Phần I : Cơ sở lý thuyết

HPLC là chữ vi ết tắt của 04 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương ph áp sắc
ký lỏng hiệu năng cao ( Hi gh Performa nce Liquid Chro matog raphy)
,trước kia gọi là phươ ng pháp sắc ký lỏng cao áp
(Hi gh Pressure Liquid Chro mat ography)

Phương ph áp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ

phương pháp sắc ký cột cổ điển . Hiện nay phươ ng pháp HPLC ngày càng ph át triển và

hiện đại hoá cao nhờ sự ph át triển nh anh chóng của ng ành chế tạo máy ph ân tích

.Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều ng hành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho

ng hành kiểm nghiệm Th uốc . Và nó hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc

đa thành
 Phần I : Cơ sở lý thu yết

1 - Khái niệm : Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phươ ng pháp chia tách trong đó pha
động là châït lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã đượ c phân chia dướ i
dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn
,hay một chất mang đã đư ợc biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức
hữu cơ .Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ,phân bố ,trao đổi Ion hay
phân loại theo kích cỡ ( Rây ph ân tử ) .
2- Ng uyên tắc của quá trình sắc ký tro ng cột : Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng
quyết định bản chất của quá trình sắc ký và lọai sắc ký .
Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có Sắc ký hấp phụ pha thuận hoặc pha
đả o .
Nếu pha tĩnh là chất trao đổi Ion thì ta có Sắc ký trao đổi ion .
Nếu pha tĩnh là chất Lỏng thì ta có Sắc ký phân bố
 Phần I : Cơ sở lý thuyết

Nếu pha tĩnh là Gel thì ta có Sắc ký Gel hay Rây phân tử .
Cù ng với pha tĩnh để rửa rải chất phân tích ra khỏi cột
,chúng ta cần có một pha độüng .
Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A,B,C
.. Vào cột phân tích ,kết quả các chất A,B,C.. Sẽ đư ợc tách ra khỏi nhau sau khi đi
qua cột
.Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tươ ng tác .
Cháút phán têch A
+B+C
F1 F2

F3
Pha ténh Pha âäüng
 Phần I : Cơ sở lý thu yết

Tổng của 03 tương tác này sẽ quy ết đị nh

ch ất nào đượ c rửa rải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất
( F1) .và ngược lại .
Đối với mỗi chấ t ,sự lưu giữ đượ c qui định bởi
03 lực F1,F2,F3 .Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định .còn F3 là yếu
tố ảnh hưởng không lớn .
Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột
.F2 là lực kéo của pha động đối với ch ất phân tích ra khỏi cột .
Như vậy với các chất khác nh au thì F1 và F2 là khác nhau ,Kết quả là các
ch ất khác nhau sẽ
di chuyển trong cột với tốc độ khác nh au và tách
 Phần I : Cơ sở lý thuyết :
Phần minh
hoạ quá trình tách các chất A

và B trong cột tách sắc ký

Pha

độ ng

Thời gian A B
 Phần I : Cơ sở lý

thu yết
3 - Phân loại sắc ký :
Theo cơ chế tách sắc ký ngườ i ta phân loaüi như sau :
3.1 Sắc ký hấp phụ :
Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh ,yếu khác nhau của pha tĩnh đối
với các chất tan và sự rửa giải
( ph ản hấp phụ ) của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột
.Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất độ ng học của
chất hấp phụ . Trong trường loại này có 02 loại hấp phụ :
+ Sắc ký hấp phụ pha thuận ( NP - HPLC) : Pha tĩnh phân cực
,pha động không phân cực .
+ Sắc ký hấp phụ pha đả o (RP - HPLC) : Pha tĩnh không phân
cực ,pha động ph ân cực .
Loại sắc ký này đư ợc áp dụng rất thành công để tách các hỗn hợp các chất
có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực,ph ân cực yếu hay
trung bình như các Vitamin,thu ốc hạ nh iệt giảm đau ....
Hiện nay chúng ta đang sử dụng chỉ có loại sắc ký này
 Phần I : Cơ sở lý thuyết
Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha đảo ( RP )

Trong dược điển USP khi chúng ta tra cứu cột có giá trị tương ứng như sau :

L1 : RP 18 Kích thước hạt tươ ng ứng từ 5 -

m
10

L7 : RP 8 Kích thước hạt tươ ng ứng từ 5 -

m
10

L3 : Si 60 Kích thước hạt tươ ng ứng từ 5 -

10 m
Và còn một số loại cột khác như cột Diol , Cột
NH 2,CN . . vv
 Phần I : Cơ sở lý

thu yết
4 - Các đại lượn g đặc trưng của sắc ký đồ

Kết quả của quá trinh tách các ch ất được

Detec tor phát hiện ghi thành sắc ký đồ như
hình trên
 Phần I : Cơ sở lý

thu y ế t
T o : Thời gian lưu chết
tr2
: Thời gian lưu thực
t’r1

ch ất A
tr1
: Thời gian lưu thực
t’r2
 2
ch ất B

tr1 : Thời gian

lưu ch ất A

t’r1 tr2 : Thời gian lưu ch ất B

to t’r
 Phần I : Cơ sở lý

thu yết
Từ các thông số của các peak trên đây ,nhiều đại
lượ ng đặc trưng về lý thu yết đượ c đư a ra để dánh giá một quá trình sắc ký .Dướ i
đây là một số đại lượng thường dùng trong thực tế và cách thay đổ i các đại
lượ ng này có lơiü cho quá trình ph ân tích sắc ký.
4.1 Thờ i gian lưu thực t’r : Rete nti on ti me
Thờ i gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫ u vào cột cho
đến khi chất đó ra kh ỏi cột đạt giá trị cực đại.
Thời gian lưu của mỗ i chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian
lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọ n .Vì vậ y thời
gian lưu là đại lượng để phát hiện định tí nh các chất.
Thời gian lưu phụ thuộ c vào các yếu tố :
+ Bản ch ất sắc ký của pha tĩ nh .
+ Bản ch ất ,thành phần,tốc độ của pha động
+ Cấ u tạo và bả n chất phân tử của chất tan
+ Trong mộ t số trườ ng hợ p thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha
độn g .
 Phần I : Cơ sở lý
thuyết
Trong một ph ép phân tích nếu tr nhỏ quá thì sự tách kém
,còn nếu tr quá lớn thì peak bị doãng và độ lặp lại của Peak rất kém ,thời
gian phân tích rất dài đồ ng thời kéo theo nh iều vấn đề khác như hao tốn dung
môi ,hoá chất, độ chính xác của ph ép phân tích kém.
Để thay đổi thời gi an lưu chú ng ta dựa vào các yếu tố trên đã trình bày .
4.2 Hệ số dun g lượn g K’ : Capaci ty Fact or
Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai
pha cộng với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng
chất tan trong pha độ ng ở trong thời điểm cân bằng .
K’ = ( tR - t0)/ t0

Nếu K’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém . Nếu K’ lớn thì Peak bị doã ng .
Trong thực tế K’ từ 1- 5 là tối ưu .
 Phần I : Cơ sở lý

thu yết

4.3 - Độ chọn lọc :

Độ chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ
thống sắc ký ,khi 02 chất A ,B có K’A và K’B khác nh au thì
mới có khả năng tách .,mức độ tách
biểu thị ở Độ chọn lọc .

= K’B / K’A Với điều kiện K’B > K’A

với càng khác 1 thì khả năng tách càng rõ ràng

= 1.02 = 1.16 = 1.20

 Phần I : Cơ sở lý thu yết

4.2 Số đĩa lý thu yết N:

Số đĩa lý thu yết là đạ i lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký
nhất định .Mỗi đĩa lý thuyết trong cột săc ký gi ống nh ư là một lớp pha tĩnh
có chiều cao là H ,Tất nhi ên lớp này có tính chất động tức là một khu vực
của hệ phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động học đượ c thiết lập
giữa nồìng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động .
Bề dày H phụ thu ộc vào nh iều yếu tố :
+ Đư ờng kính và độ hấp phụ của hạt pha tĩnh
+ Tốc độ và độ nhớt ( độ phân cực )của pha
động

+ Hệ số khuyếch tán của các chất trong cột .

Vì vậy với một điều kiên sắc ký xác đị nh thì chiều cao
H cũng hằng định đối với một chất phân tích và số đĩ a lý
Phần I : Cơ sở lý thu yết
4.2 Số đĩa lý th uyết N:
Số đĩ a lý thu yết N được tính theo công thức sau :

N = 5,54 ( tR / W0, 5)2

Trong đó : tR : Thời gian lưu của chất phân tích .

W0,5 : Độ rộng tại điểm 1/2 của Peak . Tr ong thực tế N
nằm trong khoảng 2500 đến 5500
là vừa đủ .
 Phần I : Cơ sở lý thu yết

4.3 Độ phân giải R : ( Resoluti on )

Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một
điều kiện sắc ký đã cho. Độ ph ân giải của 02
Peak cạnh nhau phải đượ c tính theo công thức sa u
:
R= 2( t’RB - t’RA)/ (wa + wB)

Trong thực tế nếu các Peak cân đối ( Ga ss) thì độ phân giải tối thi ểu để 02
Peak tách là R =1.0 .Trong ph ép định lượng R=1,5 là phù hợp
+ Nếu R nhỏ thì các Peak chưa tách hẳn ,việc tính toán diện tích Peak sẽ không
chính xác ,lúc này phải tìm cách tăng R theo 03 cá ch sau:
* Làm thay đổi K’ bằng cách thay đổi lực rửa giải của pha động ( Thay đổi
độ phân cực nếu là RP - HPLC ,thay đôíi
cườ ng độ ion nếu là IE - HPLC ... .)
* Làm tăng số đĩ a lý thuyết của cột bằng cách dù ng
 Phần I : Cơ sở lý

thu yết

4.3 Độ phân giải R : ( Resoluti on )

* Làm tăng độ chọn lọc bằng cách dùng cột khác phù hợp hơn
với quá trình tách hoặc thay đổi thành phần pha động .
+ Nếu R lớn quá thì thời gian phân tích sẽ lâu,tốn nhiều pha động ,độ nhạy sẽ
kém. Để khắc phục ta có thể thay đổi hệ
pha động hay dùng chươ ng trình Gradient dung môi
. Tuy nhiên trong quá trình chạy sắc ký dùng chương trình
dung môi thì một số pha động có tỷ lệ thay đổi sẽ kéo theo sự thay đổi đườ ng nền
làm ảnh hưởng rất lớn đến thời gian lưu và di ện tích của các Peak ta ph ân tích .
Trong thực tế nên hạn chế sử dụng chương trình Grad ient dung môi mà chủ
yếu là chúng ta phải tìm được hệ pha độ ng rửa giải phù hợp, đáp ứng các yêu
cầu trong quá trình phân tích .
s? l? thu yết

?ng T : ( Taili ng factor)

cho bi?t m?c ?? kh ?ng ??i x?ng c?a Peak tr ?n s?c k? ?? thu
s? ?? r?ng c?a 02 n?a Peak t?i ?i?m 1/10 ch i?u cao Peak :

Ga uss tr?n th?c t? kh? ?? t ??? c v? v?y ph?i quan t?m ??n h
 Phần I : Cơ sở lý thuyết

4.4 Hệ số không đố i xứ ng T : ( Ta ili ng fa cto r)

* Khi T 2.5 thì phép đị nh lượng được ch ấp n hận
* Khi T > 2.5 thì điểm cuối của Peak rất khó xác định ,vì vậy
phép định lượng cần phải thay đổi các điều kiện sắc ký để làm cho Peack cân đối
hơn theo các cách sau :
+ Làm giảm thể tích chết tức là đoa ün nối từ cột đêïn Detector .
+ Thay đổi thành phần pha độ ng sao cho khả năng rửa giải tăng lên

+ Gi ảm bớt lượ ng mẫu đưa vào cột bằ ng cách pha

loãng mẫu hay giảm thể tích tiêm mẫu

Phần I : Cơ sở lý thuyết
5 Ph ân loại sắc ký và ứng dụn g :
+ Theo cơ chế chia tách của sắc ký ,ng ười ta phân ra các loại sau đây :
Sắc ký hấp phụ ( NP - HPLC và RP - HPLC); sắc ký phân bố - sắc ký
chiết ( LLC); sắc ký trao đổi ion ( IE - HPLC) ; sắc ký rây phân tử -
sắc ký gel ( IG - HPLC) .Nh ưng thực tế hiên nay
chúng ta hiện chỉ đang ứng dụng sắc ký hấp phụ vào phân tích mẫu .

5.1 Sắc ký hấp phụ :

* Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các
chất tan và sự rửa gi ải (phản hấp phụ) cuả pha động để ké o chất tan ra khỏi cột .Sự
tách một hỗn hợp phụ thu ộc vào tính chất độ ng học của chất hấp phụ .Trong loại
này có 02 ki ểu hấp ph ụ:
Phần I : Cơ sở lý thuyết

+ Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP-H PLC): Pha tĩnh ph ân cực ,pha độ ng
kh ông phân cực
.

+ Sắc ký hấp ph ụ pha đảo ( RP - HPLC): Pha tĩnh khô ng phân cực
pha độ ng ph ân cực
.
Loại sắc ký này được áp dụng rất rộ ng rãi ,thành công để tá ch
các hỗn hợp các chất có tính chất gần tương tự nhau và th uộc loại
kh ông ph ân cực ,phân cực yếu hay trung bình nh ư các Vi tamin, các thuốc
hạ hi ệt giảm đau ... ....
 Phần II : Hệ thống HPLC
I- Máy HP:C gồm các bộ phận cơ bản đượ c tóm tắt trên sơ đồ sau :

Column

Degasse Pump

Tiím
mẫu

Detector
 Phần II: Hệ thống HPLC

Trong đó :
1- Bình chứa dung môi pha độüng
2- Bộ phận khử khí
3- Bơm cao áp
4-Bộ phận tiêm mẫu ( bằng tay hay Aut osample)
5-C ột sắc ký ( Pha tĩnh ) ( để ngòai môi trường hay trong bộ điều nh iệt )
6- Detector ( nhận tín hiệu )
7-Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận,t ín hiệu và sử lý dữ liệu và điều khiển hệ
thố ng HPLC.
8- In dữ liệu .
 Phần II: Hệ thống HPLC

II.1 - Bình đự ng dung môi

- Hiện tại máy HPLC thường có 04 đườ ng dung môi vào

đầu bơm cao áp .Cho phép chúng ta sử dụng 04 bình chứa dung môi cùng 1 lần để rưaó
giải theo tỷ lệ mong muốn và tổng tỷ lệ dung môi của 04 đườ ng là 100 % .

Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì chúng ta ít khi sử dụng 04 đường dung môi
cùng một lúc mà chúng ta chi sử dụng tối đa là 03và 02 đường để cho hệ pha động
luôn được pha trộn đồ ng nhất hơn,hệ pha độ üng đơ n gi ản hơn để quá trình rửa giải
ổn đị nh .

Hiện 04 đườ ng dung môi phục vụ chủ yếu cho việc rửa giải Gra dial dung

môi theo thời gian

 Phần II: Hệ thống HPLC
Lưu ý : - Tất cả các dung môi

dùng cho HPLC đề u phải là dung môi

tinh khiết và có ghi rõ trên nhãn là

dùng cho HPLC Hay dung môi tinh

khiết phân tích .

- Tất cả các hóa chất dùng để pha mẫu và pha hệ đệm phải đượ c sử dụng là
hóa chất tinh khi ết phân tích .

Nhằm mục đích tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đườ ng nền, tạo ra các Pe ak tạp

trong quá trình ph ân tích .

 Phần II: Hệ thống HPLC

II.2 Bộ khử khí Deg asse :

Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung
môi pha động .

Nêïu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót các bọt khí
thì một số hiện tượng sau đây sẽ sảy ra - Tỷ lệ pha động của các đườ ng
dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian lưu của Peak thay đổi .

- Trong trườ ng hợp bọt quá nhiều Bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì
có thể Pump sẽ không hút được dung môi (Bị e) khi đó áp su ất không lên và máy
sắc ký sẽ ng ừng hoạt động .

Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai .
 Phần II: Hệ thống HPLC
II.3- Pump Cao áp :
- Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký .Pump

phải tạo đượ c áp suất cao khoả ng 3000-6000 PSI hoặc 250 at đế n - 500 at ( 1at
=0.98 Bar) và pump phải tạo dòng
liên tục .Lưu lượ ng bơm từ 0.1 đến 9.9 99 ml /phút .(hiện nay đã có nhiều loại
Pump có áp su ất rất cao lên đế n 1200 bar)
- Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường có áp su ất tôïi đa 412 Bar. Tốc độ
dòng 0.1-
9.999 ml/ph út .

- Tốc độ bơm là hằ ng định theo thông số đã được cài đặt . Hiện tại bơm có 2
Pistone để thay ph iên nhau đẩ y dung môi liên tục .
 Phần II: Hệ thống HPLC
II.4 Bộ phận tiêm mẫu ( inje ction):
 ĐêØ đưa mẫu vào cột ph ân tích theo phươ ng pháp không ngừng dòng chảy
. Với dung tích
của loop là 5 - 100 l.

Có 02 cách lấy mẫu vào trong cột : Bằ ng tiêm mẫu thủ công( tiêm bằng tay
) và tiêm mẫu tự động( Auto sample) .
II.5 Cột sắc ký :

Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng
cao .
- Cột pha tĩnh thông thường làm bằ ng thép không rỉ ,chiều dài cột kho ảng 10 -30cm
,đường kính trong 1-10mm ,hạt chất nhồi cỡ = 5-10 m.( ngoài
ra còn có một số trường hợp đặc biệt về kích thước và kích cỡ hạt.... )
 Phần II: Hệ thống HPLC
-Với chất nhồi cột cỡ = 1.8 -5 m có thể dùng cột ngắn ( 3-10 cm )
và nhỏ ( đườ ng kính trong 1-4.6 mm)l oại cột naỳ có hiệu năng tách cao.
- Ch ất nhồi cột tùy theo lọai cột và kiểu sắc ký (
trong các dược điển USP 23 ,24 có tiêu ch uẩn hóa các lọai cột )
- Thông thường ch ất nhồi cột là Silic agel (pha thuận)
hoặc là Silica gel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ ( pha
đảo ) ,ngoài ra người ta còng dùng các loại hạ t khác như :Nhôm Oxit,Polyme xốp
,chất trao đổi ion.
* Đối với một số phươ ng pháp phân tích đòi hỏi
 Phần II: Hệ thống HPLC
II.6 - De tector :

- Là bộ phận Ph át hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi
trên săc ký đồ để có thể đị nh tính và định lượng .Tùy theo tính
ch ất của các chất cần ph ân tích mà người ta sử
dụng loaüi Detector thích hợp và phải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ
nh ất đị nh của chất phân tích
A=k.C
Trong : A là tín hiệu đo được
C Nồng độ chất phân tích

k là hằng số thực nghiệm của Det ect or

đã ch ọn

Tín hiệu này có thể là : độ hấp thụ quang ; Cường độ phát xạ ,cường độ điện thế
,độ dẫn điện ;độ
 Phần II: Hệ thống HPLC
Trên cơ sở đó ngườ i ta chế tạo các lọai
Detector sau :
+ De tect or quang phổ tử ngoại 200 - 380 nm để phát hiện UV
+ Detec tor quang phổ tử ngoại khả kiến ( UV - VIS): 190 - 900 nm để phát hiện
các ch ất hấp thụ quang .đây là loại thông dụng nhất
+De tec tor huỳnh quang đêí phát hiện các chấ t hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên
cũng như các dẫn ch ất có huỳ nh qu ang .Là loại De tec tor có độ chọn lọc cao nhất .
+L oại hiện đại đại hơn có De tec tor Diod Array
,ELSD (Detector tán xạ bay hơi ) các Detector này có khả năng quét chồng
phổ để đị nh tính
 Phần II: Hệ thống HPLC
- Ng oài ra còn có một số loại Detector khác là :
+ De tec tor điện hóa : Đo dòng ,cực phổ ,độ dẫn ,điện lượng
..)
+ De tectorCh iết suất vi sai : De tec tor khúc xạ ( thông thường dùng cho đo
các ch ất đường )
+ De tec tor đo độ dẫn nhiệt ,hiệu ứng nhiệt ..
II.6 - Bộ phận ghi tín hiệu
- Để ghi tín hiệu phát hiện do Detector truy ền sa ng .
+ Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký
đồ,thời gian lưu,diện tích của Peak ,chiều cao ..
 Phần II: Hệ thống HPLC
+ Các máy thế hệ mới đề u dùng ph ần mềm chạy trên máy tính nó có thể
lưu tất cả các thông số,phổ đồ và các thông số của Peak như tính đối xứn g,hệ số
phân giải .... trong quá trình phân tích đồng thời sử lý ,tính toán các thông số theo
yêu cầu của người sử dụng như : Nồng độ,RSD, ...
II.7 In kết quả :
+ Sau khi đã ph ân tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính
toán ra giấy để hoàn thiện hồ sơ .
 Phần III : CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ

Muốn có một kết quả táh tốt nhất ta phải tìm đượ c các điều kiện sắc ký tốt nhất cho
một hỗn hợp mẫu ; Các điều kiện đó bao gồm :

Pha tĩnh : - Loại pha tĩnh

- Kích thước cột
Pha độ ng : Thành ph ần và tỷ lệ ,pH , tốc độ dòng, nhiệt độ ... Nếu là chương
trình rửa giải Isocratic
Th ành phần và tỷ lệ ,pH , tốc độ dòng, nhiệt độ và chương trình
dung môi ... Nếu là chương trình rửa giải Gradient.
Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký
Hệ thống trang bị:
- Loại De tec tor:
- Van tiêm mẫu,thể tích tiêm
- Hệ đường dẫn
Các yếu tố khác : nh iệt độ ,độ nhạy của de tec tor bước sóng phân tích
 Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

III.1 : Lựa chọn pha tĩnh

- Dựa vào các tài liệu ,Dược điển ,thành ph ần và tính chất của các ch ất có
trong mẫu phân tích
.....ta lựa chọn cột sắc ký phù hợp có thể là cột pha thu ận, cột pha đảo hay các loại cột
khác nhau ...

Ch úng ta thông th ường dùng 02 loại cột pha thu ận ( NP) và cột pha đảo (
RP)

Ngoài ra ta có thể dùng một số loại cột khác như cột CN ,cột NH 2 ,....
 Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

Cột pha thuận ( NP): Sil icagel trung tính

Pha tĩnh :Cột này là loại cột dùng để tách các chất không phân cực hay ít phân cực
.Trên bề mặt hoạt độ ng của nó có chứa các nhóm OH phân cực ưa nước .

Ví dụ cột Lichrosorb Si 40,Si 60... Cấu tạo cột như sau

OH OH OH

- O - Si - O - Si - O - Si - O - OH OH OH
Pha độ ng : dùng cho loaüi này là các dung môi
 Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

III.1 : Lựa chọn pha tĩnh

Cột pha đảo ( RP) : ( Sili cagel đã Alkyl hóa )

Dùng để tách các ch ất không phân cực ,ít phân cực ,các chất phân cực có thể tạo
cặp Ion .Tr ên bề mặt hoạt động các nhóm OH đã bị Alkyl hóa tức là thay thế nguyên
tử H bằng các mạch Carbon thẳng
( C8 hay C18 tươ ng đươ ng RP 8 hay RP 18) ha y các mạch Carbon vòng(
Phenyl- tươ ng đươ ng cột Phenyl
)

vì thế nó ít phân cực hay phân cực rất ít .

Ví dụ như cột Lichrosor -Lichrospher RP 8 ...... ODS , Cột Nucleosil C18 ... .... .
 Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

Pha Độ ng : Pha độ ng dùng trong loại này là các dung môi có phân cực như

:Methanol
,Ace tonit ril,,nướ c hay các loại dung dịch đệ m ,hỗn hợp của các dung môi-đệ m .

Sự tách của ch ất nhồi loại cột này có độ lặp lại cao và nó được ứng dụng
chủ yếu trong ph ân
tích Dượ c phẩm . Hiện nay chú ng ta chỉ sử dụng loại này là chủ yếu .

Hiện nay pha tĩnh trên nền Silic agel đã có hàng trăm ch ất khác nhau tùy
thuộc vào nhóm thế của nguyên tử H ,ngoài ra còn có các lọai pha tĩnh trên nền Oxid
Nhôm,trên nền ch ất hữu cơ cao phân tử,trên nền mạch các bon ......
 Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

III.2 : Lựa chọn pha động

- Dựa vào các tài liệu ,Dược điển ,thành ph ần và tính chất của các ch ất có
trong mẫu phân tích
.....ta lựa chọn pha động phù hợp để cho quá trình rửa giải tách hoàn toàn các ch ất có
trong mẫu đáp ứ ng đầy đủ các tiêu ch uẩn của peak đã trình bày đồng thời phải có thời
gian phân tiïch phù hợp nhằm tiết kiệm được dung môi,hóa chất,thời gian phân
tích mẫu, giảm thiểu sự hoạt động của thiết bị .

- Pha động có thể làm thay đổi :

+ Độ chọn lọc

+ Thời gian lưu

 Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

- Pha động có thể làm thay đổi :

+ Hiệu năng tách của cột

+ Độ ph ân giải

+ Tính đối xứng của Peak

Do đó ,Trong một pha tĩnh đã chọn nếu ta chọn được pha động có thành
phần phù hợp thì ta sẽ có hiệu su ất tách sắc ký tốt nh ất đối với hỗn hợp các chất cần
ph ân tích . Chí nh vì vậy pha động cần có cầu yêu cầu sau :

+ Pha động phải trơ với pha tĩnh đã có .Không được làm cho pha tĩnh bị biến

đổi hóa học . ( vd giá trị pH : 2.5< pH <8.5)

 Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

+Pha động phải hòa tan được các chất phân

tích thì mới rửa giải được chú ng.( đặc biệt phải chú
ý khi tha y đổi pha động phải rửa cột bằng dung môi phù hợp để không làm tủa các ch ất
có trong cột
,hay pha động có sẵn trong cột vd : đệm phosp hat rưả ngay
bằng ACN hay MeOH sẽ bị kết tủa trên column)

+ Pha động phải bền vữ ng theo thời gian : càng bền lâu càng tốt nhưng ít nhất
là chúng là pha động không bị phân hủy trong suốt thời gia ph ân tích mẫu ).

+ Phả i có độ tinh khiết cao : dung môi cho

HPLC, hoá chất tinh khiết phân tích .
 Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

+ Phả i phù hợp với loại Detector : vd UV - VIS

thì dung môi không được hấp thụ quang (vd acid acetic ở bước sá ng thấp < 220 nm) .
Detector huỳnh qu ang thì dung môi không được ph át quang.

+ Phả i kinh tế ,không quá hiếm và đắt

Trong hệ sắc ký hấp phụ pha đảo ( RP - HPLC) pha động là dung môi phân cực là :
Nước,ACN,MeOH
,acid hay Base hữu cơ và một vài Amin hay
Aminoacid ..

+ Do sự thêm nước vào dung môi hữu cơ tạo thành một pha động ph ân cực

hơn chất hữu cơ nguyên một mì nh nó .Vd thêm nước vào ACN hay MeOH .. Sẽ tạo được

pha động ph ân cực hơn nó .

 Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

+ Ngòai các dung môi chí nh thì trong thành

phần pha động trong rất nh iều trường hợp tách RP- HPLC còn có thêm hỗn hợp đệm
pH để ổn định pH.C hất tạo phức ,tạo cặp ion để tạo ra sự rửa giải tốt nhất .

+ Khi chọn dung môi ta thường dựa vào lực rửa rải E của dung môi theo
bảng sa u:

BẢNG ĐỘ PHÂN CỰC CỦA MỘT SỐ DUNG MÔI

01- n Hexan 0.1 04 - Methan ol 5.11

02 -Tetra Chloro Ca rbon 1.6 05- Acten itril

5.8
 Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

- Việc lựa chọn điều kiện sắc ký là công việc

hết sức cần thiết trong quá trình xây dựng chươ ng trình sắc ký . Chỉ khi lựa chọn điều
kiên sắc ký tốt,phù hợp thì chúng ta mới có thể định tín h,định lượng được các lọai
thuốc đa thành phần một cách nhanh chóng và hiệu quả cao .

- Tất nhiên phần lý thuy ết nói rất nhiều về các phương pháp chọn điều kiện sắc
ký tuy nh iên để chọn được chương trình sắc ký tốt đồi hỏi phải có thời gian ,tài liệu và
một phần kinh nghiệm của những người làm sắc ký
 Phần IV : Tiến hành sắc ký

- IV -1 Chuẩn bị dụng cụ và máy mó c :

+ Má y HPLC phải được kiểm chứng theo định kỳ để bảo đảm máy họat động
tốt cho kết quả phân tích có độ đúng,độ lặp lại,tuyến tính ,tỷ lệ dung môi
,tốc đô dòng,năng lượng đèn ü ....đúng theo yêu cầu thông số của máy do nhà sản xu ất
đặt ra .

+ Đặc biệt cột sắc ký phải được kiểm tra về

số đĩa lý thuyết theo định kỳ hay khi có nghi ngờ về khả năng tách ,và rửa đúng qui
định sau mỗi lần chạy sắc ký :

vd : Với sắc ký pha thuận NP-HPLC : rửa bằng

MeOH Không rưẳ bằng Nước
 Phần IV : Tiến hănh sắc ký

-Tỷ lệ ACN hay MeOH : Nước ( 50 : 50 ) cho

sạch hết các chất còn đọng lại trong cột đồng thời để bảo vệ cột không bị Mốc khi để
lâu . Tuyệt đối tình trạng chỉ rửa bằng nước 100% sau đoú để cột một thời gian không
sử dụng chắc chắn cột sẽ bị mốc ,hỏng không thể dùng được . Xin lưu ý nếu rưẳ cột
không tốt thì kết quả chạy sắc ký sẽ không thể đáp ứng được các yêu cầu phân tích .
4.2 - Chuẩn bị dung môi ph a động :

Các dung môi dùng cho sắc ký là loại tinh khiết HPLC
Các hóa chấ t dùng phải là loạûi PA

Pha dung môi đúng ,chính xác theo đúng tỷ lệ đã nêu ,để ổn định dung môi

đúng thời gian theo

 Phần VI : Kỹ Thuật tiến hănh sắc ký

-4.3 Chuẩn bị mẫu đo HPLC :

+ Mẫ u Thử : Sử lý mẫu thử theo đúng chuyên luận ,qui trình theo ng uyên tắc
:

- Du ng môi hòa tan hoạt ch ất phải hòa tan trong pha động ,trong nhiều trường
hợp dùng dung môi pha động để hòa tan mẫu - Phải loại bỏ các chất
không tan trong pha động hoặc không rưẳ giải được bằng cách lọc hay chiết ..

-Phải lọc và ly tâm ,lọc mẫu qua mà ng lọc 0.2

- 0.45 m

- Nồng độ mẫu ở mức vừa phải,không vượt quá khả năng tách của cột.Có thể
gây ra ng hẽn cột.
 Phần VI : Kỹ Thuật tiến hănh sắc ký

-Mẫu ch uẩn :

Pha dung dịch chuẩn có thà nh phần giống

như mẫu thử trong cùng dung môi ,riêng về nồng độ các thành ph ần giôïng như mẫu thử là
tốt nhất
,ngoài ra có thể d ùng nồng độ khác nhưng phải nằm trong khoảng tuy ến tính đã khảo sát
của từng th ành p hần.

4.4 Cách đo HPLC :

Mỗi máy có cách vận hành khác nhau tùy thuôcü vào hãng sản xuất ,phần mền
sắc ký . Tuy nhiên cách vận hành luôn phải theo nguyên tăïc sau
:
 Phần VI : Kỹ Thuật tiến hănh sắc ký

+ Đặt đầy đủ các điều kiện sắc ký

nh ư :

* Cấu hình máy

* Tỷ lệ các dung môi pha động

* Bước sóng ,thành phần mẫu, các thông số của quá trình
ph ân tích yêu cầu .
 Phần V

Hệ thống sắc ký Merck - Hitachi vă phần mềm diều khiển

D7000 – Multi HSM manager

(Sẽ bổ sung
sa u)

Người viết
KS Phan Hiền Lương
Mail :
luonghoak8@ymail.com