You are on page 1of 69

PHẦN V

CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT


Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 345

CẤU TRÚC vector plasmid MANG GEN KHÁNG SÂU VÀ


ỨNG DỤNG TRONG TẠO CÂY TRỒNG CHUYỂN GEN
THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển


Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU
Hiện nay, bên cạnh phương pháp tạo giống cây trồng truyền thống nh ư lai hữu tính,
gây đột biến…, ngành công nghệ sinh học với sự phát triển của công nghệ gen đã và
đang tạo ra những bước đột phá do công nghệ gen cho phép đưa các gen có lợi vào thực
vật để tạo ra những cây trồng có tính trạng mà chúng ta mong muốn.
Hàng năm trên thế giới tốn rất nhiều chi phí trong việc phòng trừ sâu hại. Các
nhà khoa học đã và đang nghiên cứu chuyển nạp gen Bt (Bacillus thuringiensis) vào cây
trồng để cây trồng tự sản sinh các protein gây chết sâu hại. Cây trồng mang gen kháng
sâu Bt là một trong những thành tựu của công nghệ sinh học trong việc cải tiến cây
trồng. Cây mang gen tạo độc tố này có khả năng kháng với các sâu hại chính thuộc bộ
Lepidoptera, Coleoptera và Diptera. Hiện nay ngoài việc cải tiến kỹ thuật chuyển gen
Bt còn phải cải tiến gen thích hợp sao cho gen Bt, một gen của vi khuẩn có thể biểu hiện
có hiệu quả trong thực vật. Phương pháp có hiệu quả để tạo cây chuyển gen là sử dụng
súng bắn gen; tuy nhiên, đối với những cơ sở nghiên cứu chưa thể trang bị được thiết bị
này thì việc chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là phương pháp
được lựa chọn; ngoài ra phương pháp dùng vi khu ẩn Agrobacterium tumefaciens còn có
các ưu điểm riêng của nó mà các phương pháp khác không có đư ợc.
Theo hướng dùng vi khuẩn để chuyển nạp, chúng tôi đã nghiên cứu tái cấu trúc
vector plasmid mang ba gen là gen bar (gen chọn lọc), gen gusA (gen chỉ thị) và gen Bt
cryIA nhằm tạo một số vector plasmid mới - được đặt tên là plasmid pITB (Institute of
Tropical Biology).
Nội dung bài báo này, chúng tôi trình bày k ết quả nghiên cứu tái cấu trúc và sử
dụng các plasmid qua tái cấu trúc trong nghi ên cứu tạo cây cây hông và cây cải ngọt
chuyển gen.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1. Cấu trúc plasmid mới


 Chủng Agrobacterium tumefaciens EHA 105 được sử dụng để chuyển gen.
 Chuẩn E. coli DH5: được dùng làm vi khuẩn có khả năng biến nạp.
346 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

 Plasmid pCAMBIA 3301, plasmid pUbi.cryIA(b) và plasmid pUbi. cryIA(c).

2. Chuyển gen vào cây


Vật liệu và dòng vi khuẩn: Cây trong ống nghiệm được dùng làm vật liệu chuyển gen.
Sử dụng chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (At) EHA 105 chứa plasmid ITB
mang gen cryIA(c), gen bar và gen gusA.
Phương pháp chuyển gen vào cây hông (Paulownia fortunei): Sử dụng vi khuẩn At
được lắc qua đêm để gây nhiễm mảnh lá, sau đó các mảnh lá được nuôi cấy trên môi
trường tái sinh tạo chồi (môi trường MS có 0,1mg/l NAA và 10mg/l BA) có bổ sung
chất acetosyringone nồng độ 100 µM trong hai ngày. Sau đó rửa và diệt vi khuẩn bằng
dung dịch kháng sinh 500mg/l cefotaxime trong thời gian 30 phút, chuyển các mảnh lá
sang môi trường tái sinh tạo chồi có chứa 4mg/l PPT v à 500mg/l cefotaxime. Cấy
truyền 2 tuần/ lần trên cùng loại môi trường. Sau 6 tuần, mẫu lá có chồi tái sinh đ ược
cấy truyền sang môi trường cho ra rễ có chứa 4mg/l PPT. Các cây ra rễ tốt được đưa ra
trồng ở vườn ươm.
Phương pháp chuyển gen vào cây cải ngọt (Brassica integrifolia L.): Lá mầm với
cuống lá dài 1-2mm của cây con từ hạt nẩy mầm 5-6 ngày tuổi được sử dụng làm mẫu
chuyển gen. Sử dụng vi khuẩn đ ã lắc qua đêm để gây nhiễm mẫu, sau đó các lá mầm
được nuôi cấy trên môi trường tái sinh tạo chồi (môi trường MS có 2mg/l NAA, 4mg/l
BA và 3,3mg/l AgNO 3) trong hai ngày (có bổ sung acetosyringone nồng độ 100 µM).
Sau đó rửa và diệt vi khuẩn bằng dung dịch kháng sinh 500 mg/l cefotaxime trong thời
gian 30 phút, chuyển các mẫu sang môi trường tái sinh tạo chồi có chứa chất chọn lọc
PPT và 500mg/l cefotaxime. Cấy truyền 2 tuần/ lần trên cùng loại môi trường. Sau 4-5
tuần, mẫu có chồi tái sinh đ ược cấy truyền sang môi trường ra rễ (môi trường MS có
0,1mg/l NAA và 6mg/l PPT).
Phương pháp kiểm tra cây chuyển gen:
 Kiểm tra gen chỉ thị gusA bằng dung dịch X-Gluc: bằng cách ngâm các mảnh lá
chồi nhỏ với dung dịch X-Gluc khoảng 15 giờ ở 37C, mẫu chuyển gen sẽ có màu
xanh chàm đặc trưng, mẫu đối chứng sẽ không chuyển m àu.
 PCR gen cryIA(c): DNA thực vật được chạy PCR với cặp mồi chuy ên biệt, quy
trình tách DNA thực vật được thực hiện theo phương pháp của Dellaporta (1983).
 Các cây chuyển gen được kiểm tra sự biểu hiện của gen cryIA(c) qua khả năng
kháng sâu bằng cách thả sâu xanh Heliothis armigera lên các mẫu lá trong đĩa pétri.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1. Cấu trúc plasmid mới


Việc gắn gen cryIA(b) và cryIA(c) vào plasmid pCAMBIA 3301 để tạo plasmid mới như
sau:
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 347

 Vectơ plasmid CAMBIA 3301 có độ dài 12 Kb chứa gen gusA và gen bar. Có 14
enzyme giới hạn tại vị trí cloning site trong vùng T-DNA, ở đó cho phép tách hoặc ghép
các đoạn gen mong muốn. Trong thí nghiệm này chúng tôi đã sử dụng enzyme giới hạn
Hind III (A/AGCTT) để cắt tạo hai đầu Hind III của chuỗi plasmid pCAMBIA 3301.
 Plasmid pUbi.cryIA(b) và plasmid pUbi.cryIA(c) ch ứa gen cryIA có độ dài 4 kb, ở hai
đầu của toàn bộ gen này (promoter-gen-terminator) có vị trí cắt bởi enzyme giới hạn
Hind III. Nên chúng tôi đã sử dụng enzyme giới hạn Hind III để cắt ở hai vị trí này.
 Sau khi cắt bởi enzyme giới hạn Hind III các đoạn plasmid DNA đã được chạy điện di
cho kết quả: với plasmid pCAMBIA đã được mở ra với hai đầu cắt bởi Hind III và được
xử lý bởi AP (alkaline phosphat) để chúng khó có thể tự nối lại với nhau. C òn plasmid
pUbi.cryIA do có hai vị trí cắt nên tạo ra hai đoạn: 6 kb DNA tương ứng với thân còn lại
của plasmid và đoạn 4 kb tương ứng với đoạn gen cryIA.
Sau đó tiến hành nối kết 2 đoạn DNA plasmid pCAMBIA 12 kb v à đoạn gen cryIA 4
kb với nhau bởi enzyme ligase ở nhiệt độ 4 oC trong thời gian 16 giờ. Kết quả đã tạo được
2 plasmid mới dài khoảng 16 kb.
Để kiểm tra kết qủa này chúng tôi đã chuyển 2 plasmid mới vào vi khuẩn biến nạp
E.coli, nhân bản E. coli và tách chiết ADN. Sử dụng lại enzyme giới hạn Hind III để cắt
cho kết quả mỗi plasmid đã cho được hai băng DNA với 1 đoạn 12 kb v à 1 đoạn 4 kb
(xem ảnh 2 điện di) hoàn toàn phù hợp với kích thước plasmid mới được chúng tôi đặt tên
là plasmid pITB-CRY (Institute of Tropical Biology) ch ứa 3 gen và được chuyển vào
dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA 105.
Chuyển gen vào cây hông:
Sau khi chuyển gen bằng vi khuẩn At, mẫu lá được đăt trên môi trường có PPT nồng
độ 4mg/l, đa số các mảnh lá bắt đầu vàng sau 2 tuần nuôi cấy, một số mảnh lá vẫn duy tr ì
màu xanh nhưng không hình thành mô sẹo, chỉ một số ít khoảng 10% h ình thành mô sẹo
và một số trong đó bắt đầu tái sinh sau 5 tuần nuôi cấy. S au giai đoạn chọn lọc này các
chồi con được chuyển sang môi trường MS để ra rễ với 4mg/l PPT. Và chỉ có vài dòng
cây tiếp tục phát triển và ra rễ, được chúng tôi giả định là cây chuyển gen. Kết quả quá
trình chuyển gen được thể hiện như sau:
Bảng 1: Tỷ lệ tái sinh chồi và cây chuyển gen của các mảnh lá trên môi trường có 4mg/l
PPT sau khi nhiễm với Agrobacterium tumefaciens và mẫu lá đối chứng

Thí Số mẫu Số mẫu lá Số mẫu lá Số lượng Tần số chuyển gen


nghiệm lá tạo mô tái sinh dòng cây (%)
sẹo chồi chuyển gen
Chuyển 580 52 21 5 0,8
gen
Đối chứng 30 0 0 0 0
Để khẳng định đây là những cây hông chuyển gen, chúng tôi cấy cây hông giả định
chuyển gen và cây đối chứng vào môi trường ra rễ với chất chọn lọc PPT nồng độ 4mg/l để
thử khả năng chống chịu, sau 2 tuần toàn bộ cây đối chứng chết hoàn toàn, trong khi các cây
chuyển gen vẫn tiếp phát triển và ra rễ, giúp chúng tôi khẳng định đây là những cây hông đã
được chuyển gen.
348 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

Sự biểu hiện gen gusA của cây chuyển gen: Các chồi nhỏ, mảnh lá của cây chuyển gen
đã được xử lý với dung dịch X-Gluc, kết quả cho thấy chồi và mảnh lá này có màu xanh
chàm đặc trưng khẳng định sự biểu hiện của gen gusA trong cây chuyển gen.
Sự biểu hiện của gen bar trong cây chuyển gen: gen bar tạo tính trạng kháng thuốc trừ cỏ
đã được khẳng định trong cây in vitro, tuy nhiên chúng tôi muốn tiếp tục khảo sát sự tồn tại
ổn định và khả năng biểu hiện của gen này trên cây sau khi được trồng ra môi trường tự nhiên
ngoài vườn ươm. Chúng tôi sử dụng nồng độ 300mg/l PPT để phun l ên các cây đối chứng và
cây chuyển gen 1 tháng tuổi tại vườn ươm. Sau 2 tuần nhận thấy các cây hông chuyển gen
tiếp tục sinh trưởng và phát triển bình thường, chỉ có một dòng cây hơi bị vàng lá phía dưới
nhưng vẫn sống và phát triển cho phép chúng tôi khẳng định một lần n ữa đây là những cây
hông đã nhận được gen chuyển.
Sự hiện diện của gen cryIA(c) và khả năng kháng sâu của cây chuyển gen: Phân tích PCR
với cặp mồi chuyên biệt cho gen cryIA(c) cho thấy các mẫu DNA của cây chuyển gen sau khi
chạy điện di có xuất hiện các băng có kích thước 0,65 kb giống như mẫu đối chứng dương tính
plasmid, chúng là kết quả của sự khuếch đại gen cryIA(c) trong khi mẫu cây đối chứng hoàn
toàn không có băng. Qua đó chúng tôi kh ẳng định sự hiện diện của gen cryIA(c) trong nhiễm
sắc thể của cây chuyển gen. Sau đó các cây hông chuyển gen đ ược chuyển ra trồng trong vườn
ươm. Để thử nghiệm tính kháng sâu các lá nhỏ đ ược đặt trong đĩa pétri cùng sâu xanh Heliothis
armigera. Sau 3 ngày, với các lá đối chứng diện tích lá bị hại lớn, kích th ước sâu tăng rõ rệt,
trong khi đó ở lá cây chuyển gen diện tích lá bị sâu ăn nhỏ, sâu tăng tr ưởng rất kém và sau 3
ngày sâu hoàn toàn không còn ăn và chết nhiều vào ngày thứ 5 hoặc 6.
Chuyển gen vào cây cải ngọt:
Với phương pháp sử dụng lá mầm của cây con từ hạt nẩ y mầm 5-6 ngày tuổi, cấy lá
mầm vào môi trường tái sinh 3-4 ngày trước khi nhúng cuống lá mầm v ào dịch vi khuẩn
để lây nhiễm, thời gian ủ với vi khuẩn l à hai ngày trên môi trường có bổ sung 100 µM
Acetosyringone và sau khi r ửa được cấy trên môi trường tái sinh có Cefotaxime
500mg/l và 4mg/l PPT thì sau 3-4 tuần các chồi tái sinh hình thành và chúng được cấy
truyền trên môi trường MS có 6mg/l PPT để kiểm tra khả năng kháng PPT của cây.
Chúng tôi đã thực hiện thí nghiệm chuyển gen nhiều lần với số mẫu trun g bình từ 80-
120 mẫu/lần. Kết quả được trình bày ở bảng 2.
Bảng 2. Tỷ lệ tái sinh ch ồi và cây, trên môi trường có 4mg/l PPT, của các lá mầm được
nhiễm với Agrobacterium tumefaciens v à của mẫu lá mầm đối chứng

Thí nghiệm Số lá mầm Số lá mầm Số lá mầm Số lượng dòng cây Tần số


thí nghiệm tạo mô sẹo tái sinh chồi giả định chuyển gen chuyển gen (%)
Chuyển gen 1380 52 21 2 0,14
(3,7%) ( 1,5%)
Đối chứng 30 0 0 0 0
Qua thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy số lượng lá mầm chống chịu với chất chọn lọc
4mg/l PPT để hình thành mô sẹo khoảng 3,7% nhưng số lượng có thể tái sinh chồi chỉ ở
mức 1,5% và gần như đa số các chồi đều không phát triển v à chết ở các lần cấy truyền sau,
theo chúng tôi đây là hiện tượng được coi là escape khá phổ biến trong quá trình chuyển
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 349

gen hoặc chồi ở thể khảm và chỉ còn 2 chồi tiếp tục phát triển trên môi trường MS với
6mg/l PPT - điều này cho thấy tần số chuyển gen thấp (0,14%). Chúng tôi cho rằng khi
chuyển gen trên các đối tượng cây trồng khác như cây thuốc lá và cây hông thì mẫu lá có
khả năng tái sinh chồi cao từ xung quanh rìa lá nên vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có
thể xâm nhập vào nhiều vị trí có khả năng tái sinh này, trong khi ở cây cải ngọt lá mầm chỉ
có thể tái sinh tại cuống lá nên vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chỉ có một vị trí duy
nhất để có thể xâm nhiễm tạo cây chuyển gen. Các cây cải giả định chuyển gen đ ược phân
tích PCR với cặp mồi chuyên biệt của gen cryIA(c) - cho thấy các mẫu DNA của cây giả
định chuyển gen sau khi chạy điện di có xuất hiện các băng có kíc h thước 0,65 kb giống
như mẫu đối chứng dương tính plasmid, chúng là kết quả của sự khuếch đại gen cryIA(c)
trong khi mẫu cây đối chứng hoàn toàn không có băng.

KẾT LUẬN
Với việc sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA 105 mang plasmid ITB
để chuyển gen, chúng tôi đã nhận được một số dòng cây hông và cây cải ngọt chuyển gen
mang gen cryIA(c) kháng sâu xanh Heliothis armigera. B ằng các kỹ thuật sinh học phân tử
và sinh học chúng tôi đã xác định được của gen này hiện diện trong cây hông và cây cải
ngọt chuyển gen và gen chuyển đã có biểu hiện tính trạng khá rõ rệt.

Plasmid ITB (lane 2 và 3 mang Phân tích PCR gen cryIA(c) ở Phân tích PCR gen cryIA(c) ở
gen cryIA(b) và cryIA(c) cây hông chuyển gen (băng cây cải ngọt chuyển gen (băng
DNA 0,65 kb) DNA 0,65 kb)

Cây cải ngọt giả định chuyển gen phát triển Cây hông giả định chuyển gen phát triển
trên môi trường chọn lọc PPT trên môi trường chọn lọc PPT
350 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

LỜI CÁM ƠN
Các tác giả xin chân thành cám ơn Chương trình KC-04-13, Chương trình nghiên
cứu cơ bản đã tài trợ thiết thực cho nghiên cứu này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển, 2003. Tạo cây hông (Paulownia
fortunei) chuyển gen kháng sâu thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .
Tuyển tập Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học to àn quốc, Hà Nội, 16-
17/12/2003. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 1088-1090.
2. Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Phạm Thị Hạnh, Nguyễn Văn Uyển, 2005. Ảnh
hưởng của tác nhân chọn lọc đến mô cây cải ngọt ( Brassica integrifolia) và nghiên
cứu tạo cây cải ngọt chuyển gen. Tuyển tập Báo cáo Hội nghị khoa học t oàn quốc
“Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống” , Đại học Y Hà Nội, Hà
Nội, 3/11/2005, tr. 1194-1197.
3. Phạm Thị Hạnh, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển, 2005. Khảo sát
khả năng tái sinh cây in vitro cây cải ngọt (Brassica integrifolia) từ lá mầm và trụ
mầm phục vụ cho nghiên cứu chuyển gen. Tuyển tập Báo cáo Hội nghị khoa học
toàn quốc “Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống” , Đại học Y
Hà Nội, Hà Nội, 3/11/2005, tr. 498-500.
4. Nguyễn Văn Uyển, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu H ổ, 2003. Nghiên cứu hệ thống tái
sinh cây hông (Paulownia fortunei) và ảnh hưởng của tác nhân chọn lọc để tạo cây
chuyển gen. Tuyển tập Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học to àn quốc,
Hà Nội, 16-17/12/2003. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 866-869.
5. Murashige, T., Skoog F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay
with tobacco tissue culture. Physiol Plant 15: 473-497.
6. Pua, E. C., Barfield D. G., 1991. Gene transfer in plants of Brassica juncea using
Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Plant Cell Reports 10: 308-314.

SUMMARY
Construction of plasmid vector and utilization for production
of transgenic plants resistant to insect via Agrobacterium
tumefaciens
Le Tan Duc, Nguyen Huu Ho, Nguyen Van Uyen
Institute of Tropical Biology
New plasmid vector pITB-CRY (Institute of Tropical Biology) consisting bar,
cryIA(c) and gusA genes was constructed and applied to transfer into Agrobacterium
tumefaciens EHA 105 for Paulownia and Brassica plants genetic transformation. Many
transgenic lines of both plant cultivars were obtained. PCR analyses and indigogenic
GUS assay were performed to confirm the presence and the expression of bar, cryIA(c)
and gusA genes. Insect bioassays with larvae showed an improvement of resistance
against Heliothis armigera.
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 351

TẠO CÂY THUỐC LÁ KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ


VÀ CÔN TRÙNG

Phạm Thị Hạnh, Phan T ường Lộc, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ
Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

ĐẶT VẤN ĐỀ
Một trong những yếu tố làm giảm năng suất cây trồng trên đồng ruộng hiện nay là
những tác hại do sâu bệnh gây ra và việc phòng trừ dịch hại này thường gây sự ô nhiễm
môi trường ngày càng nghiêm trọng. Vấn đề này chỉ có thể được giải quyết thông qua
sự kết hợp giữa khoa học hiện đại v à ý thức giữ gìn sinh thái môi trường. Một trong
những ứng dụng của công nghệ sinh học để giải quyết vấn đề tr ên là tạo ra những cây
trồng tự bản thân có khả năng chống chịu với các loại sâu bệnh. Trong các loại côn
trùng gây hại thì rầy, rệp chiếm vai trò quan trọng, việc chích hút nhựa của chúng làm
cây không phát triển đồng thời chúng là nguồn lây lan một số bệnh virus quan trọng nh ư
virus gây bệnh khảm ở cây thuốc lá...
Hiện nay, phương pháp chuyển gen vào cây trồng bằng vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens được xem là một phương pháp có hiệu quả, là phương pháp qua đó k ết quả
chuyển gen thường biểu hiện kiểu tích hợp gen (DNA integration) t ương đối đơn giản,
phù hợp với ý muốn của các nh à công nghệ gen.
Nội dung báo cáo này, chúng tôi nghiên cứu tái cấu trúc plasmid mới mang gen bar
(gen kháng thuốc trừ cỏ), gen gna (gen kháng côn trùng chích hút) và gen gusA; chuyển
plasmid mới cấu trúc vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và dùng dòng vi khuẩn
biến nạp trong nghiên cứu tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ v à côn trùng.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1. Vật liệu
 Vi khuẩn E. coli chứa plasmid pBluescript SK +-GNA mang cassette gen nguyên
vẹn [Bao gồm Promoter Ubiquitin (Ubi) + Trình tự mã hoá protein GNA (gen gna)
+ Terminator Nopaline synthase (nos)], kích thư ớc khoảng gần 4 kb.
 Chủng vi khuẩn E. coli chứa pCAMBIA 3301 mang gen bar (gen kháng thuốc trừ
cỏ) và gusA (gen chỉ thị). Gen chỉ thị gusA: được phân lập từ vi khuẩn E. coli
(Jefferson & ctv., 1987), mã hóa enzym -glucuronidase (không màu). Enzyme
này xúc tác phản ứng phân giải cơ chất glucuronide (không m àu) để tạo thành
352 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

sản phẩm có màu xanh chàm đặc trưng dễ nhận biết. Glucuronide th ường dùng
gọi là X-gluc, công thức hóa học: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronide.
Gen bar kháng chất phosphinothricin (PPT) đ ược phân lập từ vi khuẩn S.
hygroscopicus. Gen này mã hóa cho enzym phosphinothricin acetyl transferase
(PAT), giúp biến đổi PPT từ dạng ức chế sinh tổng hợp glutamine gây chết cây
trồng sang dạng bị acetyl hóa không c òn gây độc cho cây. Vì vậy, ngoài tác
dụng chọn lọc trong quá trình chuyển gen ở thực vật, gen bar còn có vai trò
kháng thuốc trừ cỏ Basta trong sản xuất nông nghiệp.
 Chủng vi khuẩn E. coli DH5 được dùng trong biến nạp nhằm khuếch đại số l ượng
bản sao các plasmid.
 Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 dùng để biến nạp plasmid mới.
 Môi trường nuôi cấy: Môi trường Luria-Bertani (LB) chứa kháng sinh được sử
dụng trong nuôi cấy và biến nạp.
 Enzym giới hạn SacI, KpnI và enzym nối DNA ligase T4.

2. Phương pháp
a. Cấu trúc các plasmid mới
Phương pháp xử lý enzym để cắt DNA plasmid theo qui trình của Sambrook và ctv.
(1989). Các phản ứng nối kết được thực hiện ở nhiệt độ 14 0C trong thời gian 3-4g. Biến
nạp E. coli và Agrobacterium tumefaciens theo phương pháp sốc nhiệt, 42 0C trong 2
phút. Môi trường LB được bổ sung các kháng sinh thích hợp để chọn lọc cá thể biến
nạp. Trong thí nghiệm chúng tôi sử dụng các kháng sinh nh ư kanamycin (50mg/l) và
streptomycin (25mg/l). Các hợp chất hóa sinh như IPTG (Isopropyl-D-thiogalactoside)
50mg/l và X-gal (5-Bromo 4-chloro 3-indolyl -D galactopyranoside) 40mg/l đư ợc bổ
sung vào môi trường nuôi cấy các thể biến nạp để hoạt hoá enzym -galactosidase, cho
phép chọn lọc các khuẩn lạc xanh/trắng. Ph ương pháp tách DNA plasmid các khuẩn lạc
để kiểm tra cloning theo phương pháp của bộ kit công ty Promega.
b. Tạo cây thuốc lá kháng thuốc trừ cỏ v à kháng côn trùng
Sử dụng giống thuốc lá sợi v àng Kutsaga 326. Lá cây thu ốc lá trong ống nghiệm
được cắt kích thước khoảng 1x1cm được dùng làm nguyên liệu chuyển gen.
Sử dụng vi khuẩn đã lắc qua đêm để gây nhiễm mảnh lá, sau đó các mảnh lá đ ược
nuôi cấy trên môi trường tái sinh tạo chồi (môi tr ường MS có 0,1mg/l NAA v à 1mg/l
BA) trong hai ngày. Sau đó r ửa và diệt vi khuẩn bằng dung dịch Cefotaxim e 500mg/l
trong thời gian 30 phút, chuyển các mảnh lá sang môi tr ường tái sinh tạo chồi có 10mg/l
PPT và 500mg/l Cefotaxim e. Cấy truyền 2 tuần / lần trên cùng loại môi trường. Sau 6
tuần, mẫu lá có chồi tái sinh đ ược cấy truyền sang môi tr ường ra rễ có chứa 20 mg/l
PPT. Các cây ra rễ tốt được đưa ra trồng ở vườn ươm.
Phương pháp kiểm tra cây chuyển gen
 Khảo sát khả năng phát triển v à ra rễ của cây chuyển gen v à cây đối chứng in vitro
trên môi trường MS có chứa chất chọn lọc nồng độ 20mg/l PPT.
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 353

 Kiểm tra gen chỉ thị gusA bằng dung dịch X-Gluc: bằng cách ngâm các mảnh lá v à
chồi nhỏ với dung dịch X-Gluc khoảng 15 giờ ở 370C, mẫu chuyển gen sẽ có màu
xanh chàm đặc trưng, còn mẫu đối chứng sẽ không chuyển m àu.
 Sự hiện diện của gen gna trong cây được kiểm tra qua phản ứng PCR với cặp mồi
chuyên biệt như sau: Mồi 1: 5’CGG ATC CAT GGC TAA GGC AAG TCT CCT
C-3’ và mồi 2: 5’CGG TAC CTC ATT ACT TTG AAG TCA CAA G -3’. Kích
thước đoạn DNA của gen gna khuếch đại của phản ứng PCR đ ược mong đợi là
0,47 kb.
 Sự hiện diện của gen bar được kiểm tra qua phân tíc h PCR với các cặp mồi như
sau: Mồi 1: 5’ ATG AGC CCA GAA CGA CG 3’ v à mồi 2: 5’ TCA GAT CTC
GGT GAC GG 3’. Gen bar ở cây chuyển gen qua phân tích PCR sẽ có đoạn DNA
được khuếch đại là 0,5 kb.
 Các cây chuyển gen và đối chứng được phun dung dịch Basta (PPT nồng độ 4g/l)
có bổ sung chất bám dính Tween 80 để kiểm tra tính kháng thuốc trừ cỏ.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1. Cấu trúc plasmid mới


Trong thí nghiệm này chúng tôi đã xử lý cassette gen nguyên vẹn [Bao gồm
Promoter Ubiquitin (Ubi) + Trình t ự mã hoá protein GNA (gen gna) + Terminator
Nopaline synthase (nos)], kích thư ớc khoảng gần 4 kb nằm tr ên plasmid Bluescript SK+
được cắt bởi hai enzym giới hạn Kpn I v à Sac I. Cassette này sẽ được chèn vào vị trí
Lac Z alpha (trong vùng T -DNA, cũng được cắt bởi Kpn I và Sac I) ở plasmid
pCAMBIA 3301.
Tiếp theo chạy điện di trên gel agarose 0,8% kết quả điện di sau khi cắt bởi 2
enzym cho thấy plasmid pBluescript SK+ -GNA được cắt làm hai đoạn, đoạn khoảng
gần 4 kb là nguyên cassette chứa gen gna còn plasmid pCAMBIA chỉ có 1 đoạn khoảng
12 kb. Tách và làm sạch đoạn cassette và plasmid backbone trước khi đưa vào nối kết
(ligation).
Phản ứng nối kết giữa gen gna v à vector pCAMBIA bằng enzym ligase T4 ở 14 oC
trong 3 giờ. Sau đó các sản phẩm tr ên được biến nạp vào E. coli DH5 khả biến trong
môi trường LB có 50 mg/l kháng sinh kanamycin, nuôi 37 oC qua đêm. Kết quả cho thấy
trên các đĩa đối chứng (biếp nạp không có plasmid), các tế b ào E. coli DH5 do không
được bổ sung plasmid khi thực hiện biến nạp n ên không có khả năng kháng Kanamycin,
do vậy chúng không sinh trưởng được trên môi trường LB có bổ sung kanamycin.
Ngược lại, các thể được biến nạp mang plasmid mới phát triển đ ược trên môi trường
chọn lọc này chứng tỏ chúng chính là các thể mong muốn. Bên cạnh đó, môi trường
chọn lọc có bổ sung X-gal, dựa trên nguyên tắc sàng lọc, các khuẩn lạc trắng tr ên đĩa
biến nạp sẽ được sơ chọn để nhân bản plasmid mới. Để xác định kết quả, chúng tôi lấy
354 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

một số khuẩn lạc màu trắng nuôi trong môi trường LB lỏng có 50mg/l kháng sinh
kanamycin, nuôi lắc qua đêm ở 370C. Sau khi tách DNA plasmid, ti ến hành xử lý 2
enzym SacI và KpnI cho plasmid m ới và pCAMBIA. Kết quả xử lý enzym, chạy điện di
trên gel 0,8% cho thấy plasmid mới chứa 2 đoạn DNA: một đoạn 12 kb (t ương ứng
pCAMBIA 3301 backbone) và m ột đoạn kích thước khoảng gần 4 kb (t ương ứng
cassette chứa gen gna); cho thấy plasmid đ ã được hình thành có kích thước khoảng gần
16 kb. Như vậy có thể khẳng định gen mục ti êu đã được lắp ghép thành công và plasmid
mới đã được nhân bản trong E. coli, plasmid này được ký hiệu là p3301-GNA. Sau đó
chúng tôi đã tạo chủng Agrobacterium tumefaciens mang plasmid n ày.

2. Tạo cây thuốc lá kháng thuốc trừ cỏ v à kháng côn trùng


Trên môi trường có PPT nồng độ 10mg/l, các mảnh lá đối chứng bị mất m àu màu
xanh sau 2-3 tuần. Ngược lại, một số mảnh lá đ ã xử lý vi khuẩn chuyển gen vẫn c òn
màu xanh và hình thành d ần các cụm mô sẹo và chồi nhỏ. Sau 6 tuần chọn lọc, các chồi
này được chuyển sang môi trường ra rễ có 20mg/l PPT. Chồi thuốc lá qua xử lý chuyển
gen vẫn tiếp tục phát triển và ra rễ. Trong khi đó ở thí nghiệm đối chứng, chồi từ mô lá
không xử lý chuyển gen trên môi trường ra rễ chứa 20mg/l PPT dần dần vàng và chết
trong 2-3 tuần. Do đó chúng tôi cho rằng những chồi v à cây phát triển trên môi trường
20 mg/l PPT là những cá thể giả định chuyển gen. Qua thí nghiệm chuyển gen, cây sinh
trưởng tốt trên môi trường có 20mg/l PPT có sự biểu hiện của gen gusA, lá của các cây
này có màu xanh đặc trưng.

Bảng 1: Tỷ lệ tái sinh chồi của cá c mảnh lá trên môi trường có 20mg/l PPT sau khi
nhiễm với Agrobacterium v à mẫu lá đối chứng

Thí nghiệm Số mẫu lá thử Số lượng mẫu lá tái sinh Tần số chuyển gen( %)
nghiệm chồi
Chuyển gen 120 11 9,16
Đối chứng 20 0 0

Kiểm tra sự hiện diện của gen mục ti êu gna trong cây thuốc lá chuyển gen: Phản
ứng PCR được thực hiện với cặp mồi đặc hiệu cho gen gna. Đối chứng dương là
plasmid pUbi-GNA và đối chứng âm là DNA bộ gen tách chiết từ nhiễm sắc thể của cây
không được chuyển gen. Kết quả cho thấy ở các dòng cây giả định chuyển gen có sự
hiện diện của vạch DNA mong đợi có kích th ước bằng với kích thước của vạch đối
chứng dương tính là 0,47 kb (so với thang chuẩn). Không thấy vạch này ở trường hợp
cây thuốc lá đối chứng. Kết quả n ày chứng minh gen mục tiêu gna từ plasmid của vi
khuẩn Agrobacterium đã được chuyển và sáp nhập vào bộ gen của cây.
Sự hiện diện của gen bar v à khả năng kháng thuốc trừ cỏ Basta: Kết quả phân tích
PCR cho thấy các mẫu DNA của cây chuyển gen xuất hiện băng DNA với kích thước
khoảng 0,50 kb là kết quả của việc khuếch đại gen bar. Do đó, chúng tôi có th ể khẳng
định bước đầu gen bar đã được chuyển vào nhiễm sắc thể của cây. Sau khi trồng tại
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 355

vườn ươm khoảng 30 ngày, các cây thuốc lá đối chứng đã được kiểm tra khả năng
chống chịu với thuốc trừ cỏ Basta bằng cách phun thuốc với các n ồng độ 4 g/l PPT. Sau
14 ngày, tất cả cây thuốc lá đối chứng đều bị chết ở nồng độ nói tr ên nên chúng tôi đã
chọn nồng độ 4g/l PPT để xử lý số cây thuốc lá chuyển gen. Sau 14 ng ày, cây thuốc lá
chuyển gen vẫn tiếp tục sinh tr ưởng bình thường.

KẾT LUẬN
Như vậy bằng các kỹ thuật sinh học phân tử chúng tôi đ ã tạo được chủng
Agrobacterium tumefaciens mang gen bar, gen gna và gen gusA. Sau đó đã sử dụng vi
khuẩn này để tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen bar kháng thuốc trừ cỏ và gen gna
kháng côn trùng chích hút.

LỜI CÁM ƠN
Các tác giả xin chân thành cám ơn Sở Khoa học và Công nghệ Tp Hồ Chí Minh và
Trung tâm phát triển KHCN Trẻ - Thành Đoàn Tp Hồ Chí Minh đã tài trợ cho nghiên
cứu này.

TÀI LIỆU THAM KHẢO


1. Gleave A. P., 1992. A versatile binary vector syste m with a T-DNA organisational
structure conductive to efficient integration of cloned DNA into the plant genome.
Plant Molecular Biology 20: 1203 -1207.
2. Hilder V. A., Gatehouse M. R., Gatehouse J. A., Van Damme E., Boulter D., 1995.
Expression of snowdrop lectin (GNA) in transgenic tobacco plants results in added
protection against aphids. Transgenic Research 4: 18 -25.
3. Kumar K. K., Sudhakar D., Raija J. A., Balasubramanian P., 1999. Engineering
resistance in elite indica rices to major diseases through Agr obacterium -mediated
transformation.General Meeting of The International Program on Rice
Biotechnology, September, 1999, Phuket, Thailand.
4. Murashige T., Skoog F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay
with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15: 473-497.Ư
5. Rao K. V., Christou P., Gatehouse M. R., Gatehouse J. A, 1998. Expression of
snowdrop lectin (GNA) in transgenic rice plants confers resistance to rice brown
planthopper. Plant Journal 15(4): 469 -477.
6. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T., 1989. Molecular Cloning - A Laboratory
Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
356 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

SUMMARY
Production of transgenic tobacco plants ( Nicotiana tabacum
L.) resistant to insect and Basta R herbicide via Agrobacterium
tumefaciens
Pham Thi Hanh, Phan Tuong Loc, Le Ta n Duc, Nguyen Huu Ho
Institute of Tropical Biology

Intact gna gene cassette was collected from the plasmid pBluescript SK + by
restriction enzymes KpnI và SacI and inserted in Lac Z alpha region on T-DNA of the
plasmid pCAMBIA 3301. Consequently, newly for med plasmid was introduced into
competent E. coli and Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 (for transformation). After
co-cultivation, tobacco leaf disks were cultured on selection medium containing 10 mg/l
PPT (Phosphinothricin). Many transgenic tobacco plants with aphid resistance gene gna,
herbicide resistance gene bar, and reporter gene gusA were obtained via Agrobacterium
tumefaciens LBA 4404 carrying the plasmid pCAMBIA 3301-GNA. PCR analyses and
indigogenic GUS assay were pe rformed to confirm the presen ce and the expression of
gna, bar and gusA genes.
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 357

Hình 1. Ảnh điện di của Hình 2, 3: Kết quả phân tích PCR gen bar (h. 2) v à gna
plasmid pCAMBIA 3301 - (h. 3) ở cây thuốc lá chuyển gen. L: thang DNA 1 kb,
GNA (1) và pCAMBIA PC: đối chứng dương tính, NC: đối chứng âm tính,
3301 (2) 1,2,3,4: cây chuyển gen

Hình 4: Cây thuốc lá chuyển Hình 5: Chồi cây thuốc lá Hình 6: Cây thuốc lá chuyển
gen và đối chứng trên môi chuyển gen biểu hiện gen và đối chứng sau khi
trường chứa 20 mg/l PPT gen gusA qua ngâm phun dung dịch Basta
trong dung dịch X-gluc
358 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

NGHIÊN CỨU TÁI SINH in vitro VÀ BƯỚC ĐẦU PHÂN


TÍCH CÂY CÚC Dendranthema grandiflorum L. MANG
GEN ipt tạo cytokinin

Nguyễn Hữu Hổ, Lê Tấn Đức, Phan Tường Lộc, Phạm Đức Trí,
Nguyễn Thị Thanh
Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU
Trong ngành trồng hoa thương mại, một trong các vấn đề đ ược quan tâm nhiều nhất
là nghiên cứu giữ cho cây hoa nói chung v à hoa cắt cành nói riêng sao cho lâu tàn. Các
nhà sản xuất và kinh doanh hoa cảnh đã sử dụng một số tác nhân l àm cho hoa được tươi
lâu như dung dịch chất điều hoà sinh trưởng (ĐHST) cytokinin (dihydrozeatin hoặc
benzyladenin), dung dịch đường, dung dịch sát khuẩn,,, để xử lý hoa cắt cành hoặc xử lý
đối với cả cây hoa.
Cây hoa cúc là đối tượng cây hoa có nhu cầu tiêu thụ rất cao vì có hoa đẹp, đa dạng,
nhiều màu sắc nhưng thời gian bền tươi của hoa cắt cành không dài nhất là khi đưa vào
tiêu thụ giống cúc ôn đới hoặc trưng bày, bảo quản hoa trong điều kiện không thích hợp
nên nghiên cứu làm tăng độ bền tươi của cây hoa này là vấn đề cần được quan tâm.
Như chúng ta đã biết, các chất điều hoà sinh trưởng như auxin, gibberellin, ethylen,
acid abscisic, cytokinin có ý nghĩa rất lớn trong việc điều ho à sự lão hoá. Trong các
nhóm chất nêu trên, cytokinin chiếm vai trò quan trọng [5,9,10,11]. Trong công nghệ
nuôi cấy mô tế bào in vitro, cytokinin có vai trò rất rõ rệt trong việc giữ cho mô lá tách
rời chậm thoái hoá diệp lục tố - được xanh tươi lâu. Trong thực tiễn công tác giống cây
trồng, việc xử lý cytokinin, li ên quan mật thiết đến sự tươi lâu của rau vừa thu hoạch và
kéo dài tuổi thọ của hoa cắt cành, mang ý nghĩa thương mại rất cao.
Trên thế giới, các nhà khoa học đã nghiên cứu chuyển gen nạp ipt (mã hoá enzym
isopentenyl transferase có liên quan đ ến sinh tổng hợp cytokinin isopentenyl adenin,
zeatin và dihydrozeatin) vào cây tr ồng mục đích làm mô tế bào của chúng tự sản xuất
cytokinin. Thực tế nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh rằng, ở một số tr ường hợp
như cây thuốc lá [25], Petunia [5,10] cây bông cải [11], cây cải xà lách [13,14] kể cả
cây cúc [8,9,10]…, tác d ụng của cytokinin nội sinh (sản phẩm của gen đ ược chuyển
nạp) đối với tuổi thọ của lá v à hoa của cây chuyển nạp gen là rất có ý nghĩa. Để tránh sự
tạo dư thừa (overproduction) cytokinin gây thay đồi h ình dạng cây, các nhà khoa học đã
sử dụng một số loại promoter khác nhau tạo sự biểu hiện gen khi cây ở điều kiện đặc
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 359

thù [1,5,9,10,13] trong đó có promote r SAG12 (tạo sự sinh tổng hợp cytokinin khi mô
đi vào trạng thái lão hoá) [5,13] mà chúng tôi s ử dụng trong nghiên cứu này.
Theo xu hướng trên, ở nghiên cứu này, qua kết hợp công nghệ nuôi cấy mô v à công
nghệ gen, chúng tôi nghiên cứu tái sinh cây in vitro và chuyển gen ipt vào cây hoa cúc
Dendranthema morifolium L. Với hy vọng sự hiện diện v à biểu hiện của gen ipt nói trên
sẽ có tác dụng góp phần làm cho cây hoa lâu héo tàn.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP


Giống lan: Sử dụng giống cúc đại đoá Đ à Lạt có hoa màu vàng.
Phương pháp
Môi trường nuôi cấy mô và thử tính chống chịu đối với kháng sinh hygromycin
1. Môi trường nuôi cây: MS (Murashige -Skoog, 1962) [15 ] không ch ất điều hoà sinh
trưởng (ĐHST).
2. Môi trường tái sinh chồi: MS có các chất ĐHST NAA , BA với các nồng độ khác
nhau.
3. Môi trường vươn chồi tạo cây và ra rễ: như môi trường số 1.
4. Môi trường thử tính chống chịu đối với kháng sinh hygromycin: nh ư môi trường 1
nhưng có hygromycin từ 5 - 10mg/l.
Điều kiện nuôi cấy: 9 giờ chiếu sáng/ng ày, nhiệt độ 25-28 oC.
Dòng vi khuẩn và môi trường nuôi cấy
Sử dụng dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 chứa plasmid
pVDH396 (kích thước  15,9 kb) (do TS. Nguyễn Thị Thanh thiết kế) mang gen ipt (có
nguồn gốc từ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ) tạo enzyme isopentenyl t ransferase
[có promoter SAG12 (senescence associated gene 12, t ừ Arabidopsis thaliana), gen
gusA (có intron, promoter CaMV35S) và gen kháng hygromycin hph (promoter
CaMV35S).
Môi trường giữ giống vi khuẩn là môi trường LB có 50mg/l kanamycin. Để nhân
giống cho nghiên cứu chuyển gen, vi khuẩn đ ược nuôi cấy lắc qua đêm trong môi
trường khoáng AB (Chilton v à cs., 1974) cũng có nồng độ kanamycin nh ư trên. Nhiệt
độ nuôi cấy: 25 - 280C.
Quy trình chuyển gen
Các mảnh lá với kích thước 0,6 x 0,6cm, từ cây in vitro trên môi trường MS không
chất điều hoà sinh trưởng, được sử dụng làm vật liệu chuyển gen.
Tóm tắt quy trình chuyển gen
1. Nuôi cấy mảnh lá trên môi trường có 0,5mg/l NAA và 1mg/l BA trong thời gian 2
ngày.
360 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

2. Gây nhiễm các mảnh lá với vi khuẩn trong thời gia n 10 phút. Vớt mẫu ra, thấm bớt
dịch vi khuẩn thừa bằng giấy lọc.
3. Nuôi chung mảnh lá với vi khuẩn trong 2 ng ày. Sử dụng môi trường như trên
nhưng có acetosyringone 100 M.
4. Rửa thật sạch vi khuẩn bằng n ước cất và bằng dung dịch cefotaxime 500 mg/l (kết
hợp lắc nhẹ).
5. Vớt mẫu ra, thấm ráo nước và cấy các mảnh lá trên môi trường chọn lọc: như môi
trường ở bước 1 của quy trình nhưng có bổ sung 10 mg/l hygromycin, 500 mg/l
cefotaxime. Thời gian nuôi 15 ngày / chu kỳ chọn lọc và thực hiện 2 chu kỳ.
6. Tiếp tục thực hiện sự chọn lọc thêm 3 chu kỳ (15 ngày/chu kỳ) trên môi trường
chọn lọc như trên nhưng có 5mg/l hygromycin đến khi có chồi tái sinh.
7. Cấy truyền các chồi / cụm chồi tái sinh (cao khoảng 1 cm) sang môi trường MS
không chất sinh trưởng cũng chứa 5mg/l hygromy cin đến khi vươn chồi, thời gian
nuôi khoảng 1 tháng.
Kiểm tra cây chuyển gen
1. Tách các chồi vươn cao (khoảng 2cm) và cấy truyền cũng sang môi tr ường MS
không chất sinh trưởng có 5mg/l hygromycin: theo dõi s ự vươn chồi và ra rễ trong
thời gian khoảng 20 ngày.
2. Nhuộm GUS (Jefferson và ctv, 1987) [7]: ủ mô lá trong thuốc thử GUS qua đ êm ở
370C (tủ ấm).
3. PCR: Sự hiện diện của gen hph, gen gusA và gen ipt được kiểm tra dùng các cặp
mồi đặc hiệu.
Gen hph: HPH1: CGTCGTTCGAGAAGTTTC, HPH2:
TACTTCTACACAGCCATC; chương trình nhiệt: 94 C: 5 phút; 35 chu kỳ (940C: 1
0

phút, 62 0C: 1 phút, 72 0C: 1 phút); 72 0C: 5 phút; khuếch đại đoạn DNA 800 bp.
Gen gusA: GUS1: CCTGTAGAAACCCCAACCCGTG, GUS2:
CCCGGCAATAACATACGGCGTG; chương tr ình nhiệt: 94 C: 3 phút; 30 chu kỳ (940C:
0

30 giây, 560C: 45 giây, 72 0C: 1 phút); 720C: 10 phút; khuếch đại đoạn DNA 365 bp .
Gen ipt: IPT1: TCAACCGGAAGCGGACGACC, IPT2:
GCCATGTTGTTTGCTAGCCAG; chương tr ình nhiệt: 90 C:10 phút; 40 chu kỳ (940C: 15
0

giây, 450C: 45 giây, 720C: 50 giây); 720C: 7 phút; khuếch đại đoạn DNA 355 bp.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN


a. Tính chống chịu tự nhiên của mô lá đối với hygromycin
Theo một số tài liệu công bố về chuyển nạp gen qua sử dụng tác nhân chọn lọc l à
hygromycin thì cây cúc là đối tượng rất mẫn cảm đối với tác nhân chọn lọc n ày. Qua
triển khai thử nghiệm tính chống chịu đối với hygromycin d ùng vật liệu là mảnh lá và
cây con in vitro, kết quả cho thấy các mảnh lá (kích thước 0,6 x 0,6cm) và cây con (cao
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 361

khoảng 1,5 - 2cm) đều bị chết nâu trên môi trường MS không chất sinh trưởng có
10mg/l hygromycin. Trên môi trường có nồng độ 5mg/l hygromycin, ở mảnh lá có sự
hình thành mô sẹo nhưng mô sẹo đen dần và không có khả năng tái sinh chồi, và nếu có
sự tái sinh chồi xảy ra th ì chồi rất yếu ớt, xanh nhạt; đối với thử nghiệm tr ên cây con thì
cây tuy cũng có sự phát triển nhất định nh ưng chậm, rễ ra ngắn và có màu nâu đen, các
lá gần gốc ở trạng thái héo nâu, rũ.
Kết hợp thử nghiệm riêng trên giống cúc thí nghiệm và theo tài liệu đã công bố,
chúng tôi chọn nồng độ hygromycin 10mg/l để chọn lọc tế bào chuyển gen ở giai đoạn
đầu (1 - 2 chu kỳ) qua sử dụng phiến lá (không mang phần cuống) l àm vật liệu xử lý
chuyển gen. Tuy vậy, chúng tôi cũng quan tâm cân đối việc gia giảm nồng độ tác nhân
chọn lọc này để đảm bảo vừa có sự tái sinh ở mức t ương đối chấp nhận được vừa không
bị lúng túng do việc tái sinh nhiều cây không phải l à cây chuyển gen. Cũng qua thực tế
triển khai thử nghiệm này trên giống cúc đại đoá vàng Đồng Tháp (giống chịu nhiệt) th ì
giống này lại tỏ ra ít mẫn cảm hơn giống cúc nói trên (số liệu cá nhân).
b. Nghiên cứu nuôi cấy mô tái sinh cây phục vụ nghi ên cứu chuyển gen
Nói chung, trong nghiên cứu nuôi cấy mô và chuyển gen thì việc quan tâm trạng
thái sinh lý của lá là yêu cầu quan trọng. Tuy giống cúc n ày phát triển rất tốt trong bình
nuôi cấy, lá xanh đậm và to tạo thuận lợi cho việc lấy mẫu nh ưng theo kinh nghiệm
nghiên cứu thì việc lấy các lá không ở vị trí ngọn cũng nh ư gần gốc là điều cần thiết
nhất là đối với nghiên cứu chuyển gen. Điều này rất rõ đối với nghiên cứu nuôi cấy mô
và chuyển gen đối với cây hoa cát t ường (tài liệu cá nhân).
Chúng tôi đã bố trí một số môi trường thí nghiệm tái sinh tr ên cơ sở khoáng MS với
các nồng độ NAA 0,1; 0,5 và 1mg/l kết hợp với BA 1 và 2mg/l. Kết quả cho thấy, nói
chung, khi NAA cao (0,5; 1mg/l) kết hợp với BA 1 hoặc 2mg/l thì sự tái sinh chồi xảy
ra theo kiểu phát sinh cơ quan (organogenesis) [22] thông qua giai đo ạn trung gian là
mô sẹo. Ngược lại, khi nồng độ NAA thấp h ơn (0,1mg/l) kết hợp với BA 1 hoặc 2mg/l,
nhất là khi dùng 2mg/l, thì sự tái sinh chồi xảy ra ít qua giai đoạn mô sẹo, một số chồi
có vẻ hình thành trực tiếp từ mảnh lá [20,22,23]. Đặc biệt, sự hình thành trực tiếp này là
thường theo kiểu sinh phôi sô-ma [19], xảy ra nhiều khi chỉ dùng BA từ 1 - 2mg/l mà
không bổ sung NAA (số liệu cá nhân).
Theo một số tác giả nước ngoài nghiên cứu chuyển gen trên cây cúc, sự tái sinh
theo dạng trực tiếp này không có lợi cho nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi
phù hợp ý kiến nêu trên. Về vấn đề này, thực tế nghiên cứu cho thấy khả năng nhận
được cây chuyển gen sẽ cao h ơn khi điều chỉnh sự tái sinh thông qua mô sẹo v ì theo
chúng tôi tế bào chuyển gen, trước hết, cần được nhân lên và như vậy sẽ tạo cơ hội cao
cho sự tái sinh cây mang gen chuyển. Nói chung, hiện nay tr ên thế giới, nghiên cứu nuôi
cấy mô phục vụ nhân giống [2], sự phát sinh h ình thái [4,8, 20,22,26] và ph ục vụ
chuyển nạp gen [17,18] đã và đang được các nhà khoa học quan tâm rất nhiều ở đối
tượng cây trồng này.
c. Quy trình chuyển gen
Như đã nói ở trên do tính rất mẫn cảm với hygromycin nên chúng tôi, như đã trình
bày trong phần quy trình chuyển gen, sự chọn lọc được thực hiện ở giai đoạn đầu với
362 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

10mg/l hygromycin, sau đó giảm xuống còn 5mg/l nhằm tạo cơ hội cho sự tái sinh.
Cách làm này của chúng tôi phù hợp với cách thực hiện của một số tác giả n ước ngoài
vì theo các tác giả ấy, trên giống cúc cụ thể ở công bố, th ì sự tái sinh không thể xảy ra
dù đã có sự chuyển nạp gen (gen hph).
Cũng do quá mẫn cảm đối với hygromycin n ên quá trình chọn lọc tế bào chuyển
gen từ sau xử lý vi khuẩn đến khi nhận được cây thì khá dài. Điều này là do trên môi
trường có hygromycin tế bào tăng sinh chậm và cây khi đã có đầy đủ thân lá phát triển
cũng rất chậm. Và thực tế cũng cho thấy khi đ ã là cây chuyển gen nhưng chúng cũng
phát triển khá chậm trên môi trường có nồng độ hygromycin dù không phải ở mức quá
cao (5mg/l). Theo chúng tôi, đây là đi ểm đáp ứng đặc thù của các giống cúc khi sử dụng
tác nhân chọn lọc là hygromycin. Qua quá trình chuy ển gen, chúng tôi đã nhận được 3
dòng chồi có khả năng vươn cao thành cây. Chúng đư ợc kiểm tra về khả năng sinh
trưởng, ra rễ trên môi trường có hygromycin sẽ được trình bày dưới dây.
Hiện nay, trên thế giới, các nhà khoa học dùng nhiều phương pháp khác nhau [3, 6,
12, 16, 17, 21, 23, 24, 27] để chuyển một số gen khác nhau nhằm tạo ra các đặc tính
mới cho cây cúc như cây chậm lão hoá [5, 9, 10, 13], tạo hoa có màu sắc mới lạ, kháng
virus [27].
d. Kiểm tra khả năng ra rễ trên môi trường có hygromycin
Các cây vươn cao t ừ 2cm trở lên được cấy sang môi tr ường MS không chất sinh
trưởng có 5mg/l hygromycin đ ể theo dõi sự sinh trưởng tiếp theo. So sánh với cây
đối chứng, sự sinh trưởng tiếp tục với biểu hiện k èm theo là có sự hình thành rễ là
hai hiện tượng xảy ra đồng thời đối với cây thực sự l à cây chuyển gen; ngược lại,
cây đối chứng mất hoàn toàn khả năng sinh trưởng dẫn đến sự chết sau đó tr ên cùng
loại môi trường.
e. Thử GUS
Điểm gây sự chú ý ở đây là các dòng chuyển gen đều cho kết quả âm tính đối với thử
nghiệm GUS. Điểm đặc biệt nữa l à không chỉ riêng giống cúc này trên các dòng chuyển
gen khác nhau mà đối với giống cúc khác (đại đoá v àng Đồng Tháp) tạo ra cũng bằng
phương pháp dùng vi khuẩn Agrobacterium và bằng phương pháp chuyển gen khác (là bắn
gen) thì tất cả các dòng chuyển gen cũng đều cho kết quả âm tính (tài liệu của phòng). Theo
một tài liệu nước ngoài, hiện tượng âm tính đối với thử GUS này vẫn chưa giải thích được
khi dùng dòng vi khuẩn LBA 4404 để chuyển nạp v à khi dùng promoter CAMV35S cho
gen gusA. Tuy nhiên, theo chúng tôi, đây ch ỉ là gen chỉ thị nên dù có biểu hiện hay không là
điều không quan trọng, chỉ có điều nó gây cho ng ười nghiên cứu ít nhiều khó khăn khi
muốn kiểm tra nhanh cây chuyển gen khi ch ưa cần làm PCR.
f. Phân tich PCR các gen hph, gusA và ipt
Các dòng cây được kiểm tra bằng PCR chỉ khi chúng đã qua giai đoạn tạo rễ và có
sinh trưởng bình thường trên môi trường có 5mg/l hygromycin. Kết quả phân tích PCR
các gen hph, gusA, ipt v ới các cặp mồi đặc hiệu cho thấy có sự hiện diện của các băng
DNA được khuếch đại tương ứng là 800 bp, 365 bp và 355 bp.
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 363

hph gusA ipt

Hình hàng trên (từ trái sang phải): Phôi sô -ma, chồi hình thành trực tiếp và gián
tiếp từ mảnh lá
Hình hàng dưới (từ trái sang phải): Cụm chồi kháng hygromycin; phân tích PCR
gen hph (800 bp), gen gusA (365 bp) và gen ipt (355 bp)

KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu nuôi cấy tái sinh cây v à chuyển nạp gen trên cây cúc đại đoá vàng
Đà Lạt nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, chúng tôi có một số kết luận sau:
 Trong số các môi trường khảo sát, môi trường thích hợp đồng thời cho việc tái sinh
cây và cho nghiên cứu chuyển nạp gen (ở khía cạnh cần sự tái sinh cây thông qua
mô sẹo) là môi trường MS có 0,5mg/l NAA v à 1mg/l BA.
 Giống cúc nói trên rất mẫn cảm đối với hygromycin n ên việc chọn lọc áp lực cao
(10mg/l hygromycin) chỉ nên được thực hiện trong 1 - 2 chu kỳ đầu, sau đó cần
giảm xuống (5 - 6mg/l hygromycin) ở giai đoạn tái sinh để có thể nhận đ ược chồi
tái sinh.
 Đã nhận được 3 dòng cây cúc mang gen ipt, gen hph và gen gusA. Sự hiện diện của
chúng đã được kiểm tra bằng phân tích PCR.

LỜI CÁM ƠN
Các tác giả xin chân thành cám ơn Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí
Minh đã tài trợ cho nghiên cứu này.

TÀI LIỆU THAM KHẢO


1. Aida, R., S. Nagaya, K. Yoshida, S. Kishimoto, M. Shibata , A. Ohmiya, 2005.
Efficient transgene expression in chrysanthemum, Chrysanthemum morifolium
Ramat., with the promoter of a gene for tobacco elongation factor 1  protein.
JARQ 39(4): 269-274.
2. Bhattacharya, P., S. Dey, N. Das, B. C. Bhattacharya, 1990. Rap id mass
propagation of Chrysanthemum morifolium by callus derived from stem and leaf
explants. Plant Cell Rep. 9: 439-442.
364 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

3. Boase, M. R., J. M. Bradley, N. K. Borst, 1998. Genetic transformation mediated


by Agrobacterium tumefaciens of Florists’ chrysanthemum (Dendranthema
grandiflorum) cultivar ‘Peach Margaret’. In vitro Cell. Dev. Biol.- Plant 34: 46-51.
4. Bush, R., E. D. Earle, R. W. Langhans, 1976. Plantlets from petal segments, petal
epidermis and shoot tips of the periclinal chimera, Chrysanthemum morifolium
‘Indianapolis”. Am. J. Bot. 63: 729-737.
5. Chang, H., M. L. Jones, G. M. Banowetz, D. G. Clark, 2003. Overproduction of
cytokinins in Petunia flowers transformed with P SAG12-IPT delays corolla
senescence and decreases sensitivity to ethylene. Plant Physiology 132: 2174-2183.
6. De Jong, J., W. Rademaker, M. F. Van Wordragen, 1993. Restoring adventitious
shoot formation on chrysanthemum leaf explants following co -cultivation with
Agrobacterium tumefaciens . Plant Cell Tiss. Org. Cult. 32: 263-270.
7. Jefferson, R. A., T. A. Kavanagh, B. W. Bevan, 1987. GUS fusion: -
glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.
EMBO 6: 3901-3907.
8. Kaul, V., R. M. Miller, J. F. Hutchinson, D. Richards, 1990. Shoot regeneration
from stem and leaf ex plants of Dendranthema grandiflora ‘Tzvelev’ (syn.
Chrysanthemum morifolium Ramat.). Plant Cell Tiss. Org. Cult. 21: 21-30.
9. Khodakovskaya, M. V., R. McAvoy, H. Liu, Y. Li, 1998. Ethylene -regulated
expression of the ipt gene increases flower number in trans genic Dendranthema
grandiflorum. Abstracts, Society for In Vitro Biology.
10. Khodakovskaya, M. V., Y. Li, J. Li, R. Vankova, J. Malbeck, R. McAvoy, 2005.
Effects of cor15a-IPT gene expression on leaf senescence in transgenic Petunia
hybrida and Dendranthema grandiflorum. Plant Growth Regulation 00: 00-00.
Richard.McAvoy@uconn.edu .
11. Kim Hong, N. T., E. J. Kane, P. J. Dix, 1998. Hormonal regulation of senescence in
cauliflower (Brassica oleracea var. Botrytis) (Abstract). In: Altman A., Ziv M.,
Izhar S. (eds), Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21 st Century, IX
International Congress on Plant Tissue Culture. Kluwer Academic Publishers,
Dordrecht, The Netherlands, p. 164.
12. Ledger, S. E., S. C. Deroles, N. K. Given, 1991. Regeneration and Agrobacterium-
mediated transformation of chrysanthemum. Plant Cell Rep. 10: 195-199.
13. McCabe, M. S. et al., 2001. Effects of P SAG12-ipt gene expression on development
and senescence in transgenic lettuce. Plant Physiol., 127: 505-516.
14. McCabe, M. S., U. Mohapatra, F. Sch epers, K. Van Dun, J. B. Power, M. Davey,
1998. Delayed senescence in transgenic lettuce using an autoregulated ipt gene. J.
Exp. Bot. Suppl. 49: 49.
15. Murashige, T., F. Skoog, 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay
with tobacco tissue culture. Physiol. Plant .15: 473-497.
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 365

16. Renou, J. P., P. Brochard, R. Jalouzot, 1993. Recovery of transgenic


chrysanthemum (Dendranthema grandiflorum Tzvelev) after hygromycin resistance
selection. Plant Science 89: 185-197.i1
17. Sherman, J. M., J. W. Moyer, M. E. Dau b, 1998. A regeneration and
Agrobacterium-mediated transformation system for genetically diverse
chrysanthemum cultivars. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 123: 189-194.
18. Shinoyama, H., T. Kazuma, M. Komano, Y. Nomura, T. Tsuchiya, 2002. An
efficient transformation system in Chrysanthemum [ Dendranthema x grandiflorum
(Ramat.) Kitamura] for stable and non -chimeric expression of foreign genes. Plant
Biotechnology 19(5): 335-343.
19. Tanaka, K., Y. Kanno, S. Kudo, M. Suzuki, 2000. Somatic embryogenesis and
plant regeneration in chrysanthemum (Dendranthema grandiflorum (Ramat.)
Kitamura). Plant Cell Rep. 19:945-953.
20. Teixeira da Silva, J. A., 2003. Thin cell layer technology for induced response and
control of rhizogenesis in chrysanthemum. Plant Growth Regulation 39: 67-76.
21. Teixeira Da Silva, J. A., S. Fukai, 2002. Increasing transient and subsequent stable
transgene expression in chrysanthemum following optimization of particle
bombardment and Agroinfection parameters. Plant Biotechnology 19(4): 229 -240.
22. Teixeira da Silva, J. A., S. Fukai, 2003. Chrysanthemum organogenesis through
thin cell layer technology and plant growth regulator control. Asian Journal of Plant
Sciences 2(6): 505-514.
23. Teixeira da Silva, J. A., S. Fukai, 2003. Four gene introduction methods affect the
shoot regeneration and localization of transgene expression in greenhouse stem
explants and in vitro-grown chrysanthemum stem thin cell layers. African Journal
of Biotechnology 2(5): 114-123.
24. Urban, L. A., J. M. Sherman, J. W. Moyer, M. E. Daub, 1994. High frequency
shoot regeneration and Agrobacterium-mediated transformation of chrysanthemum
(Dendranthema grandiflora). Plant Sci. 98: 69-79.
25. Wang, J., D. S. Letham, E. Cornish, K. R. Stevenson, 1997. Studies on cytokinins
action and metabolism using tobacco p lants expressing either the ipt or the gus gene
controlled by a chalcone synthase promoter: 1. Developmental features of the
transgenic plants. Aus. J. Plant Physiol. 24: 661-672.
26. Xiaohan, Y., J. Bo, Z. Yan, M. Ding, T. Xuemei, 2002. Enhancement of direct
shoot regeneration from internode segments of chrysanthemum by silver nitrate.
Propagation of Ornamental Plants 2(1): 28-37.
27. Yepes, L. C., V. Mittak, S -Z. Pang, C. Gonsalves, J. L. Slightom, D. Gonsalves,
1995. Biolistic transformation of chrysanthemum wit h the nucleocapsid gene of
tomato spotted wilt virus. Plant Cell Rep. 14: 694-698.
366 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

SUMMARY
In vitro plant regeneration and transformation of
Dendranthema grandiflorum L. with the ipt gene for cytokinin
production

Nguyen Huu Ho, Le Tan Duc, Phan Tuong L oc, Pham Duc Tri, Nguyen Thi Thanh
Institute of Tropical Biology

The leaf disks of Dendranthema grandiflorum L. (0.6 x 0.6 cm) were co -cultivated
with Agrobacterium tumefaciens strain LBA 4404. This Agro-strain contains the
plasmid pVDH396 harbouring the ipt gene (with SAG12 promoter) for the isopentenyl
transferase enzyme, the nptII gene (for kanamycin resistance) and the reporter gene
gusA. After 2 day co-cultivation, The leaf disks were transferred to the medium
containing hygromycin of 10 mg/l for sel ection. Through 4 - 5 rounds of selection, 3
independent transformed plants were obtained. The presence of the hph, gusA and ipt
genes was checked by the PCR analyses and / or the GUS assay [In the case of gusA
gene: positive in the PCR analysis; negative for the expression of gene in the different
organs of three in vitro transformed plant lines, in the GUS assay]. These transgenics
are being grown in the greenhouse for further studies.
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 367

MỘT SỐ NGHIÊN CỨU HƯỚNG ĐẾN KHẢ NĂNG TẠO


vắc-xin VIÊN GAN B TỪ CÂY TRỒNG

Nguyễn Hữu Hổ, Trương Thiện Trí, Lê Tấn Đức,


Phạm Thị Hạnh, Nguyễn Hữu Tâm
Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU
Thời gian gần đây, công nghệ sinh học đặc biệt l à công nghệ gen đã có những bước
tiến vượt bậc, qua đó các nhà khoa học nhiều nước (Mỹ, Cuba, Đức, Hàn Quốc, Trung
Quốc, Tây Ban Nha…) có thể sản xuất vắc -xin tái tổ hợp từ cây trồng
[9,10,11,15,16,17,19,20]. Hư ớng nghiên cứu sản xuất vắc-xin này được xem là hướng
có tiềm năng vô cùng lớn vì theo tính toán giá thành sản phẩm sẽ thấp hơn rất nhiều so
với giá thành các sản phẩm hiện dùng do có thể sản xuất ở quy mô lớn, lại khá đ ơn giản
trong khâu tổ chức sản xuất, vận chuyển v à bảo quản nguồn vắc-xin, sản phẩm không
chứa các virus gây bệnh cho người… - tạo điều kiện thuận lợi phục vụ tiêm chủng vắc-
xin mở rộng cho người dân ở các nước nghèo và các nước đang phát triển. Nêu đề tài
nghiên cứu này, chúng tôi hy vọng kết quả nghiên cứu của mình, cùng với kết quả
nghiên cứu theo hướng này của các nhà khoa học khác trong nước, sẽ góp phần nhất
định vào sự phát triển của lĩnh vực nghi ên cứu, sản xuất vắc-xin từ các nguồn vật liệu
truyền thống nói chung và vắc-xin được sản xuất từ cây trồng nói ri êng.
Như chúng ta đã biết, nước ta là vùng lưu hành cao của bệnh viêm gan do siêu vi B
(HBV). Tỷ lệ người mang mầm bệnh vào khoảng 10-15 % dân số (trên dưới 10 triệu
người). Tình trạng nhiễm này đã gây ra nhiều hậu quả nghiêm trọng. Bệnh này lây lan
theo hướng đa dạng và phức tạp, trường hợp bệnh mạn tính có thể dẫn đến x ơ gan và
ung thư gan, thời gian chữa trị kéo dài hơn nữa chi phí điều trị còn rất cao so với thu
nhập. Cách tốt nhất là phòng ngừa và một trong các biện pháp ph òng ngừa quan trọng là
chủng ngừa. Tuy nhiên, chi phí cho chủng ngừa bệnh cũng còn khá cao nếu tuân thủ
phác đồ điều trị tiêu chuẩn (tiêm nhiều mũi cách quãng thời gian).
Protein HBsAg của HBV là thành phần rất quan trọng giúp cho HBV bám dính v ào
màng tế bào và sau đó đi vào tế bào và huyết tương người bệnh và huyết tương có chứa
HBsAg là nguồn vật liệu quan trọng để sản xuất thuốc chủng ngừa có nguồn gốc huyết
tương (ngoài huyết tương, vắc-xin này còn được sản xuất từ nấm men, tế b ào động vật
hữu nhũ…). Đã có một số công bố khoa học li ên quan đến nghiên cứu chuyển nạp gen
HBsAg (mã hoá protein vỏ - HBsAg), dùng công nghệ chuyển gen vào nhân và lục lạp
tế bào, vào một số cây trồng, sản xuất sinh khối mô tế b ào cây chuyển gen, chiết tách
protein tinh khiết và nghiên cứu khả năng đáp ứng miễn dịch ở c ơ thể động vật qua tiêm
368 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

chích protein tinh khiết hoặc/và ăn trực tiếp sản phẩm cây chuyển gen. Qua các nghi ên
cứu nêu trên, nhận thấy protein kháng nguyên HBsAg sử dụng qua đường tiêu hoá có
khả năng tạo đáp ứng miễn dịch tốt - mở ra triển vọng nghiên cứu chuyển nạp gen này
vào các cây trồng có bộ phận ăn tươi được như quả, lá, thân, củ… Cũng qua một số
công bố nêu trên, kết quả nghiên cứu còn có mặt hạn chế là lượng protein (sản phẩm
của gen chuyển) trong cây chuyển gen c òn chưa cao nên trong nghiên c ứu này, chúng
tôi đặt vấn đề đưa hệ thống sao chép T7 của thực khuẩ n thể vào nghiên cứu ở đối tượng
thực vật (vấn đề đã gây được sự quan tâm đặc biệt chỉ trong v ài năm gần đây) kết hợp
với promoter PDS tạo sự biểu hiện chuyên biệt ở quả nhằm hướng làm tăng hàm lượng
protein kháng nguyên trong lo ại mô này. Tuy nhiên, ở nghiên cứu này, gen HBsAg với
promoter PDS được nghiên cứu sự tích hợp và biểu hiện trước hết ở cây thuốc lá tuy
rằng protein biểu hiện chuyên biệt ở quả cây thuốc lá không có ý nghĩa sử dụng nh ư
“vắc-xin ăn được” và kết quả nghiên cứu chuyển gen này trên cây cà chua quả bi là kết
quả khoa học mang tính mới mẻ.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP


Giống thuốc lá, cà chua: Sử dụng giống thuốc lá sợi v àng K.326 và cà chua bi qu ả
dài (mua ngoài chợ). Hạt được khử trùng bằng nước Javel 50 % (v/v) trong 5 phút, rửa
sạch bằng nước cất và được cấy trên môi trường không chất sinh tr ưởng. Các mảnh lá
cây in vitro với kích thước khoảng 0,7 x 0,7cm (đối với thuốc lá) và lá mầm của cây
mầm 7-10 ngày tuổi (đối với cà chua) được sử dụng làm nguyên liệu chuyển gen.
Môi trường nuôi cấy mô và điều kiện nuôi cấy: Sử dụng môi tr ường cơ bản MS
(Murashige và Skoog, 1962) [13].
 Gieo hạt sau khử trùng và nuôi cây giai đoạn tạo rễ: MS không chất sinh tr ưởng.
1/ Tái sinh chồi, cây từ mảnh lá: MS + 0,1mg/l NAA + 1 mg/l BA (đối với thuốc
lá), MS + 0,5mg/l NAA + 2mg/l BA (đối với cà chua).
Điều kiện nuôi: Nhiệt độ 26-28°C, cường độ ánh sáng khoảng 3000 lux.
Dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens:
2/ LBA 4404 chứa plasmid pITB-HBsAg ( 16,78 kb) (do TS. Nguyễn Hữu Tâm
thiết kế) mang gen HBsAg (promot er T7, terminator T7;  0,7 kb), gen gusA (promoter
T7, terminator T7) và gen nptII kháng kanamycin (promoter CaMV35S). Gen HBsAg
mã hoá protein nhỏ S và gen gusA được điều khiển bởi hệ thống [promoter PDS
(phytoene desaturase,  2 kb) + T7-polymerase (2,7 kb)] tạo sự biểu hiện chuyên biệt ở
quả. Vi khuẩn được nuôi trong môi trường LB có 50mg/l kanamycin trước khi gây
nhiễm mô.
Quy trình chuyển gen:
 Cấy các mảnh lá (đối với thuốc lá) v à lá mầm (đối với cà chua) trên môi trường 2;
nuôi 2 ngày ngoài sáng.
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 369

 Gây nhiễm mô với vi khuẩn trong 10 phút v à nuôi chung mô và vi khu ẩn trong 2
ngày trên môi trường 2; để ngoài sáng (trường hợp cà chua thì môi trường có bổ
sung acetosyringone 100 M).
 Rửa vi khuẩn bám vào mô bằng nước cất + 500mg/l cefotaxime, thấm khô nhẹ mô.
 Cấy mô lá / lá mầm trên cùng môi trường 2 có 500mg/l cefotaxime và tác nhân
chọn lọc kanamycin 100 mg/l (đối với thuốc lá) hoặc tăng dần từ 20 -50mg/l (đối với
cà chua); để ngoài sáng.
 Cấy truyền mô hình thành trên môi trường có kanamycin sang môi tr ường chọn lọc
như trên (thực hiện 3-4 chu kỳ, 15 ngày / chu kỳ) đến khi hình thành chồi và cây con.
Kiểm tra sự hiện diện và biểu hiện của gen chuyển :
 Nhuộm GUS (Jefferson và ctv, 1987) [7]: ủ mô lá, chồi trong thuốc thử GUS ở
37°C (tủ ấm) trong 24 giờ.
 Đối với cà chua, mảnh lá của cây giả định chuyển gen đ ược cấy trên môi trường số
2 có 50mg/l kanamycin để theo dõi khả năng tạo mô sẹo và tái sinh.
 PCR: Sự hiện diện của gen nptII, gen gusA v à gen HBsAg được kiểm tra dùng các
cặp mồi đặc hiệu.
Gen nptII: K1: A CACGCTGAAATCACCAGTCTC, K2:

CTCGTCCTGCAGTTCATTC; khuếch đại đoạn 600 bp; chương trình nhiệt: 94 C: 5 phút;
35 chu kỳ (94C: 1 phút, 55C: 1 phút, 72C: 2 phút); 72C: 7 phút.
Gen gusA: GUS1: CCTGTAGAAACCCCAACCCGTG, GUS2:
CCCGGCAATAACATACGGCGTG; chương tr ình nhiệt: 94C: 3 phút; 30 chu kỳ (94C:
30 giây, 56C: 45 giây, 72 C: 1 phút); 72C: 10 phút; khuếch đại đoạn DNA 365 bp .
Gen HBsAg: Sử dụng cặp mồi: HBV1: CTACACTCGTGGTGGACTTCTC,
HBV2: AACGCCGCAGACACATCC; khu ếch đại đoạn DNA 680 bp; ch ương trình
nhiệt: 94C:10 phút; 40 chu k ỳ (94C: 50 giây, 45 C: 45 giây, 72 C: 50 giây); 72 C: 7
phút; hoặc cặp mồi HBsAg1: ATGGAGAACACAACATC, HBsAg2:
GGATCCTTTTGCGGAAGCCCA; khu ếch đại đoạn DNA 480 bp; ch ương trình nhiệt:
như trên. Sản phẩm PCR gen HBsAg (680 bp) c òn được kiểm tra bằng máy phân tích tự
động Agilent 2100 Bioanalyzer - Automated Analysis System (công ty Agilent
Technologies, Mỹ) với bộ kit DNA 12000 LabChip (công ty Caliper Life Science, Mỹ).
 Sự hiện diện của protein HBsAg đ ược kiểm tra bằng máy phân tích Agilent 2100
Bioanalyzer với bộ kit Protein 200 Plus LabChip của các công ty nói tr ên.
 Kiểm tra nhanh sự hiện diện của protein HBsAg trong cây chuyển gen bằng que thử
đặc hiệu của công ty Clinotech Diagnostics (Mỹ).

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN


Chuyển gen vào cây thuốc lá:
Sau khoảng 15 ngày nuôi cấy chọn lọc trên môi trường có hygromycin, nhìn chung các
phiến lá bị mất dần màu diệp lục, đồng thời có sự hình thành các cụm mô sẹo nhỏ ở mép lá và
370 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

sau đó là các chồi nhỏ được tái sinh. Trên môi trường có nồng độ tác nhân chọn lọc
kanamycin đúng ngưỡng (100mg/l), màu sắc tương phản của chồi tái sinh (màu xanh lục
đậm) và phiến lá (mất màu xanh) là hiện tượng rất dễ nhận biết; điều này cho thấy các chồi
mới hình thành rất có thể là những chồi đã mang gen chọn lọc. Khá nhiều trường hợp có
nhiều hơn một chồi / cây hình thành trên 4 đường cắt (chu vi) của một mảnh lá. Sau đó, các
cây con được cấy truyền sang môi trường nuôi (môi trường 1) cũng có nồng độ kanamycin
như trên. Ở báo cáo này, cây giả định chuyển gen (GĐCG) được định nghĩa là những cây tái
sinh trên môi trường tái sinh có nồng độ chọn lọc ngưỡng, có khả năng phát triển tốt rễ thân lá
trên môi trường nuôi cây (MS không chất sinh tr ưởng) với cùng nồng độ chọn lọc ngưỡng.
Thực ra, các dòng cây tái sinh trên môi trường chọn lọc thường cũng có khả năng phát tiển tốt
rễ thân lá trên môi trường nuôi cây chọn lọc. Tất cả các d òng cây tái sinh qua xử lý chuyển
gen đều đã được kiểm tra theo cách này trước khi được đem phân tích tiếp theo.
Do thuốc lá là một đối tượng có đáp ứng khá cao đối với chuyển gen nên sau một số chu
kỳ chọn lọc chúng tôi đã nhận được khá nhiều dòng cây GĐCG. Theo dự kiến của chúng tôi
thì gen gusA (cùng với gen HBsAg) sẽ không biểu hiện ở mô sinh d ưỡng như lá, thân, rễ do
chúng được điều khiển bởi promoter PDS chỉ tạo sự biểu hiện chuyên biệt ở quả. Kết quả thử
nghiệm GUS đối với các loại mô nói trên đều cho kết quả âm tính với thuốc thử X -gluc, hoàn
toàn phù hợp với dự kiến. Ngược lại, phân tích PCR gen gusA cho kết quả d ương tính với
băng DNA 365 bp.
PCR gen chọn lọc nptII và gen mục tiêu HBsAg cũng đã được thực hiện với các trình tự
DNA được khuếch đại theo thứ tự là 600 bp và 680 bp (đối với cặp mồi HBV1 và HBV2)
hoặc 480 bp (đối với cặp mồi HBsAg1 v à HBsAg2). Sự hiện diện cũng như kích thước đoạn
khuếch đại gen HBsAg (680 bp) qua kiểm tra bằng hệ thống phân tích tự động cho kết quả
khớp với kết quả chạy điện di trên gel agarose.
Cũng bằng hệ thống phân tích tự động n êu trên, một peak protein có trọng lượng phân tử
khoảng 23 kDa được ghi nhận [trọng lượng phân tử của protein thuộc loại nhỏ (S) trong số ba
loại protein cấu thành protein kháng nguyên bề mặt của virus (S, preS1, preS2)]; ngược lại, ở
trường hợp đối chứng thì không có. Như chúng ta đã biết, protein kháng nguyên bề mặt S là
protein quan trọng trong tạo đáp ứng miễn dịch ở cơ thể người và động vật.
Trong nghiên cứu này, do muốn kiểm tra sự chính xác của cấu trúc plasmid, gen v à vai
trò của promoter PDS nên chúng tôi, trước hết, nghiên cứu chuyển gen này vào cây thuốc lá.
Hiện chúng tôi đang cấu trúc gen HBsAg với promoter cấu trúc (constitutive) CaMV35S
trong hệ thống T7 nhằm tạo biểu hiện cao ở tất cả các bộ phận của cây với hy vọng trong
tương lai có thể nghiên cứu chiết tách protein kháng nguyên tinh khiết từ lá cây thuốc lá - một
đối tượng cây trồng cho sinh khối lá rất cao t ương tự như một số nghiên cứu trên thế giới
[9,11,15,20]. Việc sử dụng promoter tạo biểu hiện chuyên biệt ở một bộ phận của cây trong
lĩnh vực nghiên cứu tạo vắc-xin từ cây trồng cũng đã được công bố [4]. Ngoài nghiên cứu sản
xuất vắc-xin viêm gan siêu vi B, hiện nay các nhà khoa học còn đang nghiên cứu tạo vắc-xin
phòng bệnh viêm gan C từ cây trồng [14].
Các cây chuyển gen đang được trồng và theo dõi ở vườn ươm đến khi ra hoa, kết
quả. Chúng tôi sẽ thực hiện một số nghiên cứu liên quan đến sự biểu hiện của gen
HBsAg và gen gusA ở giai đoạn quả.
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 371

Kết quả thử nhanh bằng que thử ELISA cho thấy có sự h ình thành vạch dương tính (test
line) ngoài vạch đối chứng (control line) ở cây chuyển gen. Theo công ty Clinotech
Diagnostics, que thử có độ chính xác rất cao (99,8%), tính đặc hiệu tuyệt đối (100%) đối với
tất cả các subtype virus có các quyết định kháng nguy ên (determinants) phổ biến hiện nay.
Chuyển gen vào cây cà chua bi:
Sau khi được cắt ra từ cây mầm, các lá mầm đ ược nuôi 2 ngày trên môi trường số 2
nhằm làm tăng độ khoẻ (pre-conditioning) trước khi lây nhiễm với vi khuẩn. Các khâu
xử lý, nuôi chung với vi khuẩn, chọn lọc đ ược thực hiện tương tự trường hợp cây thuốc
lá và đã được trình bày ở phần nguyên liệu và phương pháp.
Nói chung, cây cà chua bi có đáp ứng không cao đối với sự chuyển nạp gen mặc d ù
khả năng tái sinh in vitro khá cao (số liệu chưa công bố). Tại thời gian đầu nghi ên cứu,
sau khi nuôi chung, mô đư ợc cấy chọn lọc ngay trên môi trường (MS + 1mg/l NAA + 2
mg/l BA) có nồng độ kanamycin cao - 50 mg/l. Kết quả cho thấy, tất cả các lá mầm đều
chết. Sau đó, chúng tôi áp dụng chế độ chọn lọc với nồng độ kanamycin t ăng dần từ
thấp đến cao - từ 20mg/l đến 50mg/l qua 4 chu kỳ chọn lọc và bước đầu nhận được 2
dòng cây tái sinh.
Mảnh lá của hai dòng cây này, có kích thước khoảng 0,6 x 0,6cm, được cấy trên
môi trường chứa các chất điều ho à sinh trưởng NAA và BA và có 50mg/l kanamycin để
theo dõi khả năng hình thành mô sẹo và tái sinh cây. Kết quả cho thấy, khoảng 7 - 10
ngày sau nuôi cấy có sự hình thành mô sẹo và có sự tái sinh chồi sau khoảng 20 -30 ngày
nuôi cấy; ngược lại, ở lá cây đối chứng, ho àn toàn không có sự hình thành mô sẹo. Phân
tích PCR các gen đang đư ợc thực hiện để khẳng định chúng l à cây chuyển gen.
Như chúng ta đã biết, việc tạo một số “vắc -xin ăn được” nhằm phòng bệnh viêm
gan B và một số bệnh khác [11,16,18,19, 21] đ ã được thực hiện trên một số đối tượng
cây trồng có sản phẩm ăn được trực tiếp (đối với động vật) nh ư khoai tây [1,2,3,8] thì
cây cà chua [6,12] là đối tượng cây trồng được quan tâm vì có thể ăn trực tiếp quả đối
với nghiên cứu tạo đáp ứng miễn dịch cho ng ười. Nghiên cứu của chúng tôi nhằm tiếp
cận xu hướng này.

Hình 1: PCR gen nptII v ới băng. Hình 2: PCR gen HBsAg v ới băng
DNA 600 bp DNA 450 bp

KẾT LUẬN
Qua sử dụng phương pháp chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ,
chúng tôi đã nhận được một số dòng cây thuốc lá và cây cà chua bi mang gen mã hoá
protein kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B. Các dòng nói trên c ơ bản đã qua kiểm
372 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

tra sự hiện diện và biểu hiện của gen chuyển bằng một số phương pháp định tính và sinh
học phân tử. Nghiên cứu này nhằm hướng đến việc tạo “vắc-xin ăn được”.

TÀI LIỆU THAM KHẢO


1. Arakawa, T., 1997. Expression of cholera toxin B subunit oligomers in transgenic
potato plants. Transgenic Research 6: 403-413a3
2. Bose, B., N. Khanna, S. K. Acharya, S. Sinha, 2006. Generation and
characterization of a single-gene mouse-human chimeric antibody against hepatitis
B surface antigen. J. Gastroenterology and Hepatology 21: 1439-1447.
3. Diminsky, D., R. Schirmbech, J. Reiman n, Y. Barenholz, 1997. Comparison
between hepatitis B surface antigen (HBsAg) particles derived from mammalian
cells (CHO) and yeast cells ( Hansenula polymorpha): composition, structure and
immunogenecity. Vaccine 15(6-7): 637-647.
4. Domansky, N., P. Ehsani, A. H. Salmanian, T. Medvedeva, 1995. Organ -specific
expession of the hepatitis B surface antigen in potato. Biotechnol. Lett. 17: 863-866.
5. Ehsani, P., A. Khabiri, N. Domansky, 1997. Polypeptide of hepatitis B surface
antigen in transgenic potato. Gene 190: 107-111.
6. Gao, Y., Y. Ma, M. Li, T. Cheng, S -W. Li, J. Zhang, N-S. Xia, 2003. Oral
immunization of animals with transgenic cherry tomatillo expressing HBsAg.
World journal of Gastroenterology 9(5): 996-1002.
7. Jefferson, R. A., T. A. Kavanagh, B. W. Bevan, 1987. GUS fusion: -glucuronidase as a
sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO 6: 3901-3907.
8. Joung, Y. H., et al., 2004. Expression of the hepatitis B surface S and preS2
antigens in tubers of Solanum tuberosum. Plant Cell Rep. 22: 925-930.
9. Kapusta, J. et al., 1999. Biotechnological approaches to making vaccine in plants.
Plant Biotechnology and In vitro Biology in the 21 st Century, A. Altman et al.
(eds.), Kluwer Academic Publishers, 571 -574.
10. Kong, Q., L. J. Richter, Y. F. Yang, C . J. Arntzen, H. S. Mason, Y. Thanavala,
2001. Oral immunization with hepatitis B surface antigen expressed in transgenic
plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98(20): 11539-11544.
11. Mason, H. S., C. J. Arntzen, 1995. Transgenic plants as vaccine production
systems. Trends in Biotechnology 13: 388-392.
12. McGarvey, P. B., J. Hammond, M. M. Dienelt, D. C. Hooper, Z. F. Fu, B.
Dietzschold, H. Koprowski, F. H. Michaels, 1995. Expression of the rabies virus
glycoprotein in transgenic tomatoes. Bio/Technology 13: 1484-1487.
13. Murashige T., F. Skoog, 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays
with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15, 473-497.
14. Nemchinov, L. G., T. J. Liang, M. M. Rifaat, H. M. Mazyad, A. Hadidi, J. M.
Keith, 2000. Development of a plant -derived subunit vaccine candidate against
hepatitis C virus. Arch. Virol. 145: 2557-2573.
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 373

15. Ramírez, N., et al., 2003. Expression and characterization of an anti -(hepatitis B
surface antigen) glycosylated mouse antibody in transgenic tobacco ( Nicotiana
tabacum) plants and its use in the immunopurification of its target antigen.
Biotechnol. Appl. Biochem . 38: 223-230.
16. Richter, L. J., Y. Thanavala, C. J. Arntzen, H. S. Mason, 2000. Production of
hepatitis B surface antigen in transgenic plants for oral immuniza tion. Nature
Biotechnology 18: 1167-1171.
17. Sakakibara, K. Y., K. Saito, 2006. Genetically modified plants for the promotion of
human health. Biotechnol. Lett. 28: 1983-1991.
18. Smith, M. L., L. Richter, C. J. Arntzen, M. L. Shuler, H. S. Mason, 2003. Structura l
characterization of plant-derived hepatitis B surface antigen employed in oral
immunization studies. Vaccine 21: 4011-4021.
19. Tripurani, S. K., N. S. Reddy, K. R. S. Sambasiva Rao, 2003. Green revolution
vaccines, edible vaccines. African Journal of Biotechnology 2(12): 679-683.
20. Valdés, R., et al., 2003. Hepatiris B surface antigen immunopurification using a
plant-derived specific antibody produced in large scale. Biochemical and
Biophysical Research Communication 310: 742-747.
21. Webster, D. E. et al., 2002. Successful boosting of a DNA measles immunization
with an oral plant-derived measles virus vaccine. Virology 76: 7910-7912.

SUMMARY
Towards evolving production of Hepatitis B vaccine
from plant
Nguyen Huu Ho, Truong Thien Tri, Le Tan Duc,
Pham Thi Hanh, Nguyen Huu Tam
Institute of Tropical Biology

Towards production of vaccine from the plant cultivars, the leaf disks of tobacco
Nicotiana tabacum L. and the cotyledons of tomato Lycopersicon esculentum were co-
cultivated with Agrobacterium tumefaciens strain LBA 4404 containing the HBsAg
gene (with T7 system and PDS promoter) along with the nptII gene (kanamycin
resistance gene) and the reporter gene gusA. After 2 - 3 day co-cultivation, tissues were
transferred to the medium containing kanamyc in (100 mg/l for tobacco, 20-50mg/l for
tomato) for selection. Through 3 -4 cycles of selection, several transgenic plants were
obtained. The presence of the HBsAg, nptII and gusA genes was checked by PCR
analyses and / or GUS assay [GUS assay: positive for the expre ssion in the fruit but
negative in the leaf, stem and root]. The presence of HBsAg protein was carried out by
the Agilent 2100 Bioanalyzer Automated Analysis System and by the quick ELISA test
using the dip stick of the Clinotech Diagnostics Inc. The trans genics are being grown in
the greenhouse for further studies.
374 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

CHUYỂN GEN PHÁT SÁNG gfp VÀO CÂY HOA PHONG


LAN Dendrobium cv. Burana White NHỜ VI KHUẨN
Agrobacterium tumefaciens

Võ Phan Mi Sa, Lê Tấn Đức, Nguyễn Thị Thanh,


Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển
Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU
Phong lan là loại hoa đẹp do đa dạng về m àu sắc, kiểu dáng; hoa được tiêu thụ phổ
biến trên thế giới và trong nước, kinh doanh hoa lan trong n ước có khả năng đạt doanh
thu rất cao (1 tỷ đồng/ha/năm). Ri êng tại Thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chỉ đạo về phát
triển hoa lan đã được thành lập nhằm xây dựng chương trình giống và xác định vùng
trồng hoa lan với quy mô h àng hoá để đưa cây hoa lan trở thành cây nông nghiệp đô thị
chủ lực của thành phố. Trong tiến trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng, Thành phố Hồ Chí
Minh sẽ phấn đấu mở rộng diện tích trồng lan l ên 200 ha vào năm 2010. Trên th ế giới
cũng như ở nước ta, ngoài việc nhân giống phong lan phục vụ sản xuất bằng ph ương
pháp nuôi cấy mô, việc tạo giống (d òng) mới như giống kháng bệnh (nấm, vi khuẩn,
virus), giống có dạng cây nhỏ (mini) và đáp ứng các tiêu chuẩn đòi hỏi ngày càng cao
của người tiêu dùng như hoa có màu s ắc và đặc tính mới lạ là những vấn đề đang và sẽ
được quan tâm nghiên cứu.
Hiện nay, bên cạnh phương pháp tạo giống cây trồng truyền thống nh ư lai hữu tính,
gây đột biến..., phương pháp công nghệ sinh học (chuyển nạp gen) đ ã và đang chứng tỏ
là công cụ hỗ trợ rất đắc lực cho nghi ên cứu tạo giống và song hành với các phương
pháp tạo giống truyền thống. Đến nay đ ã có khá nhiều giống cây trồng biến đổi gen (gen
nhân) được trồng trên diện rộng nhằm mục đích th ương mại. Nghiên cứu tạo giống bằng
công nghệ gen đã và đang được thực hiện đối với cây lan một phần v ì việc tạo giống lan
bằng phương pháp lai hữu tính tiêu tốn nhiều thời gian và nguồn gen đích mong muốn
dùng lai tạo không phong phú [12].
Trên thế giới, đã có khá nhiều thông báo đề cập chuyển một số gen v ào cây hoa lan
(vào nhân) như gen bar, gen gusA, gen nptII, gen hpt...[11, 14, 16, 17, 18, 24, 25], gen
mã hoá protein vỏ virus (papaya ringspot virus ) [12], trình tự ACC antisense [1]; cũng
đã ghi nhận được công trình nghiên cứu chuyển gen phát sáng gfp [16], luc [5,6]. Cây
phong lan Dendrobium lai (hybrid) mang gen luc phát sáng sinh học (bioluminescent
orchid) đã được rao bán đấu giá trên thị trường thế giới với giá khởi điểm 200.000 đô -la
Singapore [4] [ở lĩnh vực chuyển gen v ào động vật, cá cảnh Zebra - Zebra fish
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 375

Brachydanio rerio mang gen gfp [1] phát sáng có điều kiện (chiếu tia UV) cũng đ ã được
thương mại hoá với giá 5 đô-la/con tại Singapore, Mỹ].
Như chúng ta đã biết, gen gfp (green fluorescent protein gene) t ạo protein GFP có
khả năng phát sáng - được phân lập (từ sứa biển Aequorea victoria), được xác định trình
tự và dòng hoá vào đầu những năm 90 [2, 13]. Từ đó, gen n ày được biến nạp và biểu
hiện ở nhiều loại cơ thể sinh học khác nhau nh ư vi khuẩn, nấm, động vật có / không có
xương sống và thực vật [3, 8, 13]. Ngoài gen gfp, gen luc (mã hoá luciferase, phân l ập
từ đom đóm) [4, 5, 6, 20] cũng tạo sự phát sáng - theo cơ chế khác nhưng ít được nghiên
cứu hơn do kỹ thuật tạo phát sáng mô tế b ào cây chuyển gen phức tạp hơn. Ở lĩnh vực
chuyển nạp gen vào cây trồng, gen gfp được xem là gen chỉ thị sống (vital) [21, 22, 23],
mới [22] và có tiềm năng ứng dụng lớn trong nghi ên cứu [7, 8, 13, 19]. Đã có khá nhiều
công trình nghiên cứu chuyển gen này bằng phương pháp bắn gen [23], bằng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens [10, 13] vào một số cây trồng và có thể nghiên cứu sự biểu
hiện của gen này ở mức ty thể tế bào. Do vậy, theo chúng tôi, gfp là đối tượng gen cần
được xem xét sử dụng trong các nghi ên cứu về biến nạp di truyền.
Đến nay, ở nước ta, chưa ghi nhận được công trình công bố chuyển các gen nói
chung, gen gfp nói riêng vào cây hoa lan. Vì v ậy, theo chúng tôi, nghi ên cứu chuyển
gen gfp cây phong lan (Dendrobium Burana White) là vấn đề cần được quan tâm thực
hiện theo xu hướng chuyển gen này vào một số đối tượng cây hoa trên thế giới hiện nay.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP


Giống lan: Sử dụng giống lan Dendrobium Burana White có hoa màu tr ắng.
Phương pháp:
Môi trường nuôi cấy mô
1. Môi trường nuôi, nhân protocorm -like body (PLB): 1/2 x MS (Murashige -Skoog,
1962) [15] có1 mg/l BA.
2. Môi trường tạo sự vươn chồi: 1/2 x MS có 2mg/l BA.
3. Môi trường nuôi cây: 1/2 x MS không có chất sinh tr ưởng.
Điều kiện nuôi cấy: 9 giờ chiếu sáng / ngày, nhiệt độ 25-28oC.
Dòng vi khuẩn và môi trường nuôi cấy
Sử dụng dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 chứa plasmid
pCAMBIA 1303 (kích thư ớc 12,36 kb) (CAMBIA) mang gen gfp5 tạo protein phát sáng
GFP (green fluorescent protein) , gen gusA và gen kháng hygromycin hph.
Môi trường giữ giống vi khuẩn là môi trường LB có 100mg/l kanamycin. Để nhân
giống cho nghiên cứu chuyển gen, vi khuẩn đ ược nuôi cấy lắc qua đêm trong môi
trường khoáng AB (Chilton v à cs., 1974) cũng có nồng độ kanamycin như trên.
Nhiệt độ nuôi cấy: 25 - 28oC.
376 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

Quy trình chuyển gen


Các cụm nhỏ PLB (được cắt từ cụm to, nhằm tạo vết th ương) với kích thước 0,3 x
0,3cm được sử dụng làm vật liệu chuyển gen.
Tóm tắt quy trình chuyển gen
1. Nuôi các cụm PLB trên môi trường số 1 trong thời gian 2 ngày.
2. Gây nhiễm các cụm PLB với vi khuẩn trong thời gian 10 phút. Vớt mẫu ra, thấm
bớt dịch vi khuẩn thừa bằng giấy lọc.
3. Nuôi chung các cụm PLB với vi khuẩn trong 7 ng ày. Sử dụng môi trường số 1 có
bổ sung acetosyringone 100 M.
4. Rửa thật sạch vi khuẩn bằng nước cất và bằng dung dịch cefotaxime 500 mg/l (kết
hợp lắc nhẹ).
5. Vớt mẫu ra, thấm ráo n ước và cấy các cụm PLB trên môi trường chọn lọc: môi
trường số 1 có bổ sung 20mg/l hygromycin, 500 mg/l cefotaxime. Thực hiện 2 chu
kỳ chọn lọc, thời gian chọn lọc 20 ngày / chu kỳ.
6. Tiếp tục thực hiện sự chọn lọc th êm 3 chu kỳ (20 ngày / chu kỳ) trên môi trường
chọn lọc như trên nhưng có 30mg/l hygromycin.
7. Cấy truyền các cụm PLB kháng hygromycin sa ng môi trường số 2 cũng chứa
30mg/l hygromycin đến khi vươn chồi, thời gian nuôi khoảng 2 tháng.
Kiểm tra cây chuyển gen
1. Tách các chồi vươn cao (khoảng 1-1,5cm) và cấy truyền sang môi trường số 3 có
30mg/l hygromycin: theo dõi s ự vươn chồi và ra rễ.
2. Nhuộm GUS (Jefferson và ctv, 1987) [ 9]: ủ mô PLB, chồi trong thuốc thử GUS ở
37°C (tủ ấm) trong 24 giờ.
3. PCR: Sự hiện diện của gen hph, gen gfp được kiểm tra dùng các cặp mồi đặc hiệu.
4. Sự phát sáng của PLB, chồi chuyển gen (đ ược ghi nhận trong điều kiện tối) bằng
cách chiếu tia cực tím sóng dài (365nm) từ đèn cực tím Blak-Ray (công ty UVP,
San Gabriel, CA, Mỹ) hoặc sử dụng kính hiển vi huỳnh quang Nikon. Chụp ảnh
qua kính lúp bằng máy ảnh kỹ thuật số Nikon 8700 8 Mpixels (khi d ùng đèn cực
tím cầm tay) hoặc dùng camera (khi dùng hệ thống kính hiển vi huỳnh qua ng).

Gen hpt: HPH1: CGTCGTTCGAGAAGTTTC, HPH2:


TACTTCTACACAGCCATC; chương tr ình nhiệt: 94C: 5 phút; 35 chu kỳ (94C: 1
phút, 62 C: 1 phút, 72 C: 1 phút); 72 C: 5 phút; khuếch đại đoạn DNA 800 bp.
Gen gusA: GUS1: CCTGTAGAAACCCCAACCCGTG, GUS2:
CCCGGCAATAACATACGGCGTG; chương trình nhiệt: 94 C: 3 phút; 30 chu kỳ (94C:

30 giây, 56C: 45 giây, 72 C: 1 phút); 72C: 10 phút; khuếch đại đoạn DNA 365 bp .
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 377

Gen gfp: GFP1: TGGAGAGGGTGAAGGTGATG, GFP2:


TGTGTGGACAGGTAATGGTTG; chương tr ình nhiệt: 94C: 5 phút; 30 chu kỳ (94C: 1
phút, 55C: 1 phút, 72C: 1 phút); 72C: 10 phút; khuếch đại đoạn DNA 500 bp.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN


Thực tiễn nghiên cứu trên thế giới về sự biểu hiện (phát sáng có điều kiện) của
protein GFP ở cơ thể cây trồng cho thấy sự phát sáng xanh lục của protein GFP bị che
khuất bởi sự phát sáng đỏ của diệp lục tố khi cây đ ược chiếu ánh sáng cực tím sóng d ài
hoặc ánh sáng lam. Vì vậy, đối với cây trồng lấy hoa trang trí (hồng, cát t ường…), các
nhà khoa học thường chọn đối tượng có hoa màu trắng (không có diệp lục tố). Trong
nghiên cứu này, chúng tôi cũng đã sử dụng giống phong lan Dendrobium Burana White
có hoa màu trắng.
Bước đầu nghiên cứu cho thấy, giống phong lan n ày tuy nuôi cấy mô không là vấn
đề ở khía cạnh nhân giống v à tạo chồi / cây từ PLB nh ưng tương đối khó thực hiện sự
dung nạp gen gfp hơn so với một số giống khác nh ư Dendrobium Candy Stripe x
Madam Cherry (số liệu chưa công bố) trong cùng điều kiện plasmid sử dụng, c ùng điều
kiện chuyển nạp và phương pháp chuyển nạp.
a. Tính chống chịu tự nhiên của mô PLB đối với kháng sinh hygromycin
Tuy đã có thông tin về nồng độ kháng sinh hygromycin d ùng chọn lọc mô PLB đối
với một số giống lan là 30mg/l nhưng yếu tố nhạy cảm đối với kháng sinh n ày, theo
chúng tôi, có khác nhau tuỳ giống. Thực tế nghi ên cứu của chúng tôi cho thấy giống
Burana White có tính nhạy cảm cao hơn so với giống khác là Candy Stripe x Madame
Cherry. Điều này tạo thuận lợi và định hướng cho quá trình chọn lọc là cần sử dụng nồng
độ hygromycin từ thấp đến cao (tăng dần từ 15 mg/l đến 30mg/l) - khác với các nghiên
cứu trên thế giới là sử dụng nồng độ cao 30mg/l hygromycin ngay ở chu kỳ chọn lọc đầu
tiên; và thực tế cũng cho thấy rằng nếu dùng ngay nồng độ 30mg/l hygromycin thì thí
nghiệm không đạt kết quả. Thậm chí ở có một số lô thí nghiệ m, toàn bộ PLB chết hết khi
nồng độ hygromycin chỉ 15mg/l được sử dụng sau khi xử lý chuyển gen bằng vi khuẩn.
b. Giai đoạn nuôi chung
Theo nhiều công bố về chuyển nạp gen ở cây trồng, giai đoạn nuôi chung mô với vi
khuẩn thường chỉ kéo dài từ 2 - 3 ngày. Nhưng ở đối tượng phong lan chúng tôi nghi ên
cứu, trên môi trường nuôi chung mô là môi trường 1/2 MS có 1mg/l BA và 100 M
acetosyringone thì sau 2 ngày chúng tôi nh ận thấy vi khuẩn mọc rất yếu, th ường không
nhận biết được bằng mắt thường. Vì vậy, chúng tôi kéo dài thời gian nuôi chung lên 7
ngày và đôi khi để lâu hơn. Thời gian nuôi chung kéo d ài ở nghiên cứu của chúng tôi
phù hợp với một số nghiên cứu trên thế giới (có lô thí nghiệm kéo d ài cả tháng); theo
chúng tôi có thể là do mô PLB khá cứng, tương đối trơn láng tạo độ bám ít, có thể trong
cây lan có hợp chất không thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn; h ơn nữa môi trường
nuôi chung lại khá đơn giản (khoáng 1/2 MS). Sự xử lý kéo d ài thời gian nuôi chung
thường ít được sử dụng trừ ở một vài đối tượng cây trồng và tuỳ loại mô như trường hợp
378 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

nuôi chung vi khuẩn với lá cây hoa cát tường - có thể lên đến 5 ngày. Nói tóm lại, nồng
độ 30mg/l hygromycin có thể được dùng để chọn lọc giống lan này.
c. Quy trình chuyển gen
Như đã nói ở trên do tính mẫn cảm với hygromycin, tương tự như trường hợp chọn
lọc tế bào lúa bằng hygromycin dùng nồng độ tuần tự từ thấp đến cao, tr ước hết, chúng
tôi dùng nồng độ tương đối thấp 15mg/l để chọn lọc. Trên môi trường này, sau khoảng 1
tháng nuôi chọn, có sự hình thành một số cụm PLB mới tăng sinh nhưng đa số PLB còn
sống nhiều. Sự chọn lọc d ùng 15mg/l hygromycin được thực hiện 2 lần; tiếp theo l à 3
lần chọn lọc trên môi trường có hygromycin 30mg/l. Sau thời gian chọn lọc ( 3 tháng),
một số cụm PLB kháng hygromycin tăng sinh. The o chúng tôi, cần áp dụng chế độ chọn
lọc theo kiểu tăng dần nồng độ hygromycin v ì bản chất tế bào cấu thành PLB không
phải là tế bào mô sẹo nên theo chúng tôi tính đ ộc lập của chúng trong hệ thống không
cao so với tế bào mô sẹo nên chúng cần có điều kiện và thời gian để tăng sinh. Nhận
thấy các mô có khả năng tăng sinh mạnh tr ên môi trường 30mg/l hygromycin (do được
chuyển gen) thì chúng vẫn có khả năng tăng sinh tr ên môi trường có nồng độ
hygromycin cao đến 50mg/l.
d. Kiểm tra khả năng ra rễ tr ên môi trường có hygromycin
Các cây nhận được trên môi trường chọn lọc đúng ngưỡng (30mg/l) được cấy
truyền sang môi trường số 3. Kết quả cho thấy các cây chuyển gen ra rễ v à có sinh
trưởng bình thường trên môi trường có 30 mg/l hygromycin; ng ược lại cây đối chứng bị
chết sau khoảng 15-20 ngày nuôi.
e. Thử GUS
Hầu hết các mô PLB / mô chồi kháng hygromycin đều có kết quả d ương tính với
thuốc thử GUS (hình 1, 2). Cũng ghi nhận có một số tr ường hợp âm tính với thuốc thử
nhưng có kết quả dương tính với PCR gen gusA, tuy nhiên do gen này không là gen
mục tiêu nên chúng tôi không quan tâm l ấy số liệu thống kê là bao nhiêu phần trăm.
Đây là trường hợp thường nhận thấy ở các nghi ên cứu chuyển nạp gen đặc biệt đối với
gen gusA.
f. Phân tích PCR các gen hph, gusA và gfp
Các dòng cây được kiểm tra bằng PCR chỉ khi chúng đ ã qua giai đoạn tạo rễ và có
sinh trưởng bình thường trên môi trường có 30mg/l hygromycin. Kết quả phân tích PCR
các gen hph, gusA, gfp v ới các cặp mồi đặc hiệu cho thấy có sự hiện diện của các băng
DNA được khuếch đại tương ứng là 800 bp, 365 bp và 500 bp (hình 5).
g. Sự phát sáng của mô chuyển gen
Các cụm PLB và chồi nhỏ được để trong tối trong khoảng thời gian 1 tháng (để
giảm hoặc hạn chế sự hình thành diệp lục tố) được chiếu tia cực tím sóng d ài 365nm.
Kết quả cho thấy có thể ghi nhận đ ược sự phát sáng xanh lục bằng mắt th ường và sự
phát sáng này được chụp qua kính lúp bằng máy ảnh kỹ thuật số hoặc máy ảnh thuộc hệ
thống kính hiển vi huỳnh quang Nikon (hình 3, 4).
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 379

1 2 3 4

Hình 1, 2: Thử GUS dương tính ở PLB và chồi. 3, 4: PLB và chồi phát sáng xanh lục
qua xử lý tia UV sóng dài 365 nm. 5: Kết quả PCR dương tính gen gfp v ới băng DNA
được khuếch đại 500 bp

KẾT LUẬN
Qua sử dụng chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 chứa plasmid
pCAMBIA 1303 mang gen gfp5, gen gusA và gen hph để chuyển gen vào PLB cây hoa
phong lan Dendrobium Burana White, chúng tôi đ ã nhận được một số dòng cây chuyển
gen. Các dòng cây này có sinh trưởng in vitro bình thường trên môi trường có
hygromycin 30mg/l, nhuộm xanh với thuốc thử GUS v à có sự phát sáng màu xanh lục
khi được xử lý bằng tia UV sóng d ài (của đèn cực tím) hoặc sóng lam của hệ thống kính
hiển vi huỳnh quang.

LỜI CÁM ƠN
Các tác giả xin chân thành cám ơn Vi ện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tài
trợ cho nghiên cứu này.

TÀI LIỆU THAM KHẢO


1. ‘BioThailand 2005’: Biotechnology - Challenges in the 21 st Century (The 3 rd
International Biotechnology Trade Exhibition and Conference, Bangkok, T hailand,
Nov. 2-5/2005; Conference on Biosafety of Genetically Modified Organisms -
Plant Genetic Engineering Unit at Kasetsart University, Kamphaengsoen Campus).
2. Baulcombe D. C., Chapman S., Santa Cruz S. 1995. Jellyfish green fluorescent
protein as a reporter for virus infection. The Plant Journal. 7: 1045-1053.
3. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W., Prasher D. 1994. Green fluorescent
protein as a marker for gene expression. Science 263: 802-805.
4. Chia T. F. 2000. Bioluminescent orchid, Natural Science Academic Group, NTU,
Singapore. E-mail: auctionadmin@interauct.com; http://www.interauct.com.
5. Chia T. F., Chan Y. S., Chua N. H. 1990. In: Bonham D. G., Kemohan J. (eds).
Proceedings of the 13 th World Orchid Conference. 13 WOC Proceedings Trust,
Auckland, p. 284.
380 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

6. Chia T. F., Chan Y. S., Chua N. H. 1994. The firefly luciferase gene as a non -
invasive reporter for Dendrobium transformation. The Plant Journal 6(3): 441-446.
7. Davis S. J., Vierstra R. D. 1998. Sol uble, highly fluorescent variants of green
fluorescent protein (GFP) for use in higher plants. Plant Molecular Biology 36:
521-528.
8. Hu W., Cheng C. 1995. Expression of Aequorea fluorescent protein in plant cells.
FEBS Lett. 369: 331-334.
9. Jefferson, R. A., T. A. Kavanagh, B. W. Bevan, 1987. GUS fusion: -glucuronidase as
a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO 6: 3901-3907.
10. Kim C. K., Chung J. D., Park S. H., Burrell A. M., Kamo K. K., Byrne D. H. 2004.
Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Rosa hybrida using the green
fluorescent protein gene. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 78(2): 107-111.
11. Knapp J. E., Kausch A. P., Chandlee J. M. 2000. Transformation of three genera of
orchid using the bar gene as a selective marker. Plant Cell Rep. 19: 893-898.
12. Kuehnle A. R., Sugii N. 1992. Transformation of Dendrobium orchid using particle
of protocorms. Plant Cell Rep. 11: 484-488.
13. Leffel S. M., Stephen A. M., Stewart Jr. C. N. 1997. Application of green
fluorescent protein in plants. BioTechniques 23(5): 912-918.
14. Men S., Ming X., Liu R., Wei C., Li Y. 2003. Agrobacterium-mediated genetic
transformation of a Dendrobium orchid. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 75: 63-71.
15. Murashige, T., F. Skoog, 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay
with tobacco tissue culture. Physiol. Plant .15: 473-497.
16. Nan G. L., Kuehnle A. R. 1995. Factors affecting gene delivery by particle
bombardment of Dendrobium orchids. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 31: 131-136.
17. Nan G. L., Kuehnle A. R. 1995. Genetic transformation of Dendrobium (orchid).
In: Bajaj Y. P. S. (ed). Biotechnology in Agriculture and Forestry . Vol. 34, Berlin:
Spinger Verlag, pp. 149-160.
18. Nan G. L., Kuehnle A. R., Kado C. I. 1997. Dendrobium orchids contain an inducer
of Agrobaterium virulence genes. Physiol. Mol. Plant Pathol . 51: 391-399.
19. Niedz R. P., Sussman M. R., Satterlee J. S. 1995. Green fluorescent protein: an in
vitro reporter of plant gene expression. Plant Cell Reports 14: 403-406.
20. Ow D. W., Wood K. V., DeL uca M., de Wet J. R., Helinski D. R., Howell S. H.
1986. Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant cells
and transgenic plants. Science 234: 856-859.
21. Pang S., DeBoer D. L., Wan Y., Ye G., Layton J. G., Neher M. K., Armstrong C .
L., Hinchee M. A. W., Fromm M. E. 1996. An improved green fluorescent protein
gene as a vital marker in plant. Plant Physiol. 112: 893-900.
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 381

22. Sheen J., Hwang S., Niwa Y., Kobayashi H., Galbraith D. W. 1995. Green -fluorescent
protein as a new vital marker in plant cells. The Plant Journal 8: 777-784.
23. Vain, P., Worland B., Kohli A., Snape J. W., Christou P. 1998. The green
fluorescent protein (GFP) as a vital screenable marker in rice transformation.
Theor. Appl. Genet. 96, 164-169.
24. Yu H., Yang S. H., Goh C. J. 2000. DOH1, a class 1 knox gene, is required for
maintenance of the basic plant architecture and floral transition in orchid. Plant Cell
12: 2143-2159.
25. Yu H., Yang S. H., Goh C. J. 2001. Agrobacterium-mediated transformation of a
Dendrobium orchid with the class 1 knox gene DOH1. Plant Cell Rep. 20: 301-305.

SUMMARY
Genetic transformation of Dendrobium Burana White
with the gfp gene through Agrobacterium tumefaciens

Vo Phan Mi Sa, Le Tan Duc, Nguyen Thi Thanh,


Nguyen Huu Ho, Nguyen Van Uyen
Institute of Tropical Biology

Protocorm - like bodies (PLBs), about 3 mm in size, of the Dendrobium Burana


White (White flower) were cut and co -cultivated with the Agrobacterium tumefaciens
strain LBA 4404 containing the gfp5 gene (green fluorescent protein gen e), gusA gene
and hph gene (hygromycin resistance gene) (from CAMBIA). Following co -cultivation
(for one week), PLBs were cultured on the 1/2 MS (plus 1 mg/l BA) se lection medium
containing 20-30mg/l of hygromycin. After 5 rounds of selection, several tran sfomed
PLBs were obtained. The transformed PLBs / in vitro small plants were checked for
green fluorescence using the long - wave UV lamp (365nm) and/or the Nikon
fluorescence microscope. They also showed the positive results on the GUS assay and
the PCR analyses of the hph and gfp genes.
382 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN ipt TẠO


cytokinin NHẰM KHẢ NĂNG LÀM CHẬM SỰ LÃO HOÁ
Ở CÂY BẮP CẢI (Brassica oleracea var. capitata)

Bùi Đình Thạch, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Thị Thanh,


Lê Tấn Đức, Phan Tường Lộc, Nguyễn Đức Minh Hùng
Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU
Như chúng ta đã biết, gen ipt (phân lập từ vi khuẩn Agrobacterium) l à gen tạo ra
enzyme isopentenyl transferase và c ũng là enzyme quan trọng của con đường sinh
tổng hợp cytokinin tro ng thực vật [4,5,7,20,22]. Đối với sự l ão hoá ở thực vật,
cytokinin có vai trò điều hoà theo hướng tích cực là làm chậm quá trình này
[6,7,9,10,13,16,20].
Nghiên cứu chuyển gen ipt v ào thực vật đã được thực hiện thành công trên một
số đối tượng cây trồng như Arabidopsis, thu ốc lá, Petunia, bông cải, cải x à lách,
cúc,...[6,7,9,10,12,13,15] và k ết quả cho thấy cây chuyển gen có lá xanh t ươi hơn, ở
các lá già do diệp lục tố chậm bị phân huỷ n ên lá chậm chuyển sang m àu vàng. Điều
này mở ra triển vọng khai thác tiềm năng của gen n ày trong nghiên cứu chuyển gen
tạo giống cây trồng chậm l ão hoá, tăng sinh trưởng và năng suất [10,17]. Ngoài ra,
gen ipt còn có khả năng làm tăng hàm lượng hợp chất thứ cấp ở cây d ược liệu
chuyển gen [19] và có thể được sử dụng như gen có khả năng thay thế cho gen chọn
lọc [8].
Trước đây, gen chuyển ipt tạo tình trạng dư thừa cytokinin (overproduction) dẫn
đến sự thay đổi kiểu hình của cây [9] nhưng gần đây tình trạng này đã được khắc phục
do sử dụng các promoter như cor15a, SAG12... chỉ tạo biểu hiện trong những điều kiện
nhất định [12,13,15].
Ở cây bắp cải, trên đồng ruộng, các lá già gần gốc thường chuyển vàng sớm (mất
diệp lục tố do lão hoá) tạo điều kiện cho nấm bệnh xâm nhập; ngo ài ra, việc giữ sản
phẩm sao cho được xanh tươi lâu trong quá trình thu hoạch, vận chuyển và bảo quản là
yêu cầu rất quan trọng đối với các nh à trồng trọt và kinh doanh cây trồng này.
Nội dung bài này, chúng tôi trình bày k ết quả bước đầu việc nghiên cứu chuyển gen
ipt vào cây bắp cải nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens nhằm khả năng làm giảm
các ảnh hưởng không tốt do hiện t ượng lão hoá gây ra như đã nói ở trên và đây là công
trình đầu tiên về nghiên cứu chuyển gen này vào cây bắp cải.
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 383

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP


Giống bắp cải:
Sử dụng giống F1 TN5 (của Công ty hạt giống Trang Nông).
Phương pháp:

Khử trùng hạt

Trước hết, hạt được rửa với nước cất vô trùng 2 lần, khử trùng bằng nước Javel
nồng độ 50% (v/v) trong 7 phút. Sau đó, hạt đ ược rửa sạch bằng nước vô trùng 3 lần và
được gieo trên môi trường.
Môi trường nuôi cấy mô và thử tính chống chịu đối với kháng sinh hygromycin

1. Môi trường gieo hạt và nuôi cây: khoáng MS (Murashige - Skoog, 1962), vitamin
Morel (Morel, 1948), không có ch ất điều hoà sinh trưởng.
2. Môi trường tái sinh chồi từ lá mầm: khoáng MS, vitam in B 5 (Gamborg và cs.,
1968) có 0,1mg/l IBA , 3 mg/l BA.
3. Môi trường vươn chồi và tạo rễ: như môi trường số 1.
4. Môi trường thử tính chống chịu đối với kháng sinh hygromycin: nh ư môi trường 1
nhưng có hygromycin từ 5 - 10mg/l.
5. Các loại môi trường trên có đường 30g/l, thạch 9g/l, pH 5,8.
6. Điều kiện nuôi cấy: 12 giờ chiếu sáng/ng ày, nhiệt độ 23 - 25oC.
Dòng vi khuẩn và môi trường nuôi cấy

Sử dụng dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 chứa plasmid


pVDH396 (kích thước  15,9 kb) (do TS. Nguyễn Thị Thanh thiết kế) mang gen ipt (có
nguồn gốc từ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ) tạo enzyme isopentenyl transferase
[có promoter SAG12 (senescence associated gene 12, t ừ Arabidopsis thaliana), gen
gusA (có intron, promoter CaMV35S) và gen kháng hygromycin hph (promoter
CaMV35S).
Môi trường giữ giống vi khuẩn là môi trường LB có 50mg/l kanamycin. Để nhân
giống cho nghiên cứu chuyển gen, vi khuẩn đ ược nuôi cấy lắc qua đêm trong môi
trường khoáng AB (Chilton v à cs., 1974) cũng có nồng độ kanamycin nh ư trên. Nhiệt
độ nuôi cấy: 25 - 28oC.
Quy trình chuyển gen

Các lá mầm, từ cây mầm 7 - 10 ngày tuổi trên môi trường MS không chất điều ho à
sinh trưởng, được sử dụng làm vật liệu chuyển gen.
Tóm tắt quy trình chuyển gen

1. Nuôi cấy lá mầm trên môi trường số 2 (0,1mg/l IBA, 3mg/l BA) trong thời gian
2 ngày.
384 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

2. Gây nhiễm các lá mầm với dịch vi khuẩn (OD= 0,6 -1) trong thời gian 15 phút. Vớt
mẫu ra, thấm bớt dịch vi khuẩn thừa bằng giấy lọc.
3. Nuôi chung lá mầm với vi khuẩn trong 2 ng ày. Sử dụng môi trường như trên nhưng
có acetosyringone 50 M.
4. Rửa thật sạch vi khuẩn bằng n ước cất và bằng dung dịch cefotaxime 500 mg/l (kết
hợp lắc nhẹ, 15 phút).
5. Vớt mẫu ra, thấm ráo nước và cấy các mảnh lá trên môi trường số 2 bổ sung 5-10 mg/l
hygromycin, 250mg/l cefotaxime. Thời gian nuôi 15 ngày/ chu kỳ chọn lọc và thực
hiện 3 chu kỳ chọn lọc dùng tuần tự 5-10-5mg/l hygromycin.
6. Cấy truyền các chồi/ cụm chồi tái sinh (cao từ 1 -1,5cm) sang môi trường MS không
chất sinh trưởng cũng chứa 5mg/l hygromycin đến khi vươn chồi, thời gian nuôi
khoảng 1 tháng.
Kiểm tra cây chuyển gen

1. Tách các chồi vươn cao (khoảng 2cm) và cấy truyền sang môi trường MS không
chất sinh trưởng có 5mg/l hygromycin: theo dõi s ự vươn chồi và ra rễ trong thời
gian khoảng 20 ngày.
2. Mảnh lá cây giả định chuyển gen đ ược nuôi cấy trên môi trường số 2 có 5mg/l
hygromycin và theo dõi kh ả năng hình thành mô sẹo và tái sinh sau khoảng 20-30
ngày (so với đối chứng).
3. Nhuộm GUS (Jefferson và cs., 1987) [11]: ủ mô lá trong thuốc thử GUS qua đ êm ở
37°C (tủ ấm).
4. PCR: Sự hiện diện của gen hph, gen gusA và gen ipt được kiểm tra dùng các cặp
mồi đặc hiệu.
Gen hph: HPH1: CGTCGTTCGAGAAGTTTC, HPH2:
TACTTCTACACAGCCATC; chương tr ình nhiệt: 94 C: 5 phút; 35 chu kỳ (94C: 1

phút, 62 C: 1 phút, 72 C: 1 phút); 72 C: 5 phút; khuếch đại đoạn DNA 800 bp.
Gen gusA: GUS1: CCTGTAGAAACCCCAACCCGTG, GUS2:
CCCGGCAATAACATACGGCGTG; chương tr ình nhiệt: 94 C: 3 phút; 30 chu kỳ (94C:

30 giây, 56C: 45 giây, 72 C: 1 phút); 72C: 10 phút; khuếch đại đoạn DNA 365 bp.
Gen ipt: IPT1: TCAACCGGAAGCGGACGACC, IPT2:
GCCATGTTGTTTGCTAGCCAG; chương trình nhiệt: 90 C: 10 phút; 40 chu kỳ (94C:

15 giây, 45C: 45 giây, 72 C: 50 giây); 72C: 7 phút; khuếch đại đoạn DNA 355 bp.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN


Do không có giống bắp cải thuần được bán trên thị trường nên chúng tôi sử dụng
giống lai F1 TN5 để nghiên cứu. Do vậy, việc nhân giống cây chuyển gen d ùng cho các
nghiên cứu tiếp theo sẽ được thực hiện bằng phương pháp nhân giống vô tính in vitro /
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 385

ex vitro. Sau 7-10 ngày nuôi cấy hạt trên môi trường gieo hạt, các lá mầm đ ược sử dụng
làm vật liệu chuyển gen.
Qua tham khảo một số tài liệu công bố về nuôi cấy mô cây bắp cả i trong và ngoài
nước, chúng tôi đã bố trí một số công thức môi tr ường với nồng độ chất điều ho à sinh
trưởng (ĐHST) IBA, BA khác nhau. Kết quả cho thấy, đối với giống F 1 TN5, tổ hợp
ĐHST IBA (0,1mg/l + BA 3mg/l) được xem là tổ hợp cho tỷ lệ tái sinh chồi rất cao ( 60%).
Theo một số nghiên cứu trong và ngoài nước [1,3,18,21], nồng độ BA cao (2-4mg/l) được
xem là thích hợp, tạo sự tái sinh với tần số cao; nồng độ 3mg/l BA trong nghiên cứu của
chúng tôi phù hợp với khoảng dao động nồng độ BA sử dụng của các tác giả n êu trên.
Qua thử nghiệm tính chống chịu tự nhi ên của mô đối với kháng sinh hygromycin,
kết quả cho thấy mô sẹo cũng nh ư chồi/ cây con rất mẫn cảm đối với kháng sinh n ày
(nồng độ dùng chọn lọc chỉ từ 5-10mg/l) tương tự như trường hợp cây bông cải [2];
ngược lại, đối với giống bắp cải B. oleracea cv. Alboglabra [3] và đ ối giống cải
Brassica rapa [13] thì nồng độ hygromycin sử d ụng cao hơn, theo thứ tự là 30mg/l và
25mg/l.
Lá mầm, sau khi xử lý và nuôi chung với vi khuẩn, được cấy trên môi trường tái
sinh có bổ sung 5mg/l hygromycin. Nhận thấy sau khoảng 7-10 ngày nuôi cấy, một số lá
mầm có phần gốc cuống ph ình to và khoảng một tháng sau có sự tái sinh chồi (h ình 1);
ngược lại, toàn bộ lá mầm đối chứng đều chết.
Các chồi/ cụm chồi tái sinh trên môi trường có 5mg/l hygromycin được cấy truyền
tiếp sang môi trường có nồng độ hygromycin cao h ơn (10mg/l) để sự chọn lọc được triệt
để hơn. Kết quả nghiên cứu cho thấy có một số chồi chết ở giai đoạn chọn lọc tiếp theo
này. Các chồi/ cụm chồi tuy tái sinh tr ên môi trường có hygromycin nh ưng khả năng
phát triển của chúng không nhanh tr ên môi trường có 10mg/l hygromycin. Do vậy, ở
chu kỳ chọn lọc thứ ba, chúng tô i chỉ dùng nồng độ hygromycin 5mg/l (như đối với chu
kỳ 1) để tiếp tục kiểm tra tính kháng của chồi/cây. Đến nay, chúng tôi đ ã nhận được một
số dòng chồi/ cây có khả năng sinh tr ưởng bình thường trên môi trường có 5mg/l
hygromycin (dòng cây gi ả định chuyển gen).
Như đã nói ở trên, do tính mẫn cảm cao đối với hygromycin n ên sau khi qua 3 chu
kỳ chọn lọc, chúng tôi cấy truyền chồi/cây sang môi tr ường nuôi cây không có
hygromycin để chồi/cây phát triển nhanh.
Các dòng giả định chuyển gen được kiểm tra một lần nữa qua sử dụng các mảnh lá
để cấy trên môi trường tái sinh có 5mg/l hygromycin nhằm theo dõi khả năng tạo mô
sẹo và tái sinh. Kết quả cho thấy, các mảnh lá cây giả định chuyển gen có khả năng h ình
thành mô sẹo và tái sinh chồi; ngược lại, mảnh lá cây đối chứng ho àn toàn không có khả
năng tạo mô mới và chết sau đó.
Mô lá của các chồi có khả năng phát triển li ên tục trên môi trường có hygromycin
được nhuộm với thuốc thử X -Gluc để kiểm tra sự biểu hiện của gen gusA. Kết quả cho
thấy chúng có màu xanh đặc trưng với thuốc thử (hình 2); ngược lại, các mẫu lá cây đối
chứng đều âm tính ở kết quả thử GUS n ày. Cũng ghi nhận một số mô lá âm tính với
thuốc thử dù chồi có sự phát triển bình thường trên môi trường chọn lọc và theo chúng
386 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

tôi có thể đây là do hiện tượng im lặng của gen gusA thường gặp trong nghiên cứu
chuyển nạp gen này.
Chúng tôi đang tiến hành phân tích PCR nhằm kiểm tra sự hiện diện của các gen
hph, gusA, ipt với các mồi đặc hiệu như đã ghi trong phần nguyên liệu và phương pháp.

Hình 1: Chồi chuyển gen tái sinh tr ên Hình 2: Mẫu lá/ chồi cây chuyển gen
môi trường chọn lọc có 5 mg/l dương tính với thuốc thử GUS
hygromycin

LỜI CÁM ƠN
Các tác giả xin chân thành cám ơn Trung tâm Phát tri ển Khoa học - Công nghệ Trẻ
Thành Đoàn Thành phố Hồ Chí Minh (Chương trình Vườn ươm sáng tạo) đã tài trợ cho
nghiên cứu này.

TÀI LIỆU THAM KHẢO


1. Nguyễn Thị Liên Chi, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Thị Than h, Lao Thị Nga, Nguyễn
Quốc Bình, Nguyễn Văn Uyển, 1994. Chọn lọc các môi tr ường nuôi cấy để nâng
cao hiệu suất tái sinh cây bắp cải Brassica oleracea var. capitata dùng cho hệ thống
chuyển gen của Bacillus thuringiensis kháng sâu tơ. Tạp chí Khoa học và Công
nghệ 22(1): 1-7.
2. Kim Hong, N. T., E. J. Kane, P. J. Dix, 1998. Hormonal regulation of senescence in
cauliflower (Brassica oleracea var. Botrytis) (Abstract). In: Altman A., Ziv M.,
Izhar S. (eds), Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21 st Century, IX
International Congress on Plant Tissue Culture. Kluwer Academic Publishers,
Dordrecht, The Netherlands, p. 164.
3. Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Văn Uyển, Maria Dolores Sacristan, 1997. Tạo hai
dòng cải Brassica oleracea L. cv. Alboglabra mang gen kháng hygromycin bởi
Agrobacterium tumefaciens. Tạp chí Sinh học 19(4): 13-16.
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 387

4. Akiyoshi, D. E., H. Klee, R. M. Amasino, E. W. Nester, M. P. Gordon, 1984. T -DNA


of Agrobacterium tumefaciens encodes an enzyme of cytokinin biosynthesis. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 81: 5994-5998.
5. Barry, G. F., S. G. Rogers, R. T. Fraley RT, L. Brand, 1984. Identification of a
cloned cytokinin biosynthetic gene . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4776-4780.
6. Chang, H., M. L. Jones, G. M. Banowetz, D. G. Clark, 2003. Overproduction of
cytokinins in Petunia flowers transformed with P SAG12-IPT delays corolla
senescence and decreases sensitivity to ethylene. Plant Physiology 132: 2174-2183.
7. Chang, H., M. L. Jones, G. M. Banowetz, D. G. Clark, 2003. The Arabidopsis
AtIPT8/PGA22 gene encodes an isopentenyl transferase that is involved in de novo
cytokinin biosynthesis. Plant Physiol. 131(1): 167-176.
8. Ebinuma H., K. Sugita, E. Matsunaga, M. Yamakado, 1997. Selection of marker -
free transgenic plants using the isopentenyl transferase gene. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 94: 2117-2121.
9. Eklof, S., C. Astot, F. Sitbon, T. Moritz, O. Olsson, G. Sandberg, 2000. Transgenic
tobacco plants co-expressing Agrobacterium iaa and ipt genes have wild-type
hormone levels but display both auxin -and cytokinin-overproducing phenotypes.
The Plant Journal 23(2): 279-284.
10. He, S. S., A. Hoelscher, J. Liu, D. O’Neill, J. Layton, R. McCarroll, S. Dotson,
2005. Cell cycle specific isopentenyl transferase expression led to coordinated
enhancement of cell division, cell growth and development in transgenic
Arabidopsis. Plant Biotechnology 22: 261-270.
11. Jefferson, R. A., T. A. Kavanagh, B. W. Bevan, 1987. GUS fusion: -glucuronidase as
a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO 6: 3901-3907.
12. Khodakovskaya, M. V., R. McAvoy, H. Liu, Y. Li, 1998. Ethylene -regulated
expression of the ipt gene increases flower number in transgenic Dendranthema
grandiflorum. Abstracts, Society for In Vitro Biology.
13. Khodakovskaya, M. V., Y. Li, J. Li, R. Vankova, J. Malbeck, R. McAvo y, 2005.
Effects of cor15a-ipt gene expression on leaf senescence in transgenic Petunia
hybrida and Dendranthema grandiflorum. J. of Experimental Botany 56(414):
1165-1175.
14. Kuvshinov, V., K. Koivu, K. E. Pehu, 1999. Agrobacterium tumefaciens -mediated
transfrmation of greenhouse-grown Brassica rapa ssp. Olifera. Plant Cell Reports
18(9): 773-777.
15. McCabe, M. S. et al., 2001. Effects of P SAG12-ipt gene expression on development
and senescence in transgenic lettuce. Plant Physiol. 127: 505-516.
16. McCabe, M. S., U. Mohapatra, F. Schepers, K. Van Dun, J. B. Power, M. Davey,
1998. Delayed senescence in transgenic lettuce using an autoregulated ipt gene. J.
Exp. Bot. Suppl. 49: 49.
388 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

17. Medford, J. I., R. Horgan, Z. El -Sa-wi, H. J. Klee, 1989. Alterations of endogenous


cytokinins in transgenic plants using a chimeric isopentenyl transferase gene. The
Plant Cell 1: 403-413.
18. Metz, T. D., R. Dixit, E. D. Earle, 1995. Agrobacterium tumefaciens -mediated
transformation of broccoli (Brassica oleracea var. italica) and cabbage (B. oleracea
var. capitata). Plant Cell Reports 15: 287-292.
19. Sa, G., M. Mi, Y. He-chun, L. Guo-feng, C. Kang, 2001. Effects of ipt gene
expression on the physiological and chemical characteristics of Artemisia annua L..
Plant Science 160: 691-698.
20. Smart, C. M., Scofield S. R., M. W. Bevan, T. A. Dyer, 1991. Delayed leaf
senescence in tobacco plants transformed with tmr, a gene for cytokinin production
in Agrobacterium. Plant Cell 3: 647-656.
21. Tsukazaki, H., Y. Kuginuki, R. Aida, T. Suzuki, 2002 . Agrobacterium -mediated
transformation of a double haploid line of cabbage. Plant Cell Reports 21: 257-262.
22. Werner, T., V. Motyka, M. Strnad, T. Schmulling, 2001. Regulation of plant
growth by cytokinin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 10487-10492.

SUMMARY
Preliminary study on transfer of ipt gene into cabbage
(Brassica oleracea var. capitata) for retardation of senescence

Bui Dinh Thach, Nguyen Huu Ho, Nguyen Thi Thanh


Le Tan Duc, Phan Tuong Loc, Nguyen Duc Minh Hung
Institute of Tropical Biology

Some transgenic cabbage plants were obtained via the Agrobacterium tumefaciens
LBA 4404 carrying the ipt gene (for cytokinin production), gusA gene (as reporter gene
for -glucuronidase) and hph gene (for hygromycin resistance). The cotyledons of the
seedlings (7-10 days after seed germination) were cut at the basal and co -cultivated with
Agrobacterium tumefaciens . After three cycles of selection on the MS (with IBA, BA)
medium containing hygromycin (5 -10mg/l), several hygromycin resistant calli / shoots
were induced. They expressed the GUS activity and the presence of transgenes in the
plant genome was performed by PCR analysis .
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 389

XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH in vitro CÂY NGÔ Zea


mays L. VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG TRONG CHUYỂN
NẠP GEN TẠO protein GIẦU SẮT NHỜ VI KHUẨN
Agrobacterium tumefaciens
Nguyễn Thị Phương Nam, Lê Tấn Đức, Phạm Đức Trí, Nguyễn Hữu Tâm
Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển
Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU

Ngô (Zea mays L.) là cây lương thực quan trọng trên thế giới cũng như ở nước ta.
Ngoài việc dùng làm lương thực cho con người, ngô còn được dùng làm thức ăn trong
chăn nuôi gia súc, gia c ầm, làm nguyên liệu cho công nghiệp sản xuất r ượu, cồn, tinh
bột… Ngô là nguồn xuất khẩu thu ngoại tệ lớn đối với một số n ước như Mỹ, Pháp,
Argentina, Trung Quốc…
Trong nghiên cứu nuôi cấy mô và chuyển gen, các nhà khoa học thường dùng vật
liệu phôi non (10-20 ngày sau thụ tinh) [3,4,5,6,16,18,22] để nghi ên cứu do có khả năng
đáp ứng cao với nuôi cấy (tỷ lệ tạo mô sẹo sinh phôi v à tái sinh cao). Tuy nhiên, thường
khó chủ động trong việc thu phôi non v à cần nhiều thời gian, công sức cho công việc
tách lấy phôi. Để chủ động h ơn trong nghiên cứu, chúng tôi dùng đốt thân (nodal
section) và chồi đỉnh cây in vitro (có nguồn gốc từ hạt tươi trưởng thành) như nguyên
liệu dùng cho nghiên cứu nuôi cấy mô và để tạo mô tế bào thích hợp dùng chuyển nạp.
Trước đây, chọn tạo giống ngô đ ược thực hiện thông qua ph ương pháp lai tạo, gây
đột biến. Hiện nay, công nghệ sinh học đ ã có nhiều đóng góp quan trọng trong tạo giống
cụ thể là nhờ công nghệ gen nhiều giống ngô chuyển gen với đặc tính quý đ ã được tạo
ra và được thương mại hoá như giống ngô kháng sâu, kháng thuốc trừ cỏ… . Theo các
nhà nghiên cứu, công nghệ chuyển nạp gen ng ày càng có vị trí quan trọng trong công
tác giống ngô đặc biệt trong tình trạng vốn gen tự nhiên cây ngô còn nhiều hạn chế.
Sự thiếu hụt dinh dưỡng sắt là một vấn đề gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến khoảng
30 % dân số thế giới. Sự thiếu máu do thiếu hụt sắt có ảnh hưởng xấu hoặc rất xấu đến
trẻ em, thai phụ và phụ nữ sau khi sinh. Ở nước ta, theo điều tra tại các v ùng nghèo tỷ lệ
trẻ thiếu máu, thiếu sắt lên tới hơn 70%, chủ yếu do bữa ăn thiếu chất dinh d ưỡng và
nghèo thành phần; sự thiếu sắt có tác động xấu đến sự phát triển về thể chất v à trí tuệ
của trẻ. Mặc dù việc bổ sung sắt vào thực phẩm hoặc khuyến cáo sử dụng thuốc đ ã tỏ ra
có hiệu quả nhằm kiểm soát nạn thiếu hụt sắt nh ưng các biện pháp nói trên khó có thể
áp dụng nhanh chóng tại các n ước còn nghèo nàn lạc hậu vì chi phí phát sinh cao và s ố
lượng các chương trình chăm sóc sức khoẻ ban đầu còn hạn chế. Một số cây họ Đậu,
cây cải spinach… được biết chứa hàm lượng sắt cao nhưng cũng chứa nhiều acid oxalic
và các hợp chất có nhiều acid phytic (phytate -like substances) gây hạn chế hấp thu sắt.
390 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

Ferritin - protein dự trữ sắt được phân bố rộng rãi trong động vật, thực vật và vi
khuẩn. Ferritin của thực vật gồm 24 tiểu phần (subunit) có thể chứa từ 4.000 - 4.500
nguyên tử sắt ở khoang trung tâm phân tử (central cavity) [10,11]. Các đoạn cDNA
ferritin thực vật đã được dòng hóa để nghiên cứu từ nhiều nguồn khác nhau nh ư trụ dưới
lá mầm đậu nành Glycine max [10], hạt non đậu Pisum sativum (pea), lá non đậu Vigna
unguiculata, hạt đậu Phaseolus vulgaris (French bean)… Ferritin có hai nhi ệm vụ chính
trong tế bào sống; một là, cung cấp sắt để tổng hợp các protein chứa sắt nh ư ferredoxin
và các cytochrome, hai là, chống các tác hại gây ra bởi các gốc tự do tạo ra bởi sự t ương
tác sắt / dioxygen. Các nghi ên cứu gần đây cho thấy ferritin có thể đ ược sử dụng để xử
lý các trường hợp bệnh thiếu máu ở chuột. Các phát hiện tr ên cho phép các nhà khoa
học đưa ra các nghiên cứu, bằng con đường công nghệ di truyền, tạo ra các cây ngũ cốc
chuyển gen giàu sắt nhằm góp phần nhất định v ào việc giải quyết nạn thiếu hụt sắt ở
con người và cho đến nay, người ta đã tạo ra được một số dòng lúa indica và japonica
với hàm lượng sắt cao hơn gấp nhiều lần [11].
Nhằm tiếp cận hướng tạo giống dùng phương pháp công ngh ệ sinh học, ở nghiên
cứu này, chúng tôi nêu nội dung nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh cây từ mô đốt
thân và chồi đỉnh và bước đầu ứng dụng trong chuyển nạp gen tạo ferritin nhờ vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens với hy vọng cải thiện hàm lượng sắt ở cây ngô.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP


Giống ngô:
Sử dụng giống ngô Nếp địa ph ương ở tỉnh Tiền Giang.
Phương pháp:
Khử trùng hạt tươi
Bóc bỏ lá bao bên ngoài quả ngô tươi để lộ hạt ngô bên trong. Tách lấy hạt bằng tay
và khử trùng hạt bằng hypochlorite Na 50% (v/v) trong 20 phút. Rửa sạch bằng n ước cất
nhiều lần và cấy hạt trên môi trường MS không chất sinh tr ưởng.
Kỹ thuật tách nuôI chồi đỉnh
Dùng dao mổ cắt bỏ phần trên và dưới đốt thân cây ngô in vitro phát triển từ hạt
(sau khoảng 1/2 tháng nuôi cấy). Tách bỏ phần mô bao phía tr ên đốt thân để lộ đỉnh
sinh trưởng. Cũng bằng dao mổ cắ t lấy chồi đỉnh 0,4 x 0,4mm v à đặt vào môi trường
nuôi cấy.
Môi trường nuôi cấy mô
Môi trường cấy hạt sau khử tr ùng: MS (Murashige-Skoog, 1962) không ch ất sinh
trưởng.
Môi trường nuôi cấy đốt thân cây in vitro:
1. MS + 0,5mg/l 2,4-D + 1mg/l BA
2. MS + 0,5mg/l 2,4-D + 2,2g/l picloram + 1,38g/l L - proline + 3,4mg/l nitrate bạc
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 391

Môi trường nuôi cấy chồi đỉnh (kích th ước 0,4 mm) thân cây in vitro:
3. MS + 0 - 0,05mg/l BA
4. MS + 0,05mg/l NAA + 1 -2mg/l BA
5. MS + 0,5mg/l 2,4-D + 1mg/l BA
Môi trường tạo vườn cây từ cụm chồi (môi trường số 6): MS + 0,1mg/l NAA + 1 mg/l BA
Môi trường nuôi cây: MS không chất sinh tr ưởng.
Điều kiện nuôi cấy: 9 giờ chiếu sáng/ngày, nhiệt độ 25-28oC.
Dòng vi khuẩn và môi trường nuôi cấy:
Sử dụng dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 chứa plasmid pITB-
FERRITIN (do TS. Nguyễn Hữu Tâm thiết kế) mang gen tạo protein gi àu chất sắt
(ferritin) và gen kháng hygromycin hph.
Môi trường giữ giống vi khuẩn là môi trường LB có 50mg/l kanamycin v à 25mg/l
streptomycin. Để nhân giống cho nghiên cứu chuyển gen, vi khuẩn đ ược nuôi cấy lắc
qua đêm trong môi trường khoáng AB (Chilton v à cs., 1974) cũng chứa các kháng sinh
như trên. Nhiệt độ nuôi cấy: 25- 28oC.
Quy trình chuyển gen:
Các cụm mô đang trong quá tr ình tái sinh (kích thước 0,5 x 0,5mm) hình thành từ
đốt thân hoặc/và chồi đỉnh trên môi trường có 0,5mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (môi trường
số 1) được dùng làm vật liệu chuyển gen.
Tóm tắt quy trình chuyển gen:
1. Nuôi các cụm mô trên môi trường số 1 trong thời gian 2 ng ày.
2. Tạo vết thương bằng cách châm đầu lưỡi dao mổ nhọn vào mô, lây nhiễm mô với
vi khuẩn trong thời gian 10 phút. Vớt mẫu ra, thấm bớt dịch vi khuẩn thừa bằng
giấy lọc.
3. Nuôi chung mô với vi khuẩn trong 2 ngày (sử dụng môi trường số 1 có bổ sung
acetosyringone 100 M).
4. Rửa thật sạch vi khuẩn bằng nước cất và bằng dung dịch cefotaxime 500 mg/l (kết
hợp lắc nhẹ).
5. Vớt mẫu ra, thấm ráo nước và cấy mô trên môi trường chọn lọc: môi trường số 1 có
nồng độ hygromycin 20mg/l hygromycin, 500 mg/l cefotaxime. Thời gian chọn lọc
15 ngày.
6. Tiếp tục chọn lọc tế bào thêm 3 chu kỳ (15 ngày / chu kỳ) trên môi trường chọn lọc
như trên nhưng có 30mg/l hygromycin.
7. Cấy truyền các mô sang môi trường số 6 cũng bổ sung 30 mg/l hygromycin, thời
gian nuôi 20-30 ngày.
392 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

Kiểm tra cây chuyển gen:


1. Tách cây và cấy cây sang môi trường MS không chất sinh trưởng có 30mg/l
hygromycin, thời gian theo dõi sự sinh trưởng khoảng 15 ngày.
2. PCR: Sự hiện diện của gen hph đang được kiểm tra dùng cặp mồi đặc hiệu: H1:
CGTCGTTCGAGAAGTTTC, H2: TACTTCTACACAGCCATC; chương tr ình
nhiệt: 94C: 5 phút; 35 chu kỳ (94C: 1 phút, 62 C: 1 phút, 72 C: 1 phút); 72 C: 5
phút; khuếch đại đoạn DNA 800 bp.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Về nuôi cấy mô:


- Nuôi cấy đốt thân:
Trong nghiên cứu này, nói chung có sự hình thành hai loại hệ thống mô khác nhau:
một là, mô sẹo có khả năng sinh phôi, h ình thành trên cả hai môi trường số 1 và 2, với
tỷ lệ cao hơn trên môi trường số 2 (60%); hai là, mô sẹo mang phác thể chồi (đang trong
quá trình tái sinh) chỉ hình thành trên môi trường số 1 với tỷ lệ khoảng 52 %; và như
vậy trên môi trường số 1 có sự hình thành cả hai loại mô nói trên. Theo chúng tôi, có sự
hình thành hai loại mô nói trên trên môi trường số 1 là do môi trường nuôi cấy có một
lượng auxin 2,4-D nhất định thúc đẩy sự tạo mô sẹo v à có cytokinin BA tạo sự phân hoá
chồi. Thành phần môi trường số 2 có acid amin L - proline và tác nhân ức chế hình
thành ethylen là nitrate b ạc, theo một số tác giả, cần thiết cho sự h ình thành mô sẹo có
khả năng sinh phôi đối với cây ngô với tần số cao.
- Nuôi cấy chồi đỉnh:
Trên môi trường có 0,05mg/l NAA và 0,1mg/l BA, tất cả các chồi đỉnh đều phát triển
thành cây đơn. Khi giữ nguyên lượng NAA và có lượng BA tăng cao hơn (1mg/l), có sự
hình thành cụm chồi với tỷ lệ khoảng 35% t ương tự như hệ thống cụm chồi ở kết quả
nghiên cứu trước đây [3]. Trên môi trường có 0,5mg/l 2,4-D và 1mg/l BA, khoảng trên 50%
số chồi đỉnh nuôi cấy hình thành cả hai loại mô như trong trường hợp nuôi cấy đốt thân.
Trong nghiên cứu nuôi cấy mô cây ngô, tr ên thế giới cũng như trong nước, có một
số vật liệu phổ biến dùng để tạo mô sẹo là phôi non [4,6,18], mô thu ẫn (scutellum) hoặc
đốt thân phôi trưởng thành [14,20]… Phôi non đư ợc sử dụng nhiều do khả năng đáp
ứng cao đối với sự hình thành mô sẹo phôi hoá cũng như tái sinh. Tuy nhiên, vi ệc thu
phôi non phụ thuộc vào thời vụ, gây trở ngại cho nghi ên cứu. Do vậy, trong nghiên cứu
này, theo hướng của các tác giả Sidorov v à cs., 2006 [20], chúng tôi s ử dụng đốt thân
cây in vitro làm nguyên liệu tạo mô cần thiết. Việc d ùng nguyên liệu này mang tính chủ
động cao và nhận thấy mô cũng có đáp ứng khá tốt với nuôi cấy.
Về chuyển gen:
Qua sử dụng mô sẹo đang trong quá tr ình tái sinh để chuyển nạp gen bằng ph ương
pháp dùng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, chúng tôi bước đầu nhận được 2 dòng
mô có khả năng sinh trưởng tốt trên môi trường có 30mg/l hygromycin. Thực tế nghiên
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 393

cứu của chúng tôi cho thấy có vấn đề khó khăn trong việc sử dụng mô sẹo phôi hoá để
nghiên cứu chuyển gen dùng vi khuẩn là mô sẹo sau khi xử lý vi khuẩn, nuôi chung, rửa
và cấy chọn lọc thường trở nên nhão và chết với tỷ lệ rất lớn. Chúng tôi đang tiếp cận
hướng sử dụng phương pháp bắn gen nhằm loại bỏ một số yếu tố có thể gây ảnh h ưởng
xấu trên mô như thao tác cơ học xử lý vi khuẩn, rửa, thấm khô mô… v à cũng có thể sự
khó khăn trên đây là do yếu tố giống. Khả năng tạo mô sẹo phôi hoá với tần số thấp
cũng như duy trì nó trong thời gian dài mà không giảm khả năng tái sinh đã khiến một
số tác giả trên thế giới tiếp cận phương pháp dùng chồi đỉnh (intact tisue) để nghi ên cứu
chuyển gen [12,13]. Điểm thuận lợi của chúng tôi khi sử dụng hệ thống mô sẹo đang
trong quá trình tái sinh là lo ại mô này không giảm khả năng tái sinh trong thời gian dài
cấy truyền. Được biết đến nay, đã có nhiều phương pháp chuyển gen được áp dụng trên
đối tượng cây ngô như bắn gen [16,18,21,22], d ùng vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens [12,13,15, 20], dùng xung đi ện [5,7,9,17,19] nhưng hiện nay chỉ hai
phương pháp bắn gen và dùng vi khuẩn là còn được áp dụng nhiều.

4 5

1 2 3

Hình 1: Mô sẹo có khả năng sinh phôi d ùng chuyển gen. 2: Cụm mô kháng hygromycin.
3: Thử GUS dương tính đối với mô chồi. 4: Kết quả PCR d ương tính gen hph với băng
DNA 800 bp. 5: Kết quả PCR dương tính gen tạo ferritin với băng DNA 700 bp

KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu nuôi cấy đốt thân, chồi đỉnh v à chuyển nạp gen trên giống ngô Nếp
Tiền Giang, chúng tôi có một số kết luận sau:
 Trong số các môi trường khảo sát, môi trường thích hợp tạo loại mô vừa mang khả
năng tái sinh cao vừa có thể được dùng cho nghiên cứu chuyển nạp gen là môi
trường MS có 0,5mg/l 2,4-D và 1mg/l BA. Khả năng tái sinh cây đối với loại mô
này có thể được duy trì trong thời gian dài.
 Chồi đỉnh qua nuôi cấy có thể phát triển theo hướng tạo dạng mô sẹo mang phác
thể chồi hoặc theo hướng tạo cụm chồi tuỳ theo loại chất điều ho à sinh trưởng và
nồng độ được sử dụng.
 Qua chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen hph và gen tạo
protein giàu sắt (ferritin), bước đầu chúng tôi đã chọn được 2 dòng mô ngô có khả
năng sinh trưởng tốt trên môi trường có 30mg/l hygromycin.
LỜI CÁM ƠN
Các tác giả xin chân thành cám ơn Chương trình Nghiên cứu cơ bản đã tài trợ cho
nghiên cứu này.
394 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Trần Thị Dung, Trần Trung Hiếu, 2000. Bước đầu chuyển gen vào cây bắp (Zea
mays L.) nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens . Tập san KHKT Nông Lâm
nghiệp 2: 59-61, Trường ĐH. Nông Lâm T/p HCM.
2. Nguyễn Hữu Hổ, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Tâm, Nguyễn Văn Uyển, 2003. Một số
nghiên cứu chuyển gen vào cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) và cây ngô (Zea
mays L.). Tuyển tập Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà
Nội, 16-17/12/2003, tr. 1096-1101. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
3. Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển, Z. Y. Tkaschuc, L. V. Tkaschuc, 1995. T ạo
cụm chồi cây ngô (Zea mays L.) từ đỉnh sinh trưởng và phôi hạt nuôi cấy in vitro.
Tạp chí Khoa học và Công nghệ 4: 6-9.
4. Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hàm, Phạm Minh Thợi, Đỗ Năng Vịnh, 2003. Nghiên
cứu xây dựng hệ thống tái si nh sử dụng cho biến nạp gen cây ngô. Tuyển tập Báo
cáo khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội, 16-17/12/2003, tr.
820-825. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
5. D’Halluin, K., E. Bonne, M. Bossut, M. De Beuckeleer, J. Leemans, 1992.
Transgenic maize plants by tissue electroporation. The Plant Cell 4: 1495-1505.
6. Danson, J. W., M. Lagat, M. Mbogori, 2006. Screening tropical maize lines for the
production and regeneration of friable and embryogenic type II callus. African
Journal of Biotechnology 5(230): 2367-2370.
7. Fennell, A., R. Hauptmann, 1992. Electroporation and PEG delivery of DNA into
maize microspores. Plant Cell Reports 11: 567-570.
8. Frame, B. R. et al., 2002. Agrobacterum tumefaciens -mediated transformation of
maize embryos using a standard binary vector system. Plant Physiol. 129: 13-22.
9. Fromm, M. E., L. P. Taylor, V. Walbot, 1986. Stable transformation of maize after
gene transfer by electroporation. Nature 319: 791-793.
10. Goto, F., T. Yoshihara, H. Saiki, 1998. Iron accumulation in tobacco plants
expressing soybean ferritin gene. Transgenic Research 7: 173-180.
11. Goto, F., T. Yoshihara, N. Shigemoto, S. Toki, F. Takaiwa, 1999. Iron fortification
of rice seed by the soybean ferritin gene. Nature Biotechnology 17: 282-286.
12. Gould, J., M. Devey, O. Hasegawa, E. C. Ulian, G. Peterson, R. H. Smith, 1991.
Transformation of Zea mays L. using Agrobacterum tumefaciens and the shoot
apex. Plant Physiol. 95: 426-434.
13. Grave, A. C. F., S. L. Goldman, 1986. The transformation of Zea mays seedlings
with Agrobacterium tumefaciens . Plant Molecular Biology 7: 43-50.
14. Huang, X. Q., Z. M. Wei, 2004. High -frequency plant regeneration through callus
initiation from mature embryos of maize (Zea mays L.). Plant Cell Reports 22: 793-800.
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 395

15. Ishida, Y., H. Saito, S. Ohta, Y. Hiei, T. Komari, T. Kumashiro, 1996. High
efficiency transformation of maize ( Zea mays L.) mediated by Agrobacterium
tumefaciens. Nature Biotechnology 14: 745-750.
16. Klein, T.M., T. Gradziel, M. E. Fromm, J. C. Sanford, 1988. Factor influencing
gene delivery into Zea mays cells by high-velocity microprojectiles.
Bio/Technology 6: 559-563.
17. Laursen, C. M., R. A. Krzyzek, C. E. Flick, P. C. Anderson, T. M. Spencer, 1994.
Production of fertile transgenic maize by electroporation of suspension culture
cells. Plant Molecular Biology 24: 51-61.
18. O’Kennedy, M. M., J. T. Burger, D. K. Berger, 2001. Transformation of elite white
maize using the particle inflow gun and detailed analysis of a low -copy integration
event. Plant Cell Reports 20: 721-730.
19. Planckaert, F., V. Walbot, 1989. Transient expression after electroporation of
protoplasts derived from embryogenic maize callus. Plant Cell Reports 8: 144-147.
20. Sidorov, V., L. Gilbertson, P. Addae, D. Duncan, 2006. Agrobacterium-mediated
transformation of seedling-derived maize callus. Plant Cell Reports 25: 320-328.
21. Southgate, E. M., M. R. Davey, J. B. Power, R. J. Westcott, 1998. A comparison of
methods for direct gene transfer into maize ( Zea mays L.). In Vitro Cell Dev. Biol. -
Plant 34: 218-224.
22. Vain, P., M. D. McMullen, J. J. Finer, 1993. Osmotic treatment enhances particle
bombardment-mediated transient and stable transformation of maize. Plant Cell
Reports 12: 84-88.

SUMMARY
Plant regeneration system and genetic transformation of
maize (Zea mays L.) with the ferritin gene via Agrobacterium
tumefaciens
Nguyen Phuong Nam, Le Tan Duc, Pham Duc Tri,
Nguyen Huu Tam, Nguyen Huu Ho, Nguyen Van Uyen
Institute of Tropical Biology

Nodal sections of 10 - 15 day old seedlings (Nep, Tien Giang province) were cut and
cultured on the media: MS + 0.5mg/l 2,4 -D + 1mg/l BA or MS + 0.5 mg/l 2,4-D + 2.2
g/l picloram + 1.38g/l L - proline + 3.4mg/l silver nitrate for the formation of
regenerating callus and/or embryogenic callus. Shoot apex culture (0.4 mm in size) were
also carried out. There was the formation of multishoot from shoot apex cultured on the
MS medium containing NAA (0.05mg/l) and BA (1-2mg/l). The regenerating calli were
used for genetic transformation via the Agrobacterium tumefaciens strain LBA 4404
with the aim to enhance the ferritin in the transformed plants.
396 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

NGHIÊN CỨU TẠO PHÔI VÔ TÍNH CÂY KHOAI M Ì


(Manihot esculenta Crantz)

Phan Tường Lộc, Nguyễn Hữu Hổ


Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU
Trong 10 năm trở lại đây, việc trồng khoa i mì ở Việt Nam phát triển mạnh. Năm
1995, trên cả nước, diện tích trồng khoai m ì là 277,4 nghìn ha, sản lượng đạt 2211,5
nghìn tấn; đến năm 2004, diện tích trồng tăng đến 383,6 ngh ìn ha, sản lượng đạt 5572,8
nghìn tấn (Theo tài liệu Tổng cục Thống kê).
Ngoài vai trò là cây lương thực quan trọng, khoai mì ngày nay còn là nguyên li ệu
trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau. Tinh bột khoai m ì được sử dụng để sản xuất
các sản phẩm công nghệ sinh học đang đ ược quan tâm. Do đó, đầu t ư và quản lý các
giống khoai mì có chất lượng tốt và ổn định cho từng mục ti êu đặt ra là rất cần thiết.
Khoai mì ra hoa không đều, sinh sản tự nhiên thấp, mức dị hợp tử cao, giao phối c ùng
giống cao nên việc ứng dụng các phương pháp cổ điển trong công tác giống khó khăn.
Công nghệ sinh học đã đưa ra những công cụ tiên tiến, bổ sung cho các phương pháp
chọn giống cổ điển, nhằm bảo tồn, phục tráng giống tốt trong tự nhi ên, tạo ra các tính
trạng ưu việt mới như tính kháng bệnh, sâu, tăng hàm lượng protein trong củ, giảm h àm
lượng cyanogenic glucoside, tăng thời gian tồn trữ. Xây dựng đ ược hệ thống nuôi cấy
mô hiệu quả sẽ là nền tảng cho nhiều nghi ên cứu ứng dụng thực tiễn quan trọng, trong
lĩnh vực công nghệ sinh học ở cây khoai m ì.
Nghiên cứu sự tạo phôi vô tính, phát triển th ành cây in vitro, và kiện toàn các bước
đưa cây ra trồng trong vườn ươm đã được thực hiện tại phòng Công nghệ gen Viện Sinh
học Nhiệt đới. Giống khoai m ì KM 140, do Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền
Nam cung cấp, đã được sử dụng trong nghiên cứu này.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP


Vật liệu
- Đối tượng thực vật:
Giống khoai mì KM 140. Đây là giống nhập nội đã thích nghi với điều kiện môi
trường Việt Nam, có hàm lượng tinh bột ở củ cao 27 -28%, thời gian canh tác ngắn,
khoảng 6 tháng.
- Môi trường nuôi cấy:
+ Môi trường cơ bản (KM): Khoáng đa lượng, vi lượng MS; vitamin B 5, có bổ sung
thành phần CuSO 4 0,5mg/l, casein thủy phân 50mg/l: đường 30g/l, agar 9g/l, pH 5,8.
+ Môi trường tạo phôi và phát triển cây: bổ sung thành phần chất điều hòa sinh
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 397

trưởng 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), p - fluorophenoxyacetic acid (4 -FA),


Gibberellic acid (GA 3).
Phương pháp
Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và 4-FA lên sự tạo mô sẹo của lá
Cắt các thùy lá chân vịt non có chiều dài từ 2 - 6mm của cây mới vô mẫu hoặc từ
cây in vitro sau khi cấy truyền khoảng 10 ngày (hình 1a) và nuôi cấy tạo mô sẹo. Môi
trường sử dụng là môi trường cơ bản có bổ sung 2,4-D ở các nồng độ 2, 4, 6, 8, 10, 12 mg/l
hoặc 4-FA ở các nồng độ 2, 4, 6, 8.
Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và 4-FA đến khả năng sinh phôi c ủa mô sẹo
Các mẫu tạo mô sẹo được nuôi cấy tiếp trên cùng môi trường và tiếp tục theo dõi
thời gian hình thành phôi, số lượng phôi so với mẫu ban đầu, các giai đoạn phát triển
điển hình của phôi.
Giải phẫu và nhuộm mẫu Nhằm quan sát các giai đoạn phát tr iển của mẫu từ mô sẹo
thành phôi theo phương pháp c ủa Nguyễn Tiến Bân và cs. (1979).
Khảo sát ảnh huởng của GA 3 đến sự phát triển từ phôi th ành cây
Phôi phát triển đến giai đoạn cuối cùng sẽ được tách ra và cấy trên môi trường cơ bản có
bổ sung thành phần GA3 ở các nồng độ khác nhau 0,1; 0,2; 0,3mg/l và đối chứng để theo
dõi ảnh hưởng của GA3 đối với thời gian phôi phát triển th ành cây hoàn chỉnh.
Chuyển cây in vitro ra trồng trong nhà lưới
Cây in vitro phát triển hoàn chỉnh từ phôi có chiều cao từ 5 - 7cm được đưa ra trồng
trong nhà lưới. Trong tuần đầu cây được đặt trong khung có ny lông bao kín và đư ợc
tưới phun sương 3 lần/ ngày để tránh sự thoát hơi nước của cây. Đến tuần thứ hai, cây
được mang ra khỏi khung ny lông, t ưới phun sương 3 lần/ ngày.

KẾT QUẢ

Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và 4-FA lên sự tạo mô sẹo của mẫu lá
Các thùy lá được nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo có 2,4-D đến ngày thứ 5, 6
thì mô sẹo bắt đầu hình thành ở vùng cuống và mép thùy lá. Khoảng 28 ngày mô sẹo
phát triển đầy mặt lá, các khối mô sẹo mềm, dạng th ùy, trơn láng và có màu nâu nh ạt.
Bảng 1: Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự tạo mô sẹo ở tuần nuôi cấy thứ 2 v à thứ 5

Ký hiệu Nồng độ Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%)


Nghiệm thức
môi trường (MT) 2,4-D (mg/l) Tuần thứ 2 Tuần thứ 5
1 ĐC 0 0G 0G
2 D2 2 11,11 ± 1,92 F 55,56 ± 1,93 F
3 D4 4 38,89 ± 1,92 D 70,00 ± 3,33 D
4 D6 6 76,67 ± 3,34 A 95,56 ± 1,93 A
5 D8 8 58,89 ± 1,92 B 84,44 ± 1,93 B
6 D10 10 48,89 ± 1,92 C 78,89 ± 1,92 C
7 D12 12 27,78 ± 1,92 E 64,44 ± 1,93 E
**CV (%) = 5,49 **CV (%) = 3,21
398 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

Ở nghiệm thức 4, bảng 1, tr ên môi trường có 2,4-D nồng độ 6mg/l, mẫu hình thành
mô sẹo đạt tỷ lệ cao nhất 95,56%. Ở môi trường đối chứng (2,4-D nồng độ 0mg/l), mẫu
lá gia tăng kích thước nhưng không có dấu hiệu tạo mô sẹo. Ở tuần thứ 2, có sự hình
thành rễ từ cuống và bìa một số mẫu lá.
Trên môi trường bổ sung 4-FA, sự hình thành mô sẹo chậm hơn. Hình thái mô sẹo
phát triển cũng tương tự như trên môi trường 2,4-D, tuy nhiên có sự hình thành các cụm
mô nhỏ xốp trắng đục.
Bảng 2: Ảnh hưởng của 4-FA lên sự tạo mô sẹo sau tuần nuôi cấy thứ 3 v à thứ 6

Nghiệm thức Ký hiệu Nồng độ Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%)


MT 4FA (mg/l)
Tuần thứ 3 Tuần thứ 6
1 ĐC 0 0E 0E
2 F2 2 21,11 ± 1,92 C 56,67 ± 3,34 C
3 F4 4 56,67 ± 3,34 A 85,56 ± 1,93 A
4 F6 6 42,22 ± 1,92 B 70,00 ± 3,33 B
5 F8 8 15,56 ± 1,93 D 47,78 ± 1,92 D
**CV (%) = 7,78 **CV (%) = 4,68

Nghiệm thức 3, bảng 2, môi tr ường có 4-FA nồng độ 4mg/l cho kết quả tốt nhất với
56,67% mẫu tạo mô sẹo ở tuần nuôi cấy thứ 3 v à 85,56% ở tuần nuôi cấy thứ 6 (tỷ lệ
thấp hơn so với nghiệm thức tạo mô sẹo cao nhất tr ên môi trường có 2,4-D).
Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và 4-FA đến khả năng sinh phôi của mẫu mô sẹo
Bảng 3: Ảnh hưởng của 2,4-D đến khả năng sinh phôi

Ký hiệu Nồng độ Tỷ lệ mẫu


Nghiệm thức Tổng số phôi
MT 2,4D (mg/l) sinh phôi (%)
1 ĐC 0 0 0G
2 D2 2 16,67 25,00 ± 1,00 E
3 D4 4 26,67 39,33 ± 1,53 D
4 D6 6 58,89 76,00 ± 2,00 A
5 D8 8 36,67 60,33 ± 1,53 B
6 D10 10 20,00 47,00 ± 1,00 C
7 D12 12 7,78 11,67 ± 1,53 F
**CV = 3,68%

Trên môi trường có 2,4-D, sau 40 ngày nuôi cấy, phôi bắt đầu hình thành trên khối
mô sẹo. Phôi tạo thành từng cụm gồm trung bình 4,5 phôi nằm cạnh nhau. Theo dõi đến
ngày 70 thì số lượng phôi hình thành không tăng.
Kết quả ở bảng 3 cho thấy nghiệ m thức 4, môi trường cơ bản có bổ sung 2,4-D ở
nồng độ 6 mg/l, cho có ảnh hưởng tốt nhất đến sự phát sinh phôi, đạt 58,89% mẫu cấy
sinh phôi và tổng số phôi thu nhận được là 76 phôi.
Trên môi trường có 4-FA, sau 45 - 50 ngày phôi mới bắt đầu hình thành trên các
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 399

khối mô sẹo, chậm hơn so với trên môi trường có 2,4-D. Đến ngày thứ 75, số phôi tạo
thành không tăng thêm. K ết quả thu nhận được trình bày trong bảng 4.
Bảng 4: Ảnh hưởng của 4-FA đến khả năng sinh phôi

Ký hiệu Nồng độ Tỷ lệ mẫu sinh


Nghiệm thức Tổng số phôi
MT 4FA (mg/l) phôi (%)
1 ĐC 0 0 0E
2 F2 2 34,44 46,00 ± 2,00 B
3 F4 4 57,78 101,67 ± 3,51 A
4 F6 6 20,00 29,67 ± 1,53 C
5 F8 8 8,89 16,67 ± 0,58 D
**CV = 5,02%

Kết quả ở bảng 4 cho thấy nghiệm thức 3 (môi tr ường có bổ sung 4 -FA ở nồng
độ 4 mg/l) đạt được giá trị cao nhất ở các chỉ ti êu theo dõi là 57,78% mẫu cấy sinh phôi
và có tổng số phôi thu nhận được là 101,67 phôi.
Số phôi cao nhất nhận được từ môi trường có bổ sung 2,4-D (6mg/l) thấp hơn ở môi
trường có bổ sung 4-FA (4mg/l), nhưng thời gian hình thành phôi nhanh hơn. Quá trình
hình thành phôi trên môi trường có 2,4-D và 4-FA được ghi nhận qua các giai đoạn là thuần
thục và điển hình từ dạng cầu, tim thủy lôi và dạng có cực chồi và rễ (hình 1b-f).
Giải phẫu và nhuộm mẫu
Phẫu thức các giai đoạn phát triển của phôi đ ược nhuộm và quan sát rõ ràng dưới
kính hiển vi vật kính (x10) (Hình 2).
Khảo sát ảnh hưởng của GA 3 đến sự phát triển của phôi
Phôi trưởng thành, thu nhận từ môi trường có bổ sung 2,4-D và 4-FA được cấy
truyền sang môi trường có bổ sung GA3. Sau 15 ng ày, thân mầm vươn cao và rễ hình
thành. Từ 22 - 25 ngày, hai lá mầm của cây tách ra, chồi ngọn xuất hiện với các lá ho àn
chỉnh và phát triển thành cây bình thường. Một số phôi dị dạng không phát triển th ành
cây hoàn chỉnh, hoặc chết đi trong quá trình nuôi cấy.
Bảng 5: Ảnh hưởng của GA3 đến sự phát triển của phôi thu nhận từ môi tr ường có bổ sung
2,4-D và 4-FA
Tỷ lệ phôi có Tỷ lệ phôi phát Tỷ lệ phôi có Tỷ lệ phôi phát
Ký Nồng độ lá và rễ mầm triển thành cây lá và rễ mầm triển thành cây
Nghiệm
hiệu GA3 (%) hoàn chỉnh (%) (%) hoàn chỉnh (%)
thức
MT (mg/l)
từ MT có bổ sung 2,4-D từ MT có bổ sung 4-FA
NT1 ĐC 0 54,44 3,33 ± 3,33 D 51,11 2,22 ± 1,92 D
NT2 G1 0,1 71,11 15,56 ± 1,93 C 70,00 17,78 ± 1,92 C
NT3 G2 0,2 85,56 36,67 ± 3,34 B 83,33 35,55 ± 3,85 B
NT4 G3 0,3 92,22 63,33 ± 3,34 A 91,11 62,22 ± 3,85 A
**CV = 10,24% **CV = 10,34%

Trên môi trường có bổ sung GA3 0,3mg/l, tỷ lệ phôi phát triển thành cây hoàn
400 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

chỉnh cao nhất ở cả hai trường hợp phôi thu nhận từ môi tr ường bổ sung 2,4-D và môi
trường bổ sung 4-FA. Ở nghiệm thức 1, đối chứng, tỷ lệ phôi phát triển th ành cây hoàn
chỉnh rất thấp.
Chuyển cây in vitro ra trồng trong nhà lưới
Cây con in vitro cao khoảng 5-7cm được chuyển ra trồng trong bầu đất ngo ài vườn
ươm. Sau một tuần cây bén rễ và ra lá non mới, tỉ lệ cây sống và phát triển bình thường
là 94 %. Chuyển cây sang chậu đất sau m ột tháng cây cao khoảng 50 - 60cm. (Các giá
trị trung bình trong các bảng không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác biệt rấ t
có ý nghĩa ở mức p = 0,01 dựa theo trắc nghiệm LSD)

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ


 Trên môi trường có bổ sung 2,4-D mẫu tạo mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy. Môi tr ường
có nồng độ 2,4-D 6mg/l cho tỷ lệ mẫu tạo thành mô sẹo cao nhất là 95,56% sau 5
tuần. Phôi bắt đầu hình thành ở tuần thứ 6. Cũng trên môi trường này tỉ lệ phôi hình
thành cao nhất 58,89% với 76 phôi.
 Đối với môi trường có bổ sung 4-FA, thời gian các mẫu cảm ứng tạo mô sẹo lâu
hơn và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo thấp h ơn so với 2,4-D. Mẫu bắt đầu hình thành mô sẹo
sau 3 tuần và đạt tỷ lệ tối đa sau 6 tuần nuôi cấy. Ở nồng độ 4 mg/l 4-FA mẫu tạo
mô sẹo cao nhất là 85,56%. Môi trường này cũng cho tỷ lệ tạo phôi cao nhất l à
57,78%, với 101,67 phôi.
 GA3 có ảnh hưởng rõ rệt đến việc phát triển phôi th ành cây hoàn chỉnh. Ở các nồng
độ thí nghiệm, môi trường bổ sung GA 3 0,3mg/l là môi trường thích hợp nhất để
kích thích phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh. Tỷ lệ đạt được khoảng 63%.
 Tỷ lệ sống của cây con khi chuyển từ trong b ình ra vườn ươm cây là 94%.
 Có thể ứng dụng quy trình tạo phôi khoai mì cho các nghiên cứu chuyển gen để tạo
giống mới.

Hình 1: Tạo phôi vô tính.


a: cây khoai mì in vitro
b, c, d: phôi phát tri ển qua các dạng
hình cầu, hình tim, hình thủy lôi
e, f: phôi trưởng thành dạng có cực

Hình 2: Phẫu thức mô


a: phôi hình cầu; b: phôi hình tim
c, d: phôi dạng thủy lôi cắt dọc
d: phôi trưởng thành có hai sơ
khởi lá
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 401

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bùi Trang Việt (2000). Sinh lý thực vật đại c ương, phần II: Phát triển. NXB Đại
học Quốc gia TP HCM, 187 - 223.
2. Brenda J. B., Micheal K. S., Kenneth J. S. (1986). The use of embryo culture for
the recovery of plants from cassava (Manihot esculenta Crantz) seeds. Plant Cell
Tiss. Org. Cul. 6: 229-234.
3. Gonzalez A. E., Schopke C., Taylor N. J. (1998). Regeneration of transgenic cassava
plants (Manihot esculenta Crantz) through Agrobacterium-mediated transformation of
embryogenic suspension cultures. Plant Cell Reports 17: 827 – 831.
4. Hoàng Kim, Phạm Văn Biên (1995). Cây sắn (Khoai mì). Nhà xuất bản Nông
nghiệp, TP HCM. 66 tr.
5. Hoàng Thị Sản (chủ biên), Hoàng Thị Bé. Phân loại học thực vật. Nh à xuất bản
Giáo dục, 77 - 126.
6. Kartha K. K., Gamborrg O. L. (1975). Elimination of cassava mosaic disease by
meristem culture. Phytopathology 65: 862 - 868.
7. Li H. Q., Gui J. I., Huang Y. W. (1998). Regeneration of cassav a plants via shoot
organogenesis. Plant Cell Rep. 17: 410-414.
8. Nguyễn My Uyên (2003). Phát sinh hình thái t ừ mô sẹo cây Paulownia fortunei v à
thăm dò khả năng biến nạp gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Luận văn
thạc sĩ sinh học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, TP HCM.
9. Sofiary E., Reamakers C. J. J. M., Kanju E. (1997). Comparison of NAA and 2.4 -D
induced somatic embryogenesis in cassava. Plant Cell Tissue and Organ Culture
50: 45 - 46.
10. Stamp J. A., Henshaw G. G. (1987). Somatic embryogenesis from clonal leaf
tissues of cassava.
11. Annuals of Botany 59: 445 - 450.
12. Trung tâm Tư liệu - Tổng Cục Thống kê Việt Nam http://www.gso.gov.vn

SUMMARY
Somatic Embryogenesis in Cassava
Phan Tuong Loc, Nguyen Huu Ho
Institute of Tropical Biology

Somatic embryos were obtained from immature leaf lobe explants of cassava
cultured in vitro on the KM medium containing 6mg/l 2,4-D or 4mg/l 4-FA. Mature
somatic embryos were transferred to the medium supplemented with 0.3mg/l GA3 for
elongating and rooting. In vitro plants were transplanted into soil. They were apparently
normal, similar to the stock plants.
402 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH in vitro CÂY HỒ


TIÊU (Piper nigrum. L) VÀ ỨNG DỤNG TRONG CHUYỂN
NẠP GEN TẠO protein lect in KHÁNG CÔN TRÙNG

Nguyễn Thị Thanh, Võ Phan Mi Sa, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ


Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU
Cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) là cây công nghiệp quan trọng có giá trị kinh tế cao
và là cây gia vị được sử dụng rộng rãi trên thế giới (8), do hạt tiêu có vị nóng cay và
mùi thơm hấp dẫn, nên rất thích hợp cho việc chế biến thức ăn (3). Ngo ài ra, hạt tiêu
còn được dùng trong ngành công nghi ệp chế biến hương liệu, nước hoa và trong y dược.
Trong những năm gần đây, sản xuất và xuất khẩu hạt tiêu của Việt Nam đã có bước phát
triển mạnh mẽ. Từ sản l ượng 10.000 tấn và xuất khẩu 7.000 tấn năm 1996 đến năm
2006 ước tính sản lượng và xuất khẩu đạt hơn 100.000 tấn và Việt Nam hiện nay, chiếm
vị trí số một thế giới cả về số l ượng lẫn giá trị xuất khẩu hạt ti êu. Tuy nhiên để giữ vững
vị trí số một như hiện nay, sản lượng hồ tiêu khó tăng nhanh trong nh ững năm tới, do
năng suất còn thấp, chi phí cho hóa chất ph òng trừ bệnh hại hồ tiêu cao, làm hạn chế
khả năng tăng năng suất và diện tích gieo trồng. Muốn tăng năng suất của hồ ti êu cả về
số lượng và chất lượng, vấn đề đặt ra là làm sao tạo được những giống hồ tiêu sạch bệnh
có khả năng kháng virus, nấm… (2,7,10,11).
Để tạo ra giống (dòng) mới, sạch bệnh, một số ph ương pháp tiếp cận khác như tái
sinh cây bằng nuôi cấy phôi soma (4,8,9), đỉnh sinh tr ưởng, mô sẹo từ rễ, cuống lá, đốt
và mẫu mô lá (1,5,12) và bước đầu chuyển nạp gen v ào cây hồ tiêu thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens (14) đã và đang được nghiên cứu.
Do đó, mục đích của nghiên cứu này nhằm tìm ra giống hồ tiêu cao sản có khả năng
tái sinh cao, hoàn thiện hệ thống tái sinh in vitro cây hồ tiêu phục vụ cho các nghiên cứu
về chuyển nạp gen vào cây hồ tiêu trong tương lai.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Giống

Các giống hồ tiêu được dùng nghiên cứu là : Phú Quốc, Vĩnh Linh: Hạt hồ ti êu
được khử trùng và dùng làm nguyên li ệu in vitro để tạo mô sẹo, chồi, lấy mẫu lá, thân,
cuống lá cho nghiên cứu.
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 403

Môi trường nuôi cấy

1. Môi trường nuôi cấy in vitro MS (6)


2. Môi trường tạo mô sẹo từ hạt, rễ SH: (0,1-2 mg/l) 2,4-D + 0,1mg/l Kinetin.
3. Môi trường tái sinh chồi từ mẫu mô lá: MS + 1,5mg/l BAP + 0,1mg/l Kinetin +
0,1mg/l IBA + 10% nước dừa
4. Môi trường tái sinh chồi từ đốt thân, cuống lá: MS + 2mg/l BAP + 0,1mg/l
Kinetin + 0,5mg/l IBA + 10% nước dừa
5. Môi trường giữ giống in vitro cây hồ tiêu: ½ MS + 0,1mg/l IBA + 10% nước
dừa + 0,1 % than hoạt tính.
Điều kiện nuôi cấy

Nhiệt độ từ 25-26oC. Giai đoạn cho nẩy mầm từ hạt, giai đoạn tạo mô sẹo, nuôi cấy
trong tối ở nhiệt độ 25 oC. Cây tái sinh trực tiếp từ mẫu mô lá và thân thời gian chiếu
sáng 10 giờ/ngày.
Phương pháp

Hạt hồ tiêu được thu hoạch tại các v ườn trồng hồ tiêu tại Phú Quốc, Đắk Lắk. Rửa
sạch và khử trùng bằng cồn 70 o cho 1 phút, sau đó ngâm trong dung d ịch HgCl 2 (0,1%),
rửa với nước vô trùng ít nhất 6 lần, tiếp theo ngâm hạt v ào dung dịch cefotaxime 0,1%
hoặc nước javels 40%, thời gian khử tr ùng khác nhau từ 30-60 phút. Hạt vô trùng được
đặt trong môi trường MS cho hạt nẩy mầm, hoặc môi tr ường SH có bổ sung 2,4-D với
các nồng độ khác nhau để tạo mô sẹo,
Hạt nẩy mầm chuyển sang môi tr ường ½ MS mới để tạo cây. Mô sẹo h ình thành,
chuyển sang môi trường mới để nhân sinh khối mô sẹo.
Lá của cây sinh trưởng tốt như hình 2, cắt ra rừng mảnh khoảng 5 cm và đặt trên
môi trường tái sinh (môi trường số 3), để tạo chồi.
Cắt đốt cây vô trùng, sau đó chẻ dọc làm đôi, và cuống lá, đặt lên môi trường 4, để
tạo mô sẹo và chồi. Các chồi sau đó được cấy trên môi trường số 5 để tạo rễ và giữ
giống in vitro.
Ảnh hưởng của hygromycin lên sự tái sinh chồi hồ tiêu từ mô lá.

KẾT QUẢ, THẢO LUẬN

1. Tạo giống vô trùng in vitro

Hồ tiêu là loại cây mang nhiều mầm bệnh nội sinh (7,11), bởi vậy điều quan
trọng là làm sao loại bỏ được các mầm bệnh nội sinh trong hồ ti êu như nấm, virus, vi
khuẩn nằm bên trong mô cây, h ạt. Các phương pháp thông thư ờng khử trùng như
dùng cồn và nước javel, không loại trừ được các mầm bệnh. Các mẫu qua xử lý tr ên
404 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

cho thấy: mặc dù khi sử dụng các chất có khả năng diệt khuẩn cao nh ư HgCl 2 0,1 %
trong 10 phút, mẫu khử trùng hạt vẫn nhiễm rất cao từ 80-90% sau 1 tháng trên môi
trường nuôi cấy. Do đó ph ương pháp khử trùng hạt nêu trên thu được mẫu vô trùng
rất thấp và hạt không nẩy mầm, sau một thời gian d ài (30 ngày) gieo trên môi trư ờng
MS không chất kích thích sinh tr ưởng.
Để nhận được mẫu vô trùng, chúng tôi sử dụng phương pháp: Lột vỏ hạt tiêu, rửa
sạch, ngâm vào dung dịch HgCl 2 0,1 % từ 5 -10 phút, sau đó ngâm hạt trong dung dịch
cefotaxin 1% trong 1 giờ. Bằng cách này chúng tôi thu nhận được mẫu vô trùng từ 80-
90%. Tỉ lệ nẩy mầm cao khoảng 57% so với hạt tiêu không lột vỏ.

2. Xây dựng hệ thống tái sinh qua nuôi cấy mô sẹo từ hạt

Tạo mô sẹo từ hạt: Các hạt ti êu vô trùng được đặt trên các môi trường SH, có bổ
sung thêm các chất kích thích sinh trưởng: 2,4-D có các nồng độ từ 0,1 đến 2mg/l và
kinetin 0,1mg/l. Sau một thời gian nuôi cấy, quan sát thấy mô sẹo h ình thành ở vị trí mô
noãn (seed-bud), sau khoảng 3 tuần khoảng 49% tạo mô sẹo, theo chúng tôi l à do tác
động của 2,4-D lên sự hình thành mô sẹo (4).
Qua nuôi cấy mô sẹo từ hạt, chúng tôi còn nhận được mô sẹo từ rễ. Rễ hồ ti êu cắt
và đặt trên môi trường SH có bổ sung 0,5mg/l 2,4-D tạo mô sẹo đạt 95%.
Mô sẹo này được cấy truyền nhân lên cùng sang môi trường như trên. Do hiệu suất
hình thành mô sẹo sinh phôi cũng như tốc độ nhân mô phôi trên môi trường agar không
cao. Chúng tôi quan tâm đ ến vấn đề sử dụng loại mô n ày để nghiên cứu chuyển gen,
nên chúng tôi tiếp tục nghiên cứu nhân nhanh sinh khối mô phôi bằng cách nuôi tr ên
môi trường lỏng, lắc nhẹ khoảng 80 v òng/phút để tăng hiệu quả sinh phôi mô nuôi cấy.

3. Xây dựng hệ thống tái sinh chồi trực tiếp từ đốt, lóng cây hồ ti êu

Chồi in vitro của cây hồ ti êu cao khoảng 6-7cm được cắt thành các đốt và lóng
khoảng 1,5cm. Mỗi đốt mang một chồi ngủ, đ ược cất trên môi trường MS có bổ sung
2mg/l BAP + 0,1mg/l Kinetin + 0,5mg/l IBA + 10 % nước dừa. Trên môi trường này,
sau 3-5 tuần nuôi cấy, quan sát thấy xuất hiện chồi mới, số chồi h ình thành từ 4- 6 chồi
cho đốt già và 3-4 chồi được tạo ra từ lóng (hình 4).
Nghiên cứu sự tạo chồi từ các đốt cây, cho th ấy sự khác biệt về số lượng chồi được
tạo ra. Đốt gốc và đốt giữa có khả năng tạo chồi nhiều h ơn ở đốt ngọn. Nhằm làm tăng
khả năng tạo chồi từ đốt, chúng tôi chẻ dọc đốt ra l àm đôi, hy vọng tạo thêm một số
chồi từ vết cắt.

4. Xây dựng hệ thống tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu mô lá


Các mảnh lá (từ các lá phát triển đầy đủ), của cây sinh tr ưởng tốt trên môi
trường ½ MS, có bổ sung thêm 0,1mg/l IBA và 10% nư ớc dừa. Mẫu lá được đặt trên
môi trường MS có BAP 1,5mg/l + 0,1mg/l IBA + 0,1 mg/l Kinetin và 10% nư ớc dừa.
Sau 3 tuần nuôi cấy, mô sẹo hình thành từ những vết cắt, cấy truyền mô sẹo n ày sang
môi trường mới có cùng thành phần như trên. Chồi thu nhận được sau 2 tháng nuôi cấy.
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 405

Ở nước ta và trên thế giới, nghiên cứu tái sinh trực tiếp từ mẫu mô lá đ ã được thực
hiện, nhưng chưa nhiều. qua nghiên cứu tạo chồi trực tiếp từ mẫu mô lá để d ùng cho
phương pháp bắn gen gna cùng với gen chọn lọc hygromycin, b ước đầu chúng tôi đã
nhận được một số dòng mô chống chịu được hygromycin ở nồng độ 10mg/l. Nghi ên
cứu chuyển gen gna vào lá hồ tiêu bằng phương pháp bắn gen đang được thực hiện.

A B

C D

Hình 1. Tạo cây cây hồ tiêu in vitro: A: Hạt nẩy mầm; B: Cây con in vitro;
C: Mô sẹo tạo ra từ hạt; D: Chồi tái sinh từ cuống lá.

Hình 2. Ảnh hưởng của hygromycin lên sinh trưởng của hồ tiêu: A: Đối chứng,
B: hygromycin 15mg/l
406 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bhat SH, Chandel KPS, and Malik SK, 1995. Pl ant regeneration from various
explants of cultivated species. Plant Cell Reports. 14: 398 -402.
2. De Silva DPP, Jones P, and Shaw MW, 2002. Identification and transmission of
Piper yellow mottle virus and Cucumber mosaic virus infecting black pepper ( Piper
nigrum) in Sri Lanka. Plant Pathology. 51: 537 -545.
3. Jagella T, and Grosch W, 1999. Flavour and off -f;avour compounds of black and
white pepper (Piper nigrum L.) II. Odour activity values of desirable and
undesirable odorants of black pepper. Eur Food Res Tec hnol. 209:22-26.
4. Joseph B, Joseph D, and Philip VJ, 1996. Plant regeneration from somatic embryos
in black pepper. Plant Cell, Tissue and Orgen Culture. 47: 87 -90.
5. Kelkar SM, Krishnamurthy KV, 1998. Adventitious shoot regeneration from root,
internode, petiole and leaf explants of Piper colubrinum Link. Plant Cell Reports.
17: 721-725.
6. Murashige T, Skoog F, 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays
with tobacco tissue cultures. Physiol Plant. 15: 473 -497.
7. Lockhart BEL, Kiratiya - Angul K, Jones P, Eng L, De Silva P, Olszewski NE, et
al., 1997. Identification of Piper yellow mottle virus, a mealybug -transmitted
badnavirus infecting Piper ssp. In Southeast Asia. European Juornal of Plant
Pathology. 103:303-311.
8. Nair RR, Gupta SD, 2006. High -frequency plant regeneration through cyclic
secondary somatic embryogenesis in black pepper ( Piper nigrum L.). Plant Cell
Reports. 24: 699-707.
9. Nair RR, Dutta Gupta S, 2003. Somatic embryogenesis and plant regeneration in black
pepper (Piper nigrum L.): I. direct somatic embryogenesis from tissue of germinating
seeds and ontogeny of somatic embryos. J Hort Sci Biotechnol.: 416-421.
10. Nguyễn Tiến Thắng, Boico AL, 2001. Virus v à bệnh virus trên cây hồ tiêu ở Việt
Nam. Hội nghị Quốc tế lần 3, Kiev, Ucraina.
11. Qaher A, Mandeel, 2005. Fungal contamination of some imported spices.
Mycopathologia. 159:291-298.
12. Sarma YR, Kalloo G, 2004. Status of current research towards increased production
and productivity in black pepper in India. Focus on Pepper. 1:69 -86.
13. Schenk RU, Hildebrandt AC, 1972. Medium and techniques for induction and
growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Can J Bot. 50:
199-204.
14. Sim SL, Jafar R, Power JB, Davey MR, 2004. Development of an Agrobacterium -
mediated transformation system for black pepper (Piper nigrum L.). ISHS Acta
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 407

Horticulturae. 461. International Symposium on Biotechnology of Tropical and


subtropical Species part 2.

SUMMARY
Establishment of in vitro plant regeneration system of black
pepper (Piper nigrum L.) for gene transfer

Nguyen Thi Thanh, Vo Phan Mi Sa, Le Tan Duc, Nguyen Huu Ho


Institute of Tropical Biology

The economic importance of black pepper ( Piper nigrum L.) has lead to its
selection and breeding over thousands of year in the world. For successful gene t ransfer
in black pepper, efficient shoot regeneration systems are required. Regeneration
frequencies in black pepper are often low and genotype dependent. Black pepper leaf is
ideal explant source for biolistic transformation, but is not optimal for plant
regeneration. For this reason, A high -frequency shoot regeneration protocol was
developed for two commercial cultivars of black pepper (Phu Quoc and Vinh Linh) and
a range of culture media were tested for development of a highly -efficient regeneration
system from leaf, petiole, root explants and callus which was derived from micropylar
tissues of germinating seeds on SH media in the absence of light at 25 oC. Both cultivars
Phu Quoc and Vinh Linh were response for shoot regeneration using either one -step (for
petiole, internode and leaf explants) or two -step regeneration protocols (for callus).
These genotypes were chosen for further studies.
408 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

CHUYỂN NẠP GEN Ở CÂY DÂU TÂY ( Fragaria vesca L.)


NHỜ VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens KẾT HỢP XỬ
LÝ SÓNG SIÊU ÂM

Mai Trường, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ


Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU
Cây dâu tây do người Pháp du nhập vào Việt Nam đầu những năm 1930, c ó tên
khoa học là Fragaria vesca L., là kết quả của sự lai giống giữa ( Fragaria chiloensis
Duch và Fragaria virginiana Duch) thuộc nhóm hai lá mầm, họ Rosacea. Trong phần
thịt quả dâu tây có chứa nhiều sinh tố thiết yếu cho con ng ười như A, B1, B2 và đặc biệt
là sinh tố C. Do đó, những dòng dâu tây mang tính thương mại cao đã được chọn và
triển khai canh tác đại trà ở Lâm Đồng như dòng Mỹ Đá, Mỹ Hương (nhập khẩu bởi các
Công ty nghiên cứu giống), dòng HO của Nhật Bản (Phân Viện Sinh học Đà Lạt)…[1]
Hiện nay, với sự phát triển vượt bậc của ngành Công nghệ gen thực vật, đã cho phép đưa
một số gen mã hóa cho những tính trạng có ích theo nhóm sau: kháng bệnh hại (sâu, rầy, côn
trùng chích hút), chống chịu ngoại cảnh bất lợi (hạn, mặn, kháng thuốc trừ cỏ), trong y d ược
(tăng cường vitamin A, vắc-xin ăn được)… thông qua một số kỹ thuật biến nạp gen như bắn
gen (biolistic), vi khuẩn Agrobacterium, xung điện (electroporation). Riêng đối với đối tượng
cây ăn quả, nhiều công trình công bố quốc tế cho thấy cây dâu tây tỏ ra có ưu thế trong việc
ứng dụng công nghệ gen để tạo ra những giống mang đặc tính di truyền mới. Đồng thời cây
dâu tây có khả năng nhân giống nhanh và trồng đại trà tạo điều kiện cho việc thử nghiệm
đánh giá một số tính trạng mới [4][5][6][9][10][11][12][13].
Trong phạm vi bài báo này, chúng tôi trình bày một số kết quả trong việc x ây dựng
phương pháp chuyển nạp gen dùng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens kết hợp xử lý
sóng siêu âm, thông qua hệ thống nuôi cấy tái sinh từ đĩa lá dâu tây [2][3][7][8].

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP


1. Nguyên liệu
 Giống dâu Mỹ Đá do Phân viện Sinh học Đ à Lạt cung cấp. Mảnh lá dâu tây từ nhân
giống in vitro được cắt theo dạng đĩa với kích th ước (1x1) cm, dùng làm nguyên
liệu để chuyển nạp gen.
 Môi trường nuôi cấy: khoáng đa lượng, vi lượng (Murashige và Skoog, 1962),
vitamin B5 (Gamborg, 196 8), đường 30g/l, pH 5,8.
 Chất điều hòa sinh trưởng: TDZ (Thidiazuron), 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid).
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 409

 Dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chứa plasmid pCAMBIA 2301, mang


gen nptII mã hóa enzyme neomycine phosphotransferase, gen ch ỉ thị gusA. Nuôi
lắc vi khuẩn qua đêm trên môi trường AB (Chilton, 1974), chứa kh áng sinh chọn
lọc kanamycin nồng độ 50mg/l.

2. Phương pháp nghiên cứu


a. Phương pháp chuyển nạp gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens kết hợp
xử lý sóng siêu âm
 Thí nghiệm 1: đĩa lá (1x1) cm được ngâm chung với vi khuẩn trong 20 phút.
 Thí nghiệm 2: đĩa lá (1x1) cm được xử lý bằng sóng siêu âm trong 3 giây bằng thiết bị
siêu âm Transsonic 660 từ hãng Elma, sau đó ngâm chung với vi khuẩn trong 20 phút.
 Mẫu từ thí nghiệm 1 và 2 được nuôi cấy chung với vi khuẩn 2 ng ày trên môi trường
tái sinh chồi có bổ sung tổ hợp chất điều h òa sinh trưởng TDZ 1,5mg/l, 2,4-D 0,2
mg/l (viết tắt MSDT). Đĩa lá được rửa sạch nhiều lần bằng n ước cất vô trùng, và
chuyển sang môi trường tái sinh chồi như trên, có bổ sung kháng sinh diệt khuẩ n
Cefotaxime 500mg/l và kh áng sinh chọn lọc mô chuyển gen kanamycin 20mg/l.
 Cấy truyền sang môi trường mới 2 tuần/lần.
 Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 25 oC + 2.
 Thời gian chiếu sáng 12g/ngày.
 Cường độ chiếu sáng 3.000 lux.
 Mỗi công thức thí nghiệm gồm 50 mẫu lá, lặp lại thí nghiệm 3 lần.
b. Phương pháp phân tích sự hiện diện của gen chuyển nạp
 Hóa mô: kiểm tra gen chỉ thị gusA bằng cách ngâm chồi con trong dung dịch X -
Gluc. Ủ qua đêm ở 370C.
 PCR (Polymerase Chain Reaction): t ách chiết DNA nhiễm sắc thể từ mô lá theo
phương pháp của Dellaporta (1983) v à sử dụng cặp mồi (primer) đặc hiệu cho gen
kháng kháng sinh kanamycin (nptII):
* Primer (f): 5 ’ ACA CGC TGA AAT CAC CAG TCT C 3 ’
* Primer (r): 3 ’ CTC GTC CTG CAG TTC ATT C 5 ’
* Chương trình nhiệt độ cho PCR:
* Khởi đầu:
940C / 5 phút 35 chu kỳ

- Tách sợi DNA : 940C / 1 phút


- Gắn mồi: 550C / 1 phút
- Tổng hợp DNA: 720C / 2 phút
* Kết thúc: 720C / 7 phút
410 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN


 Các đĩa lá đối chứng (không xử lý với sóng si êu âm và vi khuẩn) trên môi trường
do bị ức chế mạnh bởi kháng sinh kanamycin ở nồng độ 20mg/l, nên sự phát sinh
hình thái chồi không diễn ra. Đa phần mô sẹo h ình thành ngay vết cắt, hóa nâu và
chết sau 45 ngày nuôi cấy.
 Tác động của kháng sinh kanamycin ở nồng độ 20mg/l lên khả năng tái sinh chồi
của mẫu lá đã xử lý chuyển gen và mẫu xử lý sóng siêu âm trước khi chuyển gen
trên môi trường bổ sung tổ hợp chất điều h òa sinh trưởng TDZ, 2,4-D sau 45 ngày:
 Mẫu xử lý chuyển gen trên môi trường MSDT cho thấy sự tăng sinh mô sẹo r õ rệt trên
cuống lá, rìa lá xung quanh vết cắt đĩa lá, dần hóa nâu và chết. Chỉ thu nhận duy nhất 1
mẫu lá tái sinh chồi và phát triển được trên môi trường chứa kháng sinh chọn lọc.
 Mẫu xử lý sóng siêu âm trước và chuyển gen sau đó trên môi trường MSDT, sự
phát sinh hình thái chồi xuất hiện ở vị trí cuống lá, rìa lá. Sơ khởi thu nhận 2 mẫu lá
tái sinh chồi trên môi trường chọn lọc sau 45 ngày.

Bảng 1: Tần số tái sinh chồi của thí nghiệm 1 v à 2 trên môi trường chọn lọc chứa
kanamycin nồng độ 20 mg/l sau 45 ng ày

Môi trường nuôi cấy MSDT Số mẫu lá Số mẫu lá Tỉ lệ tái sinh chồi (%)
(có kanamycin 20 mg/l) thí nghiệm tái sinh chồi
Thí nghiệm 1 150 1 0,66
Thí nghiệm 2 150 2 1,33

Hình 1: Mẫu nuôi cấy trên môi trường MSDT+ kanamycin 20 mg/l sau 45 ng ày
A. Mẫu đối chứng
B. Mẫu xử lý chuyển gen tái sinh chồi ở vị trí cuống lá
C. Mẫu xử lý sóng siêu âm+chuyển gen tái sinh chồi ở vị trí r ìa lá
D. Mẫu xử lý chuyển gen tái sinh chồi ở vị trí cuống lá
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 411

- Kết quả phân tích mẫu chuyển gen có xử lý trước sóng siêu âm:

Hình 3. Kết quả PCR đối với gen kháng


Hình 2. Sự biểu hiện tạm thời của kanamycin (nptII). TC: Thang chuẩn DNA
gen gusA thông qua phương pháp (1kb). 0: Plasmid pCAMBIA 2301. 1: M ẫu
hóa mô không chuyển gen. 2,3: Mẫu chuyển gen

KẾT LUẬN
 Đã thu nhận một số chồi in vitro kháng được kanamycin ở độ 20mg/l trên môi
trường tái sinh bổ sung TDZ 1 ,5mg/l, 2-4D 0,2mg/l, thông qua phương pháp
chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium kết hợp xử lý sóng siêu âm.
 Kết quả hóa mô cho thấy sự hiện diện của gen gusA.
 Gen npt II mã hóa cho enzyme neomycine phosphotransfer ase, tạo tính kháng
kanamycin đã được kiểm tra bằng kỹ thuật PCR.

TÀI LIỆU THAM KHẢO


1. Thông tin Khoa học Công nghệ Lâm Đồng, số 4 (2002).
2. Nguyễn Văn Uyển (1995). Những ph ương pháp công nghệ sinh học thực vật, tập 1
& 2. NXB Nông nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh.
3. Murashige T., Skoog F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassay
with tobacco tissue cultures. Plant Physiol 15: 473-497.
4. Jame, D. J. et al. (1990). Agrobacterium-mediated transformation of the cultivated
strawberry (Fragaria x ananassa Duch.) using disarmed binary vector. Plant
Science 69: 79-94.
5. Nehra, M. S. et al. (1990a). Agrobacterium-mediated transformation of strawberry
calli and recovery of tran sgenic plants. Plant Cell Reports 9:10-13.
6. Nehra, M. S. et al. (1990b). Genetic transformation of strawberry by Agrobacterium
tumefaciens using leaf disk regeneration system. Plant Cell Reports 9: 293-298.
412 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

7. Graham, J. et al. (1995). Agrobacterium-mediated transformation of soft fruit Rubus,


Ribes and Fragaria. Methods in Molecular Biology , Humana Press, Totowa, N. J.
44: 129-133.
8. Trick, H. N. and Finer, J. J. (1997). SAAT: Sonication Assisted Agrobacterium-
mediated Transformation. Transgenic Research 6:329-336.
9. Liu, Z. R. and Sanford, J. C. (1998). Plant regeneration by organogenesis from
strawberry leaf and runner tissue. HortScience 23:1057-1059.
10. Haymes, K. M. and Davis, T. M. (1998). Agrobacterium-mediated transformation
Fragaria vesca, and transmission of transgenes to R 1 progeny. Plant
Cell Reports 17: 279-283.
11. Barcelo, M. et al. (1998). Regeneration and transformation via Agrobacterium
tumefaciens of the strawberry cultivar Chandler. Plant Cell, Tissue and Organ
Culture 54: 29-36, 1998.
12. Yan Zhao, Qingzhong and Davis, R. E. (2004). Transgene expression in
strawberries driven by a heterologous phloem -specific promoter. Plant Cell Reports
23:224-230.
13. Nhut, D. T. et al. (2005). Callus formation, shoot proliferati on and rooting by
liquid culture: A novel efficient method for rapid propagation of strawberry
(Fragaria vesca L.). Proceedings of Vietnam -Korea International symposium
2005 on Biotechnology and Biosystem Engineering , 96-100, HCMC Uni. of
Agriculture and Forestry.

SUMMARY
Leaf disk transformation system of strawberry ( Fragaria
vesca L.) using the sonication assisted Agrobacterium method
Mai Truong, Le Tan Duc, Nguyen Huu Ho
Institute of Tropical Biology
Leaf disk regeneration system of strawberry ( Fragaria vesca L.) was carried out
using modified Murashige and Skoog medium ( 1962) with TDZ 1,5 mg.l -1 and 2,4-D
0,2 mg.l-1. Transformation works were performed via Agrobacterium tumefaciens
containing the plasmid pCAMBIA 2301 with gusA and npt II genes. Leaf explants were
pretreated with sonication in 3 seconds by Transsonic 660 unit and a 2 days of
Agrobacterium co-cultivation. After a 45-day culture under the pressure of kanamycin
20 mg.l -1 as a selective agent, shoot regeneration was recovered on the med ium with
TDZ 1,5 mg.l-1, 2,4-D 0,2 mg.l-1. The transformation frequency is low with percentage
of 1.33. Histochemical GUS assay and PCR analysis showed the presense of gusA and
npt II genes in putative transformants.

You might also like