Bioresource Technology 101 (2010) 4851–4861

CÁC KỸ THUẬT TIỀN XỬ LÝ GIÚP QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BIOETHANOL HIỆU QUẢ

BẰNG THỦY PHÂN NHỜ ENZYME

P.Alvira, E.Tomás-Pejó, M.Ballesteros, M.J.Negro

CIEMAT, Renewable Energy Division, Biomass Unit, Avda. Complutense 22, Madrid 28040, Spain

Tóm tắt

Nhiên liệu sinh học tư nguyên liệu lignocellulose,được xem là thế hê cồn sh thứ 2 với ưu thế về năng
lượng , kt và mt so với cồn sinh học từ đường và tinh bột. Tuy nhiên, các hàng rào lý hóa do sự liên
kêt chặt chẽ của các thành phần chính trong sinh khối lignocellulose đã cản trở sự thủy phân của
cellulose và hemicellulose để tạo thành các đường có thể lên men. Mục tiêu cua tiền xư lý là tăng khả
năng xâm nhập của các enzym để cải thiện khả năng phân giải của cellulose. Vì mỗi cách xử lý có
một hiệu quả đặc hiệu lên thành phần cellulose, hemicellulose và lignin, nên các điều kiên và phuơng
pháp xử lý khác nhau được chon dựa vào đặc điểm của quy trình được dùng để thủy phân và lên
men sau đó. Tài liêu này tổng quan các công nghê hấp dẫn để sản xuất cồn từ lignocellulose va chỉ
ra vài đặc điểm chủ chốt cần hướng đến để tao ra 1 chu trinh xư lý tiên tiến với chi phí thấp.

1. Giới thiệu

Vấn đề tăng luơng khi thải Co2 cùng những lo ngại về an ninh năng lượng đã gia tăng sự wan tâm
đên các nguồn năng lượng thay thế ko dựa vào dầu mỏ. Sinh khối là nguồn năng lượng sơ cấp duy
nhất có khả năng tái tạo và phù hợp để có thể cung cấp các nhiên liêu thay thế trong vậnn tải như
côn sh hay dầu sh trong tương lai gần (Hamelinck et al., 2005; Sun and Cheng, 2002).
Sản phẩm cồn sh hiên nay là cồn được sản xuất từ đường và tinh bột, nhưng đã có nhiêu cuộc tranh
cãi đáng chú ý về tính lâu dài của nó. Trong bôi cảnh này, cồn sh đuoc sx từ sinh khối lignocellulose
là sản phẩm thay thê hấp dẫn vì nguyên liêu lignocellulose ko canh tranh với cây luơng thực và cũng
rẻ hơn nguyên liêu nông nghiêp truyền thống.

Lignocellulose là sinh khối phong phú nhất và có khả năng tái tạo; sản lượng hàng năm trên toàn thế
giới của nó được ước tính vào khoảng 1 × 1010 triệu tấn (Sánchez và Cardona, 2008). Sự chuyển
đổi về mặt sinh học của các nguồn nguyên liệu lignocellulose khác nhau như rừng và các bộ phận
nông nghiệp, hay mùa màng thu hoạch lignocellulose phục vụ cho sản xuất cồn mang lại nhiều lợi ích
nhưng sự phát triển của nó còn bị hạn chế bởi những trở ngại về kinh tế và kỹ thuật (Sánchez và
Cardona, 2008). Trong bối cảnh này, một số yếu tố quan trọng nhất để làm giảm giá thành sản xuất
cồn là: sử dụng hiệu quả nguyên liệu để thu được sản lượng cồn lớn với năng xuất cao, chất liệu của
quá trình chưng cất có nồng độ cồn cao, cũng như sự tích hợp quy trình nhằm làm giảm tiêu thụ
năng lượng ([Galbe và Zacchi, 2007] và [Tomás-Pejó và cs, 2008])

Sản xuất ethanol từ sinh khối chứa lignocellulosic bao gồm các bước chính sau đây: thủy phân
cellulose và hemixenluloza, lên men đường, phân tách các dư lượng lignin và cuối cùng là thu hồi và
tinh sạch ethanol để đáp ứng các thông số kỹ thuật nhiên liệu. Nhiệm vụ của thủy phân lignocellulose
thành monosacarit có thể lên men vẫn là vấn đề kỹ thuật vì khả năng phân giải cellulose bị cản trở
bởi nhiều yếu tố lý-hóa, cấu trúc và kết cấu. Do những đặc điểm cấu trúc, tiền xử lý là một bước cần
thiết để đạt được khả năng lên men đường trong bước thủy phân. Mục đích của tiền xử lý là để phá
vỡ cấu trúc lignin và phá vỡ cấu trúc tinh thể của cellulose để tăng cường khả năng tiếp cận với các
enzym xenluloza trong bước thủy phân (Mosier và cộng sự, 2005b.)

Các nghiên cứu về tiền xử lý hiện tại tập trung vào xác định, đánh giá, phát triển và mô tả những
hướng tiếp cận có nhiều hứa hẹn để hỗ trợ đắc lực sự thủy phân tiếp theo bằng enzym của sinh khối
đã được xử lý với nồng độ enzym thấp hơn và thời gian chuyển hóa ngắn hơn. Nhiều hướng tiếp cận
để thực hiện tiền xử lý đã được khảo sát trên nhiều loại nguyên liệu khác nhau và có vài bài báo tổng
quan gần đây cung cấp thông tin tổng quát về lĩnh vực này ([Carvalheiro và cs, 2008], [Hendriks và
Zeeman, 2009], [Taherzadeh và Karimi, 2008] và [Yang và Wyman, 2008]).
Tiền xử lý sinh khối được coi là một bước quyết định trong sự biến đổi để tạo thành cồn, ngoài ra nó
còn là một trong trong những yếu tố chính về giá thành của quy trình. Thực tế là, nó đã được mô tả là
chi phí của bộ phận có mức tốn kém thứ hai, sau chi phí của nguyên liệu, trong quá trình chuyển đổi
lignocellulose thành cồn dựa vào thủy phân bằng enzym.

Vì các nguyên liệu lignocellulose khác nhau có các đặc tính lý hóa khác nhau, nên cần áp dụng
những công nghệ tiền xử lý thích hợp theo các đặc điểm của sinh khối lignocellulose ở từng nguyên
liệu. Hơn nữa, sự lựa chọn một công nghệ tiền xử lý nhất định có tác động lớn đến tất cả các bước
tiếp theo của toàn bộ quá trình chuyển đổi như là khả năng bị phân giải của cellulose, sự phát sinh
các chất độc có khả năng ức chế nấm men, năng lượng cần thiết cho quy trình tiếp theo và những
yêu cầu về xử lý nước thải (Galbe và Zacchi, 2007). Các nghiên cứu khác mô tả một số chỉ số (sự
thu hồi pentose, kích cỡ cần thiết của mảnh, nồng độ các chất độc hình thành trong tiền xử lý và tiêu
hao năng lượng thấp) như là các yếu tố quyết định của một công nghệ tiền xử lý hiệu quả (Sun và
Cheng, 2002).

Mục đích của công trình này là tổng quan các công nghệ tiền xử lý hấp dẫn nhất và những tiến bộ
gần đây trong sản xuất cồn từ lignocellulose cũng như phân tích các yếu tố đan xen giữa tiền xử lý,
thủy phân và lên men.

2. Các yếu tố then chốt để có công nghệ tiền xử lý sinh khối lignocellulose hiệu quả.
Có một số đặc điểm then chốt cần lưu ý để có một quy trình tiền xử lý tiên tiến và tiết kiệm (Yang và
Wyman, 2008):

- Sản lượng cao với nhiều loại cây trồng, nhiều bộ phận, nhiều lứa tuổi và thời gian thu hoạch.
Nhiều công nghệ tiền xử lý được biết là phù hợp hơn với những nguyên liệu đặc hiệu. Chẳng hạn,
phương pháp tiền xử lý dựa vào kiềm như vôi, thủy phân bằng amoniăc (AFEX), và chiết hồi lưu
amoniăc (ARP), có thể làm giảm lượng lignin có trong các sản phẩm nông nghiệp một cách hiệu quả
nhưng lại kém hiệu quả đối khi xử lý cơ chất bền vững như các loại gỗ mềm (Chandra và cộng sự,
2007). Các quy trình tiền xử lý dựa vào axit đã cho thấy tính hiệu quả đối với nhiều loại cơ chất
lignocellulose, nhưng khá tốn kém (Mosier và công sự, 2005b)

- Chất rắn qua tiền xử lý có khả năng bị phân giải cao. Cellulose từ quá trình tiền xử lý cần có khả
năng bị phân giải cao với sản phẩm thu được trên 90% trong thời gian dưới 5 ngày và tốt hơn là dưới
3 ngày với lượng enzym sử dụng dưới 10 FPU/g cellulose. (Yang và Wyman, 2008).
- Lượng các chất độc tối thiểu. Dịch lỏng thủy phân sau bước tiền xử lý cần có khả năng lên men với
các điều kiện chi phí thấp và sản lượng cao. Các điều kiện khắc nghiệt trong tiền xử lý dẫn đến sự
thoái biến một phần bán cellulose và phát sinh các chất độc tạo ra do sự phân rã đường mà điều này
có thể ảnh hưởng đến các bước thủy phân và lên men tiếp theo (Oliva và cs, 2003). Các chất độc
được phát sinh và số lượng của chúng phụ thuộc vào các nguyên liệu và sự khắc nghiệt của tiền xử
lý. Các sản phẩm thoái biến do tiền xử lý các vật liệu lignocellulose có thể được phân chia thành các
nhóm sau: axit carboxylic, các dẫn xuất furan và các hợp chất phenol. Các dẫn xuất chính của furan
là furfural và 5-hydroxymethylfurfural (HMF) lần lượt được tạo ra từ sự thoái biến các pentose và
hexose (Palmqvist và Hahn-Hägerdal, 2000). Các axit yếu chủ yếu là axit axetic, foocmic và levulinic.
Các hợp chất phenol bao gồm các rượu, andehit, ceton và axit (Klinke và cs, 2002)

- Làm giảm kích thước sinh khối là không cần thiết. Nghiền hoặc xay nguyên liệu thành các hạt kích
thước nhỏ trước khi tiền xử lý là công nghệ tốn kém và tiêu hao năng lượng.

- Tiến hành trong các lò phản ứng kích thước phù hợp và giá cả vừa phải. Các lò phản ứng tiền xử lý
cần có chi phí thấp bằng cách giảm thiểu thể tích của chúng, sử dụng các vật liệu chế tạo phù hợp
với các môi trường hóa chất ăn mòn mạnh và giữ áp suất hoạt động hợp lý.
- Không tạo ra các chất thải rắn. Các hóa chất tạo thành trong quá trình thủy phân chuẩn bị cho các
bước tiếp theo không nên cản trở cho quá trình xử lý hay xả rác.

- Hiệu quả ở độ ẩm thấp. Việc sử dụng nguyên liệu có độ khô cao sẽ làm giảm tiêu hao năng lượng
trong quá trình tiền xử lý.

- Thu được nồng độ đường cao. Nồng độ của các đường từ hai quá trình tiền xử lý và thủy phân
bằng enzym cần đạt được trên 10% để đảm bảo thu được nồng độ ethanol phù hợp và để làm cho
mức thu hồi và chi phí khác sau đó có thể chấp nhận được.

3. Các yếu tố hạn chế sự thủy phân bằng enzym

Tiền xử lý là bước cần thiết để biến đổi một số đặc điểm cấu trúc của lignocellulose, làm tăng khả
năng tác động của enzym lên glucan và xylan. Như đã được đề cập, những biến đổi cấu trúc của
lignocellulose này phụ thuộc nhiều vào loại tiền xử lý được áp dụng và có tác động mạnh đến sự thủy
phân bằng enzym (Kumar và cs., 2009b) và các bước tiếp theo. Sự lựa chọn công nghệ tiền xử lý với
một loại nguyên liệu nhất định phụ thuộc vào vài yếu tố, trong đó một số yếu tố liên quan trực tiếp
đến bước thủy phân bằng enzym như các phổ các loại đường được giải phóng và các enzym được
sử dụng. Bởi vậy, sự phối hợp của thành phần cơ chất, loại tiền xử lý và liều lượng cũng như hiệu
suất của các enzym được dùng trong thủy phân ảnh hưởng to lớn đối với sự phân giải sinh khối; mặc
dù từng tác động của những yếu tố này đối với quá trình thủy phân bằng enzym vẫn còn chưa rõ
ràng.
Các yếu tố chính ảnh hưởng đến sự thủy phân bằng enzym của cellulose trong nguyên liệu
lignocellolose có thể được chia thành hai nhóm: các yếu tố liên quan đến enzym và các yếu tố liên
quan đến cơ chất, mặc dù nhiều yếu tố liên quan đến cả hai trong quá trình thủy phân. Thành phần
cấu tạo của phần chất lỏng và các chất rắn hình thành từ các phương pháp tiền xử lý khác nhau có
thể rất khác nhau. Những sự khác biệt này sẽ có ảnh hưởng lớn đến những yêu cầu cần thiết để có
quá trình đường phân nhờ enzym hiệu quả trong các bước xử lý tiếp theo.

Sự giảm bớt tính chặt chẽ trong quá trình tiền xử lý đôi khi do yêu cầu cắt giảm chi phí kinh tế. Việc
này dẫn đến sự giải phóng đường ít hơn và do đó nó đòi hỏi nhiều loại enzyme khác nhau và với số
lượng lớn hơn để tạo ra nhiều những sản phẩm đường từ cả cellulose và emicellulose. Trong điều
kiện đó, sự phát triển của Hemicellulase và các enzyme kèm theo khác cần thiết cho sự thủy phân
hoàn toàn các thành phần lignocellulose trở thành vấn đề rất quan trọng. Các nghiên cứu gần đây chỉ
ra tầm quan trọng của phức hơp enzyme cân bằng mới bao gồm những kết hợp tối ưu cho sự thay
đổi có hiệu quả cấu trúc phức hợp của các nguyên liệu lignocellulose. Các tác nhân liên quan đến cơ
chất hạn chế sự thủy phân enzyme được kết nối trực tiếp với quá trình tiền xử lý được áp dụng.
Những tác nhân này được miêu tả riêng lẻ mặc dù ảnh hưởng của chúng thường quan hệ chặt chẽ
với nhau.

3.1. Sự kết tinh cellulose (chỉ số kết tinh cellulose, CI)

Mức độ trùng hợp và kết tinh cellulose được coi là những nhân tố quan trọng trong xác định tốc độ
thủy phân của các cơ chất cellulose tương đối tinh khiết, nhưng dữ liệu trong một vài nghiên cứu độc
lập chỉ ra rằng các chỉ số này một mình không giải thích được tính trơ của các cơ chất lignocellulose.
Trong thực tế, người ta đã xác định được các phức hợp enzyme cellulase có khả năng thủy phân
cellulose dạng tinh thể. Trong một vài nghiên cứu đề xuất về tầm quan trọng của sự kết tinh, các
nguyên liệu lignocellulose được tiền xử lý bằng phương pháp cơ học, vì thế giảm sự kết tinh luôn
luôn kèm theo sự biến đổi các đặc tính khác của cơ chất ví như sự giảm kích thước hạt hay tăng diện
tích bề mặt tiếp xúc .

Người ta thấy rằng tiền xử lý lignocellulose cải thiện được khả năng thủy phân của nó, nhưng trong
một số trường hợp thì nó làm tăng chỉ số kết tinh (CrI) của thành phần cellulose. Hiện tượng này
được đề xuất là do sự mất đi hoặc giảm cellulose vô định hình (là phần dễ bị tác động hơn) sau các
phương pháp tiền xử lý như bằng hơi nước áp suất cao. Ngược lại, tiền xứ lý với pH cao được thấy
là có hiệu quả thấp ngay cả trong một số trường hợp nó làm giảm sự kết tinh của sinh khối.

3.2. Mức độ trùng hợp của cellulose (DP, số lượng nhóm glycosyl của mỗi mạch cellulose)
Mức độ polymer hóa về cơ bản liên quan đến các đặc điểm khác của cơ chất, chẳng hạn như mức
độ kết tinh. Mặc dù vai trò của độ dài mạch glucan chưa được biết một cách rõ ràng, nhưng người ta
tin rằng nó ảnh hưởng đến sự thủy phân của cellulose (Puri, 1984). Trong phản ứng thủy phân bằng
enzym, các enzym endoglucanase phân cắt các vùng bên trong của mạch cellulose, ưu tiên các
mạch có độ trật tự thấp hơn, là yếu tố chính để làm giảm mức độ trùng hợp của các cơ chất
cellulose. Tuy nhiên, dường như có một mức độ trùng hợp giống nhau của cellulose mà không phụ
thuộc vào cơ chất sẽ bị tác động, nó liên quan đến tính trơ của các phần cellulose tinh thể (Mansfield
và cs., 1999).

Hiệu quả của các biện pháp tiền xử lý lên độ dài của mạch cellulose đã được nghiên cứu trong đó
cho thấy sự giảm mức độ trùng hợp ở các thể rắn qua các biện pháp tiền xử lý khác nhau đã gợi ý
rằng sự loại bỏ xylan có tác động lên độ dài mạch cellulose sâu sắc hơn so với loại bỏ lignin (Kumar
và cs., 2009b).

3.3. Diện tích bề mặt tiếp xúc của cơ chất (dung tích lỗ)
Sự tiếp xúc của cơ chất với các enzym phân giải cellulose là một trong những yếu tố chính ảnh
hưởng đến quá trình thủy phân. Bởi thế, một trong những mục đích chính của tiền xử lý là để làm
tăng diện tích bề mặt tiếp xúc để enzym xúc tác

3.4. Rào cản lignin (hàm lượng và phân bố)

Sự có mặt của lignin và bán cellulose gây cản trở đối với sự xâm nhập tới cellulose của các enzym
cellulase (Mansfield và cs., 1999), do đó làm giảm hiệu suất của sự thủy phân.
Lignin hạn chế tốc độ của sự thủy phân bằng eznym bằng cách hoạt động như một rào cản vật lý,
ngăn cản sự thủy phân của các phần có khả năng bị phân giải của cơ chất (Chang và Holtzapple,
2000). Bên cạnh đó, lignin dường như làm giảm sự thủy phân cellulose bằng cách gắn không đặc
hiệu vào các enzym phân giải cellulose (Esteghlalian và cs., 2001).
Các chiến lược khác nhau đã được nghiên cứu để khắc phục sự hấp phụ không đặc hiệu của
cellulase vào lignin như tách chiết bằng kiềm và cho thêm protein (như BSA) hay các chất phụ gia
(như poly ethylene glycol, Tween) ([Börjesson và cs., 2007] và [Pan và cs., 2005]). Mặc dù việc sử
dụng các chất phụ gia sẽ phát sinh phụ phí của quá trình sản xuất ethanol, nhưng có thể đạt được
nhưng lợi ích đáng kể thông qua việc cải thiện bước thủy phân bằng enzym.

Sự gắn bất thường của các enzym lên lignin còn bị ảnh hưởng bởi bản chất của cơ chất
(Esteghlalian và cs., 2001). Trong khi nhiều enzym cellulase khác nhau ở sự ức chế của chúng bởi
lignin, thì các enzym xylanase và cellulase ít bị ảnh hưởng hơn (Berlin và cs., 2006).
Một số biện pháp tiền xử lý đã được báo cáo để tạo ra các hiệu ứng khác nhau như làm nóng chảy
và tái phân bố lignin (biện pháp dùng hơi nước áp suất cao) hay phá vỡ các liên kết lignin-
carbonhydrate (AFEX) (Laureano-Pérez và cs., 2005). Hóa học lignin ngày nay thực sự là một trong
những lĩnh vực nghiên cứu lớn. Nó có tầm ảnh hưởng to lớn đối với quá trình thủy phân bằng enzym
và còn với, như là một trong những thành phần chính của nguyên liệu lignocellulose, các ứng dụng
khác xa hơn của lignin đang được nghiên cứu để thu được các sản phẩm tiềm năng có giá trị cao
hơn trong quá trình tinh chế sinh học tiên tiến. Các hiệu ứng của các biện pháp tiền xử lý khác nhau
đối với lignin sẽ được mô tả chi tiết hơn.

3.5 Hàm lượng Hemicellulose

Loại bỏ Hemicellulose làm tăng kích thướctrung bình của các lỗ trên (của) cơ chất và vì vậy tăng khả
năng xâm nhập và bị thủy phân của cellulose. Mặt khác, sự thu hồi các đường hemicellulose ở các
chát rắn đã qua tiền xử lý có thể giúp tạo ra nhiều hơn lượng đường tổng số có khả năng lên men.
Trong trường hợp này thì các yêu cầu về enzyme cho việc biến đổi hemicellulose cần phải được tính
đến. Mức độ acetyl hóa ở hemicellulose cũng là một yếu tố quan trọng khác bởi lignin và các nhóm
acetyl được gắn vào mạng lưới hemicellulose và có thể gây cản trở sự phá vỡ polysaccharide
(Chang và Holtzapple, 2000).

3.6. Kích thước hạt của nguyên liệu

Có một số bằng chứng ủng hộ rằng sự giảm kích thước hạt sẽ làm tăng diện tích bề mặt đặc hiệu và
dẫn đến làm tăng khả năng xâm nhập của cellulose đến các enzym (Sun và Cheng, 2002).

3.7. Quá trình tạo lỗ

Các nghiên cứu trước đây đã kết luận rằng kích thước lỗ của cơ chất so với kích thước của enzym là
yếu tố giới hạn chính của quá trình thủy phân sinh khối lignocellulose dựa vào enzym (Chandra và
cs., 2007). Các enzym cellulase có thể bị mắc kẹt tại các lỗ nếu vùng bên trong lớn hơn nhiều so với
vùng bên ngoài (?), mà đây là đặc điểm phổ biến của nhiều nguyên liệu lignocellulose (Zhang và
Lynd, 2004). Sự gia tăng quá trình tạo lỗ trong các quy trình tiền xử lý có thể cải thiện đáng kể sự
thủy phân.

3.8. Độ dày của thành tế bào (tính thô ráp)

Rào cản dạng sáp bao gồm lớp cutin ở cỏ và vỏ cây gây cản trở sự thấm sâu của enzym; ngay cả khi
được xay ra thì thân cây và mô gỗ vẫn hạn chế sự ngấm sâu của chất lỏng do đặc tính vốn có của
chúng.

3.9. Thay đổi khả năng xâm nhập bằng sự chuyển đổi
Vai trò của khả năng xâm nhập glucan và sự thay đổi khả năng này thông qua chuyển đổi đã được
tranh luận, với một số ít các nghiên cứu chỉ ra rằng khả năng xâm nhập glucan trở nên hạn chế thông
qua sự chuyển đổi (Wang và cs., 2006) và một số khác lại cho thấy khả năng xâm nhập thông qua sự
chuyển đổi giảm không đáng kể, thậm chí là không hề thay đổi (Kumar và Wyman, 2009b).

4. Các công nghệ tiền xử lý của sinh khối lignocellulose

Đặc tính đa dạng của các nguyên liệu sinh khối khác nhau là trở ngại để nghĩ đến quy trình tiền xử lý
chung cho tất cả. Một tập hợp nhiều các công nghệ tiền xử lý khác nhau đã được đề xuất trong các
thập kỷ vừa qua. Chúng có thể được phân loại thành các công nghệ tiền xử lý sinh học, vật lý, hóa
học và hóa lý, tùy theo các lực khác nhau hay năng lượng được sử dụng trong quá trình tiền xử lý.
Sự kết hợp các phương pháp này cũng đã được nghiên cứu.

4.1 Tiền xử lí bằng phương pháp sinh học

Việc tiền xử lí bằng nấm đã được khảo sát trước đây nhằm mục đích nâng cấp nguyên liệu
lignocellulose trong sản xuất thức ăn gia súc hay ứng dụng trong công nghiệp giấy. Gần đây, những
phương pháp tiền xử lí có tính chất thân thiện với môi trường lại nhận được sự chú ý với tư cách là
một phương pháp tiền xử lý nhằm gia tăng sự tạo đường từ sinh khối lignocellulose bằng enzym
trong quy trình sản xuất ethanol. Tiền xử lí sinh học sử dụng vi sinh vật, chủ yếu là các loại nấm mục
trắng, nấm mục nâu và nấm mục mềm, là những loại nấm có khả năng phân giải lignin, hemicellulose
và một phần rất nhỏ cellulose, là phần có tính trơ nhiều hơn so với những thành phần khác. Sự phân
giải của lignin bởi nấm mục trắng, phương pháp có hiệu quả nhất khi tiền xử lí lignocellulose bằng pp
sinh học, phát huy tác dụng thông qua sự xúc tác của các enzym phân giải lignin như enzyme
peoidase và laccase.

Một vài loại nấm mục trắng như Phanerochaete chrysosporium, Ceriporia lacerata, Cyathus
stercolerus, Ceriporiopsis subvermispora, Pycnoporus cinnarbarinus và Pleurotus ostreaus đã được
đánh giá trên các sinh khối lignocellulose khác nhau, cho thấy hiệu suất phân giải lignin cao ([Kumar
và cs., 2009a] và [Shi và cs., 2008]). Tiền xử lý sinh học bằng nấm mục trắng đã được kết hợp với
tiền xử lý sử dụng dung môi hữu cơ trong quy trình sản xuất ethanol bằng cách tạo đường và lên
men đồng thời (SSF) từ các mảnh gỗ sồi (Itoh và cs., 2003). Kết quả từ các nghiên cứu khác gần đây
đã cho thấy rằng tiền xử lý bằng nấm đối với rơm cây lúa mì trong 10 ngày bằng nấm có khả năng
phân giải cao lignin và ít phân giải cellulose (dòng nấm phân lập RCK-1) đã làm giảm lượng axit cho
quá trình thủy phân, tăng giải phóng các đường có khả năng lên men và giảm nồng độ của các yếu tố
ức chế lên men. Sản lượng và hiệu suất ethanol thu được với Pichia stipitis lần lượt là 0.48 g/g và
0.54 g/L h (Kuhar và cs., 2008). Một khảo sát về tiền xử lý sinh học đối với bã mía bằng cách sử
dụng tám loài vi khuẩn và nấm khác nhau đã được tiến hành dựa trên cơ sở đánh giá sự thay đổi về
số lượng của các thành phần trong bã mía, sự tổng hợp phức hợp enzym cellulase, protein tổng số
và sự giải phóng các đường khử bởi các tác nhân sinh học khác nhau cũng như sự tác động của các
thông số hóa học khác nhau đối với tiền xử lý (Singh và cs., 2008). Trong trường hợp này, các
phương pháp tiền xử lý bằng vi khuẩn đối với bã mía đã làm tăng khả năng xâm nhập của các đường
cho quá trình thủy phân bằng enzym.

Nói chung, những quy trình như vậy sẽ có những lợi thế như chi phí đầu tư thấp, tiêu hao năng
lượng ít, không đòi hỏi các hóa chất, các điều kiện môi trường ít chặt chẽ. Tuy nhiên, trở ngại chính
để phát triển các phương pháp sinh học là tốc độ thủy phân đạt được thấp ở hầu hết các nguyên liệu
sinh học so với các công nghệ khác (Sun and Cheng, 2002).
Để hướng tới một phương pháp tiền xử lý sinh học của lignocellulose có tính cạnh tranh về giá thành
và để cải thiện sự thủy phân nhằm cải thiện sản lượng ethanol, cần phải tiếp tục nghiên cứu và thử
nghiệm các nấm basidiomycetes khác về khả năng của chúng trong việc phân giải lignin các nguyên
liệu thực vật nhanh và hiệu quả.

4.2. Các phương pháp tiền xử lý vật lý

4.2.1. Phân nhỏ bằng phương pháp cơ học
Mục đích của tiền xử lý cơ học là làm giảm kích thước hạt và mức độ kết tinh của lignocellulose
nhằm gia tăng bề mặt tiếp xúc và giảm mức độ trùng hợp. Việc phân nhỏ này có thể được thực hiện
bằng sự kết hợp đập vỡ, nghiền hoặc xay phụ thuộc vào kích thước hạt cần đạt được của nguyên
liệu (10–30 mm sau khi đập vỡ và 0.2–2 mm sau khi nghiền hoặc xay) (Sun và Cheng, 2002).
Các quy trình xay nghiền khác nhau (nghiền bóng, nghiền hai trục, nghiền keo và nghiền năng lượng
vibrio?) có thể được sử dụng để cải thiện sự thủy phân các nguyên liệu lignocellulose bằng enzym
(Taherzadeh và Karimi, 2008). Yêu cầu về năng lượng của phương pháp tiền xử lý này tương đối
cao phụ thuộc vào kích thước hạt cuối cùng và các đặc điểm của sinh khối. Nếu tính đến đòi hỏi cao
về năng lượng cho xay nghiền và sự gia tăng liên tục giá cả của năng lượng thì dường như quy trình
này không có hiệu quả kinh tế (Hendriks và Zeeman, 2009
4.2.2. Quy trình đẩy
Quy trình đẩy là phương pháp tiền xử lý mới và nhiều hứa hẹn để chuyển đổi sinh khối phục vụ sản
xuất ethanol. Trong quy trình đẩy, các nguyên liệu được xử lý bởi nhiệt độ, trộn và cắt xén để tạo ra
các biến đổi hóa lý theo chiều dài của ống đẩy. Tốc độ của trục xoắn và nhiệt độ của lòng ống được
cho là phá vỡ cấu trúc của lignocellulose gây ra sự thoái biến sợi, hình thành sợi và làm ngắn các sợi
và kết cục là làm tăng khả năng xâm nhập của carbonhydrate đối với các tác động của enzym
(Karunanithy và cs., 2008). Cần phải lưu ý đến các thông số khác nhau của bioreactor để đạt được
hiệu suất cao nhất của quy trình. Trong các nghiên cứu gần đây, ứng dụng của các enzym trong quy
trình đẩy đang được xem xét như là một công nghệ hứa hẹn để sản xuất ethanol.

4.3. Các phương pháp tiền xử lý hóa học

4.3.1. Các phương pháp tiền xử lý bằng kiềm
Tác động của một số bazơ lên sinh khối lignocellulose là cơ sở của các phương pháp tiền xử lý bằng
kiềm, là phương pháp hiệu quả phụ thuộc vào hàm lượng lignin của sinh khối. Các phương pháp tiền
xử lý bằng kiềm làm tăng khả năng thủy phân của cellulose và chúng giúp sự hòa tan của lignin tốt
hơn và ít hòa tan cellulose và hemicellulose hơn so với các quy trình axit hay thủy nhiệt (Carvalheiro
et al., 2008).
Tiền xử lý bằng kiềm có thể được tiến hành ở nhiệt độ phòng và trong thời gian từ nhiều giây đến
nhiều ngày. Nó được mô tả là ít gây ra sự thoái biến đường hơn so với tiền xử lý bằng axit và nó cho
thấy tính hiệu quả cao hơn ở các sản phẩm nông nghiệp so với các nguyên liệu gỗ (Kumar và cs.,
2009a). Tuy nhiên, cần phải cân nhắc đến khả năng mất mát các đường có khả năng lên men và sự
tạo thành các hợp chất ức chế để tối ưu hóa các điều kiện tiền xử lý.
Natri, kali, canxi và amoni hydroxit là các phương pháp tiền xử lý thích hợp. NaOH làm trương, gia
tăng diện tích bề mặt ở bên trong của cellulose và giảm mức độ polymer hóa và mức độ kết tinh, là
những yếu tố gây ra sự phá vỡ cấu trúc của lignin (Taherzadeh và Karimi, 2008). NaOH đã được
công bố làm gia tăng khả năng phân giải của gỗ cứng từ 14% lên 55% bằng cách giảm hàm lượng
lignin từ 24-55% xuống còn 20% (Kumar và cs., 2009a)

Ca(OH)2, còn gọi là vôi, đã được nghiên cứu rộng rãi. Tiền xử lý bằng vôi loại bỏ các chất vô định
hình như lignin, làm tăng chỉ số mức độ kết tinh. Sự loại bỏ lignin sẽ gia tăng hiệu quả của enyzm
bằng cách giảm các vùng hấp phụ không đặc hiệu đối với enzym và bằng cách gia tăng khả năng
xâm nhập của cellulose (Kim và Holtzapple, 2006). Vôi còn loại bỏ các nhóm acetyl từ hemicellulose
làm giảm sự ức chế lập thể của các enzym và tăng cường khả năng phân giải của cellulose (Mosier
và cs., 2005b). Vôi đã được khẳng định hiệu quả đối với thân lá cây ngô hay gỗ cây bạch dương ở
nhiệt độ từ 85–150 °C và trong khoảng 3–13 h (Chang và cs., 2001). Tiền xử lý bằng vôi có chi phí
thấp và yêu cầu về an toàn ít hơn so với tiền xử lý bằng NaOH hay KOH và có thể thu hồi dễ dàng từ
dịch thủy phân bằng phản ứng với CO2 (Mosier và cs., 2005b).
Cho thêm một tác nhân oxi hóa (Oxy/H2O2) vào phương pháp tiền xử lý bằng kiềm (NaOH/Ca(OH)2)
có thể cải thiện hiệu quả thông qua thúc đẩy sự loại bỏ lignin (Carvalheiro và cs., 2008). Người ta đã
đạt được sản lượng ethanol 0.33 g/g trong các quy trình đường hóa và lên men đồng thời (SSCF)
bằng Escherichia coli FBR5 từ rơm lúa mạch được tiền xử lý bằng peroxit kiềm (Saha và Cotta,
2006). Hơn nữa, người ta không phát hiện được furfural hay HMF trong dịch thủy phân thu được từ
phương pháp tiền xử lý bằng peroxit kiềm là phương pháp tạo thuận lợi cho bước thủy phân trong
quy trình sản xuất ethanol (Taherzadeh và Karimi, 2008).

4.3.2. Phương pháp tiền xử lý bằng acid

Mục đích chủ yếu của các phương pháp tiền xử lý bằng axit là để hòa tan phần hemicellulose của
sinh khối và để làm cho phần cellulose có nhiều khả năng tiếp xúc với enzym hơn. Loại tiền xử lý này
có thể được tiến hành với axit đặc hay loãng nhưng việc sử dụng axit đặc trong sản xuất ethanol ít
được chú ý hơn do sự tạo thành các chất ức chế. Hơn nữa, vấn đề ăn mòn thiết bị và thu hồi axit là
những nhược điểm quan trọng khi sử dụng các phương pháp tiền xử lý bằng axit đặc. Chi phí vận
hành và bảo dưỡng cao làm giảm sự quan tâm đến việc áp dụng phương pháp tiền xử lý bằng axit
đặc ở quy mô thương mại (Wyman, 1996).
Phương pháp tiền xử lý bằng axit loãng dường như là phương pháp được lựa chọn hơn cho các ứng
dụng công nghiệp và đã được nghiên cứu để tiền xử lý nhiều loại sinh khối lignocellulose. Nhiều loại
reactor khác nhau như reactor chiết ngâm, dòng chảy theo vòi, shrinking-bed, mẻ và đối lưu đã được
áp dụng để tiền xử lý các nguyên liệu lignocellulose (Taherzadeh và Karimi, 2008). Nó có thể được
tiến hành ở nhiệt độ cao (ví dụ 180 °C) trong khoảng thời gian ngắn; hay ở nhiệt độ thấp hơn (ví dụ
120 °C) trong khoảng thời gian dài hơn (30–90 phút). Nó cho thấy ưu thế về hòa tan hemicellulose,
chủ yếu là xylan và còn chuyển đổi hemicellulose thành các đường có khả năng lên men. Tuy nhiên,
tùy vào nhiệt độ của quy trình mà một số hợp chất thoái biến đường như furfural và HMF và các hợp
chất vòng thơm thoái biến lignin có thể được phát hiện và ảnh hưởng đến chuyển hóa của vi sinh vật
trong bước lên men (Saha và cs., 2005). Tuy nhiên, phương pháp tiền xử lý này phát sinh ít các sản
phẩm thoái biến hơn so với các phương pháp tiền xử lý bằng axit đặc.

Đã có báo cáo về việc thu được nhiều sản phẩm thủy phân khi tiền xử lý các nguyên liệu
lignocellulose bằng H2SO4 loãng, một loại axit được nghiên cứu nhiều nhất. Axit chlorhydric,
phosphoric và nitric cũng đã được thử nghiệm (Mosier và cs., 2005a). Sản phẩm của quá trình
đường hóa thu được cao tới 74% khi rơm cây lúa mạch được xử lý bằng H2SO4 0.75% về thể tích ở
nhiệt độ 121 °C trong thời gian 1h (Saha và cs., 2005). Sinh khối của cây oliu được tiền xử lý bằng
H2SO4 1.4% ở 210 °C thu được sản phẩm thủy phân 76.5% (Cara và cs., 2008). Gần đây, người ta
đạt được sản lương ethanol cao tới 0.47 g/g glucose trong phản ứng lên men của bã quả đào lộn hột
được tiền xử lý bằng H2SO4 loãng ở 121 °C trong thời gian 15 phút (Rocha và cs., 2009).
Các axit hữu cơ như fumaric hay maleic dường như là phương án thay thế để tăng cường thủy phân
cellulose phục vụ sản xuất ethanol. Trong bối cảnh này, cả hai axit tương đương với axit sulfuric về
phương diện sản phẩm thủy phân từ rơm lúa mạch và sự tạo thành các chất thoái biến của đường
trong quá trình tiền xử lý. Các kết quả cho thấy các axit hữu cơ có thể tiền xử lý rơm lúa mạch với
hiệu suất cao mặc dù axit fumaric ít hiệu quả hơn axit maleic. Hơn nữa, furfural được tạo thành ít hơn
trong các phương pháp tiền xử lý bằng axit maleic và fumaric so với axit sulfuric (Kootstra và cs.,
2009).

4.3.3. Ly giải bằng ozon

Ozon là chất oxi hóa mạnh cho thấy hiệu quả cao trong thoái biến lignin (Sun và Cheng, 2002). Sự
loại bỏ lignin làm tăng sản lượng của quá trình thủy phân bằng enzym sau đó. Tiền xử lý thường
được tiến hành ở nhiệt độ phòng và áp suất bình thường và không dẫn đến việc tạo thành các chất
ức chế có thể ảnh hưởng đến quá trình thủy phân và lên men tiếp theo. Ly giải bằng ozon đã được
áp dụng đối với một vài loại sản phẩm nông nghiệp như rơm cây lúa mạch và lúa mạch đen, nó làm
tăng sản lượng thủy phân bằng enzym sau tiền xử lý bằng ozon trong cả hai trường hợp (García-
Cubero và cs., 2009).. Mặc dù có một số kết quả hấp dẫn nhưng cần phải tiến hành các nghiên cứu
sâu hơn liên quan đến sản xuất ethanol từ nguyên liệu lignocellulose bằng ozon. Một bất lợi quan
trọng cần xem xét đến là cần dùng đến lượng lớn ozon, điều này có thể khiến quy trình không đảm
bảo về mặt kinh tế.(Sun và Cheng, 2002).

4.3.4. Dung môi hữu cơ

Phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ là một chiến lược tiền xử lý nhiều hứa hẹn, vì nó đã cho
thấy tiềm năng đối với các nguyên liệu lignocellulose (Papatheofanous và cs., 1995). Người ta có thể
sử dụng nhiều loại hỗn hợp dung môi hữu cơ bao gồm methanol, ethanol, aceton, ethylen glycol và
cồn tetrahydrofurfuryl để hòa tan lignin và tạo ra cellulose thích hợp với phản ứng thủy phân bằng
enzym (Zhao và cs., 2009a). So với các phương pháp tiền xử lý hóa học khác thì ưu thế chính của
quy trình sử dụng dung môi hữu cơ là thu hồi được sản phẩm phụ là lignin tương đối tinh khiết (Zhao
và cs., 2009a).
Trong một số nghiên cứu những hỗn hợp này được kết hợp với các chất xúc tác axit (HCl, H2SO4,
oxalic hoặc salicylic) để phá vỡ các liên kết hemicellulose. Người ta thường thu được sản lượng cao
xylose khi cho thêm axit. Tuy nhiên, người ta có thể tránh việc cho thêm axit này bằng cách tăng
nhiệt độ của quy trình (trên 185 °C) để khử lignin hiệu quả.
Quy trình sử dụng dung môi hữu cơ đã được đề xuất kết hợp với thủy phân bằng axit trước đó để
phân tách hemicellulose và lignin thành hai phân đoạn. Với quy trình này, lượng lignin đã được loại
bỏ cao (70%) và lượng cellulose tối thiểu bị mất đi (dưới 2%) (Papatheofanous và cs., 1995).

4.3.5. Phương pháp tiền xử lý sử dụng các chất lỏng ion (IL)
Gần đây, việc sử dụng các IL như là các dung môi cho tiền xử lý sinh khối cellulose đã nhận được
nhiều sự chú ý. Các IL là các muối, điển hình bao gồm các cation hữu cơ lớn và các anion vô cơ nhỏ,
tồn tại dưới dạng chất lỏng ở nhiệt độ tương đối thấp; thường là nhiệt độ phòng. Đặc điểm dung môi
của chúng có thể thay đổi bằng cách điều chỉnh anion và các nhóm alkyl của cation. Những đặc điểm
hấp dẫn này bao gồm khả năng bền vững với nhiệt độ và hóa chất, không có khả năng gây cháy, áp
suất hơi thấp và xu hướng giữ trạng thái lỏng ở giải nhiệt động rộng (Hayes, 2009). Vì không có chất
khí độc hại và gây nổ nào được tạo thành nên các IL được gọi là các dung môi "xanh". Các
cacbonhydrate và lignin có thể được hòa tan đồng thời trong các IL với hoạt tính anion (ví dụ cation
1-butyl-3 methylimidazolium [C4mim]+) vì các IL tạo thành các liên kết hydro giữa các ion clor không
bị hydrat hóa của IL và các proton của nhóm hydroxyl của đường theo tỷ lệ 1:1. Kết quả là mạng lưới
phức tạp của các tương tác yếu của các polymer sinh khối của cellulose, hemicellulose và lignin bị
phá vỡ một cách hiệu quả đồng thời giảm thiểu sự hình thành các sản phẩm thoái biến. Tuy nhiên,
hầu hết các dữ liệu cho thấy hiệu quả của IL đã thu được bằng cách sử dụng cellulose tinh thể tinh
khiết, và khả năng ứng dụng của nó với các phức hợp các thành phần phức tạp hơn trong sinh khối
lignocellulose đòi hỏi có các nghiên cứu sâu hơn. Tuy nhiên, việc sử dụng các IL cũng đã được mô tả
ở một số nguyên liệu lignocellulose như rơm (Li và cs., 2009) hay gỗ (Lee và cs., 2009)

Để ứng dụng các IL trên quy mô lớn thì sự phát triển các phương pháp tái sử dụng hiệu quả về mặt
năng lượng đối với các IL là điều kiện tiên quyết và cần được khảo sát kỹ lưỡng. Độc tính đối với các
enzym và các vi sinh vật lên men cũng phải được nghiên cứu trước khi các IL có thể được xem như
là một lựa chọn khả thi cho tiền xử lý sinh khối ([Yang và Wyman, 2008] và[Zhao và cs., 2009b]). Phụ
thuộc vào số lượng các IL còn lại mà người ta có thể quan sát thấy hiệu ứng ức chế đáng kể đối với
hoạt tính của enzym cellulase. Bởi vậy, loại bỏ các thành phần IL có thể cần thiết để ngăn ngừa sự
giảm sút nồng độ các đường sau cùng.

Trong một nghiên cứu về tiền xử lý bằng cách sử dụng 1-ethyl-3-methyl imidazolium diethyl
phosphate, sản lượng các đường khử thu được từ rơm cây lúa mì với dịch lỏng ion này ở 130 °C
trong thời gian 30 phút là 54.8% sau khi thủy phân bằng enzym trong 12 h (Li và cs., 2009). Khả năng
lên men của dịch lỏng thủy phân thu được sau quá trình tạo đường nhờ enzym của rơm cây lúa mì
được tái sử dụng cũng đã được khảo sát. Những kết quả thu được bằng cách sử dụng
Saccharomyces cerevisiae đã chỉ ra rằng rơm cây lúa mì đã được tiền xử lý bằng IL này không gây
ra bất cứ hiệu ứng ức chế nào đối với sự phát triển của S. cerevisiae (Li và cs., 2009).
Cần tiến hành các nghiên cứu sâu hơn để cải thiện tính kinh tế của tiền xử lý bằng các IL trước khi
chúng có thể được áp dụng trên quy mô công nghiệp. Công nghệ còn đắt tiền và các phương pháp
thu hồi IL mang tính kinh tế vẫn chưa được phát triển hoàn thiện. Bên cạnh đó, các kỹ thuật cần
được phát triển để thu hồi hemicellulose và lignin từ các dung dịch sau khi tách chiết cellulose
(Hayes, 2009). Mặc dù có những hạn chế hiện thời này, nghiên cứu tiên tiến như sự tiềm năng tổng
hợp các IL từ các cacbonhydrate có thể sẽ đóng vai trò trong việc làm giảm giá thành của chúng.
Phát triển phương pháp tiền xử lý sử dụng các IL mang lại tiềm năng to lớn cho các quy trình tinh chế
sinh học lignocellulose trong tương lai.

4.4. Các phương pháp tiền xử lý hóa lý

4.4.1. Bung hơi nước áp suất cao: Bung hơi nước áp suất cao - SO2
Bung hơi nước áp suất cao là phương pháp tiền xử lý bằng hóa lý đối với sinh khối lignocellulose
được áp dụng rộng rãi nhất. Đó là phương pháp tiền xử lý thủy nhiệt trong đó người ta cho sinh khối
tiếp xúc với hơi nước áp suất cao trong khoảng thời gian từ vài giây đến vài phút và sau đó giảm áp
suất đột ngột. Phương pháp tiền xử lý này kết hợp các lực cơ học và các hiệu ứng hóa học do sự
thủy phân (tự thủy phân) của các nhóm acetyl có trong hemicellulose.
Sự tự thủy phân diễn ra khi nhiệt độ cao thúc đẩy sự hình thành axit acetic từ các nhóm acetyl; hơn
nữa, nước còn có thể hoạt động như một axit ở nhiệt độ cao. Hiệu ứng cơ học gây ra bởi áp suất
giảm đột ngột và các sợi bị tách nhau ra nhờ sự giải nén bùng phát. Cùng với sự thủy phân và hòa
tan một phần hemicellulose thì lignin cũng được tái phân bố và bị loại bỏ ở mức độ nhất định khỏi
nguyên liệu (Pan et al., 2005). Sự loại bỏ hemicellulose sẽ bộc lộ bề mặt cellulose và gia tăng khả
năng xâm nhập của enzym vào các vi sợi cellulose.
Các yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hiệu quả của hơi nước áp suất cao là kích thước hạt,
nhiệt độ, thời gian lưu và hiệu ứng tổng hợp của các nhiệt độ (T) và thời gian (t), được diễn tả bởi
yếu tố khắc nghiệt (Ro) [Ro = t * e[T-100/14.75]], với các điều kiện tối ưu để thu được lượng đường
tối đa thì yếu tố khắc nghiệt có giá trị từ 3.0 đến 4.5 (Alfani et al., 2000). Nhiệt độ càng cao sẽ loại bỏ
càng nhiều hemicellulose từ thành phần chất rắn và càng tăng khả năng thủy phân của cellulose, nó
cũng thúc đẩy sự thoái biến đường nhiều hơn.

Quy trình bung hơi nước áp suất cao có nhiều đặc điểm hấp dẫn khi so sánh với các công nghệ tiền
xử lý khác. Những đặc điểm này gồm có tiềm năng ảnh hưởng đến môi trường thấp hơn đáng kể,
giảm đầu tư vốn, nhiều tiềm năng về hiệu quả năng lượng hơn, các hóa chất và điều kiện của quy
trình ít độc hại hơn và thu hồi đường hoàn toàn (Avellar và Glasser, 1998). Cùng với những ưu thế
chính, cần đề cập đến khả năng sử dụng kích thước mảnh lớn, không cần thêm chất xúc tác axit (trừ
các gỗ mềm), thu hồi đường cao, nhiều sản phẩm thủy phân thu được trong quá trình thủy phân nhờ
enzym và tính khả thi của nó khi phát triển lên quy mô công nghiệp. Điều đáng chú ý là tiêu hao năng
lượng để thu được kích thước mảnh nhỏ trước khi tiền xử lý có thể chiếm tới một phần ba yêu cầu
năng lượng của toàn bộ quá trình (Hamelinck và cs., 2005). Hơn nữa, mặc dù trước đây khả năng
tránh việc phải dùng các chất xúc tác đã được công bố như là một ưu điểm nhưng việc cho thêm
chất xúc tác axit cũng đã được mô tả như là một cách thức để gia tăng khả năng phân giải cellulose
để cải thiện sự thủy phân hemicellulose và phụ thuộc vào nhiệt độ để làm giảm hình thành các hợp
chất thoái biến (Sun và Cheng, 2002). Vì giảm chi phí và tiêu thụ năng lượng ít là cần thiết để có một
công nghệ tiền xử lý hiệu quả nên kích thước mảnh lớn cũng như không phải cho thêm axit có thể
thích hợp để tối ưu hóa tính hiệu quả của quá trình (Hamelinck và cs., 2005).

Mặc dù việc sử dụng axit trong phương pháp bung hơi nước áp suất cao được cho là có một số
nhược điểm, nhiều phương pháp tiền xử lý (SO2-bung áp suất cao) bao gồm việc cho thêm axit
ngoại lai (H2SO4) để xúc tác sự hòa tan của hemicellulose, giảm nhiệt độ tối ưu của tiền xử lý và
khiến cellulose bị thủy phân một phần ([Brownell và cs., 1986] và[Tengborg và cs., 1998]). Tuy nhiên,
trở ngại chính khi sử dụng các axit liên quan đến các yêu cầu về thiết bị và sự hình thành nhiều hơn
các hợp chất thoái biến ([Mosier và cs., 2005b] và[Palmqvist và Hahn-Hägerdal, 2000]). Nói chung,
bung hơi nước xúc tác bởi SO2 được coi là một phương pháp hiệu quả nhất để tiền xử lý nguyên liệu
gỗ mềm (Tengborg và cs., 1998).

Công nghệ bung hơi nước áp suất cao đã được xác nhận trong sản xuất ethanol từ nhiều loại
nguyên liệu như cây bạch dương (Oliva và cs., 2003), các bộ phận cây oliu (Cara và cs., 2006), các
bộ phận của cây thân thảo như thân lá cây ngô (Varga và cs., 2004), thân cây lúa mạch. Nó đã hoạt
động đạt kết quả tốt với các loại gỗ cứng và các sản phẩm trong nông nghiệp hay các sinh khối của
cây thân thảo nhưng nó không thật sự hiệu quả với các loại gỗ mềm do hàm lượng các nhóm acetyl
thấp của phần hemicellulose (Sun và Cheng, 2002).

Với mục đích gia tăng cực đại thu hồi đường, một số tác giả đã đề xuất phương pháp tiền xử lý hai
bước. Trong bước thứ nhất, tiền xử lý được tiến hành ở nhiệt độ thấp để hoà tan phần hemicellulose
và phần cellulose thì được đưa vào bước tiền xử lý thứ hai ở nhiệt độ cao hơn 210 °C. Nó tao ra
thêm một số ưu điểm như sản lượng ethanol cao hơn, sử dụng tốt hơn nguyên liệu và hàm lượng
enzym sử dụng thấp hơn trong quá trình thủy phân bằng enzym. Tuy nhiên, cần tiến hành khảo sát
về khía cạnh kinh tế để xác định tính hiệu quả của bung hơi nước ở áp suất cao bổ sung.

Mặc dù việc sử dụng axit trong phương pháp bung hơi nước áp suất cao được cho là có một số
nhược điểm, nhiều phương pháp tiền xử lý (SO2-bung áp suất cao) bao gồm việc cho thêm axit
ngoại lai (H2SO4) để xúc tác sự hòa tan của hemicellulose, giảm nhiệt độ tối ưu của tiền xử lý và
khiến cellulose bị thủy phân một phần ([Brownell và cs., 1986] và[Tengborg và cs., 1998]). Tuy nhiên,
trở ngại chính khi sử dụng các axit liên quan đến các yêu cầu về thiết bị và sự hình thành nhiều hơn
các hợp chất thoái biến ([Mosier và cs., 2005b] và[Palmqvist và Hahn-Hägerdal, 2000]). Nói chung,
bung hơi nước xúc tác bởi SO2 được coi là một phương pháp hiệu quả nhất để tiền xử lý nguyên liệu
gỗ mềm (Tengborg và cs., 1998).
Công nghệ bung hơi nước áp suất cao đã được xác nhận trong sản xuất ethanol từ nhiều loại
nguyên liệu như cây bạch dương (Oliva và cs., 2003), các bộ phận cây oliu (Cara và cs., 2006), các
bộ phận của cây thân thảo như thân lá cây ngô (Varga và cs., 2004), thân cây lúa mạch. Nó đã hoạt
động đạt kết quả tốt với các loại gỗ cứng và các sản phẩm trong nông nghiệp hay các sinh khối của
cây thân thảo nhưng nó không thật sự hiệu quả với các loại gỗ mềm do hàm lượng các nhóm acetyl
thấp của phần hemicellulose (Sun và Cheng, 2002).
Với mục đích gia tăng cực đại thu hồi đường, một số tác giả đã đề xuất phương pháp tiền xử lý hai
bước. Trong bước thứ nhất, tiền xử lý được tiến hành ở nhiệt độ thấp để hoà tan phần hemicellulose
và phần cellulose thì được đưa vào bước tiền xử lý thứ hai ở nhiệt độ cao hơn 210 °C. Nó tao ra
thêm một số ưu điểm như sản lượng ethanol cao hơn, sử dụng tốt hơn nguyên liệu và hàm lượng
enzym sử dụng thấp hơn trong quá trình thủy phân bằng enzym. Tuy nhiên, cần tiến hành khảo sát
về khía cạnh kinh tế để xác định tính hiệu quả của bung hơi nước ở áp suất cao bổ sung.

4.4.2. Nước nóng thể lỏng

Nước nóng thể lỏng là phương pháp xử lý thủy nhiệt khác mà không đòi hỏi sự giảm áp nhanh và
không sử dụng các chất xúc tác hay các hóa chất. Áp suất được sử dụng để duy trì nước ở trạng thái
lỏng khi nhiệt độ tăng cao (160–240 °C) và thúc đẩy sự biến đổi về cấu trúc của lignocellulose. Mục
đích của nước nóng thể lỏng là hòa tan chủ yếu hemicellulose, để làm cho cellulose có nhiều khả
năng được tiếp cận hơn và tránh sự tạo thành các chất ức chế, pH cần giữ ở mức giữa 4 và 7 trong
quá trình tiền xử lý vì ở pH này thì các đường hemicellulose được giữ ở dạng oligo và sự tạo thành
đường đơn được giảm thiểu. Bởi vậy sự tạo thành các sản phẩm thoái biến cũng thấp hơn.
Phương pháp nước nóng thể lỏng đã cho thấy có thể loại bỏ đến 80% hemicellulose và tăng cường
sự phân giải nhờ enzym của các nguyên liệu qua tiền xử lý ở các nguyên liệu thân thảo như thân lá
cây ngô, bã mía và thân cây lúa mạch. Tiền xử lý hai bước đã được nghiên cứu để tối ưu hóa thu hồi
các đường hemicellulose và tăng sản phẩm thu được của phản ứng thủy phân nhờ enzym. Lignin
được khử polymer một phần và còn được hòa tan trong quá trình tiền xử lý bằng nước nóng nhưng
sự khử lignin hoàn toàn không thể đạt được chỉ bằng nước nóng, vì sự tái hóa đặc của các thành
phần hòa tan có nguồn gốc từ lignin.
Các hệ thống dòng chảy liên tục đã được báo cáo để loại bỏ nhiều hơn hemicellulose và lignin so với
hệ thống mẻ từ một số loại nguyên liệu. Cho thêm axit ngoại lai trong quy trình dòng chảy liên tục
cũng đã được nghiên cứu nhưng người ta vẫn còn tranh luận liệu việc cho thêm axit có làm tăng loại
bỏ hemicellulose và lignin hay không.
Nhìn chung, các phương pháp tiền xử lý nước nóng thể lỏng hấp dẫn nhờ vào khả năng tiết kiệm chi
phí: không đòi hỏi chất xúc tác và xây dựng lò phản ứng giá rẻ nhờ vào khả năng ít bị ăn mòn. Nó
còn có ưu điểm lớn là các sản phẩm hemicellulose và lignin được hòa tan có mặt với nồng độ thấp,
nhờ vào nguồn nước đi vào nhiều và kéo theo nồng độ của các sản phẩm thoái biến giảm. So với
phương pháp bung hơi nước, người ta thu hồi được lượng đường pentose cao hơn và sự hình thành
các yếu tố ức chế thấp hơn, tuy nhiên yêu cầu về nước trong quy trình và yêu cầu năng lượng cao
hơn và nó chưa được phát triển lên quy mô thương mại.

4.4.3. Bung sợi amoniac (AFEX)

Trong quy trình AFEX, sinh khối được xử lý bằng amoniac khan dạng lỏng ở nhiệt độ từ 60 đến 100
°C với áp suất cao trong khoảng thời gian khác nhau. Sau đó áp suất được loại bỏ dẫn đến sự lan
tỏa nhanh chóng của khí amoniac để gây ra sự trương phồng và phá vỡ về vật lý các sợi của sinh
khối và khử kết tinh một phần của cellulose. Trong khi một số phương pháp tiền xử lý khác như bung
hơi nước tạo thành dạng bùn vữa có thể phân tách thành các phần rắn và lỏng thì AFEX chỉ tạo
thành một chất liệu rắn đã qua xử lý.
AFEX đã được báo cáo là làm giảm mức độ kết tinh của cellulose và phá vỡ các liên kết lignin-
carbohydrate. Trong quá trình tiền xử lý chỉ một lượng nhỏ chất liệu rắn được hòa tan; một phần nhỏ
hemicellulose và lignin được loại bỏ. Khử acetyl của hemicellulose cũng được quan sát. AFEX loại bỏ
tối thiểu các nhóm acetyl từ những loại nguyên liệu lignocellulose nhất định. Khả năng bị phân giải
của sinh khối được gia tăng sau tiền xử lý bằng phương pháp AFEX và bởi thế sự thủy phân nhờ
enzym tạo ra nhiều sản phẩm hơn. Quá trình thủy phân cần đến cả enzym cellulase và hemicellulase
do một lượng đáng kể hemicellulose còn lại trong nguyên liệu đã qua tiền xử lý.
Thu hồi và tái sử dụng amoniac có tính khả thi mặc dù tinh linh động khá cao của chúng nhưng sự
phức tạp và giá thành liên quan đến việc thu hồi amoniac có thể là đáng kể khi tính đến khả năng
thương mại của tiền xử lý AFEX.
Một trong những ưu điểm chính của tiền xử lý bằng amoniac là không tạo thành các chất ức chế
trong các quá trình sinh học diễn ra sau đó, tuy nhiên một số phân đoạn kiểu phenol của lignin và các
chất khác của thành tế bào có thể tồn tại trên bề mặt của cellulose.

Tiền xử lý AFEX hiệu quả hơn ở các sản phẩm nông nghiệp và thực vật thân cỏ và có hiệu quả hạn
chế đã được mô tả ở các sinh khối dạng gỗ và các nguyên liệu khác có hàm lượng lignin cao. Đã có
các chiến lược được báo cáo gần đây để tối ưu hóa các điều kiện của tiền xử lý AFEX trong các
nghiên cứu sử dụng các nguyên liệu khác nhau. Ở những điều kiện tối ưu, AFEX có thể chuyển tới
90% cellulose và hemicellulose thành các đường có thể lên men đối với nhiều loại nguyên liệu
lignocellulose. Thực sự là dù cho sự loại bỏ lignin hay hemicellulose ít trong quy trình AFEX, sự phân
giải nhờ enzym với hàm lượng enzym sử dụng thấp cho ra kết quả rất cao khi so sánh với các
phương pháp tiền xử lý thay thế khác. Điều này có thể gợi ý rằng amoniac ảnh hưởng đến lignin và
có thể hemicellulose khác với các hóa chất khác, làm giảm khả năng của lignin hấp phụ enzym
và/hoặc làm cho enzym khó xâm nhập vào cellulose hơn. Giảm yêu cầu và nồng độ của amoniac và
giảm nồng độ enzym được sử dụng trong khi duy trì được sự chuyển đổi cao của cellulose và
hemicellulose có thể làm giảm giá thành tổng thể của sản xuất ethanol bằng quy trình AFEX. Gần
đây, tiền xử lý AFEX đã được áp dụng thành công trong các quy trình đường hóa và đồng lên men
với các chủng S. cerevisisae tái tổ hợp và cho sản lượng ethanol cao.
Hơn nữa, bên cạnh sản xuất ethanol thì tiền xử lý AFEX được cho thấy là một phương pháp khả thi
để xử lý cỏ ba chẽ để tách chiết protein. Trong bối cảnh này, sự thu hồi cả đường và protein có thể là
một hướng tiếp cận khả thi để tinh chế sinh học cellulose nhằm giảm giá bán ethanol.

Một loại quy trình khác sử dụng amoniac là hồi lưu tái sử dụng amoniac (ARP) trong đó amoniac
dung dịch (5-15% khối lượng) đi qua lò phản ứng chứa sinh khối. Nhiệt độ thường được đặt ở 140–
210 °C, thời gian phản ứng đến 90 phút và sự tốc độ hồi lưu khoảng 5mL/phút. ARP có thể hòa tan
hemicellulose nhưng cellulose vẫn không bị biến đổi. Nó tạo ra nguyên liệu cellulose mạch ngắn với
hàm lượng glucan cao. Một trở ngại quan trọng của ARP là làm giảm lượng chất lỏng sử dụng và
giảm nhiệt độ của quy trình để giảm chi phí về năng lượng. Trong bối cảnh này, ngâm amoniac dung
dịch (SAA) dường như là biện pháp thay thế hấp dẫn vì nó được tiến hành ở nhiệt độ thấp hơn (30–
75 °C) và là một trong số ít các phương pháp tiền xử lý mà cả glucan và xylan vẫn còn lại trong các
phần rắn. Nhờ đó, nó tạo thành nguyên liệu qua tiền xử lý rất tốt để sử dụng với các vi sinh vật lên
men đường pentose. Hơn nữa, sự thu hồi xylose cao ở nhiệt độ thấp nên lượng chất ức chế được
giải phóng từ sự thoái biến đường thấp hơn. Gần đây, người ta thu được sản lượng ethanol cao tới
89.4% so với lượng lý thuyết từ trấu lúa mạch được xử lý bằng SAA trong quy trình SSCF sử dụng E.
coli tái tổ hợp KO11 (Kim et al., 2008b).

4.4.4. Oxi hóa ướt

Oxi hóa ướt là phương pháp tiền xử lý oxi hóa sử dụng oxi hay không khí là chất xúc tác. Nó cho
phép hoạt động của lò phản ứng ở nhiệt độ tương đối thấp và thời gian phản ứng ngắn. Oxi hóa
được tiến hành trong khoảng 10-15 phút ở nhiệt độ từ 170 đến 200 °C và áp suất O2 từ 10 đến 12
bar. Bổ sung oxy ở nhiệt độ trên 170 °C khiến quy trình có tính chất tỏa nhiệt và làm giảm yêu cầu
năng lượng tổng số. Các phản ứng chính của phương pháp oxi hóa ướt là sự tạo thành các axit từ
các quá trình thủy phân và các phản ứng oxi hóa.
Nó đã được chứng minh là một phương pháp hiệu quả để hòa tan hemicellulose và lignin và đặc biệt
là làm tăng khả năng bị phân giải của cellulose. Nó đã được sử dụng rộng rãi để sản xuất ethanol
ngay trước SSF.
Các hợp chất phenol không phải là các sản phẩm cuối cùng trong quá trình oxi hóa ướt vì chúng bị
phân hủy tiếp thành các axit carboxylic. Tuy nhiên, sự tạo thành furfural và HMF thấp hơn trong quá
trình oxi hóa ẩm khi so sánh với phương pháp bung hơi nước áp suất cao hay LHW. Bổ sung
Na2CO3 đã cho thấy làm giảm sự tạo thành các chất ức chế bằng cách duy trì pH trong giải từ kiềm
đến trung tính.
Tiền xử lý rơm cây lúa mạch với Na2CO3 thu hồi được 96% cellulose (65% được chuyển thành
glucose) và 70% hemicellulose. Sản phẩm thu được cao cũng đạt được sau tiền xử lý oxi hóa ướt
thân và lá cây ngô và cây vân sam. Nhìn chung, phương pháp tiền xử lý oxi hóa ướt dẫn đến sự tạo
thành các chất ức chế thấp và loại bỏ một cách hiệu quả lignin. Mặt khác, giá thành của oxy và chất
xúc tác được xem là một trong những nhược điểm chính của công nghệ oxi hóa ướt.

4.4.5. Tiền xử lý vi sóng

Tiền xử lý dựa vào vi sóng có thể được xem là phương pháp hóa lý vì liên quan đến cả hiệu ứng
nhiệt và hiệu ứng không liên quan đến nhiệt. Tiền xử lý được thực hiện bằng cách ngâm sinh khối
trong các hóa chất được pha loãng và xử lý bằng vi sóng trong thời gian từ 5 đến 20 phút. Các thí
nghiệm ban đầu đã xác các chất kiềm là những hóa chất thích hợp cho tiền xử lý dựa trên vi sóng.
Sự đánh giá các chất kiềm khác nhau đã xác định Natri hydroxit là chất kiềm có hiệu quả cao nhất.

4.4.6. Tiền xử lý bằng siêu âm

Hiệu quả của sóng siêu âm lên sinh khối lignocellulose đã được ứng dụng để tách chiết
hemicellulose, cellulose và lignin nhưng ít nghiên cứu tập trung vào tìm hiểu độ nhạy của nguyên liệu
lignocellulose đối với sự thủy phân. Mặc dù có ít nghiên cứu về tiền xử lý bằng siêu âm của
lignocellulose nhưng một số nhà nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng sự đường hóa của cellulose được
tăng cường một cách hiệu quả nhờ vào tiền xử lý bằng siêu âm.
Tiền xử lý bằng siêu âm dẫn tới sản phẩm thủy phân nhờ enzym thu được cao hơn, điều này có thể
được giải thích là nhờ hiệu ứng tạo lỗ gây ra bởi đưa sóng siêu âm vào dung dịch xử lý chứa enzym
tăng cường mạnh mẽ sự vận chuyển các đại phân tử enzym về phía bề mặt của cơ chất. Ngoài ra,
tác động cơ học gây ra bởi sự phá vỡ các bọt rỗng cũng mang lại một tác dụng quan trọng để làm
tăng diện tích bề mặt của các cơ chất rắn tạo thuận lợi cho hoạt động của enzym, bên cạnh đó, hiệu
ứng tạo lỗ tối đa xảy ra ở 50 °C, đây là nhiệt độ tối ưu đối với nhiều enzym.

4.4.7. Phương pháp bung CO2

Phương pháp bung CO2 cũng được sử dụng để tiền xử lý sinh khối lignocellulose. Phương pháp này
dựa vào việc sử dụng CO2 là một dịch lỏng siêu tới hạn, đây là dịch lỏng ở thể khí nhưng được nén
thành mật độ giống như chất lỏng ở các nhiệt độ trên điểm tới hạn của nó. Các điều kiện tiền xử lý
siêu tới hạn có thể loại bỏ một cách hiệu quả lignin và làm tăng khả năng bị phân giải của cơ chất. Bổ
sung các đồng dung môi như ethanol có thể cải thiện sự khử lignin. CO2 siêu tới hạn chủ yếu được
sử dụng làm dung môi tách chiết nhưng nó hiện đang được cân nhắc dùng cho các mục đích không
liên quan đến tách chiết nhờ vào nhiều ưu điểm của nó. Trong dung dịch với nước CO2 tạo thành
acid cacbonic, là yếu tố tạo thuận lợi cho sự thủy phân của polymer. Các phân tử CO2 có kích thước
tương đương với phân tử nước và phân tử amoniac và chúng có thể xâm nhập theo cùng một cách
vào các lỗ của lignocellulose. Cơ chế này được tăng cường nhờ áp suất cao. Sau khi giảm đột ngột
áp suất CO2, người ta thấy sự phá vỡ của cellulose và hemicellulose và hệ quả là diện tích tiếp xúc
bề mặt của cơ chất để enzym tiến hành xúc tác tăng lên.

Hoạt động ở nhiệt độ thấp hơn so với các phương pháp khác ngăn chặn sự thoái biến của các
đường đơn, nhưng so với phương pháp bung hơi nước và amoniac thì sản lượng đường thu được
thấp hơn. Tuy nhiên, sự so sánh của các phương pháp tiền xử lý khác với một số cơ chất cho thấy
rằng phương pháp bung CO2 có tính kinh tế hơn so với bung amoniac và sự tạot thành các chất ức
chế thấp hơn so với phương pháp bung hơi nước (Zheng và CS, 1998). Phương pháp CO2 siêu tới
hạn cải thiện sự thủy phân nhờ enzym ở cây dương lá rung và cây thông vàng phương nam (Kim
and Hong, 2001).

Dù sao thì nhưng cố gắng hiện tại để phát triển những phương pháp này vẫn chưa đảm bảo được
tính kinh tế. Đặc biệt là, những đòi hỏi để có một áp suất rất cao là một vấn để quan ngại. Trái lại,
việc sử dụng oxit cacbon là một lựa chọn hấp dẫn để làm giảm giá thành vì quá trình lên men ethanol
cũng là quá trình sản xuất CO2. Những ưu điểm khác là không độc hại, không gây cháy và dễ thu hồi
sau tách chiết.

5. Kết luận và đề nghị

Phương pháp tiền xử lý khác nhau đối với nguyên liệu chứa lignocellulosic đã được mô tả và nghiên
cứu rộng rãi để cải thiện quy trình sản xuất ethanol. Tất cả những phương pháp này nên làm cho các
lignocellulose có khả năng tiếp cận đến các phản ứng enzyme, tại tinh thể của cellulose, vùng bề mặt
có thể tiếp cận của nó, và các chất lignin và hemixenluloza là yếu tố ảnh hưởng chính đến đến sự
thủy phân nhờ enzym. Bảng 1 cho thấy những ưu điểm và nhược điểm chính của phương pháp tiền
xử lý triển vọng nhất, trong khi Bảng 2 tóm tắt các tác động đáng kể nhất của các công nghệ khác
nhau trên cấu trúc của lignocellulose.
Bảng 1. Tóm tắt những lợi thế và bất lợi của các phương pháp khác nhau đối với việc tiền xử lý sinh
khối chứa lignocelulose.

Phương
Thuận lợi Bất lợi
pháp

– Phân hủy lignin và hemicellulose

Sinh học – Tốc độ thủy phân thấp
– Nhu cầu năng lượng thấp

Nghiền xay – Giảm tinh thể cellulose – Nhu cầu năng lượng cao

– Thay đổi cấu trúc lignin và hòa tan

hemicellulose
– Sinh ra các hợp chất gây độc
Nổ hơi – Hiệu quả chi phí
– Phân hủy 1 phần hemicellulose
– Năng suất glucose và hemicellulose cao trong
phương pháp 2 bước

– Không hiệu quả với nguyên liệu

– Tăng khả năng tiếp cận bề mặt có lignin cao
AFEX
– Sự tạo thành các chất ức chế thấp – Chi phí cao do lượng lớn
ammonia

– Tăng khả năng tiếp cận bề mặt – Không tác động lên lignin và
CO2 explosion – Hiệu quả chi phí hemicelluloses
– Không sinh ra các hợp chất gây độc – Đòi hỏi áp suất cao

– Hiệu quả trong loại bỏ lignin

– Chi phí cao cho xúc tác oxy và
Wet oxidation – Sinh ra ít chất ức chế
kiềm
– Nhu cầu năng lượng thấp (tỏa nhiệt)

Ly giải bằng – Giảm hàm lượng lignin

– Chi phí cao cho ozone
ozon – Không sinh ra các hợp chất gây độc

Dung môi hữu – Chi phí cao

– Xảy ra sự thủy phân lignin and hemicellulose
cơ – Dung môi cần thải bỏ và tái sinh

– Chi phí cao cho acid và thu hồi

– Năng suất glucose cao
Acid đậm đặc – Hiện tưởng ăn mòn bình p.ứng
– Nhiệt độ môi trường
– Sinh ra các chất ức chế

– Hiện tượng ăn mòn ít hơn acid đặc – Sinh các sản phẩm phụ
Acid loãng
– Sự tạo thành các chất ức chế thấp – Nồng độ đường thấp ở đầu ra

Bảng 2. Tóm tắt các tác động đáng kể nhất của các công nghệ khác nhau trên cấu trúc của
lignocellulose.