis. Nhật và Nam Triều Tiên. Nhật và Nam Triều Tiên. Hãng Novo của Đan Mạch sản xuất enzym glucose iso merase cũng bằng Bacillus coagulans ở các nước châu Âu. VSV này có ưu điểm là chúng có khả năng phát triển ở rất nhiều loại môi trường khác nhau và khả năng sinh tổng hợp glucose-isomerase cũng rất mạnh. Sau 24h nuôi cấy. người ta thương nuôi chúng trong những bình lên men có pH 8.chúng có khả năng sinh tổng hợp enzym trong 24 giờ nuôi cấy. glucose/fructose được sản xuất nhiều nhất ở Mỹ. Ở các nước châu Âu. và một số nước châu Âu. vì thế người ta sản xuất enzym glucose isomerase với số lượng nhiều để áp dụng cho nhu cầu trên. Để thu nhận glucose-isomerase từ loài Streptomyces. Ngoài bacillus coagulans. Đức và Mỹ là những nước sản xuất glucose-fructose lớn nhất (hàng năm Đức sản xuất khoảng 10. người ta tiến hành ly tâm.000-20. Các thiết bị lên men thường được thiết kế và chế tạo có dung tích 22m3. Trong số các chủng thuộc loài Streptomyces. Hai loại muối này kích thích quá trình sinh tổng hợp glucoseisomerase. Nhật. người ta thường nuôi ở nhiệt độ rất cao ( nhiệt độ nuôi trong khoảng 60-70 0C). • Thu nhận enzym glucose iso merase Lượng siro glucose/fructose được sản xuất trên thế giới rất lớn.

4]. … những phế liệu của công nghiệp thịt dùng để tách enzym rất tiện lợi. rennin có khả năng đông tụ sữa cao mà không thuỷ phân sâu sắc casein.21. bò. Tuy vậy. Ngoài ra có 3 protease kiềm quan trọng là: Pacreatin. Từ ngăn thứ tư của dạ dày bê người ta thu chế phẩm rennin để làm đông sữa trong sản xuất phomat. Khác với pepsin. có nhiều ứng dụng và được quan tâm là pepsin và rennin.  Pepsin [E.C. bê. Chymotrypsin [E. để sử dụng rộng rãi trong công nghiệp và trong nền kinh tế quốc dân.21.2. chim.C. Trypsin [ E. Ở heo thì pepsin tập trung chủ yếu ở phần đáy dạ dày. Rennin là chế phẩm enzim có giá trị lớn trong công nghiệp. lipase.. đặc biệt về khả năng đông tụ sữa.3.3. gelatinase.1]  Thành phần cấu tạo Pepsin hoạt động trong dịch vị của động vật có vú. protease động vật ít thuận lợi do sản xuất chúng bị hạn chế và lượng nguyên liệu để thu enzim không lớn lắm.3. ribonuclease và một số enzym khác.6. màng nhày dạ dày.4.1]. tim. protease. 2. Pepsin thô là một hỗn hợp của pepsin. Hai enzym này được thu nhận chủ yếu từ dạ dày động vật (heo.).C. .1 THU NHẬN ENZIM TỪ NGUỒN ĐỘNG VẬT Trong tất cả các nguyên liệu có nguồn gốc động vật thì tuyến tụy.1 Enzim protease Hai protease acid quan trọng trong tuyến tiêu hoá ở người và động vật.4. bò sát và cá. Người ta cũng sản xuất pepsin từ dạ dày động vật. Dịch tụy có chứa amilase.4. Các nguyên liệu này có thể dùng trong nhiều lĩnh vực khác.4.

Pepsin thô (heo) chứa một pepsin chính A. là một protein vững chắc bởi các mối liên kết hydro. Toàn bộ quá trình tạo thành pepsin từ pepsinogen có thể biểu diễn như sau: .C.  Đặc tính Chế phẩm pepsin (dược phẩm) tồn tại ở dạng bột vô định hình. Pepsin chứa đặc biệt nhiều amino acid có tính acid nên pepsin thể hiện tính acid mạnh. pH hoạt động tối ưu của pepsin thay đổi tuỳ theo bản chất và trạng thái của cơ chất thường pH 1. hydrophobic. vị hơi chua. liên kết điện tử và S-S. mùi đặc biệt giống mùi nước thịt. 1940).22).3. nhưng trong vùng pH này hoạt lực của enzim có phần thay đổi giảm đi. Khi tiếp xúc với môi trường acid tự nhiên của bao tử hoặc chính pepsin.  Sự hoạt hoá pepsinogen thành pepsin Pepsin được tiết ra dưới dạng tiền pepsin.1N (theo Herriot. Pepsin bền nhất ở pH 4-5.8 – 2. pepsin phụ B.4. glucose hay saccharose thì có vị ngọt (Dược điển Việt Nam).4. pepsinogen sẽ được hoạt hoá thành pepsin. trắng hay vàng nhạt hay mảnh nhỏ. Số lượng các amino acid có mạch nhánh không kỵ nước phân cực là lớn. pepsin tinh khiết mang điện tích âm ngay cả trong môi trường HCl 0. D và gastricsin (E. tức pesinogen bất hoạt.2. Pepsin thuỷ phân protein trong vùng acid khá rộng pH 1-4. Do đặc điểm về thành phần amino acid. nếu thêm lactose. Từ pH = 5. Điểm đẳng điện của pepsin gần pH = 1. trong hay hơi đặc. C.5 trở lên pepsin không hoạt động.cathepsin và Brucke pepsin. làm cho enzim dễ tan trong rượu etylic nồng độ cao và trong các hỗn hợp chứa nhiều dung môi phân cực. Pepsin là một sợi polypeptide đơn giản có thể cuộn lại làm thành hình cầu.

mà chỉ cắt khoảng 15% nối liên kết peptide của protein tạo pepton có trọng lượng phân tử nhỏ.5–2. . chuyển sang dạng thích hợp để chuẩn bị cho những quá trình tiêu hoá triệt để tiếp theo.  Những yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của pepsin . Pepsin xúc tác sự thuỷ phân giải protein. Đối với mỗi cơ chất thì pH có thể thay đổi. Pepsin A và D tính đặc hiệu xảy ra trong phạm vi rộng hơn pepsin B và C.4 Phức hợp pepsin. Pepsin A.chất ức chế +5peptide Pepsin + chất ức chế pH < 5.Ảnh hưởng của nhiệt độ: Pepsin hoạt động ở nhiệt độ tối ưu khoảng 40 – 50oC. Tính đặc hiệu của pepsin phụ thuộc vào loai pepsin. Pepsin không có khả năng phân cắt triệt để protein thành các amino acid riêng lẻ. Pepsin C hoạt động cơ chất Hb. Nhiệm vụ chủ yếu là phân cắt sơ bộ protein thức ăn. pH thích hợp khoảng 1. Ở 70oC mất khả năng tiêu đạm.4 Pepsin + chất ức chế  Tính đặc hiệu và khả năng thuỷ phân protein của pepsin Pepsin là enzim quan trọng nhất của tuyến dịch vị được tiết vào dạ dày.pepsin Pepsinogen phức hợp pH = 5.diiodtyrosine) còn pepsin B chỉ có hoạt động lên APD.Ảnh hưởng của pH: Pepsin là một protease.phenylalanin –L.4. có ít hay không có amino acid tự do.chất ức chế Chất ức chế pepsin. .  Hoạt động xúc tác của pepsin Pepsin là một protease thuộc nhóm hydrolase có khả năng phân cắt các liên kết peptide của protein. D thuỷ phân lên cả hai cơ chất Hb và APD (acetyl –L.4. tạo thành chủ yếu những pepton. hoạt động ở vùng pH 1.

tận dung triệt để nguồn nguyên liệu protein của dạ dày trong sản xuất. Mặt khác. 1966) hay nhờ sự tự phân trong môi trường acid (theo Covalenco. 1960. .  Các phương pháp thu nhận pepsin Thu nhận dung dịch pepsin Bản chất của quá trình chiết tách pepsin từ màng nhầy dạ dày là sự phối hợp của ba quá trình: phá vỡ tế bào. đều dựa trên nguyên tắc: pepsin được giải phóng từ màng nhầy dạ dày cổ động vật bằng cách chiết trong dung dịch acid loãng (theo Konne và Muraviep. có cloroform để tránh nhiễm khuẩn sau chế hóa bằng etanol để pepsin kết tủa. các acid lactic. Thời gian ngâm 48 – 72 giờ. Muốn pepsin có hoạt tính cao thì phải cách ly từ niêm mạc dạ dày lấy từ động vật mới mổ hoặc có thể bảo quản niêm mạc ở nhiệt độ lạnh 0-240C trong thời gian ngắn. Pt ở nồng độ thấp vẫn gây kết tủa và làm biến tính enzim. Hg. hoạt hóa và chiết tách enzyme. Covalines và cộng sự. Trong đó. H3PO4. Phương pháp 1 (Phương pháp chiết): Dạ dày rửa sạch. Sản xuất pepsin hiện nay có hai phương pháp là phương pháp chiết và tự phân. gây tác động kém. ngâm vào nước có 5% butanol hay glyceryl. HCl là acid gây ra sự thuỷ phân mạnh nhất.Ảnh hưởng của các loại muối và các dung môi hữu cơ: Các chất hữu cơ kiềm hay dung dịch muối kiềm như NaHCO3 làm chậm sự pepton hoá của pepsin. formic. nhiệt độ thường. 1966). Nguyên nhân là do phương pháp tự phân có sự phá vỡ một cách triệt để cấu trúc tế bào.Các dung môi hữu cơ ít phân cực làm giảm hoạt tính của pepsin.Các muối lim loại nặng như Hb. nghiền. ta còn thu đựơc pepton. phương pháp tự phân còn có ưu điểm là cùng với pepsin. tách màng nhầy. . kế đến là HNO3.. .1980). Khi so sánh sự thu nhận pepsin của hai phương pháp cho thấy phương pháp tự phân cho hiệu suất thu enzym cao hơn phương pháp chiết là 5 – 7 lần (theo Teply và cộng sự. . HBr.

Theo nhiều thực nghiệm. Nguyên nhân là do HCl là acid vô cơ quan trọng có trong thành phần dịch vị dạ dày động vật. Các protein khác nhau sẽ có tính hòa tan khác nhau trong dung dịch. Cho hình thành chất kết tủa phosphattricalci từ niêm mạc dạ dày heo (ngâm nước) có mặt H3PO4. Các phương pháp thu pepsin thô từ dịch chiết Phương pháp tủa. Người ta thường dùng các muối trung tính khác nhau như (NH4)2SO4. đồng thời rút ngắn thời gian sấy. H2SO4 với nồng độ thích hợp để chiết xuất và hoạt hóa pepsinogen thành pepsin. các protein riêng biệt sẽ kết tủa theo các trình tự khác nhau. Phương pháp tủa bằng cồn hay dung môi hữu cơ: Với dung dịch pepsin thô được cô dưới áp suất thấp. Phương pháp tủa bằng muối (diêm tích): Các muối trung tính ở nồng độ cao có thể kết tủa thuận nghịch các enzym mà không gây biến tính hay giảm hoạt tính enzym. Thời gian tự phân: 48 giờ ở 40 – 420C. hạn chế sự giảm hoạt tính enzym trong khi sấy. dùng HCl hay H 3PO4.Phương pháp 2 (Phương pháp tự phân): Niêm mạc dạ dày bảo quản ở nhiệt độ lạnh hay vừa tách ra khỏi heo mới mổ. trong cơ thể sống pepsinogen được hoạt hóa thành pepsin nhờ HCl dịch vị. trộn với tá dược như lactose. việc dùng HCl để điều chỉnh pH môi trường sẽ cho hoạt tính cao nhất. Do đó khi tăng dần nồng độ muối. Dung dịch pepsin thô thu được sau khi xử lý bằng ester sẽ thu lại chất cặn có thành phần cấu tạo là pepsin sơ lọc (phương pháp Bruché). Ly tâm lấy tủa. Ngoài ra một số tác giả đã sử dụng nguyên lý hấp thụ enzym trên một chất kết tủa. glucose hay tinh bột là các chất phụ gia có tính chất ổn định enzym. NaCl… ở nồng độ gần bão hòa để làm tủa pepsin. xay nhỏ. Sau đó chất kết tủa được hòa tan bằng HCl và dung dịch thu được mang di thẩm tích (dialyz). ở nhiệt độ ≤ 450C đến khi chỉ còn lại 1/8 so với thể tích ban đầu thì đem tủa với cồn 950C hay aceton (tỷ lệ 1:3) (Có thể tủa bằng cồn cao độ hay các dung môi hữu cơ . thường sấy ở nhiệt độ ≤ 450C hay sấy kèm chân không.

aceton ở nhiệt độ gần 0 – 3 0C). thu nhận chế phẩm pepsin từ dạ dày động vật của Payeda và cộng sự . etylic. sấy tủa ở nhiệt độ ≤ 450C. Phương pháp tủa cần đựơc tiến hành ở nhiệt độ thấp 0 – 50C để đảm bảo hoạt tính của enzym. Sau đó ly tâm.thích hợp như: metylic. Ví dụ: Quy trình tách chiết.

Nguyên liệu Tách màng nhầy Xay nhuyễn. cân HCl 0. khuấy. để tự phân 24 -48 giờ Tự phân Ly tâm Lọc NaCl nồng độ bão hòa 25%.5% (tỷ lệ 1:2). để yên 30 phút Kết tủa Sấy khô Bảo quản Sản phẩm Pepsin thô . khuấy. 40500C.

Sấy khô: sau khi ly tâm thu phần kết tủa. hóa học có thể ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym. kín. izopropanol.Kết tủa: kết tủa bằng NaCl nồng độ bão hòa 25%. khuấy đều.Ly tâm: hỗn hợp dung dịch sau khi kết tủa để yên đem ly tâm 10 . khuấy nhẹ cho đến khi dung dịch bão hòa. rửa thật nhẹ màng nhày bằng nước lạnh chỉ để loại bỏ thức ăn thừa (rửa bằng tay) không làm tổn thất lớp màng nhấy chứa pepsin và tiến hành bóc màng nhầy. đem sấy khô có thổi khí ở nhiệt độ 30 – 400C hoặc sấy chân không hay thiết bị sấy đông khô. polyetylenglycol – PEG 6000. . . Pepsin được kết tủa từ từ nhờ dung dịch NH4OH .Xay nhuyễn: màng nhầy dạ dày sau khi tách cắt nhỏ và xay nhuyễn đồng nhất. Do đó. rồi thêm hỗn hợp photphat gồm: dung dịch CaCl2 10%. dung dịch sau tự phân đựơc lọc cùng dung môi đã làm lạnh và dung môi phải được cho từ từ và khuấy liên tục để tránh sự tăng nhiệt độ cục bộ bên trong hỗn hợp. lạnh. Cơ sở khoa học của phương pháp này là cho enzym hấp phụ chọn lọc lên các chất hấp phụ như: caolin. cồn 85%. . .Nguyên liệu: Dạ dày động vật tươi vừa mới giết mổ. Ví dụ: Phương pháp hấp phụ Pepsin. .15 phút với tốc độ 5000 – 6000 vòng/phút. .Lọc: vớt bỏ hết lớp mỡ phía trên mặt. than… Sau đó. ..1N vào dung dịch pepsin thô cho đến phản ứng kiềm nhẹ. . Cho muối từ từ.Trong quá trình kết tủa bằng dung môi hữu cơ sinh ra một nhiệt lượng lớn. thời gian 24 – 48 giờ. dùng các chất giải hấp phụ đặc biệt để tách enzym ra khỏi chất hấp phụ và thu nhận enzym mong muốn. Bổ sung NH4OH 0. bảo quản lạnh đông trước khi thực hiện (0 – 30C).5% với tỷ lệ (theo khối lượng) 1: 2 và nhiệt độ 40. để yên dịch thủy phân 30 phút. sau đó lọc qua nhiều lớp vải mùn thu dung dịch. Thời gian 5 – 10 phút. dung dịch dinatriphotphat 5.Bảo quản: chế phẩm pepsin thô cần đựơc bảo quản ở điều kiện khô. Có thể dùng các tác nhân tủa như: amon sulphat.Tự phân: màng nhầy sau khi xay bổ sung dung dịch HCl 0. có thể làm mất hoạt tính enzym.500C. Để tránh bị mất hoạt tính ngừơi ta trộn thêm vào chế phẩm enzym các chất độn như tinh bột hòa tan. oxit sắt. Cho PEG dạng rắn cho từ từ vào dung dịch enzym và khuấy liên tục cho tan hết. . maltose dextrin… trong quá trình sấy. tránh tiếp xúc trực tiếp ánh sáng và các tác nhân vật lý. Phương pháp hấp phụ Có thể dùng một số chất hấp phụ đặc hiệu để hấp phụ enzym. .5% với tỷ lệ 1:1.Tác nhân PEG 6000: (tương tự như muối vô cơ). aceton.Tách màng nhầy: rửa sạch bên ngoài trứơc khi lộn ngược dạ dày. nhiệt độ ≤ 50C.

Tiếp theo. pepsin tan trong dung dịch. tạo dung dịch pepsin thô sẽ đậm đặc. lấy tủa xử lý với dung dịch oxalic acid 4%. Dùng NH4OH để điều chỉnh đến pH = 2. áp suất thấp để enzym không bị giảm hoạt tính. có lẫn protein lạ và các protease khác. thêm 5 thể tích hỗn hợp cồn: ete (tỷ lệ 1:1) để tủa pepsin. Phương pháp cô dưới áp suất thấp để được dung dịch pepsin đậm đặc Với phương pháp này người ta tiến hành ở nhiệt độ ≤ 450C. tinh bột. Sau khi pepsin bị tủa bằng alcohol.6. đem lọc và làm khô.  Phương pháp tinh sạch pepsin Phương pháp kết tinh pepsin của Northrop Northrop đã bắt đầu từ dung dịch pepsin tinh sạch của Parke và Davis. Để sự nhả hấp phụ không xảy ra. lọc lấy dung dịch pepsin. để lạnh 40C và cô đặc dưới áp suất thấp.7 – 2. lọc lấy tủa và rửa với nước cất. người ta cần tiếp tục cho NH4OH để giữ môi trường phản ứng cần thiết. Pepsin này hoàn toaøn có thể sử dụng trong điều trị trong y học hay công nghiệp. Sau đó. lấy dung dịch này cho kết tủa bằng dung dịch sulfuric với MgSO4 bán bão hào. Kết tủa thu đựơc rửa với cồn. chất kết tủa được rửa sạch .4 – 2. Các phương pháp chiết tách trên đều cho pháp thu chế phẩm pepsin chưa tinh khiết. sau đó được trộn với tá dược như lactose. tricalciphosphat sẽ chuyển thành calcioxalat không tan. Dịch thủy phân được trộn đều và để yên phần nhẹ hơn sẽ nổi lên trên bề mặt. enzym bị tủa bởi alcohol và đựơc tách ra.và được hấp phụ trên mặt mỏng của tricalciphosphat và cùng với tricalciphosphat lắng xuống. Ví dụ: Pajagopalanetal thực hiện xử lý dạ dày heo bằng cách tách màng nhaøy và trữ ở trạng thái đông. sấy nhẹ tạo dạng bột khô. rồi với ete và sấy khô ở nhiệt độ ≤ 450C.9 bằng HCl và đựơc ủ ở 500C trong vài giờ. rồi đưa đến pH = 2.

Còn những phần tử nhỏ hơn chui vào trong các hạt với mức độ khác nhau tùy theo kích thước của chúng.12H2O trong 1 lít nứơc cất).2: X: dung dịch acid citric 0. cao 35cm và gel sepphadex G-100. cân 1. tinh thể pepsin xuất hiện và phải qua một loạt các quy trình hòa tan trong kiềm và tái kết tủa trong dung dịch acid sẽ điều chế được tinh thể pepsin hoàn toàn tinh khiết và hoạt tính cao. do đó di chuyển ra khỏi cột sephadex nhanh. Ở đây dùng 1 buret có đường kính 1 cm. rồi lại cho kết tủa lần 2 bằng cách gia thêm H2SO4 N/2 pha loãng trong nước 450C.028 trong 72 giờ để gel trương nở hoàn toàn. Dung dịch đệm Mc Ilvaine pH 2.1M (hòa tan 21.8 cm.2g gel ngâm trong 1 lượng thừa dung dịch NaNO3 0. sau một lần làm lạnh nữa. những phân tử nào lớn sẽ không chui vào trong hạt gel đựơc mà chỉ di động ở ngoài gel. Y: dung dịch dianatri hydrophotphat 0. ta có dung dịch đệm pH = 2.2H2O hay 71. phân tử lượng càng nhỏ ra càng chậm. . Hóa chất và dụng cụ: Tùy theo đặc điểm cột và loại gel sephadex dùng trong thí nghiệm mà ta ngâm một lượng gel sephadex thích hợp.008g acid citric trong 1 lít nứơc cất). Pha 98 ml dung dịch X và 2 ml dung dịch Y.2. chiều cao h = 80cm.với dung dịch MgSO4. Nguyên tắc Khi cho một hỗn hợp nhiều chất chảy qua cột chứa gel sephadex đã trương nước. phân tử lượng càng lớn ra khỏi cột càng nhanh.2. Cách pha đệm p.6 g Na2HPO4. hay dùng gel sepphadex G-75.2M (hòa tan 35. Gel sau khi ngâm NaNO 3 đựơc rửa sạch bằng nước cất sau đó nhồi vào cột. Phương pháp lọc qua gel sephadex. Chọn cột có Φ = 1. sau đó hòa tan bằng dung dịch NaOH N/2.H 2. Do đó những kỹ thuật này dùng để tách các chất có phân tử lượng khác nhau.7g Na2HPO4.

kết tủa đựơc hòa tan lại bằng 50 ml dung dịch đệm pH 2. Đưa mẫu vào cột Đem kết tủa 50 ml dung dịch enzym thu đựơc sau quá trình tự phân đã qua lọc bằng 283 ml cồn 85%. để cột gel ổn định trong 3 giờ. Rửa các dụng cụ khác: các ống nghiệm được rửa sạch rồi ngâm vào dung dịch sulfo cromic trong một ngày. Khóa ống mao dẫn lại. Sau đó ly tâm.2 khoảng 24 giờ ( thể tích dung dịch đệm dùng để rửa gấp khoảng 3 lần thể tích cột). rửa sạch lại. tráng bằng aceton. . trên mặt gel luôn có một lớp dung dịch đệm cao khoảng 2 cm để gel không bị khô. đem sấy khô.2 ta thu được dung dịch A. traùng nước cất rồi sấy khô. Tiến hành nhồi cột với G. Sau đó tiếp tục cho gel vào cột cho đến khi đạt độ cao cần thiết. sau đó rửa cột bằng dung dịch đệm p H = 2. Bề mặt dung dịch bên trên của cột phải phẳng.75 đã trương nở hoàn toàn: gel được đưa vào cột cùng với dung dịch đệm qua phễu một cách từ từ và tránh tạo bọt khí và phân lớp. Sau khi đã cho một ít gel lắng thành lớp cao khoảng 5 cm mới mở khóa cho dung dịch đệm chảy ra từ từ.Kỹ thuật nhồi cột Cột sau khi rửa sạch (rửa cột để đổ gel): cột đựơc rửa sạch bằng HNO3 50% rồi rửa lại bằng nước cất nhiều lần.

000 vòng/phút.Phần múi khế của dạ dày (tổng khối lượng trung bình 6.Sephacel là lọc gel được thực hiện trong đệm Na2SO4 0.01M. Có hai loại chính pepsinogen A và C được biết đến ở hoạt động ở động vật trưởng thành. Theo kết quả tính hiệu suất về hoạt tính enzym và hàm lượng protein thu được qua lọc gel.2. là enzym chính trong dạ dày.0 (Thực hiện FPLC trong đệm Tris-HCl 0. Ví dụ: Một số phương pháp và kết quả thu nhận tinh sạch pepsin dê.Hút 3 ml dung dịch A. bắt đầu hứng dung dịch chảy qua cột. Bản chất những tiến trình dùng tinh sạch pepsinogen Suncus (chuột xạ nhà) và được mô tả sau đây: . dung dịch đồng nhất đựoc ly tâm ở 15.1g) được đồng hóa với 20 ml đệm Na2SO4 0.0. Sau khi cho mẫu vào cột hết thì tiếp tục cho dung dịch đệm chảy qua cột. các phân đoạn thu được. Hoạt động thủy phân Hb .Sephacel (1. đem ly tâm bỏ cặn. Vẽ đồ thi biểu diễn mối quan hệ giữa từng phân đoạn và giá trị OD tương ứng. thêm vào khoảng 2 ml dung dịch đệm pH 2.01M. pH 7. Ngưng khóa dòng dung dịch đệm chảy qua cột. Tất cả những tiến trình trên đựơc thực hiện ở 0-40C.0). Sắc ký trên DEAE. mỗi phân ñoạn ta thu khoảng 4 ml. khi lớp dung dịch đệm vừa cạn đến mặt gel thì cho mẫu vào cột. lượng mẫu cho vào cột là 5 ml (từ 1 – 5% thể tích cột. Sau đó xác định hoạt tính pepsin của các ống tương ứng với peak chính. Số phân đoạn là n ống (ví dụ khoảng 30 ống).5 x 30cm). Dạ dày dê đựơc cắt nhỏ để tiến hành tinh sạch. Protein đã hấp phụ được giải phóng theo thiều gradient nồng độ của NaCl từ 0.5M. Phần bên trên đem tiến hành qua cột DEAE. ghi nhận các peak chính được tạo thành. p H 7. đem đo mật độ quang OD ở bước sóng 280nm.01M. Tinh sạch pepsinogen: pepsinogen là dạng zymogen của pepsin. Thu mẫu qua cột Sau khi mẫu đã vào hết trong cột. ngoại trừ FPLC thực hiện ở nhiệtt độ phòng.).

Protein của mỗi peak sau khi qua lọc gel tren cột sephadex G-100 (1.4 3.Mono Q FPLC Pepsinogen A-1 Pepsinogen A-2 Pepsinogen A-3 Pepsinogen C-1 Protein (mg) 321 Hoạt tính (đơn vị) 64 Hoạt tính riêng (đơn vị/ mg Protein) 1.7 17 23 22 0.1 Hiệu suất 100 9.1 Phương pháp tinh sạch các pepsinogen Bước 1. Hỗn hợp pepsinogen A và C được phân tách hoàn toàn chia ra từng loại isozymogen.5 x 100cm). Dung dịch protein được thực hiện FPLC trên một cột mono Q.6 4.9 4. III chứa pepsinogen A.8 3.82 1.được phát hiện tạo thành ba peak.4 8.2 1.4 13 14 15 10 8.0 11 15 14 0.0 mol/phút.Sephadex G-100 Pepsinogen A-1 PepsinogenA-2 + A-3 Pepsinogen C-1 +C-2 4.9 8.2 8.2 20. Bảng 2.5 0.8 0. HR 5/5 để tinh sạch lần cuối. Peak I chứa loại pepsinogen C và peak II.8 9.Phần thô phía trên đồng nhất 2.21 0.1 11 4.0.5M hơn 30 phút ở mức chảy thấp 1.1 2.43 0.23 5.5 3.DEAE-Sephacel Pepsinogen A-1 Pepsinogen A-2 +A-3 PepsinogenC-1 + C-2 3.3 1.4 13 17 7. Protein được giải phóng theo chiều gradient nồng độ của muối NaCl từ 0.8 .32 0.8 6.

 Thành phần cấu tạo. Mẫu được phân tích bằng máy phân tích amino acid.2 µg) được ủ với 1 đơn vị tối thiểu của glycopeptidase F dựa theo công thức sản xuất. Pepsinogen C-2 suncus được sử dụng như một kiểm chứng dương tính quá trình glycozyl hóa pepsinogen.Xác định nồng độ protein: nồng độ của protein trong dung dịch các enzym ở mỗi bước tinh sạch được xác định bởi phương pháp Lowry và cộng sự và đo ở bước sóng 280nm với serum albumin heo như một tiêu chuẩn.C.4.TAGTM Worj Station (Millipore Corp.13 1.4.Phân tích amino acid: mẫu để phân tích amino acid (10µg protein) bị thủy phân bằng HCl bay hơi ở 1500C/1giờ ở hệ thống Water PICCO. MA).3 . Renin chứa nhiều amino acid acid tính hơn amino acid kiềm tính.Điện di các protein: pepsinogen đã tinh sạch được thực hiện để không biến tính dựa theo phương pháp PAGE (polyacrtlamyl gel electrophoresis) của Ornstein và Davis. và SDS-PAGE theo Weber và osborn.  Đặc tính và khả năng thuỷ phân của rennin . đựơc tìm thấy ở dịch tiêu háo của ngăn thứ tư dạ dày bê. Số lượng pepsinogen đã tinh sạch được xác định bằng cách tính hệ số tiêu hủy phân tử từ thành phần amino acid và khối lượng phân tử. .5 12 2. Protein được nhuộm bằng Coomassie briliiant blue. việc làm giảm khối lượng của pepsinogen được phân tích bằng phương pháp SDS-PAGE. .3] Rennin là enzim đông tụ sữa.Pepsinogen C-2 0.Deglycozyl hóa: mỗi pepsinogen (khoảng 0. nhưng tỷ lệ thấp hơn pepsin.  Rennin [E. Milford.3. .

nhưng ở pH < 3 thì quá trình này xảy ra rất mạnh.Rennin tinh khiết có những đặc tính của một globulin. Tách màng nhầy  Quá trình thu nhận dịch rennin Xay nhuyễn. 0. Ở pH 3.  Các yếu tố ảnh hưởng pH tối ưu của rennin pH = 3. và không làm ảnh hưởng đến liên kết ester và amine. Rennin đặc biệt tác động mạnh lên các liên kết tạo bởi tyrosine và phenylalamine. Điểm đẳng điện của rennin pI = 4. Rennin là enzim thuỷ phân liên kết peptide trong protein. Chất kìm hãm có tác dụng hiệu quả nhất lên rennin là dung dịch H2S 0. Rennin tác động lên cơ chất casein của sữa bò và những loại sữa khác.  Sự hoạt hoá prorennin Trong môi trường acid ở pH = 5 sự hoạt hoá prorennin thành rennin xảy ra không đáng kể. chỉnh pH 4 Tự phân NaCl nồng độ bão hòa hoặc HCl Kết tủa Lọc Ly tâm . Đặc tính thuỷ phân của rennin phụ thuộc rất nhiều vào pH.5. những cation hoá trị +1 làm giảm hoạt tính của nó. Đặc điểm của rennin là tác động ở môi trường acid vừa Nguyên liệu phải và cần có sự hiện diện Ca2+.0001M và MgCl2.7. cân HCl 0.2% hoặc nước muối 10% .7 các ion làm tăng hoạt độ rennin.7% acid boric trên tổng V.

Lấy phần múi khế của bao tử và lộn ngược một cách nhẹ tay để bỏ hết thức ăn dư. Natribenzoat: chất bảo quản. máy nghiền đồng hoá. máy đo pH. máy ly tâm. . . khô không lẫn tạp chất. sau đó rửa bằng dung dịch muối NaCl 15%. máy quang phổ kế.Thiết bị sử dụng: máy điều nhiệt. đặc biệt là kim loại nặng vì gây tủa và bất hoạt enzym. tách bỏ phần mỡ.Nguyên liệu: ngăn thứ tư dạ dày bê non dưới 5 tháng tuổi.Sấy khô Bảo quản Sản phẩm rennin thô .Hoá chất: Muối NaCl. HCl sử dụng để thu tủa enzim phải tinh khiết. rửa nhẹ bằng nước lạnh. .

Cho 0. Dịch rennin được kết tủa bằng cách acid hoá dung dịch hoặc bão với NaCl. + Phương pháp thẩm tích bằng túi colodion. .Sephadex. nhiệt độ 30 400C.Tinh sạch rennin: Rennin được chiết và làm sạch bằng sắc ký DEAE. + Màng bán thấm dializ dùng để tách muối và chỉ cho chất có phân tử lượng nhỏ thẩm tích qua túi mà giữ lại những chất có phân tử lượng lớn. + Cách 2: Dạ dày xay nhuyễn. sấy khô rồi để vào bình hút ẩm.  Pacreatin Pancreatin có ở trong tụy của động vật máu nóng và thường trích pancreatin tuỵ tạng của heo. Sau đó dùng HCl N chỉnh pH = 4.000 vòng/ phút.Phương pháp thu nhận: có 2 cách + Cách 1: Dạ dày xay nhuyễn. Gelatin thường xuyên được thêm vào để giúp kết tủa vá tách renin ra khỏi dung dịch bằng sự ly tâm 45 phút ở 5. Cân trọng lượng túi có chứa enzym. Cạo lấy tủa để lên đĩa petri. + Để tủ lạnh 20 phút. cho túi vào becher đựng nước cất và cho thẩm tích trong môi trường nứơc lạnh 0 – 40C. Giữ ở 35 – 400C cả 2 mẫu qua 30 giờ trong tủ ấm. bổ sung 0. nước muối 10%. HCl 0. Lấy ra đem lọc qua vải màn và vải nhiều lớp được dịch trích rennin thô (a) có chứa rennin.Thu rennin dạng bột + Tiến hành tủa enzim theo phương pháp diêm tích với muối trung tính bằng cách cho từ từ vào dung dịch (A) một lượng NaCl kkhoảng 22 – 23% cho đến khi bão hoà NaCl..Tái chế: tách enzim từ nước sữa (dung dịch còn lại sau khi tách phần ñông tụ) và tái sử dụng bằng phương pháp sắc ký. + Lấy ra ly tâm lọc. chỉnh HCl pH = 4  tỷ lệ 1:3 theo V.2%. . Cân trọng lượng túi sau khi sấy khô.7% acid boric trên tổng V  tỷ lệ 1:3 theo V. + Hiệu số trọng lượng túi ban đầu và sau khi thẩm tích là lượng NaCl: m1 – m2 = m m1: Trọng lượng túi + mẫu thí nghiệm trước thẩm tích (g) m2: Trọng lượng túi + mẫu thí nghiệm sau thẩm tích (g) m: Trọng lượng muối NaCl đã thẩm tích qua màng (g) . Khuấy và thay đổi nước lạnh thường xuyên ( hai ngày đêm) làm khô nhanh túi bằng cách sấy quạt gió. + Cân chính xác một lượng enzim bột vào túi colodion (cellophane). .7% acid boric trên tổng V (tác dụng bảo quản).

để lắng 15 phút ở nhiệt độ lạnh Sơ đồ thu nhận pacreatin bằng phương pháp tách chiết với aceton Tủa thu lấy enzym Lọc lấy  Thu nhận pancreatin dung dịch bằng rây Ly tâm lấy tủa (lần 1) Rửa tủa bằng aceton Ly tâm lấy tủa (lần 2) Sấy tủa nhẹ ở 30. 200C. xay nhỏ đem cân chuyển dầu. tươi ở nhiệt độ đông đá  Tính chất Pancreatin Pancreatin có hoạt tính mạnh nhất trong môi trường kiềm và bị bất hoạt trong môi trường acid mạnh và nó hoạt động mạnh nhất từ 2 liên sau khi ăn để thực hiện quá trình tiêu Tách bỏ mỡ và mô -3 giờ Na2CO3 1. chất béo thành dạng nhũ tương để dễ tiêu hoá. đường. Pancreatin có thể pepton hoá nhiều loại thức ăn như sữa. khuấy 3 giờ Aceton lạnh (1:4) khuấy 10 phút. cháo… và kết.350C Nghiền nhỏ Sản phẩm Pancreatin thô .2% hoá ở ruột non. (tỷ lệ 1:2). Thành phần Pancreatin là hệ enzym thuỷ phân xúc tác các phaûn ứng chuyển hoá đạm. chất béo và một số chất khác ở Tụy heo bảo quản trong ruột. thịt.

pH = 3.25N (2:1).2) Ly tâm lấy tủa Sơ đồ thu nhận pacreatin kết tủa bằng muối (NH4)2SO4 Sấy tủa nhẹ ở 400C Nghiền nhỏ Lọc lấy dung dịch Sản phẩm Pancreatin thô . để tự phân 6-8h H2SO4 0.5-4. 1h Lọc lấy dung dịch (NH4)2SO4 60 – 70% (1.Tụy heo bảo quản tươi Tách màng nhầy Pha với nứơc cất (1:1) tự phân ở 200C.

700C.Thu nhận pancreatin thô bằng phương pháp sấy: lấy tuỵ tươi đã được bảo quản. . Sau một thời gian sấy thì đem xay nhuyễn và được chế phẩm pacreatin thô. 600C. sau đó đem sấy ở những nhiệt độ 500C. cân trong lượng và trộn với tinh bột một lượng bằng 10% so với troïng lượng tuỵ tươi.

Sự hoạt hoá trypsinogen: Trong tuyến tuỵ. Sau đó được hoạt hoá dưới tác động của enzim đường ruột enterokinase. Hoạt động và tính đặc hiệu: Trypsin tác dụng lên hầu hết các cơ chất là protein. điểm đẳng điện pI = 5.C. Nhiệt độ thích hợp là nhiệt độ cơ thể.4.C. đầu tiên trypsin được tiết ra ở dạng không hoạt động là trypsinogen.3. Chymotrypsin là một protease hoạt động trong điều kiện môi trường pH kiềm. Trypsin không làm đông tụ sữa như pepsin. pH tối ưu của trypsin là pH = 8.4.4.21.4] Trypsin có trong dịch tuỵ người và động vật.3. Trong cơ thể sinh vật.9. Ở trong máu cũng có một ít trypsin hoạt động. Vai trò của trypsin là tiếp tục thuỷ phân các protein thức ăn còn lại sau khi đã bị thuỷ phân một phần ở dạ dày. Là protease quan trọng sau trypsin. đối với collagen hay albumin của trứng thì cần xử lý nhiệt sơ bộ thì trypsin mới có tác dụng.21. hoạt động ở p H 7 . tác dụng trên hemoglobin. chymotrypsin. Trong ruột.1] Chymotrypsin là một protease được tiết ra từ tuyến tuỵ. Trypsin [ E. . sau đó chymotrypsinogen được chuyển sang dạng hoạt động là Chymotrypsin nhờ tác dụng của trypsin. chymotrypsin thuỷ phân protein và các sản phẩm đã được tiêu hoá một phần bởi pepsin để tạo ra các peptide ngắn và các amino acid tự do. Hoạt tính của chymotrypsin tương đối hơi yếu hơn trypsin nhưng nó lại có khả năng thủy phân protein sâu sắc hơn.8 và tối ưu là pH = 8 . Chymotrypsin tiết ra dưói dạng không hoạt động là chymotrypsinogen. rennin. Chymotrypsin được thu nhận ở dạng tinh thể. trypsin hoạt động trong môi trường kiềm ở ruột nên gọi là protease kiềm tính. albumin biến tính của huyết tương.  Chymotrypsin [E.

001N và 3ml dung dịch cơ chất vào trong một cuvette 1cm.2 ở bước sóng 273nm.1ml dung dịch NaH2PO4.0. Điều chỉnh pH bằng cách nhỏ từng giọt (nếu cần thiết) dung dịch NaH2PO4 đến khi đạt pH 7. pH 7.0 đến 100ml.50C và nhiệt độ trong ngăn để mẫu là 25± 0. Hòa chung 38. Phương pháp thu nhận tách chymotrypsin ra khỏi trypsin  Chuẩn bị Đệm phosphate 0. Đọc độ hấp thu sau khoảng 30 giây không kém hơn 5mm kể từ khi cho cơ chất vào dung dịch enzym. Hòa tan 4.067M.  Cách thực hiện Độ hấp thu được đo bằng quang phổ kế trong điều kiện nhiệt độ môi trường xung quanh không được thay đổi quá 0.9ml dung dịch K2HPO4 với 61.73g NaH2PO4 khan vào trong nước thành dung dịch 500ml. Hòa tan 4. Bắt đầu tính thời gian từ khi bắt đầu thêm dung dịch cơ chất vào dung dịch enzym.0. pH 7. Các giá trị . Hút 200µl dung dịch trypsin tinh khiết vào một cuvette khác.7mg N-acetyl-D-tyrosin ethyl ester (cơ chất thích hợp dùng để xác định chymotrypsin) vào khoảng 50ml dung dịch đệm phosphate 0.067M. Đặt cuvette này vào quang phổ kế và điều chỉnh thiết bị để có được độ hấp thu 0. Hút 200µl dung dịch acid HCl 0. Giữ lạnh khi pha loãng với đệm pH 7. Dung dịch cơ chất: Hòa tan 23. Lập lại các bước trên ít nhất một lần. Dung dịch trypsin tinh khiết: hòa tan một lượng chính xác trypsin tinh thể vào hydrochloric acid 0.001N để thu được một dung dịch chứa 650 đơn vị USP trypsin trong mỗi ml.10C.0.54g K2HPO4 trong nước thành dung dịch 500ml. thêm 3ml dung dịch cơ chất và đặt cuvette vào quang phổ kế.

Xác định sự thay đổi độ hấp thu trung bình trong mỗi phút. .của độ hấp thu tuyệt đối ít quan trọng hơn sự ổn định trong ít nhất 3 phút thì phải lập lại tiến trình trên và nếu cần thiết thì thực hiện với một nồng độ thấp hơn. theo dõi sự thay đổi độ hấp thu trong lần thực hiện đầu tiên. Cách tính số đơn vị USP chymotrypsin mỗi mg trysin tinh khiết theo công thức: (A2 – A1) x (0. Lập lại quá trìn trên lần thứ hai với cùng nồng độ pha loãng. chỉ sử dụng các giá trị trong vòng 3 phút.0075 TW) Với A2: Độ hấp thu lần đầu A1: Độ hấp thu lần cuối T : Thời gian giữa lần đầu đọc và cuối (phút) W : Trọng lượng (mg) của trypsin tinh thể trong thể tích dung dịch được dùng xác định độ hấp thu.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful