Chương II.

Các kỹ thuật nền

trong công nghệ sinh học hiện đại

GV: Nguyễn Thị Kim Khang

 Nội dung
I. Các kỹ thuật chính sử dụng trong tạo DNA tái tổ hợp
1. Khái niệm về DNA tái tổ hợp
2. Các enzyme chủ yếu dùng trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp
3. Các vector sử dụng trong công nghệ tái tổ hợp
4. Các vector phage
5. Các loại tế bào chủ
II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA
1. Phương pháp tách chiết DNA
2. Các phương pháp lai acid nucleic
3. Các phương pháp giải trình tự gene
4. Kỹ thuật PCR
5. Các kỹ thuật xác định tính đa hình dựa trên PCR
6. Ngân hàng cDNA
 I. Các kỹ thuật chính sử dụng trong tạo DNA tái tổ hợp
(Recombinant DNA)

3. Các vector nhân dòng (cloning vector) sử dụng trong kỹ

thuật DNA tái tổ hợp
3.1. Khái niệm

Nhân dòng gene (gene cloning): quá trình

nhân bản các đoạn DNA đã cắt thành
nhiều bản đồng nhất và sắp xếp chúng
thành từng dòng riêng biệt

Vector: DNA ngắn dạng thẳng hay dạng

vòng, DNA cần nghiên cứu được cài
vào  DNA lạ

Vector nhân dòng: là một mãnh nhỏ DNA có gốc tái bản,
có thể nhân lên trong tế bào chủ
 I. Các kỹ thuật chính sử dụng trong tạo DNA tái tổ hợp
(Recombinant DNA)

3. Các vector nhân dòng (cloning vector) sử dụng trong kỹ

thuật DNA tái tổ hợp
3.2. Yêu cầu của một vector chuyển gene

+ Có điểm khởi đầu sao chép (origin of replication)

+ Có các đoạn trình tự nhận biết cho enzyme giới hạn cắt

+ Có một hay nhiều gene chỉ thị: kháng sinh, gene tổng hợp màu
 I. Các kỹ thuật chính sử dụng trong tạo DNA tái tổ hợp
(Recombinant DNA)

3. Các vector nhân dòng (cloning vector) sử dụng trong kỹ

thuật DNA tái tổ hợp
3.3. Các ứng dụng của vector chuyển gene

+ Tạo dòng, nhân dòng các đoạn trình tự/gene để tạo nhiều bản sao giống nhau

+ Nghiên cứu sự biểu hiện của một đoạn trình/gene tự

+ Chuyển gene vào tế bào của sinh vật khác

+ Sản xuất các RNA từ các DNA tạo dòng

+ Sản xuất protein tổng hợp từ gene được tạo dòng

 I. Các kỹ thuật chính sử dụng trong tạo DNA tái tổ hợp
(Recombinant DNA)

3. Các vector nhân dòng (cloning vector) sử dụng trong kỹ

thuật DNA tái tổ hợp
3.4. Chọn lựa vector

+ Phụ thuộc vào mục đích nghiên cứu

+ Kiểu của tế bào chủ để phù hợp với DNA nhận

Nhằm đạt được hiệu suất tối ưu cho từng mục đích nghiên cứu
 3.5. Các vector nhân dòng chủ yếu
plasmids phages cosmids Các vector khác
Phân tử DNA nhỏ, cấu trúc mạch Virus của vi khuẩn Vector lai nhân Plasmid Ti, YAC
vòng, nằm ngoài NST của tế bào tạo từ một (yeast artificial
vk plasmid với các chromosome),
trình tự cos của
phage
Kích thước: 1.5 – 300 kb 2 – 200 kb ~ 5kb

Phân loại: Phân loại: Ứng dụng: để Ứng dụng: Tách

+ Plasmid có số lượng bản sao + Virulent nhân dòng các dòng gene, lập
lớn (10 – 100) + Temperate đoạn DNA lớn ngân hàng genome,
+ Plasmid có số lượng bản sao (40-45 kb) dùng trong chuyển
nhỏ (1 – 4) gene ở tế bào động
Các loại phages: vật, thực vật
+ Plasmid tiếp hợp EMBL, GEM,
+Plasmid không tiếp hợp phage M13, T4
pSC101, ColE1 Ứng dụng: Nhân
pBR322, pAT1153, pUC18 dòng các đoạn DNA
Ứng dụng: vector dùng để nhân có kích thước lớn
dòng 1 đoạn DNA trong vi khuẩn Tách dòng từ những
gene lớn để tạo
ngân hàng genome
I. Các kỹ thuật chính sử dụng trong tạo DNA tái tổ hợp
(Recombinant DNA)

4. Các vật chủ thu nhận vector chuyển gene

+ Vi khuẩn E.coli và các vi khuẩn khác

+ Nấm men và nấm mốc

+ Tế bào thực vật bậc cao

+ Tế bào động vật có vú

 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA

1. Phương pháp tách chiết DNA

1.1. Nguyên tắc

– Phá màng tế bào và màng nhân: proteinase K,

SDS (sodium dodecyl sulphate) và sarcosyl
– Loại bỏ các thành phần khác DNA trong mẫu:
phenol, chloroform
– Tủa nucleic acid: ethanol, isopropanol
 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA

1. Phương pháp tách chiết DNA

1.2. Tách chiết DNA từ mô động vật

Vật liệu

– Men, vi khuẩn

– Các mô động vật (não, gan, phổi, tim, thận…)

– Máu động vật, côn trùng

 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA

1. Phương pháp tách chiết DNA

1.3. Tách chiết DNA từ mô động vật
Chọn và trữ mẫu trước khi tách gDNA

Mẫu Yêu cầu Nhiệt độ Số lượng Ghi chú

trữ (oC) mẫu ban đầu
Mô động vật mẫu tươi -20, -70 25-60 mg

Men Gđ đầu của -20, -70 5x107 cells Rữa bằng dung
log phase môi mới
Vi khuẩn 2x109 cells

Máu động vật mẫu tươi Proteinase K

 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA
Homogenize
1. Phương pháp tách chiết DNA (Đồng nhất mẫu)

1.3. Tách chiết DNA từ mô động vật

Phase separation
(Tách rời)

Centrifugation
(Ly tâm)

DNA precipitation
(Kết tủa DNA)

DNA wash
(Rửa DNA)

DNA solubilazation
(Hoà tan DNA)
 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA
1.4. Phương pháp tách chiết RNA Phá vỡ
(Disruption)

Đồng nhất mẫu

(Homogenize)

Tách rời
(Phase separation)

Kết tủa RNA

(RNA precipitation)

Rửa RNA
(RNA wash)

Hoà tan RNA

(RNA solubilazation)
 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA
1.5. Phương pháp định lượng DNA, RNA

1.5.1. Quang phổ kế (UV-Spectrophotometer)

DNA, RNA và protein được

hấp thu ở độ quang phổ
rộng

MaxDNA/RNA = 260 nm = A260

Maxprotein = 280 nm = A280

 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA
1.5. Phương pháp định lượng DNA, RNA

1.5.1. Quang phổ kế (UV-Spectrophotometer)

Công thức tính nồng độ DNA,RNA
DNAconc./RNAconc. ( g/ml) = OD260 x (50/40) x dilution factor

Độ tinh khiết của DNA và RNA

OD260/280 = 1.8 – 2.0  DNA, RNA
OD260/280 < 1.8  DNA, RNA
OD260/280>2.0  DNA, RNA

DS-DNA: 1.0 A260-unit = 50 g/ml

Single strand-RNA: 1.0 A260-unit = 40 g/ml
OD: optical density: mật độ quang
Dilution factor: nhân tố pha loãng
 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA
1.5. Phương pháp định lượng DNA, RNA

1.5.2. Phương pháp điện di (Electrophoresis)

Nguyên tắc:
Nucleic acid là phân tử tích điện âm
Phân tử di chuyển từ cực âm đến cực dương
 Các DNA khác nhau về trọng lượng  khác nhau về
điện tích
Có 2 lọai gel: Agarose gel và Polyacrylamide gel
 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA
1.5. Phương pháp định lượng DNA, RNA

1.5.2. Phương pháp điện di (Electrophoresis)

Điện di với Agarose gel

Ethidium Bromide
 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA
1.5. Phương pháp định lượng DNA, RNA

1.5.2. Phương pháp điện di (Electrophoresis)

Điện di với Agarose gel
Số lượng agarose gel (%) Kích thước các đoạn DNA
tách rời (Kb)
0.6 – 0.8 1–2

0.9 – 1.2 0.5 – 0.7

1.2 – 1.5 0.2 – 0.5

2.0 0.1
 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA
1.5. Phương pháp định lượng DNA, RNA

1.5.2. Phương pháp điện di (Electrophoresis)

Điện di với polyacrylamide gel
Các phân tử được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ
 Phát hiện vị trí bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi

Số lượng acrylamide gel (%) Kích thước các đoạn DNA

tách rời (Kb)
4 200 – 800
5 80 – 200
8 40 – 100
11 10 - 50
 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA

2. Phương pháp lai acid nucleic

2.1. Nguyên tắc
-Dựa vào nguyên tắc bổ sung (A-T, C-G)  phân tử lai

-Điều kiện tiến hành phản ứng lai

nhiệt độ, hoá chất (NaOH, formaldehyde)  tách hai mạch
DNA thành sợi đơn  dễ dàng bắt cặp với nhau
Mẫu dò được đánh dấu phóng xạ P32  phát hiện vị trí lai

2.2. Các phương pháp lai:

Southern Blot, Northern Blot, Western Blot…
 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA
2. Phương pháp lai acid nucleic
Souther blot

- Nguyên lý

Dựa vào nguyên tắc bổ sung (A-T, C-G) của mẫu dò (DNA) đã
được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ P32
 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA
2. Phương pháp lai acid nucleic
2.2. Southern Blot
- Các bước tiến hành

Tách DNA trên

DNA Agarose gel Chuyển DNA từ gel sang màng lai

Màng lai với vạch Mẫu dò

DNA được chuyển Các vạch DNA được thể hiện trên film

Mẫu đồng vị phóng xạ

được ủ với màng lai
II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA
2. Phương pháp lai acid nucleic
2.2. Southern Blot
- Ứng dụng
+ Nghiên cứu sự đa hình của DNA và đánh giá sự đa hình
của các đoạn giới hạn (RFLP: restriction fragment length
polymorphism)
+ Xác định trọng lượng phân tử của các đoạn giới hạn và
mức độ giống nhau giữa gene NST và trình tự mẫu dò
+ Có hay không sự hiện diện của gene và có bao nhiêu
bản sao hiện diện trong bộ genome của sinh vật
II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA
2. Phương pháp lai acid nucleic
2.3. RFLP (Restriction fragment length polymorphism)
+ Là sự đa dạng về trình tự DNA của bộ genome  cắt DNA thành những
mãnh nhỏ với các enzyme giới hạn và kích thước của những mãnh này
được phân tích qua chạy điện di (electrophoresis gel)

Nguyên tắc
+ Dựa trên sự sai khác của các phổ băng điện di và độ dài của các đoạn bị cắt
bởi các enzyme giới hạn
Ứng dụng  lĩnh vực di truyền và chọn tạo giống
+ Công cụ quan trọng cho bản đồ hệ genome
+ Phát hiện sự có mặt của gene cần tìm: vị trí của các gene mang bệnh di
truyền, độ rủi ro của một bệnh
+ Phát hiện sự đa dạng DNA qua các cá thể khác nhau của một loài: dấu
vân tay
+ Kiểm tra quan hệ huyết thống
+ Phát hiện các thể lai soma
 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA
2. Phương pháp lai acid nucleic
2.4. Northern Blot

- Nguyên lý: tương tự phương pháp lai Southern blot

Lai mRNA với mẫu dò DNA

- Ứng dụng
+ Xác định kích thước và số lượng mRNA có trong tế bào
+ Sự khác nhau giữa gene của tế bào đột biến và tế bào bình thường
 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA

3. Phương pháp giải trình tự gene

3.1. Phương pháp Maxam & Gilbert
Nguyên lý:
- Dựa vào phản ứng hóa học thủy giải đặc hiệu, các DNA
không tự xoắn lại với nhau, tạo các đoạn có kích thước khác
nhau
Các base Các thay đổi đặc biệt

G Dùng dimthyl sulfate ở pH 8.0  làm cho các base dễ bị bẻ gãy bởi alkali

A hoặc G Dùng piperidin formate ở pH 2.0

C+T Hydrazine mở các vòng pyrimidine

C Nồng độ ion cao (1.5 M NaCl) chỉ có cytosine phản ứng với hydrazine
A>C Dùng 1.2 M NaOH ở nhiệt độ cao (90°C) loại bỏ A
1. Tách chiết DNA
2. Cắt DNA từ các mẫu tạo
các đoạn DNA giống nhau
3. Gắn đồng vị phóng xạ vào
đầu 5’ DNA
4. Xử lí hoá chất thành 4 nhóm
riêng biệt

5. Điện di sản phẩm trên gel

polyacrylamide

6. Chụp kết quả điện di bằng

phóng xạ tự ghi
 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA

3. Phương pháp giải trình tự gene

3.2. Phương pháp Sanger

- Nguyên lí: nhờ vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự
cần xác định nhờ hoạt động của enzyme DNA polymerase và
các deoxy

• DNA polymerase xúc tác cho việc kéo dài chuỗi polynucleotide

• Deoxy là các nucleotide mất cả hai nhóm OH ở vị trí cacbon

số 2 & 3

Dideoxynucleotide (ddNTP): ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP

Cấu trúc của các dideoxynucleotide
 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA

3. Phương pháp giải trình tự gene

3.3. Giải trình tự DNA tự động

- Nguyên lí:
Sử dụng enzyme DNA polymerase và các deoxy (phương pháp
Sanger)
 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA

4. Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction)

4.1. Khái niệm
- PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp): đoạn DNA được nhân lên
- Phát minh 1985 do Mullis K.
- Kỹ thuật được sử dụng trong sinh học phân tử  nhân bản một
đoạn DNA trong ống nghiệm
• DNA polymerase (từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus
aquaticus)
• Máy chu kì nhiệt
 Tổng hợp đoạn DNA với tốc độ nhanh, chính xác
- Kỹ thuật PCR: phương pháp nền của CNSH hiện đại
 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA

4. Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction)

4.2. Nguyên tắc
-Tạo lượng lớn các đoạn DNA đặc thù từ DNA khuôn dựa trên
cơ sở hoạt động của DNA polymerase  sợi mới bổ sung
 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA

4. Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction)

4.3. Thành phần phản ứng
- Enzyme
- Buffers (dung dịch đệm)
- Nồng độ Mg2+ và các dNTP
- Mẫu DNA (Template) và mồi (Primers)

- Chất khác
 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA

4. Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction)

4.3. Thành phần phản ứng
- Enzyme

Các đặc tính của enzyme DNA polymerase và đơn vị khác nhau tuỳ
theo nhà sản xuất
Lượng enzyme: phụ thuộc vào mẫu DNA(template) và kích thước
phản ứng

Việc thay đổi DNA polymerase  thay đổi hiệu suất phản ứng

Tính chính xác của enzyme DNA polymerase phụ thuộc vào hoạt
tính 3’5’ exonuclease
 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA

4. Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction)

4.3. Thành phần phản ứng
- Buffers
Hiệu suất, tính chính xác của enzyme DNA phụ thuộc vào hệ buffer
sử dụng
Một số buffer chứa chất hoạt động bề mặt  ảnh hưởng đến các
phản ứng khác
Một số buffer đã định sẵn một lượng ion Mg2+ nhất định  lưu ý
khi tối ưu hoá nồng độ Mg2+
 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA

4. Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction)

4.3. Thành phần phản ứng
-Nồng độ Mg2+ và các dNTPs
Nồng độ Mg2+ cao  xuất hiện thêm các sản phẩm không đặc hiệu
Nồng độ Mg2+ thấp  sản phẩm PCR thấp
Nồng độ Mg2+ tối ưu phụ thuộc vào DNA polymerase, loại DNA
và thành phần buffer

dNTP là hoá chất kém bền  chia nhỏ lượng dNTP, giảm số lần
làm tan và sử dụng lại
Lượng dNTP tối ưu là 200 M/mỗi loại
 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA

4. Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction)

4.3. Thành phần phản ứng
- Mẫu DNA và mồi

Nồng độ tối ưu của mẫu DNA:

plasmid, lamda…: 1pg – 10 ng/50 l tổng thể tích
mẫu DNA genome: 50 – 500 ng/50 l tổng thể tích
Nồng độ mồi tối ưu: 10 mM
 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA

4. Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction)

4.3. Thành phần phản ứng
- Chất khác
DMSO, formamide, glycerol, betaine…  mẫu DNA lớn, giàu GC
Tăng DMSO trong PCR  giảm nhiệt độ bắt mồi
 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA

4. Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction)

4.4. Chu trình nhiệt
- Biến tính (Denature)
- Thực hiện phản ứng lai (annealing)
- Tổng hợp mạch mới hay kéo dài (Extension)
 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA

4. Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction)

4.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR
- Mẫu DNA làm khuôn: tinh sạch, mẫu DNA không quá dài (1-
1.5kb)
- Enzyme DNA polymerase
- Mồi và nhiệt độ nóng chảy của mồi
- Ảnh hưởng của các nucleotide
- Môi trường phản ứng
- Thiết bị và dụng cụ
 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA

4. Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction)

4.6. Ứng dụng của phương pháp PCR
- Tách nhanh và chính xác từng gene
- Xác định trình tự gene, tính đa hình DNA, phân tích các chỉ thị
phân tử phục vụ công tác giống (cây trồng, vật nuôi, vsv…), các
kiểu đột biến
- Chẩn đoán các bệnh di truyền, nhiễm trùng…
- Nghiên cứu các mẫu khảo cổ, bảo tồn và duy trì những gene quí
 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA

5. Các kỹ thuật xác định tính đa hình dựa trên PCR

- Kỹ thuật RAPD (Randomly amplified polymorphic DNA) -
Đa hình các đoạn DNA nhân bản ngẫu nhiên

- Kỹ thuật AFLP (Amplified fragment length polymorphism) - Sự

đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA được nhân bản
- Kỹ thuật STS (Sequence tagged site) - Điểm trình tự được đánh
dấu
- Kỹ thuật SSR ( Simple sequence repeats) – Đa hình trình tự lặp
lại đơn giản
 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA

6. cDNA (complementary DNA) – Ngân hàng cDNA

6.1. Khái niệm:
- Tổng hợp cDNA từ mRNA với sự có mặt của enzyme phiên mã
ngược (Reverse transcriptase)
-Ưu điểm:
-Gene thu nhận đã loại bỏ được những trình tự không mã hoá
(intron).
-Tạo dòng gene mã hoá tổng hợp globine của người, động vật,
chim, protein thuỷ tinh thể mắt bò, ovalbumine, fibroin tơ tằm
 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA

6. cDNA (complementary DNA) – Ngân hàng cDNA

6.2. Kỹ thuật tạo cDNA

Cấu trúc gene

 II. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA

6. cDNA (complementary DNA) – Ngân hàng cDNA

6.2. Kỹ thuật tạo cDNA
Tách chiết và tinh sạch
RNA tổng số
Gắn oligo dT vào đầu 3’
của mRNA
Enzyme sao chép ngược
 tổng hợp cDNA sợi kép
Cảm ơn rất nhiều!