Professional Documents
Culture Documents
MỞ ĐẦU
Hiện nay, bên cạnh phương pháp tạo giống cây trồng truyền thống nh ư lai hữu tính,
gây đột biến…, ngành công nghệ sinh học với sự phát triển của công nghệ gen đã và
đang tạo ra những bước đột phá do công nghệ gen cho phép đưa các gen có lợi vào thực
vật để tạo ra những cây trồng có tính trạng mà chúng ta mong muốn.
Hàng năm trên thế giới tốn rất nhiều chi phí trong việc phòng trừ sâu hại. Các
nhà khoa học đã và đang nghiên cứu chuyển nạp gen Bt (Bacillus thuringiensis) vào cây
trồng để cây trồng tự sản sinh các protein gây chết sâu hại. Cây trồng mang gen kháng
sâu Bt là một trong những thành tựu của công nghệ sinh học trong việc cải tiến cây
trồng. Cây mang gen tạo độc tố này có khả năng kháng với các sâu hại chính thuộc bộ
Lepidoptera, Coleoptera và Diptera. Hiện nay ngoài việc cải tiến kỹ thuật chuyển gen
Bt còn phải cải tiến gen thích hợp sao cho gen Bt, một gen của vi khuẩn có thể biểu hiện
có hiệu quả trong thực vật. Phương pháp có hiệu quả để tạo cây chuyển gen là sử dụng
súng bắn gen; tuy nhiên, đối với những cơ sở nghiên cứu chưa thể trang bị được thiết bị
này thì việc chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là phương pháp
được lựa chọn; ngoài ra phương pháp dùng vi khu ẩn Agrobacterium tumefaciens còn có
các ưu điểm riêng của nó mà các phương pháp khác không có đư ợc.
Theo hướng dùng vi khuẩn để chuyển nạp, chúng tôi đã nghiên cứu tái cấu trúc
vector plasmid mang ba gen là gen bar (gen chọn lọc), gen gusA (gen chỉ thị) và gen Bt
cryIA nhằm tạo một số vector plasmid mới - được đặt tên là plasmid pITB (Institute of
Tropical Biology).
Nội dung bài báo này, chúng tôi trình bày k ết quả nghiên cứu tái cấu trúc và sử
dụng các plasmid qua tái cấu trúc trong nghi ên cứu tạo cây cây hông và cây cải ngọt
chuyển gen.
Vectơ plasmid CAMBIA 3301 có độ dài 12 Kb chứa gen gusA và gen bar. Có 14
enzyme giới hạn tại vị trí cloning site trong vùng T-DNA, ở đó cho phép tách hoặc ghép
các đoạn gen mong muốn. Trong thí nghiệm này chúng tôi đã sử dụng enzyme giới hạn
Hind III (A/AGCTT) để cắt tạo hai đầu Hind III của chuỗi plasmid pCAMBIA 3301.
Plasmid pUbi.cryIA(b) và plasmid pUbi.cryIA(c) ch ứa gen cryIA có độ dài 4 kb, ở hai
đầu của toàn bộ gen này (promoter-gen-terminator) có vị trí cắt bởi enzyme giới hạn
Hind III. Nên chúng tôi đã sử dụng enzyme giới hạn Hind III để cắt ở hai vị trí này.
Sau khi cắt bởi enzyme giới hạn Hind III các đoạn plasmid DNA đã được chạy điện di
cho kết quả: với plasmid pCAMBIA đã được mở ra với hai đầu cắt bởi Hind III và được
xử lý bởi AP (alkaline phosphat) để chúng khó có thể tự nối lại với nhau. C òn plasmid
pUbi.cryIA do có hai vị trí cắt nên tạo ra hai đoạn: 6 kb DNA tương ứng với thân còn lại
của plasmid và đoạn 4 kb tương ứng với đoạn gen cryIA.
Sau đó tiến hành nối kết 2 đoạn DNA plasmid pCAMBIA 12 kb v à đoạn gen cryIA 4
kb với nhau bởi enzyme ligase ở nhiệt độ 4 oC trong thời gian 16 giờ. Kết quả đã tạo được
2 plasmid mới dài khoảng 16 kb.
Để kiểm tra kết qủa này chúng tôi đã chuyển 2 plasmid mới vào vi khuẩn biến nạp
E.coli, nhân bản E. coli và tách chiết ADN. Sử dụng lại enzyme giới hạn Hind III để cắt
cho kết quả mỗi plasmid đã cho được hai băng DNA với 1 đoạn 12 kb v à 1 đoạn 4 kb
(xem ảnh 2 điện di) hoàn toàn phù hợp với kích thước plasmid mới được chúng tôi đặt tên
là plasmid pITB-CRY (Institute of Tropical Biology) ch ứa 3 gen và được chuyển vào
dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA 105.
Chuyển gen vào cây hông:
Sau khi chuyển gen bằng vi khuẩn At, mẫu lá được đăt trên môi trường có PPT nồng
độ 4mg/l, đa số các mảnh lá bắt đầu vàng sau 2 tuần nuôi cấy, một số mảnh lá vẫn duy tr ì
màu xanh nhưng không hình thành mô sẹo, chỉ một số ít khoảng 10% h ình thành mô sẹo
và một số trong đó bắt đầu tái sinh sau 5 tuần nuôi cấy. S au giai đoạn chọn lọc này các
chồi con được chuyển sang môi trường MS để ra rễ với 4mg/l PPT. Và chỉ có vài dòng
cây tiếp tục phát triển và ra rễ, được chúng tôi giả định là cây chuyển gen. Kết quả quá
trình chuyển gen được thể hiện như sau:
Bảng 1: Tỷ lệ tái sinh chồi và cây chuyển gen của các mảnh lá trên môi trường có 4mg/l
PPT sau khi nhiễm với Agrobacterium tumefaciens và mẫu lá đối chứng
Sự biểu hiện gen gusA của cây chuyển gen: Các chồi nhỏ, mảnh lá của cây chuyển gen
đã được xử lý với dung dịch X-Gluc, kết quả cho thấy chồi và mảnh lá này có màu xanh
chàm đặc trưng khẳng định sự biểu hiện của gen gusA trong cây chuyển gen.
Sự biểu hiện của gen bar trong cây chuyển gen: gen bar tạo tính trạng kháng thuốc trừ cỏ
đã được khẳng định trong cây in vitro, tuy nhiên chúng tôi muốn tiếp tục khảo sát sự tồn tại
ổn định và khả năng biểu hiện của gen này trên cây sau khi được trồng ra môi trường tự nhiên
ngoài vườn ươm. Chúng tôi sử dụng nồng độ 300mg/l PPT để phun l ên các cây đối chứng và
cây chuyển gen 1 tháng tuổi tại vườn ươm. Sau 2 tuần nhận thấy các cây hông chuyển gen
tiếp tục sinh trưởng và phát triển bình thường, chỉ có một dòng cây hơi bị vàng lá phía dưới
nhưng vẫn sống và phát triển cho phép chúng tôi khẳng định một lần n ữa đây là những cây
hông đã nhận được gen chuyển.
Sự hiện diện của gen cryIA(c) và khả năng kháng sâu của cây chuyển gen: Phân tích PCR
với cặp mồi chuyên biệt cho gen cryIA(c) cho thấy các mẫu DNA của cây chuyển gen sau khi
chạy điện di có xuất hiện các băng có kích thước 0,65 kb giống như mẫu đối chứng dương tính
plasmid, chúng là kết quả của sự khuếch đại gen cryIA(c) trong khi mẫu cây đối chứng hoàn
toàn không có băng. Qua đó chúng tôi kh ẳng định sự hiện diện của gen cryIA(c) trong nhiễm
sắc thể của cây chuyển gen. Sau đó các cây hông chuyển gen đ ược chuyển ra trồng trong vườn
ươm. Để thử nghiệm tính kháng sâu các lá nhỏ đ ược đặt trong đĩa pétri cùng sâu xanh Heliothis
armigera. Sau 3 ngày, với các lá đối chứng diện tích lá bị hại lớn, kích th ước sâu tăng rõ rệt,
trong khi đó ở lá cây chuyển gen diện tích lá bị sâu ăn nhỏ, sâu tăng tr ưởng rất kém và sau 3
ngày sâu hoàn toàn không còn ăn và chết nhiều vào ngày thứ 5 hoặc 6.
Chuyển gen vào cây cải ngọt:
Với phương pháp sử dụng lá mầm của cây con từ hạt nẩ y mầm 5-6 ngày tuổi, cấy lá
mầm vào môi trường tái sinh 3-4 ngày trước khi nhúng cuống lá mầm v ào dịch vi khuẩn
để lây nhiễm, thời gian ủ với vi khuẩn l à hai ngày trên môi trường có bổ sung 100 µM
Acetosyringone và sau khi r ửa được cấy trên môi trường tái sinh có Cefotaxime
500mg/l và 4mg/l PPT thì sau 3-4 tuần các chồi tái sinh hình thành và chúng được cấy
truyền trên môi trường MS có 6mg/l PPT để kiểm tra khả năng kháng PPT của cây.
Chúng tôi đã thực hiện thí nghiệm chuyển gen nhiều lần với số mẫu trun g bình từ 80-
120 mẫu/lần. Kết quả được trình bày ở bảng 2.
Bảng 2. Tỷ lệ tái sinh ch ồi và cây, trên môi trường có 4mg/l PPT, của các lá mầm được
nhiễm với Agrobacterium tumefaciens v à của mẫu lá mầm đối chứng
gen hoặc chồi ở thể khảm và chỉ còn 2 chồi tiếp tục phát triển trên môi trường MS với
6mg/l PPT - điều này cho thấy tần số chuyển gen thấp (0,14%). Chúng tôi cho rằng khi
chuyển gen trên các đối tượng cây trồng khác như cây thuốc lá và cây hông thì mẫu lá có
khả năng tái sinh chồi cao từ xung quanh rìa lá nên vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có
thể xâm nhập vào nhiều vị trí có khả năng tái sinh này, trong khi ở cây cải ngọt lá mầm chỉ
có thể tái sinh tại cuống lá nên vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chỉ có một vị trí duy
nhất để có thể xâm nhiễm tạo cây chuyển gen. Các cây cải giả định chuyển gen đ ược phân
tích PCR với cặp mồi chuyên biệt của gen cryIA(c) - cho thấy các mẫu DNA của cây giả
định chuyển gen sau khi chạy điện di có xuất hiện các băng có kíc h thước 0,65 kb giống
như mẫu đối chứng dương tính plasmid, chúng là kết quả của sự khuếch đại gen cryIA(c)
trong khi mẫu cây đối chứng hoàn toàn không có băng.
KẾT LUẬN
Với việc sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA 105 mang plasmid ITB
để chuyển gen, chúng tôi đã nhận được một số dòng cây hông và cây cải ngọt chuyển gen
mang gen cryIA(c) kháng sâu xanh Heliothis armigera. B ằng các kỹ thuật sinh học phân tử
và sinh học chúng tôi đã xác định được của gen này hiện diện trong cây hông và cây cải
ngọt chuyển gen và gen chuyển đã có biểu hiện tính trạng khá rõ rệt.
Plasmid ITB (lane 2 và 3 mang Phân tích PCR gen cryIA(c) ở Phân tích PCR gen cryIA(c) ở
gen cryIA(b) và cryIA(c) cây hông chuyển gen (băng cây cải ngọt chuyển gen (băng
DNA 0,65 kb) DNA 0,65 kb)
Cây cải ngọt giả định chuyển gen phát triển Cây hông giả định chuyển gen phát triển
trên môi trường chọn lọc PPT trên môi trường chọn lọc PPT
350 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
LỜI CÁM ƠN
Các tác giả xin chân thành cám ơn Chương trình KC-04-13, Chương trình nghiên
cứu cơ bản đã tài trợ thiết thực cho nghiên cứu này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển, 2003. Tạo cây hông (Paulownia
fortunei) chuyển gen kháng sâu thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .
Tuyển tập Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học to àn quốc, Hà Nội, 16-
17/12/2003. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 1088-1090.
2. Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Phạm Thị Hạnh, Nguyễn Văn Uyển, 2005. Ảnh
hưởng của tác nhân chọn lọc đến mô cây cải ngọt ( Brassica integrifolia) và nghiên
cứu tạo cây cải ngọt chuyển gen. Tuyển tập Báo cáo Hội nghị khoa học t oàn quốc
“Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống” , Đại học Y Hà Nội, Hà
Nội, 3/11/2005, tr. 1194-1197.
3. Phạm Thị Hạnh, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển, 2005. Khảo sát
khả năng tái sinh cây in vitro cây cải ngọt (Brassica integrifolia) từ lá mầm và trụ
mầm phục vụ cho nghiên cứu chuyển gen. Tuyển tập Báo cáo Hội nghị khoa học
toàn quốc “Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống” , Đại học Y
Hà Nội, Hà Nội, 3/11/2005, tr. 498-500.
4. Nguyễn Văn Uyển, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu H ổ, 2003. Nghiên cứu hệ thống tái
sinh cây hông (Paulownia fortunei) và ảnh hưởng của tác nhân chọn lọc để tạo cây
chuyển gen. Tuyển tập Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học to àn quốc,
Hà Nội, 16-17/12/2003. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 866-869.
5. Murashige, T., Skoog F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay
with tobacco tissue culture. Physiol Plant 15: 473-497.
6. Pua, E. C., Barfield D. G., 1991. Gene transfer in plants of Brassica juncea using
Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Plant Cell Reports 10: 308-314.
SUMMARY
Construction of plasmid vector and utilization for production
of transgenic plants resistant to insect via Agrobacterium
tumefaciens
Le Tan Duc, Nguyen Huu Ho, Nguyen Van Uyen
Institute of Tropical Biology
New plasmid vector pITB-CRY (Institute of Tropical Biology) consisting bar,
cryIA(c) and gusA genes was constructed and applied to transfer into Agrobacterium
tumefaciens EHA 105 for Paulownia and Brassica plants genetic transformation. Many
transgenic lines of both plant cultivars were obtained. PCR analyses and indigogenic
GUS assay were performed to confirm the presence and the expression of bar, cryIA(c)
and gusA genes. Insect bioassays with larvae showed an improvement of resistance
against Heliothis armigera.
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 351
Phạm Thị Hạnh, Phan T ường Lộc, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ
Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới
ĐẶT VẤN ĐỀ
Một trong những yếu tố làm giảm năng suất cây trồng trên đồng ruộng hiện nay là
những tác hại do sâu bệnh gây ra và việc phòng trừ dịch hại này thường gây sự ô nhiễm
môi trường ngày càng nghiêm trọng. Vấn đề này chỉ có thể được giải quyết thông qua
sự kết hợp giữa khoa học hiện đại v à ý thức giữ gìn sinh thái môi trường. Một trong
những ứng dụng của công nghệ sinh học để giải quyết vấn đề tr ên là tạo ra những cây
trồng tự bản thân có khả năng chống chịu với các loại sâu bệnh. Trong các loại côn
trùng gây hại thì rầy, rệp chiếm vai trò quan trọng, việc chích hút nhựa của chúng làm
cây không phát triển đồng thời chúng là nguồn lây lan một số bệnh virus quan trọng nh ư
virus gây bệnh khảm ở cây thuốc lá...
Hiện nay, phương pháp chuyển gen vào cây trồng bằng vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens được xem là một phương pháp có hiệu quả, là phương pháp qua đó k ết quả
chuyển gen thường biểu hiện kiểu tích hợp gen (DNA integration) t ương đối đơn giản,
phù hợp với ý muốn của các nh à công nghệ gen.
Nội dung báo cáo này, chúng tôi nghiên cứu tái cấu trúc plasmid mới mang gen bar
(gen kháng thuốc trừ cỏ), gen gna (gen kháng côn trùng chích hút) và gen gusA; chuyển
plasmid mới cấu trúc vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và dùng dòng vi khuẩn
biến nạp trong nghiên cứu tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ v à côn trùng.
1. Vật liệu
Vi khuẩn E. coli chứa plasmid pBluescript SK +-GNA mang cassette gen nguyên
vẹn [Bao gồm Promoter Ubiquitin (Ubi) + Trình tự mã hoá protein GNA (gen gna)
+ Terminator Nopaline synthase (nos)], kích thư ớc khoảng gần 4 kb.
Chủng vi khuẩn E. coli chứa pCAMBIA 3301 mang gen bar (gen kháng thuốc trừ
cỏ) và gusA (gen chỉ thị). Gen chỉ thị gusA: được phân lập từ vi khuẩn E. coli
(Jefferson & ctv., 1987), mã hóa enzym -glucuronidase (không màu). Enzyme
này xúc tác phản ứng phân giải cơ chất glucuronide (không m àu) để tạo thành
352 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
sản phẩm có màu xanh chàm đặc trưng dễ nhận biết. Glucuronide th ường dùng
gọi là X-gluc, công thức hóa học: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronide.
Gen bar kháng chất phosphinothricin (PPT) đ ược phân lập từ vi khuẩn S.
hygroscopicus. Gen này mã hóa cho enzym phosphinothricin acetyl transferase
(PAT), giúp biến đổi PPT từ dạng ức chế sinh tổng hợp glutamine gây chết cây
trồng sang dạng bị acetyl hóa không c òn gây độc cho cây. Vì vậy, ngoài tác
dụng chọn lọc trong quá trình chuyển gen ở thực vật, gen bar còn có vai trò
kháng thuốc trừ cỏ Basta trong sản xuất nông nghiệp.
Chủng vi khuẩn E. coli DH5 được dùng trong biến nạp nhằm khuếch đại số l ượng
bản sao các plasmid.
Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 dùng để biến nạp plasmid mới.
Môi trường nuôi cấy: Môi trường Luria-Bertani (LB) chứa kháng sinh được sử
dụng trong nuôi cấy và biến nạp.
Enzym giới hạn SacI, KpnI và enzym nối DNA ligase T4.
2. Phương pháp
a. Cấu trúc các plasmid mới
Phương pháp xử lý enzym để cắt DNA plasmid theo qui trình của Sambrook và ctv.
(1989). Các phản ứng nối kết được thực hiện ở nhiệt độ 14 0C trong thời gian 3-4g. Biến
nạp E. coli và Agrobacterium tumefaciens theo phương pháp sốc nhiệt, 42 0C trong 2
phút. Môi trường LB được bổ sung các kháng sinh thích hợp để chọn lọc cá thể biến
nạp. Trong thí nghiệm chúng tôi sử dụng các kháng sinh nh ư kanamycin (50mg/l) và
streptomycin (25mg/l). Các hợp chất hóa sinh như IPTG (Isopropyl-D-thiogalactoside)
50mg/l và X-gal (5-Bromo 4-chloro 3-indolyl -D galactopyranoside) 40mg/l đư ợc bổ
sung vào môi trường nuôi cấy các thể biến nạp để hoạt hoá enzym -galactosidase, cho
phép chọn lọc các khuẩn lạc xanh/trắng. Ph ương pháp tách DNA plasmid các khuẩn lạc
để kiểm tra cloning theo phương pháp của bộ kit công ty Promega.
b. Tạo cây thuốc lá kháng thuốc trừ cỏ v à kháng côn trùng
Sử dụng giống thuốc lá sợi v àng Kutsaga 326. Lá cây thu ốc lá trong ống nghiệm
được cắt kích thước khoảng 1x1cm được dùng làm nguyên liệu chuyển gen.
Sử dụng vi khuẩn đã lắc qua đêm để gây nhiễm mảnh lá, sau đó các mảnh lá đ ược
nuôi cấy trên môi trường tái sinh tạo chồi (môi tr ường MS có 0,1mg/l NAA v à 1mg/l
BA) trong hai ngày. Sau đó r ửa và diệt vi khuẩn bằng dung dịch Cefotaxim e 500mg/l
trong thời gian 30 phút, chuyển các mảnh lá sang môi tr ường tái sinh tạo chồi có 10mg/l
PPT và 500mg/l Cefotaxim e. Cấy truyền 2 tuần / lần trên cùng loại môi trường. Sau 6
tuần, mẫu lá có chồi tái sinh đ ược cấy truyền sang môi tr ường ra rễ có chứa 20 mg/l
PPT. Các cây ra rễ tốt được đưa ra trồng ở vườn ươm.
Phương pháp kiểm tra cây chuyển gen
Khảo sát khả năng phát triển v à ra rễ của cây chuyển gen v à cây đối chứng in vitro
trên môi trường MS có chứa chất chọn lọc nồng độ 20mg/l PPT.
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 353
Kiểm tra gen chỉ thị gusA bằng dung dịch X-Gluc: bằng cách ngâm các mảnh lá v à
chồi nhỏ với dung dịch X-Gluc khoảng 15 giờ ở 370C, mẫu chuyển gen sẽ có màu
xanh chàm đặc trưng, còn mẫu đối chứng sẽ không chuyển m àu.
Sự hiện diện của gen gna trong cây được kiểm tra qua phản ứng PCR với cặp mồi
chuyên biệt như sau: Mồi 1: 5’CGG ATC CAT GGC TAA GGC AAG TCT CCT
C-3’ và mồi 2: 5’CGG TAC CTC ATT ACT TTG AAG TCA CAA G -3’. Kích
thước đoạn DNA của gen gna khuếch đại của phản ứng PCR đ ược mong đợi là
0,47 kb.
Sự hiện diện của gen bar được kiểm tra qua phân tíc h PCR với các cặp mồi như
sau: Mồi 1: 5’ ATG AGC CCA GAA CGA CG 3’ v à mồi 2: 5’ TCA GAT CTC
GGT GAC GG 3’. Gen bar ở cây chuyển gen qua phân tích PCR sẽ có đoạn DNA
được khuếch đại là 0,5 kb.
Các cây chuyển gen và đối chứng được phun dung dịch Basta (PPT nồng độ 4g/l)
có bổ sung chất bám dính Tween 80 để kiểm tra tính kháng thuốc trừ cỏ.
một số khuẩn lạc màu trắng nuôi trong môi trường LB lỏng có 50mg/l kháng sinh
kanamycin, nuôi lắc qua đêm ở 370C. Sau khi tách DNA plasmid, ti ến hành xử lý 2
enzym SacI và KpnI cho plasmid m ới và pCAMBIA. Kết quả xử lý enzym, chạy điện di
trên gel 0,8% cho thấy plasmid mới chứa 2 đoạn DNA: một đoạn 12 kb (t ương ứng
pCAMBIA 3301 backbone) và m ột đoạn kích thước khoảng gần 4 kb (t ương ứng
cassette chứa gen gna); cho thấy plasmid đ ã được hình thành có kích thước khoảng gần
16 kb. Như vậy có thể khẳng định gen mục ti êu đã được lắp ghép thành công và plasmid
mới đã được nhân bản trong E. coli, plasmid này được ký hiệu là p3301-GNA. Sau đó
chúng tôi đã tạo chủng Agrobacterium tumefaciens mang plasmid n ày.
Bảng 1: Tỷ lệ tái sinh chồi của cá c mảnh lá trên môi trường có 20mg/l PPT sau khi
nhiễm với Agrobacterium v à mẫu lá đối chứng
Thí nghiệm Số mẫu lá thử Số lượng mẫu lá tái sinh Tần số chuyển gen( %)
nghiệm chồi
Chuyển gen 120 11 9,16
Đối chứng 20 0 0
Kiểm tra sự hiện diện của gen mục ti êu gna trong cây thuốc lá chuyển gen: Phản
ứng PCR được thực hiện với cặp mồi đặc hiệu cho gen gna. Đối chứng dương là
plasmid pUbi-GNA và đối chứng âm là DNA bộ gen tách chiết từ nhiễm sắc thể của cây
không được chuyển gen. Kết quả cho thấy ở các dòng cây giả định chuyển gen có sự
hiện diện của vạch DNA mong đợi có kích th ước bằng với kích thước của vạch đối
chứng dương tính là 0,47 kb (so với thang chuẩn). Không thấy vạch này ở trường hợp
cây thuốc lá đối chứng. Kết quả n ày chứng minh gen mục tiêu gna từ plasmid của vi
khuẩn Agrobacterium đã được chuyển và sáp nhập vào bộ gen của cây.
Sự hiện diện của gen bar v à khả năng kháng thuốc trừ cỏ Basta: Kết quả phân tích
PCR cho thấy các mẫu DNA của cây chuyển gen xuất hiện băng DNA với kích thước
khoảng 0,50 kb là kết quả của việc khuếch đại gen bar. Do đó, chúng tôi có th ể khẳng
định bước đầu gen bar đã được chuyển vào nhiễm sắc thể của cây. Sau khi trồng tại
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 355
vườn ươm khoảng 30 ngày, các cây thuốc lá đối chứng đã được kiểm tra khả năng
chống chịu với thuốc trừ cỏ Basta bằng cách phun thuốc với các n ồng độ 4 g/l PPT. Sau
14 ngày, tất cả cây thuốc lá đối chứng đều bị chết ở nồng độ nói tr ên nên chúng tôi đã
chọn nồng độ 4g/l PPT để xử lý số cây thuốc lá chuyển gen. Sau 14 ng ày, cây thuốc lá
chuyển gen vẫn tiếp tục sinh tr ưởng bình thường.
KẾT LUẬN
Như vậy bằng các kỹ thuật sinh học phân tử chúng tôi đ ã tạo được chủng
Agrobacterium tumefaciens mang gen bar, gen gna và gen gusA. Sau đó đã sử dụng vi
khuẩn này để tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen bar kháng thuốc trừ cỏ và gen gna
kháng côn trùng chích hút.
LỜI CÁM ƠN
Các tác giả xin chân thành cám ơn Sở Khoa học và Công nghệ Tp Hồ Chí Minh và
Trung tâm phát triển KHCN Trẻ - Thành Đoàn Tp Hồ Chí Minh đã tài trợ cho nghiên
cứu này.
SUMMARY
Production of transgenic tobacco plants ( Nicotiana tabacum
L.) resistant to insect and Basta R herbicide via Agrobacterium
tumefaciens
Pham Thi Hanh, Phan Tuong Loc, Le Ta n Duc, Nguyen Huu Ho
Institute of Tropical Biology
Intact gna gene cassette was collected from the plasmid pBluescript SK + by
restriction enzymes KpnI và SacI and inserted in Lac Z alpha region on T-DNA of the
plasmid pCAMBIA 3301. Consequently, newly for med plasmid was introduced into
competent E. coli and Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 (for transformation). After
co-cultivation, tobacco leaf disks were cultured on selection medium containing 10 mg/l
PPT (Phosphinothricin). Many transgenic tobacco plants with aphid resistance gene gna,
herbicide resistance gene bar, and reporter gene gusA were obtained via Agrobacterium
tumefaciens LBA 4404 carrying the plasmid pCAMBIA 3301-GNA. PCR analyses and
indigogenic GUS assay were pe rformed to confirm the presen ce and the expression of
gna, bar and gusA genes.
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 357
Hình 1. Ảnh điện di của Hình 2, 3: Kết quả phân tích PCR gen bar (h. 2) v à gna
plasmid pCAMBIA 3301 - (h. 3) ở cây thuốc lá chuyển gen. L: thang DNA 1 kb,
GNA (1) và pCAMBIA PC: đối chứng dương tính, NC: đối chứng âm tính,
3301 (2) 1,2,3,4: cây chuyển gen
Hình 4: Cây thuốc lá chuyển Hình 5: Chồi cây thuốc lá Hình 6: Cây thuốc lá chuyển
gen và đối chứng trên môi chuyển gen biểu hiện gen và đối chứng sau khi
trường chứa 20 mg/l PPT gen gusA qua ngâm phun dung dịch Basta
trong dung dịch X-gluc
358 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
Nguyễn Hữu Hổ, Lê Tấn Đức, Phan Tường Lộc, Phạm Đức Trí,
Nguyễn Thị Thanh
Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới
MỞ ĐẦU
Trong ngành trồng hoa thương mại, một trong các vấn đề đ ược quan tâm nhiều nhất
là nghiên cứu giữ cho cây hoa nói chung v à hoa cắt cành nói riêng sao cho lâu tàn. Các
nhà sản xuất và kinh doanh hoa cảnh đã sử dụng một số tác nhân l àm cho hoa được tươi
lâu như dung dịch chất điều hoà sinh trưởng (ĐHST) cytokinin (dihydrozeatin hoặc
benzyladenin), dung dịch đường, dung dịch sát khuẩn,,, để xử lý hoa cắt cành hoặc xử lý
đối với cả cây hoa.
Cây hoa cúc là đối tượng cây hoa có nhu cầu tiêu thụ rất cao vì có hoa đẹp, đa dạng,
nhiều màu sắc nhưng thời gian bền tươi của hoa cắt cành không dài nhất là khi đưa vào
tiêu thụ giống cúc ôn đới hoặc trưng bày, bảo quản hoa trong điều kiện không thích hợp
nên nghiên cứu làm tăng độ bền tươi của cây hoa này là vấn đề cần được quan tâm.
Như chúng ta đã biết, các chất điều hoà sinh trưởng như auxin, gibberellin, ethylen,
acid abscisic, cytokinin có ý nghĩa rất lớn trong việc điều ho à sự lão hoá. Trong các
nhóm chất nêu trên, cytokinin chiếm vai trò quan trọng [5,9,10,11]. Trong công nghệ
nuôi cấy mô tế bào in vitro, cytokinin có vai trò rất rõ rệt trong việc giữ cho mô lá tách
rời chậm thoái hoá diệp lục tố - được xanh tươi lâu. Trong thực tiễn công tác giống cây
trồng, việc xử lý cytokinin, li ên quan mật thiết đến sự tươi lâu của rau vừa thu hoạch và
kéo dài tuổi thọ của hoa cắt cành, mang ý nghĩa thương mại rất cao.
Trên thế giới, các nhà khoa học đã nghiên cứu chuyển gen nạp ipt (mã hoá enzym
isopentenyl transferase có liên quan đ ến sinh tổng hợp cytokinin isopentenyl adenin,
zeatin và dihydrozeatin) vào cây tr ồng mục đích làm mô tế bào của chúng tự sản xuất
cytokinin. Thực tế nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh rằng, ở một số tr ường hợp
như cây thuốc lá [25], Petunia [5,10] cây bông cải [11], cây cải xà lách [13,14] kể cả
cây cúc [8,9,10]…, tác d ụng của cytokinin nội sinh (sản phẩm của gen đ ược chuyển
nạp) đối với tuổi thọ của lá v à hoa của cây chuyển nạp gen là rất có ý nghĩa. Để tránh sự
tạo dư thừa (overproduction) cytokinin gây thay đồi h ình dạng cây, các nhà khoa học đã
sử dụng một số loại promoter khác nhau tạo sự biểu hiện gen khi cây ở điều kiện đặc
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 359
thù [1,5,9,10,13] trong đó có promote r SAG12 (tạo sự sinh tổng hợp cytokinin khi mô
đi vào trạng thái lão hoá) [5,13] mà chúng tôi s ử dụng trong nghiên cứu này.
Theo xu hướng trên, ở nghiên cứu này, qua kết hợp công nghệ nuôi cấy mô v à công
nghệ gen, chúng tôi nghiên cứu tái sinh cây in vitro và chuyển gen ipt vào cây hoa cúc
Dendranthema morifolium L. Với hy vọng sự hiện diện v à biểu hiện của gen ipt nói trên
sẽ có tác dụng góp phần làm cho cây hoa lâu héo tàn.
2. Gây nhiễm các mảnh lá với vi khuẩn trong thời gia n 10 phút. Vớt mẫu ra, thấm bớt
dịch vi khuẩn thừa bằng giấy lọc.
3. Nuôi chung mảnh lá với vi khuẩn trong 2 ng ày. Sử dụng môi trường như trên
nhưng có acetosyringone 100 M.
4. Rửa thật sạch vi khuẩn bằng n ước cất và bằng dung dịch cefotaxime 500 mg/l (kết
hợp lắc nhẹ).
5. Vớt mẫu ra, thấm ráo nước và cấy các mảnh lá trên môi trường chọn lọc: như môi
trường ở bước 1 của quy trình nhưng có bổ sung 10 mg/l hygromycin, 500 mg/l
cefotaxime. Thời gian nuôi 15 ngày / chu kỳ chọn lọc và thực hiện 2 chu kỳ.
6. Tiếp tục thực hiện sự chọn lọc thêm 3 chu kỳ (15 ngày/chu kỳ) trên môi trường
chọn lọc như trên nhưng có 5mg/l hygromycin đến khi có chồi tái sinh.
7. Cấy truyền các chồi / cụm chồi tái sinh (cao khoảng 1 cm) sang môi trường MS
không chất sinh trưởng cũng chứa 5mg/l hygromy cin đến khi vươn chồi, thời gian
nuôi khoảng 1 tháng.
Kiểm tra cây chuyển gen
1. Tách các chồi vươn cao (khoảng 2cm) và cấy truyền cũng sang môi tr ường MS
không chất sinh trưởng có 5mg/l hygromycin: theo dõi s ự vươn chồi và ra rễ trong
thời gian khoảng 20 ngày.
2. Nhuộm GUS (Jefferson và ctv, 1987) [7]: ủ mô lá trong thuốc thử GUS qua đ êm ở
370C (tủ ấm).
3. PCR: Sự hiện diện của gen hph, gen gusA và gen ipt được kiểm tra dùng các cặp
mồi đặc hiệu.
Gen hph: HPH1: CGTCGTTCGAGAAGTTTC, HPH2:
TACTTCTACACAGCCATC; chương trình nhiệt: 94 C: 5 phút; 35 chu kỳ (940C: 1
0
phút, 62 0C: 1 phút, 72 0C: 1 phút); 72 0C: 5 phút; khuếch đại đoạn DNA 800 bp.
Gen gusA: GUS1: CCTGTAGAAACCCCAACCCGTG, GUS2:
CCCGGCAATAACATACGGCGTG; chương tr ình nhiệt: 94 C: 3 phút; 30 chu kỳ (940C:
0
30 giây, 560C: 45 giây, 72 0C: 1 phút); 720C: 10 phút; khuếch đại đoạn DNA 365 bp .
Gen ipt: IPT1: TCAACCGGAAGCGGACGACC, IPT2:
GCCATGTTGTTTGCTAGCCAG; chương tr ình nhiệt: 90 C:10 phút; 40 chu kỳ (940C: 15
0
giây, 450C: 45 giây, 720C: 50 giây); 720C: 7 phút; khuếch đại đoạn DNA 355 bp.
khoảng 1,5 - 2cm) đều bị chết nâu trên môi trường MS không chất sinh trưởng có
10mg/l hygromycin. Trên môi trường có nồng độ 5mg/l hygromycin, ở mảnh lá có sự
hình thành mô sẹo nhưng mô sẹo đen dần và không có khả năng tái sinh chồi, và nếu có
sự tái sinh chồi xảy ra th ì chồi rất yếu ớt, xanh nhạt; đối với thử nghiệm tr ên cây con thì
cây tuy cũng có sự phát triển nhất định nh ưng chậm, rễ ra ngắn và có màu nâu đen, các
lá gần gốc ở trạng thái héo nâu, rũ.
Kết hợp thử nghiệm riêng trên giống cúc thí nghiệm và theo tài liệu đã công bố,
chúng tôi chọn nồng độ hygromycin 10mg/l để chọn lọc tế bào chuyển gen ở giai đoạn
đầu (1 - 2 chu kỳ) qua sử dụng phiến lá (không mang phần cuống) l àm vật liệu xử lý
chuyển gen. Tuy vậy, chúng tôi cũng quan tâm cân đối việc gia giảm nồng độ tác nhân
chọn lọc này để đảm bảo vừa có sự tái sinh ở mức t ương đối chấp nhận được vừa không
bị lúng túng do việc tái sinh nhiều cây không phải l à cây chuyển gen. Cũng qua thực tế
triển khai thử nghiệm này trên giống cúc đại đoá vàng Đồng Tháp (giống chịu nhiệt) th ì
giống này lại tỏ ra ít mẫn cảm hơn giống cúc nói trên (số liệu cá nhân).
b. Nghiên cứu nuôi cấy mô tái sinh cây phục vụ nghi ên cứu chuyển gen
Nói chung, trong nghiên cứu nuôi cấy mô và chuyển gen thì việc quan tâm trạng
thái sinh lý của lá là yêu cầu quan trọng. Tuy giống cúc n ày phát triển rất tốt trong bình
nuôi cấy, lá xanh đậm và to tạo thuận lợi cho việc lấy mẫu nh ưng theo kinh nghiệm
nghiên cứu thì việc lấy các lá không ở vị trí ngọn cũng nh ư gần gốc là điều cần thiết
nhất là đối với nghiên cứu chuyển gen. Điều này rất rõ đối với nghiên cứu nuôi cấy mô
và chuyển gen đối với cây hoa cát t ường (tài liệu cá nhân).
Chúng tôi đã bố trí một số môi trường thí nghiệm tái sinh tr ên cơ sở khoáng MS với
các nồng độ NAA 0,1; 0,5 và 1mg/l kết hợp với BA 1 và 2mg/l. Kết quả cho thấy, nói
chung, khi NAA cao (0,5; 1mg/l) kết hợp với BA 1 hoặc 2mg/l thì sự tái sinh chồi xảy
ra theo kiểu phát sinh cơ quan (organogenesis) [22] thông qua giai đo ạn trung gian là
mô sẹo. Ngược lại, khi nồng độ NAA thấp h ơn (0,1mg/l) kết hợp với BA 1 hoặc 2mg/l,
nhất là khi dùng 2mg/l, thì sự tái sinh chồi xảy ra ít qua giai đoạn mô sẹo, một số chồi
có vẻ hình thành trực tiếp từ mảnh lá [20,22,23]. Đặc biệt, sự hình thành trực tiếp này là
thường theo kiểu sinh phôi sô-ma [19], xảy ra nhiều khi chỉ dùng BA từ 1 - 2mg/l mà
không bổ sung NAA (số liệu cá nhân).
Theo một số tác giả nước ngoài nghiên cứu chuyển gen trên cây cúc, sự tái sinh
theo dạng trực tiếp này không có lợi cho nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi
phù hợp ý kiến nêu trên. Về vấn đề này, thực tế nghiên cứu cho thấy khả năng nhận
được cây chuyển gen sẽ cao h ơn khi điều chỉnh sự tái sinh thông qua mô sẹo v ì theo
chúng tôi tế bào chuyển gen, trước hết, cần được nhân lên và như vậy sẽ tạo cơ hội cao
cho sự tái sinh cây mang gen chuyển. Nói chung, hiện nay tr ên thế giới, nghiên cứu nuôi
cấy mô phục vụ nhân giống [2], sự phát sinh h ình thái [4,8, 20,22,26] và ph ục vụ
chuyển nạp gen [17,18] đã và đang được các nhà khoa học quan tâm rất nhiều ở đối
tượng cây trồng này.
c. Quy trình chuyển gen
Như đã nói ở trên do tính rất mẫn cảm với hygromycin nên chúng tôi, như đã trình
bày trong phần quy trình chuyển gen, sự chọn lọc được thực hiện ở giai đoạn đầu với
362 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
10mg/l hygromycin, sau đó giảm xuống còn 5mg/l nhằm tạo cơ hội cho sự tái sinh.
Cách làm này của chúng tôi phù hợp với cách thực hiện của một số tác giả n ước ngoài
vì theo các tác giả ấy, trên giống cúc cụ thể ở công bố, th ì sự tái sinh không thể xảy ra
dù đã có sự chuyển nạp gen (gen hph).
Cũng do quá mẫn cảm đối với hygromycin n ên quá trình chọn lọc tế bào chuyển
gen từ sau xử lý vi khuẩn đến khi nhận được cây thì khá dài. Điều này là do trên môi
trường có hygromycin tế bào tăng sinh chậm và cây khi đã có đầy đủ thân lá phát triển
cũng rất chậm. Và thực tế cũng cho thấy khi đ ã là cây chuyển gen nhưng chúng cũng
phát triển khá chậm trên môi trường có nồng độ hygromycin dù không phải ở mức quá
cao (5mg/l). Theo chúng tôi, đây là đi ểm đáp ứng đặc thù của các giống cúc khi sử dụng
tác nhân chọn lọc là hygromycin. Qua quá trình chuy ển gen, chúng tôi đã nhận được 3
dòng chồi có khả năng vươn cao thành cây. Chúng đư ợc kiểm tra về khả năng sinh
trưởng, ra rễ trên môi trường có hygromycin sẽ được trình bày dưới dây.
Hiện nay, trên thế giới, các nhà khoa học dùng nhiều phương pháp khác nhau [3, 6,
12, 16, 17, 21, 23, 24, 27] để chuyển một số gen khác nhau nhằm tạo ra các đặc tính
mới cho cây cúc như cây chậm lão hoá [5, 9, 10, 13], tạo hoa có màu sắc mới lạ, kháng
virus [27].
d. Kiểm tra khả năng ra rễ trên môi trường có hygromycin
Các cây vươn cao t ừ 2cm trở lên được cấy sang môi tr ường MS không chất sinh
trưởng có 5mg/l hygromycin đ ể theo dõi sự sinh trưởng tiếp theo. So sánh với cây
đối chứng, sự sinh trưởng tiếp tục với biểu hiện k èm theo là có sự hình thành rễ là
hai hiện tượng xảy ra đồng thời đối với cây thực sự l à cây chuyển gen; ngược lại,
cây đối chứng mất hoàn toàn khả năng sinh trưởng dẫn đến sự chết sau đó tr ên cùng
loại môi trường.
e. Thử GUS
Điểm gây sự chú ý ở đây là các dòng chuyển gen đều cho kết quả âm tính đối với thử
nghiệm GUS. Điểm đặc biệt nữa l à không chỉ riêng giống cúc này trên các dòng chuyển
gen khác nhau mà đối với giống cúc khác (đại đoá v àng Đồng Tháp) tạo ra cũng bằng
phương pháp dùng vi khuẩn Agrobacterium và bằng phương pháp chuyển gen khác (là bắn
gen) thì tất cả các dòng chuyển gen cũng đều cho kết quả âm tính (tài liệu của phòng). Theo
một tài liệu nước ngoài, hiện tượng âm tính đối với thử GUS này vẫn chưa giải thích được
khi dùng dòng vi khuẩn LBA 4404 để chuyển nạp v à khi dùng promoter CAMV35S cho
gen gusA. Tuy nhiên, theo chúng tôi, đây ch ỉ là gen chỉ thị nên dù có biểu hiện hay không là
điều không quan trọng, chỉ có điều nó gây cho ng ười nghiên cứu ít nhiều khó khăn khi
muốn kiểm tra nhanh cây chuyển gen khi ch ưa cần làm PCR.
f. Phân tich PCR các gen hph, gusA và ipt
Các dòng cây được kiểm tra bằng PCR chỉ khi chúng đã qua giai đoạn tạo rễ và có
sinh trưởng bình thường trên môi trường có 5mg/l hygromycin. Kết quả phân tích PCR
các gen hph, gusA, ipt v ới các cặp mồi đặc hiệu cho thấy có sự hiện diện của các băng
DNA được khuếch đại tương ứng là 800 bp, 365 bp và 355 bp.
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 363
Hình hàng trên (từ trái sang phải): Phôi sô -ma, chồi hình thành trực tiếp và gián
tiếp từ mảnh lá
Hình hàng dưới (từ trái sang phải): Cụm chồi kháng hygromycin; phân tích PCR
gen hph (800 bp), gen gusA (365 bp) và gen ipt (355 bp)
KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu nuôi cấy tái sinh cây v à chuyển nạp gen trên cây cúc đại đoá vàng
Đà Lạt nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, chúng tôi có một số kết luận sau:
Trong số các môi trường khảo sát, môi trường thích hợp đồng thời cho việc tái sinh
cây và cho nghiên cứu chuyển nạp gen (ở khía cạnh cần sự tái sinh cây thông qua
mô sẹo) là môi trường MS có 0,5mg/l NAA v à 1mg/l BA.
Giống cúc nói trên rất mẫn cảm đối với hygromycin n ên việc chọn lọc áp lực cao
(10mg/l hygromycin) chỉ nên được thực hiện trong 1 - 2 chu kỳ đầu, sau đó cần
giảm xuống (5 - 6mg/l hygromycin) ở giai đoạn tái sinh để có thể nhận đ ược chồi
tái sinh.
Đã nhận được 3 dòng cây cúc mang gen ipt, gen hph và gen gusA. Sự hiện diện của
chúng đã được kiểm tra bằng phân tích PCR.
LỜI CÁM ƠN
Các tác giả xin chân thành cám ơn Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí
Minh đã tài trợ cho nghiên cứu này.
SUMMARY
In vitro plant regeneration and transformation of
Dendranthema grandiflorum L. with the ipt gene for cytokinin
production
Nguyen Huu Ho, Le Tan Duc, Phan Tuong L oc, Pham Duc Tri, Nguyen Thi Thanh
Institute of Tropical Biology
The leaf disks of Dendranthema grandiflorum L. (0.6 x 0.6 cm) were co -cultivated
with Agrobacterium tumefaciens strain LBA 4404. This Agro-strain contains the
plasmid pVDH396 harbouring the ipt gene (with SAG12 promoter) for the isopentenyl
transferase enzyme, the nptII gene (for kanamycin resistance) and the reporter gene
gusA. After 2 day co-cultivation, The leaf disks were transferred to the medium
containing hygromycin of 10 mg/l for sel ection. Through 4 - 5 rounds of selection, 3
independent transformed plants were obtained. The presence of the hph, gusA and ipt
genes was checked by the PCR analyses and / or the GUS assay [In the case of gusA
gene: positive in the PCR analysis; negative for the expression of gene in the different
organs of three in vitro transformed plant lines, in the GUS assay]. These transgenics
are being grown in the greenhouse for further studies.
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 367
MỞ ĐẦU
Thời gian gần đây, công nghệ sinh học đặc biệt l à công nghệ gen đã có những bước
tiến vượt bậc, qua đó các nhà khoa học nhiều nước (Mỹ, Cuba, Đức, Hàn Quốc, Trung
Quốc, Tây Ban Nha…) có thể sản xuất vắc -xin tái tổ hợp từ cây trồng
[9,10,11,15,16,17,19,20]. Hư ớng nghiên cứu sản xuất vắc-xin này được xem là hướng
có tiềm năng vô cùng lớn vì theo tính toán giá thành sản phẩm sẽ thấp hơn rất nhiều so
với giá thành các sản phẩm hiện dùng do có thể sản xuất ở quy mô lớn, lại khá đ ơn giản
trong khâu tổ chức sản xuất, vận chuyển v à bảo quản nguồn vắc-xin, sản phẩm không
chứa các virus gây bệnh cho người… - tạo điều kiện thuận lợi phục vụ tiêm chủng vắc-
xin mở rộng cho người dân ở các nước nghèo và các nước đang phát triển. Nêu đề tài
nghiên cứu này, chúng tôi hy vọng kết quả nghiên cứu của mình, cùng với kết quả
nghiên cứu theo hướng này của các nhà khoa học khác trong nước, sẽ góp phần nhất
định vào sự phát triển của lĩnh vực nghi ên cứu, sản xuất vắc-xin từ các nguồn vật liệu
truyền thống nói chung và vắc-xin được sản xuất từ cây trồng nói ri êng.
Như chúng ta đã biết, nước ta là vùng lưu hành cao của bệnh viêm gan do siêu vi B
(HBV). Tỷ lệ người mang mầm bệnh vào khoảng 10-15 % dân số (trên dưới 10 triệu
người). Tình trạng nhiễm này đã gây ra nhiều hậu quả nghiêm trọng. Bệnh này lây lan
theo hướng đa dạng và phức tạp, trường hợp bệnh mạn tính có thể dẫn đến x ơ gan và
ung thư gan, thời gian chữa trị kéo dài hơn nữa chi phí điều trị còn rất cao so với thu
nhập. Cách tốt nhất là phòng ngừa và một trong các biện pháp ph òng ngừa quan trọng là
chủng ngừa. Tuy nhiên, chi phí cho chủng ngừa bệnh cũng còn khá cao nếu tuân thủ
phác đồ điều trị tiêu chuẩn (tiêm nhiều mũi cách quãng thời gian).
Protein HBsAg của HBV là thành phần rất quan trọng giúp cho HBV bám dính v ào
màng tế bào và sau đó đi vào tế bào và huyết tương người bệnh và huyết tương có chứa
HBsAg là nguồn vật liệu quan trọng để sản xuất thuốc chủng ngừa có nguồn gốc huyết
tương (ngoài huyết tương, vắc-xin này còn được sản xuất từ nấm men, tế b ào động vật
hữu nhũ…). Đã có một số công bố khoa học li ên quan đến nghiên cứu chuyển nạp gen
HBsAg (mã hoá protein vỏ - HBsAg), dùng công nghệ chuyển gen vào nhân và lục lạp
tế bào, vào một số cây trồng, sản xuất sinh khối mô tế b ào cây chuyển gen, chiết tách
protein tinh khiết và nghiên cứu khả năng đáp ứng miễn dịch ở c ơ thể động vật qua tiêm
368 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
chích protein tinh khiết hoặc/và ăn trực tiếp sản phẩm cây chuyển gen. Qua các nghi ên
cứu nêu trên, nhận thấy protein kháng nguyên HBsAg sử dụng qua đường tiêu hoá có
khả năng tạo đáp ứng miễn dịch tốt - mở ra triển vọng nghiên cứu chuyển nạp gen này
vào các cây trồng có bộ phận ăn tươi được như quả, lá, thân, củ… Cũng qua một số
công bố nêu trên, kết quả nghiên cứu còn có mặt hạn chế là lượng protein (sản phẩm
của gen chuyển) trong cây chuyển gen c òn chưa cao nên trong nghiên c ứu này, chúng
tôi đặt vấn đề đưa hệ thống sao chép T7 của thực khuẩ n thể vào nghiên cứu ở đối tượng
thực vật (vấn đề đã gây được sự quan tâm đặc biệt chỉ trong v ài năm gần đây) kết hợp
với promoter PDS tạo sự biểu hiện chuyên biệt ở quả nhằm hướng làm tăng hàm lượng
protein kháng nguyên trong lo ại mô này. Tuy nhiên, ở nghiên cứu này, gen HBsAg với
promoter PDS được nghiên cứu sự tích hợp và biểu hiện trước hết ở cây thuốc lá tuy
rằng protein biểu hiện chuyên biệt ở quả cây thuốc lá không có ý nghĩa sử dụng nh ư
“vắc-xin ăn được” và kết quả nghiên cứu chuyển gen này trên cây cà chua quả bi là kết
quả khoa học mang tính mới mẻ.
Gây nhiễm mô với vi khuẩn trong 10 phút v à nuôi chung mô và vi khu ẩn trong 2
ngày trên môi trường 2; để ngoài sáng (trường hợp cà chua thì môi trường có bổ
sung acetosyringone 100 M).
Rửa vi khuẩn bám vào mô bằng nước cất + 500mg/l cefotaxime, thấm khô nhẹ mô.
Cấy mô lá / lá mầm trên cùng môi trường 2 có 500mg/l cefotaxime và tác nhân
chọn lọc kanamycin 100 mg/l (đối với thuốc lá) hoặc tăng dần từ 20 -50mg/l (đối với
cà chua); để ngoài sáng.
Cấy truyền mô hình thành trên môi trường có kanamycin sang môi tr ường chọn lọc
như trên (thực hiện 3-4 chu kỳ, 15 ngày / chu kỳ) đến khi hình thành chồi và cây con.
Kiểm tra sự hiện diện và biểu hiện của gen chuyển :
Nhuộm GUS (Jefferson và ctv, 1987) [7]: ủ mô lá, chồi trong thuốc thử GUS ở
37°C (tủ ấm) trong 24 giờ.
Đối với cà chua, mảnh lá của cây giả định chuyển gen đ ược cấy trên môi trường số
2 có 50mg/l kanamycin để theo dõi khả năng tạo mô sẹo và tái sinh.
PCR: Sự hiện diện của gen nptII, gen gusA v à gen HBsAg được kiểm tra dùng các
cặp mồi đặc hiệu.
Gen nptII: K1: A CACGCTGAAATCACCAGTCTC, K2:
CTCGTCCTGCAGTTCATTC; khuếch đại đoạn 600 bp; chương trình nhiệt: 94 C: 5 phút;
35 chu kỳ (94C: 1 phút, 55C: 1 phút, 72C: 2 phút); 72C: 7 phút.
Gen gusA: GUS1: CCTGTAGAAACCCCAACCCGTG, GUS2:
CCCGGCAATAACATACGGCGTG; chương tr ình nhiệt: 94C: 3 phút; 30 chu kỳ (94C:
30 giây, 56C: 45 giây, 72 C: 1 phút); 72C: 10 phút; khuếch đại đoạn DNA 365 bp .
Gen HBsAg: Sử dụng cặp mồi: HBV1: CTACACTCGTGGTGGACTTCTC,
HBV2: AACGCCGCAGACACATCC; khu ếch đại đoạn DNA 680 bp; ch ương trình
nhiệt: 94C:10 phút; 40 chu k ỳ (94C: 50 giây, 45 C: 45 giây, 72 C: 50 giây); 72 C: 7
phút; hoặc cặp mồi HBsAg1: ATGGAGAACACAACATC, HBsAg2:
GGATCCTTTTGCGGAAGCCCA; khu ếch đại đoạn DNA 480 bp; ch ương trình nhiệt:
như trên. Sản phẩm PCR gen HBsAg (680 bp) c òn được kiểm tra bằng máy phân tích tự
động Agilent 2100 Bioanalyzer - Automated Analysis System (công ty Agilent
Technologies, Mỹ) với bộ kit DNA 12000 LabChip (công ty Caliper Life Science, Mỹ).
Sự hiện diện của protein HBsAg đ ược kiểm tra bằng máy phân tích Agilent 2100
Bioanalyzer với bộ kit Protein 200 Plus LabChip của các công ty nói tr ên.
Kiểm tra nhanh sự hiện diện của protein HBsAg trong cây chuyển gen bằng que thử
đặc hiệu của công ty Clinotech Diagnostics (Mỹ).
sau đó là các chồi nhỏ được tái sinh. Trên môi trường có nồng độ tác nhân chọn lọc
kanamycin đúng ngưỡng (100mg/l), màu sắc tương phản của chồi tái sinh (màu xanh lục
đậm) và phiến lá (mất màu xanh) là hiện tượng rất dễ nhận biết; điều này cho thấy các chồi
mới hình thành rất có thể là những chồi đã mang gen chọn lọc. Khá nhiều trường hợp có
nhiều hơn một chồi / cây hình thành trên 4 đường cắt (chu vi) của một mảnh lá. Sau đó, các
cây con được cấy truyền sang môi trường nuôi (môi trường 1) cũng có nồng độ kanamycin
như trên. Ở báo cáo này, cây giả định chuyển gen (GĐCG) được định nghĩa là những cây tái
sinh trên môi trường tái sinh có nồng độ chọn lọc ngưỡng, có khả năng phát triển tốt rễ thân lá
trên môi trường nuôi cây (MS không chất sinh tr ưởng) với cùng nồng độ chọn lọc ngưỡng.
Thực ra, các dòng cây tái sinh trên môi trường chọn lọc thường cũng có khả năng phát tiển tốt
rễ thân lá trên môi trường nuôi cây chọn lọc. Tất cả các d òng cây tái sinh qua xử lý chuyển
gen đều đã được kiểm tra theo cách này trước khi được đem phân tích tiếp theo.
Do thuốc lá là một đối tượng có đáp ứng khá cao đối với chuyển gen nên sau một số chu
kỳ chọn lọc chúng tôi đã nhận được khá nhiều dòng cây GĐCG. Theo dự kiến của chúng tôi
thì gen gusA (cùng với gen HBsAg) sẽ không biểu hiện ở mô sinh d ưỡng như lá, thân, rễ do
chúng được điều khiển bởi promoter PDS chỉ tạo sự biểu hiện chuyên biệt ở quả. Kết quả thử
nghiệm GUS đối với các loại mô nói trên đều cho kết quả âm tính với thuốc thử X -gluc, hoàn
toàn phù hợp với dự kiến. Ngược lại, phân tích PCR gen gusA cho kết quả d ương tính với
băng DNA 365 bp.
PCR gen chọn lọc nptII và gen mục tiêu HBsAg cũng đã được thực hiện với các trình tự
DNA được khuếch đại theo thứ tự là 600 bp và 680 bp (đối với cặp mồi HBV1 và HBV2)
hoặc 480 bp (đối với cặp mồi HBsAg1 v à HBsAg2). Sự hiện diện cũng như kích thước đoạn
khuếch đại gen HBsAg (680 bp) qua kiểm tra bằng hệ thống phân tích tự động cho kết quả
khớp với kết quả chạy điện di trên gel agarose.
Cũng bằng hệ thống phân tích tự động n êu trên, một peak protein có trọng lượng phân tử
khoảng 23 kDa được ghi nhận [trọng lượng phân tử của protein thuộc loại nhỏ (S) trong số ba
loại protein cấu thành protein kháng nguyên bề mặt của virus (S, preS1, preS2)]; ngược lại, ở
trường hợp đối chứng thì không có. Như chúng ta đã biết, protein kháng nguyên bề mặt S là
protein quan trọng trong tạo đáp ứng miễn dịch ở cơ thể người và động vật.
Trong nghiên cứu này, do muốn kiểm tra sự chính xác của cấu trúc plasmid, gen v à vai
trò của promoter PDS nên chúng tôi, trước hết, nghiên cứu chuyển gen này vào cây thuốc lá.
Hiện chúng tôi đang cấu trúc gen HBsAg với promoter cấu trúc (constitutive) CaMV35S
trong hệ thống T7 nhằm tạo biểu hiện cao ở tất cả các bộ phận của cây với hy vọng trong
tương lai có thể nghiên cứu chiết tách protein kháng nguyên tinh khiết từ lá cây thuốc lá - một
đối tượng cây trồng cho sinh khối lá rất cao t ương tự như một số nghiên cứu trên thế giới
[9,11,15,20]. Việc sử dụng promoter tạo biểu hiện chuyên biệt ở một bộ phận của cây trong
lĩnh vực nghiên cứu tạo vắc-xin từ cây trồng cũng đã được công bố [4]. Ngoài nghiên cứu sản
xuất vắc-xin viêm gan siêu vi B, hiện nay các nhà khoa học còn đang nghiên cứu tạo vắc-xin
phòng bệnh viêm gan C từ cây trồng [14].
Các cây chuyển gen đang được trồng và theo dõi ở vườn ươm đến khi ra hoa, kết
quả. Chúng tôi sẽ thực hiện một số nghiên cứu liên quan đến sự biểu hiện của gen
HBsAg và gen gusA ở giai đoạn quả.
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 371
Kết quả thử nhanh bằng que thử ELISA cho thấy có sự h ình thành vạch dương tính (test
line) ngoài vạch đối chứng (control line) ở cây chuyển gen. Theo công ty Clinotech
Diagnostics, que thử có độ chính xác rất cao (99,8%), tính đặc hiệu tuyệt đối (100%) đối với
tất cả các subtype virus có các quyết định kháng nguy ên (determinants) phổ biến hiện nay.
Chuyển gen vào cây cà chua bi:
Sau khi được cắt ra từ cây mầm, các lá mầm đ ược nuôi 2 ngày trên môi trường số 2
nhằm làm tăng độ khoẻ (pre-conditioning) trước khi lây nhiễm với vi khuẩn. Các khâu
xử lý, nuôi chung với vi khuẩn, chọn lọc đ ược thực hiện tương tự trường hợp cây thuốc
lá và đã được trình bày ở phần nguyên liệu và phương pháp.
Nói chung, cây cà chua bi có đáp ứng không cao đối với sự chuyển nạp gen mặc d ù
khả năng tái sinh in vitro khá cao (số liệu chưa công bố). Tại thời gian đầu nghi ên cứu,
sau khi nuôi chung, mô đư ợc cấy chọn lọc ngay trên môi trường (MS + 1mg/l NAA + 2
mg/l BA) có nồng độ kanamycin cao - 50 mg/l. Kết quả cho thấy, tất cả các lá mầm đều
chết. Sau đó, chúng tôi áp dụng chế độ chọn lọc với nồng độ kanamycin t ăng dần từ
thấp đến cao - từ 20mg/l đến 50mg/l qua 4 chu kỳ chọn lọc và bước đầu nhận được 2
dòng cây tái sinh.
Mảnh lá của hai dòng cây này, có kích thước khoảng 0,6 x 0,6cm, được cấy trên
môi trường chứa các chất điều ho à sinh trưởng NAA và BA và có 50mg/l kanamycin để
theo dõi khả năng hình thành mô sẹo và tái sinh cây. Kết quả cho thấy, khoảng 7 - 10
ngày sau nuôi cấy có sự hình thành mô sẹo và có sự tái sinh chồi sau khoảng 20 -30 ngày
nuôi cấy; ngược lại, ở lá cây đối chứng, ho àn toàn không có sự hình thành mô sẹo. Phân
tích PCR các gen đang đư ợc thực hiện để khẳng định chúng l à cây chuyển gen.
Như chúng ta đã biết, việc tạo một số “vắc -xin ăn được” nhằm phòng bệnh viêm
gan B và một số bệnh khác [11,16,18,19, 21] đ ã được thực hiện trên một số đối tượng
cây trồng có sản phẩm ăn được trực tiếp (đối với động vật) nh ư khoai tây [1,2,3,8] thì
cây cà chua [6,12] là đối tượng cây trồng được quan tâm vì có thể ăn trực tiếp quả đối
với nghiên cứu tạo đáp ứng miễn dịch cho ng ười. Nghiên cứu của chúng tôi nhằm tiếp
cận xu hướng này.
Hình 1: PCR gen nptII v ới băng. Hình 2: PCR gen HBsAg v ới băng
DNA 600 bp DNA 450 bp
KẾT LUẬN
Qua sử dụng phương pháp chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ,
chúng tôi đã nhận được một số dòng cây thuốc lá và cây cà chua bi mang gen mã hoá
protein kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B. Các dòng nói trên c ơ bản đã qua kiểm
372 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
tra sự hiện diện và biểu hiện của gen chuyển bằng một số phương pháp định tính và sinh
học phân tử. Nghiên cứu này nhằm hướng đến việc tạo “vắc-xin ăn được”.
15. Ramírez, N., et al., 2003. Expression and characterization of an anti -(hepatitis B
surface antigen) glycosylated mouse antibody in transgenic tobacco ( Nicotiana
tabacum) plants and its use in the immunopurification of its target antigen.
Biotechnol. Appl. Biochem . 38: 223-230.
16. Richter, L. J., Y. Thanavala, C. J. Arntzen, H. S. Mason, 2000. Production of
hepatitis B surface antigen in transgenic plants for oral immuniza tion. Nature
Biotechnology 18: 1167-1171.
17. Sakakibara, K. Y., K. Saito, 2006. Genetically modified plants for the promotion of
human health. Biotechnol. Lett. 28: 1983-1991.
18. Smith, M. L., L. Richter, C. J. Arntzen, M. L. Shuler, H. S. Mason, 2003. Structura l
characterization of plant-derived hepatitis B surface antigen employed in oral
immunization studies. Vaccine 21: 4011-4021.
19. Tripurani, S. K., N. S. Reddy, K. R. S. Sambasiva Rao, 2003. Green revolution
vaccines, edible vaccines. African Journal of Biotechnology 2(12): 679-683.
20. Valdés, R., et al., 2003. Hepatiris B surface antigen immunopurification using a
plant-derived specific antibody produced in large scale. Biochemical and
Biophysical Research Communication 310: 742-747.
21. Webster, D. E. et al., 2002. Successful boosting of a DNA measles immunization
with an oral plant-derived measles virus vaccine. Virology 76: 7910-7912.
SUMMARY
Towards evolving production of Hepatitis B vaccine
from plant
Nguyen Huu Ho, Truong Thien Tri, Le Tan Duc,
Pham Thi Hanh, Nguyen Huu Tam
Institute of Tropical Biology
Towards production of vaccine from the plant cultivars, the leaf disks of tobacco
Nicotiana tabacum L. and the cotyledons of tomato Lycopersicon esculentum were co-
cultivated with Agrobacterium tumefaciens strain LBA 4404 containing the HBsAg
gene (with T7 system and PDS promoter) along with the nptII gene (kanamycin
resistance gene) and the reporter gene gusA. After 2 - 3 day co-cultivation, tissues were
transferred to the medium containing kanamyc in (100 mg/l for tobacco, 20-50mg/l for
tomato) for selection. Through 3 -4 cycles of selection, several transgenic plants were
obtained. The presence of the HBsAg, nptII and gusA genes was checked by PCR
analyses and / or GUS assay [GUS assay: positive for the expre ssion in the fruit but
negative in the leaf, stem and root]. The presence of HBsAg protein was carried out by
the Agilent 2100 Bioanalyzer Automated Analysis System and by the quick ELISA test
using the dip stick of the Clinotech Diagnostics Inc. The trans genics are being grown in
the greenhouse for further studies.
374 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
MỞ ĐẦU
Phong lan là loại hoa đẹp do đa dạng về m àu sắc, kiểu dáng; hoa được tiêu thụ phổ
biến trên thế giới và trong nước, kinh doanh hoa lan trong n ước có khả năng đạt doanh
thu rất cao (1 tỷ đồng/ha/năm). Ri êng tại Thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chỉ đạo về phát
triển hoa lan đã được thành lập nhằm xây dựng chương trình giống và xác định vùng
trồng hoa lan với quy mô h àng hoá để đưa cây hoa lan trở thành cây nông nghiệp đô thị
chủ lực của thành phố. Trong tiến trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng, Thành phố Hồ Chí
Minh sẽ phấn đấu mở rộng diện tích trồng lan l ên 200 ha vào năm 2010. Trên th ế giới
cũng như ở nước ta, ngoài việc nhân giống phong lan phục vụ sản xuất bằng ph ương
pháp nuôi cấy mô, việc tạo giống (d òng) mới như giống kháng bệnh (nấm, vi khuẩn,
virus), giống có dạng cây nhỏ (mini) và đáp ứng các tiêu chuẩn đòi hỏi ngày càng cao
của người tiêu dùng như hoa có màu s ắc và đặc tính mới lạ là những vấn đề đang và sẽ
được quan tâm nghiên cứu.
Hiện nay, bên cạnh phương pháp tạo giống cây trồng truyền thống nh ư lai hữu tính,
gây đột biến..., phương pháp công nghệ sinh học (chuyển nạp gen) đ ã và đang chứng tỏ
là công cụ hỗ trợ rất đắc lực cho nghi ên cứu tạo giống và song hành với các phương
pháp tạo giống truyền thống. Đến nay đ ã có khá nhiều giống cây trồng biến đổi gen (gen
nhân) được trồng trên diện rộng nhằm mục đích th ương mại. Nghiên cứu tạo giống bằng
công nghệ gen đã và đang được thực hiện đối với cây lan một phần v ì việc tạo giống lan
bằng phương pháp lai hữu tính tiêu tốn nhiều thời gian và nguồn gen đích mong muốn
dùng lai tạo không phong phú [12].
Trên thế giới, đã có khá nhiều thông báo đề cập chuyển một số gen v ào cây hoa lan
(vào nhân) như gen bar, gen gusA, gen nptII, gen hpt...[11, 14, 16, 17, 18, 24, 25], gen
mã hoá protein vỏ virus (papaya ringspot virus ) [12], trình tự ACC antisense [1]; cũng
đã ghi nhận được công trình nghiên cứu chuyển gen phát sáng gfp [16], luc [5,6]. Cây
phong lan Dendrobium lai (hybrid) mang gen luc phát sáng sinh học (bioluminescent
orchid) đã được rao bán đấu giá trên thị trường thế giới với giá khởi điểm 200.000 đô -la
Singapore [4] [ở lĩnh vực chuyển gen v ào động vật, cá cảnh Zebra - Zebra fish
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 375
Brachydanio rerio mang gen gfp [1] phát sáng có điều kiện (chiếu tia UV) cũng đ ã được
thương mại hoá với giá 5 đô-la/con tại Singapore, Mỹ].
Như chúng ta đã biết, gen gfp (green fluorescent protein gene) t ạo protein GFP có
khả năng phát sáng - được phân lập (từ sứa biển Aequorea victoria), được xác định trình
tự và dòng hoá vào đầu những năm 90 [2, 13]. Từ đó, gen n ày được biến nạp và biểu
hiện ở nhiều loại cơ thể sinh học khác nhau nh ư vi khuẩn, nấm, động vật có / không có
xương sống và thực vật [3, 8, 13]. Ngoài gen gfp, gen luc (mã hoá luciferase, phân l ập
từ đom đóm) [4, 5, 6, 20] cũng tạo sự phát sáng - theo cơ chế khác nhưng ít được nghiên
cứu hơn do kỹ thuật tạo phát sáng mô tế b ào cây chuyển gen phức tạp hơn. Ở lĩnh vực
chuyển nạp gen vào cây trồng, gen gfp được xem là gen chỉ thị sống (vital) [21, 22, 23],
mới [22] và có tiềm năng ứng dụng lớn trong nghi ên cứu [7, 8, 13, 19]. Đã có khá nhiều
công trình nghiên cứu chuyển gen này bằng phương pháp bắn gen [23], bằng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens [10, 13] vào một số cây trồng và có thể nghiên cứu sự biểu
hiện của gen này ở mức ty thể tế bào. Do vậy, theo chúng tôi, gfp là đối tượng gen cần
được xem xét sử dụng trong các nghi ên cứu về biến nạp di truyền.
Đến nay, ở nước ta, chưa ghi nhận được công trình công bố chuyển các gen nói
chung, gen gfp nói riêng vào cây hoa lan. Vì v ậy, theo chúng tôi, nghi ên cứu chuyển
gen gfp cây phong lan (Dendrobium Burana White) là vấn đề cần được quan tâm thực
hiện theo xu hướng chuyển gen này vào một số đối tượng cây hoa trên thế giới hiện nay.
30 giây, 56C: 45 giây, 72 C: 1 phút); 72C: 10 phút; khuếch đại đoạn DNA 365 bp .
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 377
nuôi chung vi khuẩn với lá cây hoa cát tường - có thể lên đến 5 ngày. Nói tóm lại, nồng
độ 30mg/l hygromycin có thể được dùng để chọn lọc giống lan này.
c. Quy trình chuyển gen
Như đã nói ở trên do tính mẫn cảm với hygromycin, tương tự như trường hợp chọn
lọc tế bào lúa bằng hygromycin dùng nồng độ tuần tự từ thấp đến cao, tr ước hết, chúng
tôi dùng nồng độ tương đối thấp 15mg/l để chọn lọc. Trên môi trường này, sau khoảng 1
tháng nuôi chọn, có sự hình thành một số cụm PLB mới tăng sinh nhưng đa số PLB còn
sống nhiều. Sự chọn lọc d ùng 15mg/l hygromycin được thực hiện 2 lần; tiếp theo l à 3
lần chọn lọc trên môi trường có hygromycin 30mg/l. Sau thời gian chọn lọc ( 3 tháng),
một số cụm PLB kháng hygromycin tăng sinh. The o chúng tôi, cần áp dụng chế độ chọn
lọc theo kiểu tăng dần nồng độ hygromycin v ì bản chất tế bào cấu thành PLB không
phải là tế bào mô sẹo nên theo chúng tôi tính đ ộc lập của chúng trong hệ thống không
cao so với tế bào mô sẹo nên chúng cần có điều kiện và thời gian để tăng sinh. Nhận
thấy các mô có khả năng tăng sinh mạnh tr ên môi trường 30mg/l hygromycin (do được
chuyển gen) thì chúng vẫn có khả năng tăng sinh tr ên môi trường có nồng độ
hygromycin cao đến 50mg/l.
d. Kiểm tra khả năng ra rễ tr ên môi trường có hygromycin
Các cây nhận được trên môi trường chọn lọc đúng ngưỡng (30mg/l) được cấy
truyền sang môi trường số 3. Kết quả cho thấy các cây chuyển gen ra rễ v à có sinh
trưởng bình thường trên môi trường có 30 mg/l hygromycin; ng ược lại cây đối chứng bị
chết sau khoảng 15-20 ngày nuôi.
e. Thử GUS
Hầu hết các mô PLB / mô chồi kháng hygromycin đều có kết quả d ương tính với
thuốc thử GUS (hình 1, 2). Cũng ghi nhận có một số tr ường hợp âm tính với thuốc thử
nhưng có kết quả dương tính với PCR gen gusA, tuy nhiên do gen này không là gen
mục tiêu nên chúng tôi không quan tâm l ấy số liệu thống kê là bao nhiêu phần trăm.
Đây là trường hợp thường nhận thấy ở các nghi ên cứu chuyển nạp gen đặc biệt đối với
gen gusA.
f. Phân tích PCR các gen hph, gusA và gfp
Các dòng cây được kiểm tra bằng PCR chỉ khi chúng đ ã qua giai đoạn tạo rễ và có
sinh trưởng bình thường trên môi trường có 30mg/l hygromycin. Kết quả phân tích PCR
các gen hph, gusA, gfp v ới các cặp mồi đặc hiệu cho thấy có sự hiện diện của các băng
DNA được khuếch đại tương ứng là 800 bp, 365 bp và 500 bp (hình 5).
g. Sự phát sáng của mô chuyển gen
Các cụm PLB và chồi nhỏ được để trong tối trong khoảng thời gian 1 tháng (để
giảm hoặc hạn chế sự hình thành diệp lục tố) được chiếu tia cực tím sóng d ài 365nm.
Kết quả cho thấy có thể ghi nhận đ ược sự phát sáng xanh lục bằng mắt th ường và sự
phát sáng này được chụp qua kính lúp bằng máy ảnh kỹ thuật số hoặc máy ảnh thuộc hệ
thống kính hiển vi huỳnh quang Nikon (hình 3, 4).
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 379
1 2 3 4
Hình 1, 2: Thử GUS dương tính ở PLB và chồi. 3, 4: PLB và chồi phát sáng xanh lục
qua xử lý tia UV sóng dài 365 nm. 5: Kết quả PCR dương tính gen gfp v ới băng DNA
được khuếch đại 500 bp
KẾT LUẬN
Qua sử dụng chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 chứa plasmid
pCAMBIA 1303 mang gen gfp5, gen gusA và gen hph để chuyển gen vào PLB cây hoa
phong lan Dendrobium Burana White, chúng tôi đ ã nhận được một số dòng cây chuyển
gen. Các dòng cây này có sinh trưởng in vitro bình thường trên môi trường có
hygromycin 30mg/l, nhuộm xanh với thuốc thử GUS v à có sự phát sáng màu xanh lục
khi được xử lý bằng tia UV sóng d ài (của đèn cực tím) hoặc sóng lam của hệ thống kính
hiển vi huỳnh quang.
LỜI CÁM ƠN
Các tác giả xin chân thành cám ơn Vi ện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tài
trợ cho nghiên cứu này.
6. Chia T. F., Chan Y. S., Chua N. H. 1994. The firefly luciferase gene as a non -
invasive reporter for Dendrobium transformation. The Plant Journal 6(3): 441-446.
7. Davis S. J., Vierstra R. D. 1998. Sol uble, highly fluorescent variants of green
fluorescent protein (GFP) for use in higher plants. Plant Molecular Biology 36:
521-528.
8. Hu W., Cheng C. 1995. Expression of Aequorea fluorescent protein in plant cells.
FEBS Lett. 369: 331-334.
9. Jefferson, R. A., T. A. Kavanagh, B. W. Bevan, 1987. GUS fusion: -glucuronidase as
a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO 6: 3901-3907.
10. Kim C. K., Chung J. D., Park S. H., Burrell A. M., Kamo K. K., Byrne D. H. 2004.
Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Rosa hybrida using the green
fluorescent protein gene. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 78(2): 107-111.
11. Knapp J. E., Kausch A. P., Chandlee J. M. 2000. Transformation of three genera of
orchid using the bar gene as a selective marker. Plant Cell Rep. 19: 893-898.
12. Kuehnle A. R., Sugii N. 1992. Transformation of Dendrobium orchid using particle
of protocorms. Plant Cell Rep. 11: 484-488.
13. Leffel S. M., Stephen A. M., Stewart Jr. C. N. 1997. Application of green
fluorescent protein in plants. BioTechniques 23(5): 912-918.
14. Men S., Ming X., Liu R., Wei C., Li Y. 2003. Agrobacterium-mediated genetic
transformation of a Dendrobium orchid. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 75: 63-71.
15. Murashige, T., F. Skoog, 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay
with tobacco tissue culture. Physiol. Plant .15: 473-497.
16. Nan G. L., Kuehnle A. R. 1995. Factors affecting gene delivery by particle
bombardment of Dendrobium orchids. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 31: 131-136.
17. Nan G. L., Kuehnle A. R. 1995. Genetic transformation of Dendrobium (orchid).
In: Bajaj Y. P. S. (ed). Biotechnology in Agriculture and Forestry . Vol. 34, Berlin:
Spinger Verlag, pp. 149-160.
18. Nan G. L., Kuehnle A. R., Kado C. I. 1997. Dendrobium orchids contain an inducer
of Agrobaterium virulence genes. Physiol. Mol. Plant Pathol . 51: 391-399.
19. Niedz R. P., Sussman M. R., Satterlee J. S. 1995. Green fluorescent protein: an in
vitro reporter of plant gene expression. Plant Cell Reports 14: 403-406.
20. Ow D. W., Wood K. V., DeL uca M., de Wet J. R., Helinski D. R., Howell S. H.
1986. Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant cells
and transgenic plants. Science 234: 856-859.
21. Pang S., DeBoer D. L., Wan Y., Ye G., Layton J. G., Neher M. K., Armstrong C .
L., Hinchee M. A. W., Fromm M. E. 1996. An improved green fluorescent protein
gene as a vital marker in plant. Plant Physiol. 112: 893-900.
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 381
22. Sheen J., Hwang S., Niwa Y., Kobayashi H., Galbraith D. W. 1995. Green -fluorescent
protein as a new vital marker in plant cells. The Plant Journal 8: 777-784.
23. Vain, P., Worland B., Kohli A., Snape J. W., Christou P. 1998. The green
fluorescent protein (GFP) as a vital screenable marker in rice transformation.
Theor. Appl. Genet. 96, 164-169.
24. Yu H., Yang S. H., Goh C. J. 2000. DOH1, a class 1 knox gene, is required for
maintenance of the basic plant architecture and floral transition in orchid. Plant Cell
12: 2143-2159.
25. Yu H., Yang S. H., Goh C. J. 2001. Agrobacterium-mediated transformation of a
Dendrobium orchid with the class 1 knox gene DOH1. Plant Cell Rep. 20: 301-305.
SUMMARY
Genetic transformation of Dendrobium Burana White
with the gfp gene through Agrobacterium tumefaciens
MỞ ĐẦU
Như chúng ta đã biết, gen ipt (phân lập từ vi khuẩn Agrobacterium) l à gen tạo ra
enzyme isopentenyl transferase và c ũng là enzyme quan trọng của con đường sinh
tổng hợp cytokinin tro ng thực vật [4,5,7,20,22]. Đối với sự l ão hoá ở thực vật,
cytokinin có vai trò điều hoà theo hướng tích cực là làm chậm quá trình này
[6,7,9,10,13,16,20].
Nghiên cứu chuyển gen ipt v ào thực vật đã được thực hiện thành công trên một
số đối tượng cây trồng như Arabidopsis, thu ốc lá, Petunia, bông cải, cải x à lách,
cúc,...[6,7,9,10,12,13,15] và k ết quả cho thấy cây chuyển gen có lá xanh t ươi hơn, ở
các lá già do diệp lục tố chậm bị phân huỷ n ên lá chậm chuyển sang m àu vàng. Điều
này mở ra triển vọng khai thác tiềm năng của gen n ày trong nghiên cứu chuyển gen
tạo giống cây trồng chậm l ão hoá, tăng sinh trưởng và năng suất [10,17]. Ngoài ra,
gen ipt còn có khả năng làm tăng hàm lượng hợp chất thứ cấp ở cây d ược liệu
chuyển gen [19] và có thể được sử dụng như gen có khả năng thay thế cho gen chọn
lọc [8].
Trước đây, gen chuyển ipt tạo tình trạng dư thừa cytokinin (overproduction) dẫn
đến sự thay đổi kiểu hình của cây [9] nhưng gần đây tình trạng này đã được khắc phục
do sử dụng các promoter như cor15a, SAG12... chỉ tạo biểu hiện trong những điều kiện
nhất định [12,13,15].
Ở cây bắp cải, trên đồng ruộng, các lá già gần gốc thường chuyển vàng sớm (mất
diệp lục tố do lão hoá) tạo điều kiện cho nấm bệnh xâm nhập; ngo ài ra, việc giữ sản
phẩm sao cho được xanh tươi lâu trong quá trình thu hoạch, vận chuyển và bảo quản là
yêu cầu rất quan trọng đối với các nh à trồng trọt và kinh doanh cây trồng này.
Nội dung bài này, chúng tôi trình bày k ết quả bước đầu việc nghiên cứu chuyển gen
ipt vào cây bắp cải nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens nhằm khả năng làm giảm
các ảnh hưởng không tốt do hiện t ượng lão hoá gây ra như đã nói ở trên và đây là công
trình đầu tiên về nghiên cứu chuyển gen này vào cây bắp cải.
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 383
Trước hết, hạt được rửa với nước cất vô trùng 2 lần, khử trùng bằng nước Javel
nồng độ 50% (v/v) trong 7 phút. Sau đó, hạt đ ược rửa sạch bằng nước vô trùng 3 lần và
được gieo trên môi trường.
Môi trường nuôi cấy mô và thử tính chống chịu đối với kháng sinh hygromycin
1. Môi trường gieo hạt và nuôi cây: khoáng MS (Murashige - Skoog, 1962), vitamin
Morel (Morel, 1948), không có ch ất điều hoà sinh trưởng.
2. Môi trường tái sinh chồi từ lá mầm: khoáng MS, vitam in B 5 (Gamborg và cs.,
1968) có 0,1mg/l IBA , 3 mg/l BA.
3. Môi trường vươn chồi và tạo rễ: như môi trường số 1.
4. Môi trường thử tính chống chịu đối với kháng sinh hygromycin: nh ư môi trường 1
nhưng có hygromycin từ 5 - 10mg/l.
5. Các loại môi trường trên có đường 30g/l, thạch 9g/l, pH 5,8.
6. Điều kiện nuôi cấy: 12 giờ chiếu sáng/ng ày, nhiệt độ 23 - 25oC.
Dòng vi khuẩn và môi trường nuôi cấy
Các lá mầm, từ cây mầm 7 - 10 ngày tuổi trên môi trường MS không chất điều ho à
sinh trưởng, được sử dụng làm vật liệu chuyển gen.
Tóm tắt quy trình chuyển gen
1. Nuôi cấy lá mầm trên môi trường số 2 (0,1mg/l IBA, 3mg/l BA) trong thời gian
2 ngày.
384 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
2. Gây nhiễm các lá mầm với dịch vi khuẩn (OD= 0,6 -1) trong thời gian 15 phút. Vớt
mẫu ra, thấm bớt dịch vi khuẩn thừa bằng giấy lọc.
3. Nuôi chung lá mầm với vi khuẩn trong 2 ng ày. Sử dụng môi trường như trên nhưng
có acetosyringone 50 M.
4. Rửa thật sạch vi khuẩn bằng n ước cất và bằng dung dịch cefotaxime 500 mg/l (kết
hợp lắc nhẹ, 15 phút).
5. Vớt mẫu ra, thấm ráo nước và cấy các mảnh lá trên môi trường số 2 bổ sung 5-10 mg/l
hygromycin, 250mg/l cefotaxime. Thời gian nuôi 15 ngày/ chu kỳ chọn lọc và thực
hiện 3 chu kỳ chọn lọc dùng tuần tự 5-10-5mg/l hygromycin.
6. Cấy truyền các chồi/ cụm chồi tái sinh (cao từ 1 -1,5cm) sang môi trường MS không
chất sinh trưởng cũng chứa 5mg/l hygromycin đến khi vươn chồi, thời gian nuôi
khoảng 1 tháng.
Kiểm tra cây chuyển gen
1. Tách các chồi vươn cao (khoảng 2cm) và cấy truyền sang môi trường MS không
chất sinh trưởng có 5mg/l hygromycin: theo dõi s ự vươn chồi và ra rễ trong thời
gian khoảng 20 ngày.
2. Mảnh lá cây giả định chuyển gen đ ược nuôi cấy trên môi trường số 2 có 5mg/l
hygromycin và theo dõi kh ả năng hình thành mô sẹo và tái sinh sau khoảng 20-30
ngày (so với đối chứng).
3. Nhuộm GUS (Jefferson và cs., 1987) [11]: ủ mô lá trong thuốc thử GUS qua đ êm ở
37°C (tủ ấm).
4. PCR: Sự hiện diện của gen hph, gen gusA và gen ipt được kiểm tra dùng các cặp
mồi đặc hiệu.
Gen hph: HPH1: CGTCGTTCGAGAAGTTTC, HPH2:
TACTTCTACACAGCCATC; chương tr ình nhiệt: 94 C: 5 phút; 35 chu kỳ (94C: 1
phút, 62 C: 1 phút, 72 C: 1 phút); 72 C: 5 phút; khuếch đại đoạn DNA 800 bp.
Gen gusA: GUS1: CCTGTAGAAACCCCAACCCGTG, GUS2:
CCCGGCAATAACATACGGCGTG; chương tr ình nhiệt: 94 C: 3 phút; 30 chu kỳ (94C:
30 giây, 56C: 45 giây, 72 C: 1 phút); 72C: 10 phút; khuếch đại đoạn DNA 365 bp.
Gen ipt: IPT1: TCAACCGGAAGCGGACGACC, IPT2:
GCCATGTTGTTTGCTAGCCAG; chương trình nhiệt: 90 C: 10 phút; 40 chu kỳ (94C:
15 giây, 45C: 45 giây, 72 C: 50 giây); 72C: 7 phút; khuếch đại đoạn DNA 355 bp.
ex vitro. Sau 7-10 ngày nuôi cấy hạt trên môi trường gieo hạt, các lá mầm đ ược sử dụng
làm vật liệu chuyển gen.
Qua tham khảo một số tài liệu công bố về nuôi cấy mô cây bắp cả i trong và ngoài
nước, chúng tôi đã bố trí một số công thức môi tr ường với nồng độ chất điều ho à sinh
trưởng (ĐHST) IBA, BA khác nhau. Kết quả cho thấy, đối với giống F 1 TN5, tổ hợp
ĐHST IBA (0,1mg/l + BA 3mg/l) được xem là tổ hợp cho tỷ lệ tái sinh chồi rất cao ( 60%).
Theo một số nghiên cứu trong và ngoài nước [1,3,18,21], nồng độ BA cao (2-4mg/l) được
xem là thích hợp, tạo sự tái sinh với tần số cao; nồng độ 3mg/l BA trong nghiên cứu của
chúng tôi phù hợp với khoảng dao động nồng độ BA sử dụng của các tác giả n êu trên.
Qua thử nghiệm tính chống chịu tự nhi ên của mô đối với kháng sinh hygromycin,
kết quả cho thấy mô sẹo cũng nh ư chồi/ cây con rất mẫn cảm đối với kháng sinh n ày
(nồng độ dùng chọn lọc chỉ từ 5-10mg/l) tương tự như trường hợp cây bông cải [2];
ngược lại, đối với giống bắp cải B. oleracea cv. Alboglabra [3] và đ ối giống cải
Brassica rapa [13] thì nồng độ hygromycin sử d ụng cao hơn, theo thứ tự là 30mg/l và
25mg/l.
Lá mầm, sau khi xử lý và nuôi chung với vi khuẩn, được cấy trên môi trường tái
sinh có bổ sung 5mg/l hygromycin. Nhận thấy sau khoảng 7-10 ngày nuôi cấy, một số lá
mầm có phần gốc cuống ph ình to và khoảng một tháng sau có sự tái sinh chồi (h ình 1);
ngược lại, toàn bộ lá mầm đối chứng đều chết.
Các chồi/ cụm chồi tái sinh trên môi trường có 5mg/l hygromycin được cấy truyền
tiếp sang môi trường có nồng độ hygromycin cao h ơn (10mg/l) để sự chọn lọc được triệt
để hơn. Kết quả nghiên cứu cho thấy có một số chồi chết ở giai đoạn chọn lọc tiếp theo
này. Các chồi/ cụm chồi tuy tái sinh tr ên môi trường có hygromycin nh ưng khả năng
phát triển của chúng không nhanh tr ên môi trường có 10mg/l hygromycin. Do vậy, ở
chu kỳ chọn lọc thứ ba, chúng tô i chỉ dùng nồng độ hygromycin 5mg/l (như đối với chu
kỳ 1) để tiếp tục kiểm tra tính kháng của chồi/cây. Đến nay, chúng tôi đ ã nhận được một
số dòng chồi/ cây có khả năng sinh tr ưởng bình thường trên môi trường có 5mg/l
hygromycin (dòng cây gi ả định chuyển gen).
Như đã nói ở trên, do tính mẫn cảm cao đối với hygromycin n ên sau khi qua 3 chu
kỳ chọn lọc, chúng tôi cấy truyền chồi/cây sang môi tr ường nuôi cây không có
hygromycin để chồi/cây phát triển nhanh.
Các dòng giả định chuyển gen được kiểm tra một lần nữa qua sử dụng các mảnh lá
để cấy trên môi trường tái sinh có 5mg/l hygromycin nhằm theo dõi khả năng tạo mô
sẹo và tái sinh. Kết quả cho thấy, các mảnh lá cây giả định chuyển gen có khả năng h ình
thành mô sẹo và tái sinh chồi; ngược lại, mảnh lá cây đối chứng ho àn toàn không có khả
năng tạo mô mới và chết sau đó.
Mô lá của các chồi có khả năng phát triển li ên tục trên môi trường có hygromycin
được nhuộm với thuốc thử X -Gluc để kiểm tra sự biểu hiện của gen gusA. Kết quả cho
thấy chúng có màu xanh đặc trưng với thuốc thử (hình 2); ngược lại, các mẫu lá cây đối
chứng đều âm tính ở kết quả thử GUS n ày. Cũng ghi nhận một số mô lá âm tính với
thuốc thử dù chồi có sự phát triển bình thường trên môi trường chọn lọc và theo chúng
386 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
tôi có thể đây là do hiện tượng im lặng của gen gusA thường gặp trong nghiên cứu
chuyển nạp gen này.
Chúng tôi đang tiến hành phân tích PCR nhằm kiểm tra sự hiện diện của các gen
hph, gusA, ipt với các mồi đặc hiệu như đã ghi trong phần nguyên liệu và phương pháp.
Hình 1: Chồi chuyển gen tái sinh tr ên Hình 2: Mẫu lá/ chồi cây chuyển gen
môi trường chọn lọc có 5 mg/l dương tính với thuốc thử GUS
hygromycin
LỜI CÁM ƠN
Các tác giả xin chân thành cám ơn Trung tâm Phát tri ển Khoa học - Công nghệ Trẻ
Thành Đoàn Thành phố Hồ Chí Minh (Chương trình Vườn ươm sáng tạo) đã tài trợ cho
nghiên cứu này.
SUMMARY
Preliminary study on transfer of ipt gene into cabbage
(Brassica oleracea var. capitata) for retardation of senescence
Some transgenic cabbage plants were obtained via the Agrobacterium tumefaciens
LBA 4404 carrying the ipt gene (for cytokinin production), gusA gene (as reporter gene
for -glucuronidase) and hph gene (for hygromycin resistance). The cotyledons of the
seedlings (7-10 days after seed germination) were cut at the basal and co -cultivated with
Agrobacterium tumefaciens . After three cycles of selection on the MS (with IBA, BA)
medium containing hygromycin (5 -10mg/l), several hygromycin resistant calli / shoots
were induced. They expressed the GUS activity and the presence of transgenes in the
plant genome was performed by PCR analysis .
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 389
MỞ ĐẦU
Ngô (Zea mays L.) là cây lương thực quan trọng trên thế giới cũng như ở nước ta.
Ngoài việc dùng làm lương thực cho con người, ngô còn được dùng làm thức ăn trong
chăn nuôi gia súc, gia c ầm, làm nguyên liệu cho công nghiệp sản xuất r ượu, cồn, tinh
bột… Ngô là nguồn xuất khẩu thu ngoại tệ lớn đối với một số n ước như Mỹ, Pháp,
Argentina, Trung Quốc…
Trong nghiên cứu nuôi cấy mô và chuyển gen, các nhà khoa học thường dùng vật
liệu phôi non (10-20 ngày sau thụ tinh) [3,4,5,6,16,18,22] để nghi ên cứu do có khả năng
đáp ứng cao với nuôi cấy (tỷ lệ tạo mô sẹo sinh phôi v à tái sinh cao). Tuy nhiên, thường
khó chủ động trong việc thu phôi non v à cần nhiều thời gian, công sức cho công việc
tách lấy phôi. Để chủ động h ơn trong nghiên cứu, chúng tôi dùng đốt thân (nodal
section) và chồi đỉnh cây in vitro (có nguồn gốc từ hạt tươi trưởng thành) như nguyên
liệu dùng cho nghiên cứu nuôi cấy mô và để tạo mô tế bào thích hợp dùng chuyển nạp.
Trước đây, chọn tạo giống ngô đ ược thực hiện thông qua ph ương pháp lai tạo, gây
đột biến. Hiện nay, công nghệ sinh học đ ã có nhiều đóng góp quan trọng trong tạo giống
cụ thể là nhờ công nghệ gen nhiều giống ngô chuyển gen với đặc tính quý đ ã được tạo
ra và được thương mại hoá như giống ngô kháng sâu, kháng thuốc trừ cỏ… . Theo các
nhà nghiên cứu, công nghệ chuyển nạp gen ng ày càng có vị trí quan trọng trong công
tác giống ngô đặc biệt trong tình trạng vốn gen tự nhiên cây ngô còn nhiều hạn chế.
Sự thiếu hụt dinh dưỡng sắt là một vấn đề gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến khoảng
30 % dân số thế giới. Sự thiếu máu do thiếu hụt sắt có ảnh hưởng xấu hoặc rất xấu đến
trẻ em, thai phụ và phụ nữ sau khi sinh. Ở nước ta, theo điều tra tại các v ùng nghèo tỷ lệ
trẻ thiếu máu, thiếu sắt lên tới hơn 70%, chủ yếu do bữa ăn thiếu chất dinh d ưỡng và
nghèo thành phần; sự thiếu sắt có tác động xấu đến sự phát triển về thể chất v à trí tuệ
của trẻ. Mặc dù việc bổ sung sắt vào thực phẩm hoặc khuyến cáo sử dụng thuốc đ ã tỏ ra
có hiệu quả nhằm kiểm soát nạn thiếu hụt sắt nh ưng các biện pháp nói trên khó có thể
áp dụng nhanh chóng tại các n ước còn nghèo nàn lạc hậu vì chi phí phát sinh cao và s ố
lượng các chương trình chăm sóc sức khoẻ ban đầu còn hạn chế. Một số cây họ Đậu,
cây cải spinach… được biết chứa hàm lượng sắt cao nhưng cũng chứa nhiều acid oxalic
và các hợp chất có nhiều acid phytic (phytate -like substances) gây hạn chế hấp thu sắt.
390 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
Ferritin - protein dự trữ sắt được phân bố rộng rãi trong động vật, thực vật và vi
khuẩn. Ferritin của thực vật gồm 24 tiểu phần (subunit) có thể chứa từ 4.000 - 4.500
nguyên tử sắt ở khoang trung tâm phân tử (central cavity) [10,11]. Các đoạn cDNA
ferritin thực vật đã được dòng hóa để nghiên cứu từ nhiều nguồn khác nhau nh ư trụ dưới
lá mầm đậu nành Glycine max [10], hạt non đậu Pisum sativum (pea), lá non đậu Vigna
unguiculata, hạt đậu Phaseolus vulgaris (French bean)… Ferritin có hai nhi ệm vụ chính
trong tế bào sống; một là, cung cấp sắt để tổng hợp các protein chứa sắt nh ư ferredoxin
và các cytochrome, hai là, chống các tác hại gây ra bởi các gốc tự do tạo ra bởi sự t ương
tác sắt / dioxygen. Các nghi ên cứu gần đây cho thấy ferritin có thể đ ược sử dụng để xử
lý các trường hợp bệnh thiếu máu ở chuột. Các phát hiện tr ên cho phép các nhà khoa
học đưa ra các nghiên cứu, bằng con đường công nghệ di truyền, tạo ra các cây ngũ cốc
chuyển gen giàu sắt nhằm góp phần nhất định v ào việc giải quyết nạn thiếu hụt sắt ở
con người và cho đến nay, người ta đã tạo ra được một số dòng lúa indica và japonica
với hàm lượng sắt cao hơn gấp nhiều lần [11].
Nhằm tiếp cận hướng tạo giống dùng phương pháp công ngh ệ sinh học, ở nghiên
cứu này, chúng tôi nêu nội dung nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh cây từ mô đốt
thân và chồi đỉnh và bước đầu ứng dụng trong chuyển nạp gen tạo ferritin nhờ vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens với hy vọng cải thiện hàm lượng sắt ở cây ngô.
Môi trường nuôi cấy chồi đỉnh (kích th ước 0,4 mm) thân cây in vitro:
3. MS + 0 - 0,05mg/l BA
4. MS + 0,05mg/l NAA + 1 -2mg/l BA
5. MS + 0,5mg/l 2,4-D + 1mg/l BA
Môi trường tạo vườn cây từ cụm chồi (môi trường số 6): MS + 0,1mg/l NAA + 1 mg/l BA
Môi trường nuôi cây: MS không chất sinh tr ưởng.
Điều kiện nuôi cấy: 9 giờ chiếu sáng/ngày, nhiệt độ 25-28oC.
Dòng vi khuẩn và môi trường nuôi cấy:
Sử dụng dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 chứa plasmid pITB-
FERRITIN (do TS. Nguyễn Hữu Tâm thiết kế) mang gen tạo protein gi àu chất sắt
(ferritin) và gen kháng hygromycin hph.
Môi trường giữ giống vi khuẩn là môi trường LB có 50mg/l kanamycin v à 25mg/l
streptomycin. Để nhân giống cho nghiên cứu chuyển gen, vi khuẩn đ ược nuôi cấy lắc
qua đêm trong môi trường khoáng AB (Chilton v à cs., 1974) cũng chứa các kháng sinh
như trên. Nhiệt độ nuôi cấy: 25- 28oC.
Quy trình chuyển gen:
Các cụm mô đang trong quá tr ình tái sinh (kích thước 0,5 x 0,5mm) hình thành từ
đốt thân hoặc/và chồi đỉnh trên môi trường có 0,5mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (môi trường
số 1) được dùng làm vật liệu chuyển gen.
Tóm tắt quy trình chuyển gen:
1. Nuôi các cụm mô trên môi trường số 1 trong thời gian 2 ng ày.
2. Tạo vết thương bằng cách châm đầu lưỡi dao mổ nhọn vào mô, lây nhiễm mô với
vi khuẩn trong thời gian 10 phút. Vớt mẫu ra, thấm bớt dịch vi khuẩn thừa bằng
giấy lọc.
3. Nuôi chung mô với vi khuẩn trong 2 ngày (sử dụng môi trường số 1 có bổ sung
acetosyringone 100 M).
4. Rửa thật sạch vi khuẩn bằng nước cất và bằng dung dịch cefotaxime 500 mg/l (kết
hợp lắc nhẹ).
5. Vớt mẫu ra, thấm ráo nước và cấy mô trên môi trường chọn lọc: môi trường số 1 có
nồng độ hygromycin 20mg/l hygromycin, 500 mg/l cefotaxime. Thời gian chọn lọc
15 ngày.
6. Tiếp tục chọn lọc tế bào thêm 3 chu kỳ (15 ngày / chu kỳ) trên môi trường chọn lọc
như trên nhưng có 30mg/l hygromycin.
7. Cấy truyền các mô sang môi trường số 6 cũng bổ sung 30 mg/l hygromycin, thời
gian nuôi 20-30 ngày.
392 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
cứu của chúng tôi cho thấy có vấn đề khó khăn trong việc sử dụng mô sẹo phôi hoá để
nghiên cứu chuyển gen dùng vi khuẩn là mô sẹo sau khi xử lý vi khuẩn, nuôi chung, rửa
và cấy chọn lọc thường trở nên nhão và chết với tỷ lệ rất lớn. Chúng tôi đang tiếp cận
hướng sử dụng phương pháp bắn gen nhằm loại bỏ một số yếu tố có thể gây ảnh h ưởng
xấu trên mô như thao tác cơ học xử lý vi khuẩn, rửa, thấm khô mô… v à cũng có thể sự
khó khăn trên đây là do yếu tố giống. Khả năng tạo mô sẹo phôi hoá với tần số thấp
cũng như duy trì nó trong thời gian dài mà không giảm khả năng tái sinh đã khiến một
số tác giả trên thế giới tiếp cận phương pháp dùng chồi đỉnh (intact tisue) để nghi ên cứu
chuyển gen [12,13]. Điểm thuận lợi của chúng tôi khi sử dụng hệ thống mô sẹo đang
trong quá trình tái sinh là lo ại mô này không giảm khả năng tái sinh trong thời gian dài
cấy truyền. Được biết đến nay, đã có nhiều phương pháp chuyển gen được áp dụng trên
đối tượng cây ngô như bắn gen [16,18,21,22], d ùng vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens [12,13,15, 20], dùng xung đi ện [5,7,9,17,19] nhưng hiện nay chỉ hai
phương pháp bắn gen và dùng vi khuẩn là còn được áp dụng nhiều.
4 5
1 2 3
Hình 1: Mô sẹo có khả năng sinh phôi d ùng chuyển gen. 2: Cụm mô kháng hygromycin.
3: Thử GUS dương tính đối với mô chồi. 4: Kết quả PCR d ương tính gen hph với băng
DNA 800 bp. 5: Kết quả PCR dương tính gen tạo ferritin với băng DNA 700 bp
KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu nuôi cấy đốt thân, chồi đỉnh v à chuyển nạp gen trên giống ngô Nếp
Tiền Giang, chúng tôi có một số kết luận sau:
Trong số các môi trường khảo sát, môi trường thích hợp tạo loại mô vừa mang khả
năng tái sinh cao vừa có thể được dùng cho nghiên cứu chuyển nạp gen là môi
trường MS có 0,5mg/l 2,4-D và 1mg/l BA. Khả năng tái sinh cây đối với loại mô
này có thể được duy trì trong thời gian dài.
Chồi đỉnh qua nuôi cấy có thể phát triển theo hướng tạo dạng mô sẹo mang phác
thể chồi hoặc theo hướng tạo cụm chồi tuỳ theo loại chất điều ho à sinh trưởng và
nồng độ được sử dụng.
Qua chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen hph và gen tạo
protein giàu sắt (ferritin), bước đầu chúng tôi đã chọn được 2 dòng mô ngô có khả
năng sinh trưởng tốt trên môi trường có 30mg/l hygromycin.
LỜI CÁM ƠN
Các tác giả xin chân thành cám ơn Chương trình Nghiên cứu cơ bản đã tài trợ cho
nghiên cứu này.
394 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
1. Trần Thị Dung, Trần Trung Hiếu, 2000. Bước đầu chuyển gen vào cây bắp (Zea
mays L.) nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens . Tập san KHKT Nông Lâm
nghiệp 2: 59-61, Trường ĐH. Nông Lâm T/p HCM.
2. Nguyễn Hữu Hổ, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Tâm, Nguyễn Văn Uyển, 2003. Một số
nghiên cứu chuyển gen vào cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) và cây ngô (Zea
mays L.). Tuyển tập Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà
Nội, 16-17/12/2003, tr. 1096-1101. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
3. Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển, Z. Y. Tkaschuc, L. V. Tkaschuc, 1995. T ạo
cụm chồi cây ngô (Zea mays L.) từ đỉnh sinh trưởng và phôi hạt nuôi cấy in vitro.
Tạp chí Khoa học và Công nghệ 4: 6-9.
4. Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hàm, Phạm Minh Thợi, Đỗ Năng Vịnh, 2003. Nghiên
cứu xây dựng hệ thống tái si nh sử dụng cho biến nạp gen cây ngô. Tuyển tập Báo
cáo khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội, 16-17/12/2003, tr.
820-825. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
5. D’Halluin, K., E. Bonne, M. Bossut, M. De Beuckeleer, J. Leemans, 1992.
Transgenic maize plants by tissue electroporation. The Plant Cell 4: 1495-1505.
6. Danson, J. W., M. Lagat, M. Mbogori, 2006. Screening tropical maize lines for the
production and regeneration of friable and embryogenic type II callus. African
Journal of Biotechnology 5(230): 2367-2370.
7. Fennell, A., R. Hauptmann, 1992. Electroporation and PEG delivery of DNA into
maize microspores. Plant Cell Reports 11: 567-570.
8. Frame, B. R. et al., 2002. Agrobacterum tumefaciens -mediated transformation of
maize embryos using a standard binary vector system. Plant Physiol. 129: 13-22.
9. Fromm, M. E., L. P. Taylor, V. Walbot, 1986. Stable transformation of maize after
gene transfer by electroporation. Nature 319: 791-793.
10. Goto, F., T. Yoshihara, H. Saiki, 1998. Iron accumulation in tobacco plants
expressing soybean ferritin gene. Transgenic Research 7: 173-180.
11. Goto, F., T. Yoshihara, N. Shigemoto, S. Toki, F. Takaiwa, 1999. Iron fortification
of rice seed by the soybean ferritin gene. Nature Biotechnology 17: 282-286.
12. Gould, J., M. Devey, O. Hasegawa, E. C. Ulian, G. Peterson, R. H. Smith, 1991.
Transformation of Zea mays L. using Agrobacterum tumefaciens and the shoot
apex. Plant Physiol. 95: 426-434.
13. Grave, A. C. F., S. L. Goldman, 1986. The transformation of Zea mays seedlings
with Agrobacterium tumefaciens . Plant Molecular Biology 7: 43-50.
14. Huang, X. Q., Z. M. Wei, 2004. High -frequency plant regeneration through callus
initiation from mature embryos of maize (Zea mays L.). Plant Cell Reports 22: 793-800.
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 395
15. Ishida, Y., H. Saito, S. Ohta, Y. Hiei, T. Komari, T. Kumashiro, 1996. High
efficiency transformation of maize ( Zea mays L.) mediated by Agrobacterium
tumefaciens. Nature Biotechnology 14: 745-750.
16. Klein, T.M., T. Gradziel, M. E. Fromm, J. C. Sanford, 1988. Factor influencing
gene delivery into Zea mays cells by high-velocity microprojectiles.
Bio/Technology 6: 559-563.
17. Laursen, C. M., R. A. Krzyzek, C. E. Flick, P. C. Anderson, T. M. Spencer, 1994.
Production of fertile transgenic maize by electroporation of suspension culture
cells. Plant Molecular Biology 24: 51-61.
18. O’Kennedy, M. M., J. T. Burger, D. K. Berger, 2001. Transformation of elite white
maize using the particle inflow gun and detailed analysis of a low -copy integration
event. Plant Cell Reports 20: 721-730.
19. Planckaert, F., V. Walbot, 1989. Transient expression after electroporation of
protoplasts derived from embryogenic maize callus. Plant Cell Reports 8: 144-147.
20. Sidorov, V., L. Gilbertson, P. Addae, D. Duncan, 2006. Agrobacterium-mediated
transformation of seedling-derived maize callus. Plant Cell Reports 25: 320-328.
21. Southgate, E. M., M. R. Davey, J. B. Power, R. J. Westcott, 1998. A comparison of
methods for direct gene transfer into maize ( Zea mays L.). In Vitro Cell Dev. Biol. -
Plant 34: 218-224.
22. Vain, P., M. D. McMullen, J. J. Finer, 1993. Osmotic treatment enhances particle
bombardment-mediated transient and stable transformation of maize. Plant Cell
Reports 12: 84-88.
SUMMARY
Plant regeneration system and genetic transformation of
maize (Zea mays L.) with the ferritin gene via Agrobacterium
tumefaciens
Nguyen Phuong Nam, Le Tan Duc, Pham Duc Tri,
Nguyen Huu Tam, Nguyen Huu Ho, Nguyen Van Uyen
Institute of Tropical Biology
Nodal sections of 10 - 15 day old seedlings (Nep, Tien Giang province) were cut and
cultured on the media: MS + 0.5mg/l 2,4 -D + 1mg/l BA or MS + 0.5 mg/l 2,4-D + 2.2
g/l picloram + 1.38g/l L - proline + 3.4mg/l silver nitrate for the formation of
regenerating callus and/or embryogenic callus. Shoot apex culture (0.4 mm in size) were
also carried out. There was the formation of multishoot from shoot apex cultured on the
MS medium containing NAA (0.05mg/l) and BA (1-2mg/l). The regenerating calli were
used for genetic transformation via the Agrobacterium tumefaciens strain LBA 4404
with the aim to enhance the ferritin in the transformed plants.
396 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
MỞ ĐẦU
Trong 10 năm trở lại đây, việc trồng khoa i mì ở Việt Nam phát triển mạnh. Năm
1995, trên cả nước, diện tích trồng khoai m ì là 277,4 nghìn ha, sản lượng đạt 2211,5
nghìn tấn; đến năm 2004, diện tích trồng tăng đến 383,6 ngh ìn ha, sản lượng đạt 5572,8
nghìn tấn (Theo tài liệu Tổng cục Thống kê).
Ngoài vai trò là cây lương thực quan trọng, khoai mì ngày nay còn là nguyên li ệu
trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau. Tinh bột khoai m ì được sử dụng để sản xuất
các sản phẩm công nghệ sinh học đang đ ược quan tâm. Do đó, đầu t ư và quản lý các
giống khoai mì có chất lượng tốt và ổn định cho từng mục ti êu đặt ra là rất cần thiết.
Khoai mì ra hoa không đều, sinh sản tự nhiên thấp, mức dị hợp tử cao, giao phối c ùng
giống cao nên việc ứng dụng các phương pháp cổ điển trong công tác giống khó khăn.
Công nghệ sinh học đã đưa ra những công cụ tiên tiến, bổ sung cho các phương pháp
chọn giống cổ điển, nhằm bảo tồn, phục tráng giống tốt trong tự nhi ên, tạo ra các tính
trạng ưu việt mới như tính kháng bệnh, sâu, tăng hàm lượng protein trong củ, giảm h àm
lượng cyanogenic glucoside, tăng thời gian tồn trữ. Xây dựng đ ược hệ thống nuôi cấy
mô hiệu quả sẽ là nền tảng cho nhiều nghi ên cứu ứng dụng thực tiễn quan trọng, trong
lĩnh vực công nghệ sinh học ở cây khoai m ì.
Nghiên cứu sự tạo phôi vô tính, phát triển th ành cây in vitro, và kiện toàn các bước
đưa cây ra trồng trong vườn ươm đã được thực hiện tại phòng Công nghệ gen Viện Sinh
học Nhiệt đới. Giống khoai m ì KM 140, do Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền
Nam cung cấp, đã được sử dụng trong nghiên cứu này.
KẾT QUẢ
Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và 4-FA lên sự tạo mô sẹo của mẫu lá
Các thùy lá được nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo có 2,4-D đến ngày thứ 5, 6
thì mô sẹo bắt đầu hình thành ở vùng cuống và mép thùy lá. Khoảng 28 ngày mô sẹo
phát triển đầy mặt lá, các khối mô sẹo mềm, dạng th ùy, trơn láng và có màu nâu nh ạt.
Bảng 1: Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự tạo mô sẹo ở tuần nuôi cấy thứ 2 v à thứ 5
Ở nghiệm thức 4, bảng 1, tr ên môi trường có 2,4-D nồng độ 6mg/l, mẫu hình thành
mô sẹo đạt tỷ lệ cao nhất 95,56%. Ở môi trường đối chứng (2,4-D nồng độ 0mg/l), mẫu
lá gia tăng kích thước nhưng không có dấu hiệu tạo mô sẹo. Ở tuần thứ 2, có sự hình
thành rễ từ cuống và bìa một số mẫu lá.
Trên môi trường bổ sung 4-FA, sự hình thành mô sẹo chậm hơn. Hình thái mô sẹo
phát triển cũng tương tự như trên môi trường 2,4-D, tuy nhiên có sự hình thành các cụm
mô nhỏ xốp trắng đục.
Bảng 2: Ảnh hưởng của 4-FA lên sự tạo mô sẹo sau tuần nuôi cấy thứ 3 v à thứ 6
Nghiệm thức 3, bảng 2, môi tr ường có 4-FA nồng độ 4mg/l cho kết quả tốt nhất với
56,67% mẫu tạo mô sẹo ở tuần nuôi cấy thứ 3 v à 85,56% ở tuần nuôi cấy thứ 6 (tỷ lệ
thấp hơn so với nghiệm thức tạo mô sẹo cao nhất tr ên môi trường có 2,4-D).
Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và 4-FA đến khả năng sinh phôi của mẫu mô sẹo
Bảng 3: Ảnh hưởng của 2,4-D đến khả năng sinh phôi
Trên môi trường có 2,4-D, sau 40 ngày nuôi cấy, phôi bắt đầu hình thành trên khối
mô sẹo. Phôi tạo thành từng cụm gồm trung bình 4,5 phôi nằm cạnh nhau. Theo dõi đến
ngày 70 thì số lượng phôi hình thành không tăng.
Kết quả ở bảng 3 cho thấy nghiệ m thức 4, môi trường cơ bản có bổ sung 2,4-D ở
nồng độ 6 mg/l, cho có ảnh hưởng tốt nhất đến sự phát sinh phôi, đạt 58,89% mẫu cấy
sinh phôi và tổng số phôi thu nhận được là 76 phôi.
Trên môi trường có 4-FA, sau 45 - 50 ngày phôi mới bắt đầu hình thành trên các
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 399
khối mô sẹo, chậm hơn so với trên môi trường có 2,4-D. Đến ngày thứ 75, số phôi tạo
thành không tăng thêm. K ết quả thu nhận được trình bày trong bảng 4.
Bảng 4: Ảnh hưởng của 4-FA đến khả năng sinh phôi
Kết quả ở bảng 4 cho thấy nghiệm thức 3 (môi tr ường có bổ sung 4 -FA ở nồng
độ 4 mg/l) đạt được giá trị cao nhất ở các chỉ ti êu theo dõi là 57,78% mẫu cấy sinh phôi
và có tổng số phôi thu nhận được là 101,67 phôi.
Số phôi cao nhất nhận được từ môi trường có bổ sung 2,4-D (6mg/l) thấp hơn ở môi
trường có bổ sung 4-FA (4mg/l), nhưng thời gian hình thành phôi nhanh hơn. Quá trình
hình thành phôi trên môi trường có 2,4-D và 4-FA được ghi nhận qua các giai đoạn là thuần
thục và điển hình từ dạng cầu, tim thủy lôi và dạng có cực chồi và rễ (hình 1b-f).
Giải phẫu và nhuộm mẫu
Phẫu thức các giai đoạn phát triển của phôi đ ược nhuộm và quan sát rõ ràng dưới
kính hiển vi vật kính (x10) (Hình 2).
Khảo sát ảnh hưởng của GA 3 đến sự phát triển của phôi
Phôi trưởng thành, thu nhận từ môi trường có bổ sung 2,4-D và 4-FA được cấy
truyền sang môi trường có bổ sung GA3. Sau 15 ng ày, thân mầm vươn cao và rễ hình
thành. Từ 22 - 25 ngày, hai lá mầm của cây tách ra, chồi ngọn xuất hiện với các lá ho àn
chỉnh và phát triển thành cây bình thường. Một số phôi dị dạng không phát triển th ành
cây hoàn chỉnh, hoặc chết đi trong quá trình nuôi cấy.
Bảng 5: Ảnh hưởng của GA3 đến sự phát triển của phôi thu nhận từ môi tr ường có bổ sung
2,4-D và 4-FA
Tỷ lệ phôi có Tỷ lệ phôi phát Tỷ lệ phôi có Tỷ lệ phôi phát
Ký Nồng độ lá và rễ mầm triển thành cây lá và rễ mầm triển thành cây
Nghiệm
hiệu GA3 (%) hoàn chỉnh (%) (%) hoàn chỉnh (%)
thức
MT (mg/l)
từ MT có bổ sung 2,4-D từ MT có bổ sung 4-FA
NT1 ĐC 0 54,44 3,33 ± 3,33 D 51,11 2,22 ± 1,92 D
NT2 G1 0,1 71,11 15,56 ± 1,93 C 70,00 17,78 ± 1,92 C
NT3 G2 0,2 85,56 36,67 ± 3,34 B 83,33 35,55 ± 3,85 B
NT4 G3 0,3 92,22 63,33 ± 3,34 A 91,11 62,22 ± 3,85 A
**CV = 10,24% **CV = 10,34%
Trên môi trường có bổ sung GA3 0,3mg/l, tỷ lệ phôi phát triển thành cây hoàn
400 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
chỉnh cao nhất ở cả hai trường hợp phôi thu nhận từ môi tr ường bổ sung 2,4-D và môi
trường bổ sung 4-FA. Ở nghiệm thức 1, đối chứng, tỷ lệ phôi phát triển th ành cây hoàn
chỉnh rất thấp.
Chuyển cây in vitro ra trồng trong nhà lưới
Cây con in vitro cao khoảng 5-7cm được chuyển ra trồng trong bầu đất ngo ài vườn
ươm. Sau một tuần cây bén rễ và ra lá non mới, tỉ lệ cây sống và phát triển bình thường
là 94 %. Chuyển cây sang chậu đất sau m ột tháng cây cao khoảng 50 - 60cm. (Các giá
trị trung bình trong các bảng không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác biệt rấ t
có ý nghĩa ở mức p = 0,01 dựa theo trắc nghiệm LSD)
1. Bùi Trang Việt (2000). Sinh lý thực vật đại c ương, phần II: Phát triển. NXB Đại
học Quốc gia TP HCM, 187 - 223.
2. Brenda J. B., Micheal K. S., Kenneth J. S. (1986). The use of embryo culture for
the recovery of plants from cassava (Manihot esculenta Crantz) seeds. Plant Cell
Tiss. Org. Cul. 6: 229-234.
3. Gonzalez A. E., Schopke C., Taylor N. J. (1998). Regeneration of transgenic cassava
plants (Manihot esculenta Crantz) through Agrobacterium-mediated transformation of
embryogenic suspension cultures. Plant Cell Reports 17: 827 – 831.
4. Hoàng Kim, Phạm Văn Biên (1995). Cây sắn (Khoai mì). Nhà xuất bản Nông
nghiệp, TP HCM. 66 tr.
5. Hoàng Thị Sản (chủ biên), Hoàng Thị Bé. Phân loại học thực vật. Nh à xuất bản
Giáo dục, 77 - 126.
6. Kartha K. K., Gamborrg O. L. (1975). Elimination of cassava mosaic disease by
meristem culture. Phytopathology 65: 862 - 868.
7. Li H. Q., Gui J. I., Huang Y. W. (1998). Regeneration of cassav a plants via shoot
organogenesis. Plant Cell Rep. 17: 410-414.
8. Nguyễn My Uyên (2003). Phát sinh hình thái t ừ mô sẹo cây Paulownia fortunei v à
thăm dò khả năng biến nạp gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Luận văn
thạc sĩ sinh học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, TP HCM.
9. Sofiary E., Reamakers C. J. J. M., Kanju E. (1997). Comparison of NAA and 2.4 -D
induced somatic embryogenesis in cassava. Plant Cell Tissue and Organ Culture
50: 45 - 46.
10. Stamp J. A., Henshaw G. G. (1987). Somatic embryogenesis from clonal leaf
tissues of cassava.
11. Annuals of Botany 59: 445 - 450.
12. Trung tâm Tư liệu - Tổng Cục Thống kê Việt Nam http://www.gso.gov.vn
SUMMARY
Somatic Embryogenesis in Cassava
Phan Tuong Loc, Nguyen Huu Ho
Institute of Tropical Biology
Somatic embryos were obtained from immature leaf lobe explants of cassava
cultured in vitro on the KM medium containing 6mg/l 2,4-D or 4mg/l 4-FA. Mature
somatic embryos were transferred to the medium supplemented with 0.3mg/l GA3 for
elongating and rooting. In vitro plants were transplanted into soil. They were apparently
normal, similar to the stock plants.
402 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
MỞ ĐẦU
Cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) là cây công nghiệp quan trọng có giá trị kinh tế cao
và là cây gia vị được sử dụng rộng rãi trên thế giới (8), do hạt tiêu có vị nóng cay và
mùi thơm hấp dẫn, nên rất thích hợp cho việc chế biến thức ăn (3). Ngo ài ra, hạt tiêu
còn được dùng trong ngành công nghi ệp chế biến hương liệu, nước hoa và trong y dược.
Trong những năm gần đây, sản xuất và xuất khẩu hạt tiêu của Việt Nam đã có bước phát
triển mạnh mẽ. Từ sản l ượng 10.000 tấn và xuất khẩu 7.000 tấn năm 1996 đến năm
2006 ước tính sản lượng và xuất khẩu đạt hơn 100.000 tấn và Việt Nam hiện nay, chiếm
vị trí số một thế giới cả về số l ượng lẫn giá trị xuất khẩu hạt ti êu. Tuy nhiên để giữ vững
vị trí số một như hiện nay, sản lượng hồ tiêu khó tăng nhanh trong nh ững năm tới, do
năng suất còn thấp, chi phí cho hóa chất ph òng trừ bệnh hại hồ tiêu cao, làm hạn chế
khả năng tăng năng suất và diện tích gieo trồng. Muốn tăng năng suất của hồ ti êu cả về
số lượng và chất lượng, vấn đề đặt ra là làm sao tạo được những giống hồ tiêu sạch bệnh
có khả năng kháng virus, nấm… (2,7,10,11).
Để tạo ra giống (dòng) mới, sạch bệnh, một số ph ương pháp tiếp cận khác như tái
sinh cây bằng nuôi cấy phôi soma (4,8,9), đỉnh sinh tr ưởng, mô sẹo từ rễ, cuống lá, đốt
và mẫu mô lá (1,5,12) và bước đầu chuyển nạp gen v ào cây hồ tiêu thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens (14) đã và đang được nghiên cứu.
Do đó, mục đích của nghiên cứu này nhằm tìm ra giống hồ tiêu cao sản có khả năng
tái sinh cao, hoàn thiện hệ thống tái sinh in vitro cây hồ tiêu phục vụ cho các nghiên cứu
về chuyển nạp gen vào cây hồ tiêu trong tương lai.
Giống
Các giống hồ tiêu được dùng nghiên cứu là : Phú Quốc, Vĩnh Linh: Hạt hồ ti êu
được khử trùng và dùng làm nguyên li ệu in vitro để tạo mô sẹo, chồi, lấy mẫu lá, thân,
cuống lá cho nghiên cứu.
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 403
Nhiệt độ từ 25-26oC. Giai đoạn cho nẩy mầm từ hạt, giai đoạn tạo mô sẹo, nuôi cấy
trong tối ở nhiệt độ 25 oC. Cây tái sinh trực tiếp từ mẫu mô lá và thân thời gian chiếu
sáng 10 giờ/ngày.
Phương pháp
Hạt hồ tiêu được thu hoạch tại các v ườn trồng hồ tiêu tại Phú Quốc, Đắk Lắk. Rửa
sạch và khử trùng bằng cồn 70 o cho 1 phút, sau đó ngâm trong dung d ịch HgCl 2 (0,1%),
rửa với nước vô trùng ít nhất 6 lần, tiếp theo ngâm hạt v ào dung dịch cefotaxime 0,1%
hoặc nước javels 40%, thời gian khử tr ùng khác nhau từ 30-60 phút. Hạt vô trùng được
đặt trong môi trường MS cho hạt nẩy mầm, hoặc môi tr ường SH có bổ sung 2,4-D với
các nồng độ khác nhau để tạo mô sẹo,
Hạt nẩy mầm chuyển sang môi tr ường ½ MS mới để tạo cây. Mô sẹo h ình thành,
chuyển sang môi trường mới để nhân sinh khối mô sẹo.
Lá của cây sinh trưởng tốt như hình 2, cắt ra rừng mảnh khoảng 5 cm và đặt trên
môi trường tái sinh (môi trường số 3), để tạo chồi.
Cắt đốt cây vô trùng, sau đó chẻ dọc làm đôi, và cuống lá, đặt lên môi trường 4, để
tạo mô sẹo và chồi. Các chồi sau đó được cấy trên môi trường số 5 để tạo rễ và giữ
giống in vitro.
Ảnh hưởng của hygromycin lên sự tái sinh chồi hồ tiêu từ mô lá.
Hồ tiêu là loại cây mang nhiều mầm bệnh nội sinh (7,11), bởi vậy điều quan
trọng là làm sao loại bỏ được các mầm bệnh nội sinh trong hồ ti êu như nấm, virus, vi
khuẩn nằm bên trong mô cây, h ạt. Các phương pháp thông thư ờng khử trùng như
dùng cồn và nước javel, không loại trừ được các mầm bệnh. Các mẫu qua xử lý tr ên
404 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
cho thấy: mặc dù khi sử dụng các chất có khả năng diệt khuẩn cao nh ư HgCl 2 0,1 %
trong 10 phút, mẫu khử trùng hạt vẫn nhiễm rất cao từ 80-90% sau 1 tháng trên môi
trường nuôi cấy. Do đó ph ương pháp khử trùng hạt nêu trên thu được mẫu vô trùng
rất thấp và hạt không nẩy mầm, sau một thời gian d ài (30 ngày) gieo trên môi trư ờng
MS không chất kích thích sinh tr ưởng.
Để nhận được mẫu vô trùng, chúng tôi sử dụng phương pháp: Lột vỏ hạt tiêu, rửa
sạch, ngâm vào dung dịch HgCl 2 0,1 % từ 5 -10 phút, sau đó ngâm hạt trong dung dịch
cefotaxin 1% trong 1 giờ. Bằng cách này chúng tôi thu nhận được mẫu vô trùng từ 80-
90%. Tỉ lệ nẩy mầm cao khoảng 57% so với hạt tiêu không lột vỏ.
2. Xây dựng hệ thống tái sinh qua nuôi cấy mô sẹo từ hạt
Tạo mô sẹo từ hạt: Các hạt ti êu vô trùng được đặt trên các môi trường SH, có bổ
sung thêm các chất kích thích sinh trưởng: 2,4-D có các nồng độ từ 0,1 đến 2mg/l và
kinetin 0,1mg/l. Sau một thời gian nuôi cấy, quan sát thấy mô sẹo h ình thành ở vị trí mô
noãn (seed-bud), sau khoảng 3 tuần khoảng 49% tạo mô sẹo, theo chúng tôi l à do tác
động của 2,4-D lên sự hình thành mô sẹo (4).
Qua nuôi cấy mô sẹo từ hạt, chúng tôi còn nhận được mô sẹo từ rễ. Rễ hồ ti êu cắt
và đặt trên môi trường SH có bổ sung 0,5mg/l 2,4-D tạo mô sẹo đạt 95%.
Mô sẹo này được cấy truyền nhân lên cùng sang môi trường như trên. Do hiệu suất
hình thành mô sẹo sinh phôi cũng như tốc độ nhân mô phôi trên môi trường agar không
cao. Chúng tôi quan tâm đ ến vấn đề sử dụng loại mô n ày để nghiên cứu chuyển gen,
nên chúng tôi tiếp tục nghiên cứu nhân nhanh sinh khối mô phôi bằng cách nuôi tr ên
môi trường lỏng, lắc nhẹ khoảng 80 v òng/phút để tăng hiệu quả sinh phôi mô nuôi cấy.
3. Xây dựng hệ thống tái sinh chồi trực tiếp từ đốt, lóng cây hồ ti êu
Chồi in vitro của cây hồ ti êu cao khoảng 6-7cm được cắt thành các đốt và lóng
khoảng 1,5cm. Mỗi đốt mang một chồi ngủ, đ ược cất trên môi trường MS có bổ sung
2mg/l BAP + 0,1mg/l Kinetin + 0,5mg/l IBA + 10 % nước dừa. Trên môi trường này,
sau 3-5 tuần nuôi cấy, quan sát thấy xuất hiện chồi mới, số chồi h ình thành từ 4- 6 chồi
cho đốt già và 3-4 chồi được tạo ra từ lóng (hình 4).
Nghiên cứu sự tạo chồi từ các đốt cây, cho th ấy sự khác biệt về số lượng chồi được
tạo ra. Đốt gốc và đốt giữa có khả năng tạo chồi nhiều h ơn ở đốt ngọn. Nhằm làm tăng
khả năng tạo chồi từ đốt, chúng tôi chẻ dọc đốt ra l àm đôi, hy vọng tạo thêm một số
chồi từ vết cắt.
Ở nước ta và trên thế giới, nghiên cứu tái sinh trực tiếp từ mẫu mô lá đ ã được thực
hiện, nhưng chưa nhiều. qua nghiên cứu tạo chồi trực tiếp từ mẫu mô lá để d ùng cho
phương pháp bắn gen gna cùng với gen chọn lọc hygromycin, b ước đầu chúng tôi đã
nhận được một số dòng mô chống chịu được hygromycin ở nồng độ 10mg/l. Nghi ên
cứu chuyển gen gna vào lá hồ tiêu bằng phương pháp bắn gen đang được thực hiện.
A B
C D
Hình 1. Tạo cây cây hồ tiêu in vitro: A: Hạt nẩy mầm; B: Cây con in vitro;
C: Mô sẹo tạo ra từ hạt; D: Chồi tái sinh từ cuống lá.
Hình 2. Ảnh hưởng của hygromycin lên sinh trưởng của hồ tiêu: A: Đối chứng,
B: hygromycin 15mg/l
406 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
1. Bhat SH, Chandel KPS, and Malik SK, 1995. Pl ant regeneration from various
explants of cultivated species. Plant Cell Reports. 14: 398 -402.
2. De Silva DPP, Jones P, and Shaw MW, 2002. Identification and transmission of
Piper yellow mottle virus and Cucumber mosaic virus infecting black pepper ( Piper
nigrum) in Sri Lanka. Plant Pathology. 51: 537 -545.
3. Jagella T, and Grosch W, 1999. Flavour and off -f;avour compounds of black and
white pepper (Piper nigrum L.) II. Odour activity values of desirable and
undesirable odorants of black pepper. Eur Food Res Tec hnol. 209:22-26.
4. Joseph B, Joseph D, and Philip VJ, 1996. Plant regeneration from somatic embryos
in black pepper. Plant Cell, Tissue and Orgen Culture. 47: 87 -90.
5. Kelkar SM, Krishnamurthy KV, 1998. Adventitious shoot regeneration from root,
internode, petiole and leaf explants of Piper colubrinum Link. Plant Cell Reports.
17: 721-725.
6. Murashige T, Skoog F, 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays
with tobacco tissue cultures. Physiol Plant. 15: 473 -497.
7. Lockhart BEL, Kiratiya - Angul K, Jones P, Eng L, De Silva P, Olszewski NE, et
al., 1997. Identification of Piper yellow mottle virus, a mealybug -transmitted
badnavirus infecting Piper ssp. In Southeast Asia. European Juornal of Plant
Pathology. 103:303-311.
8. Nair RR, Gupta SD, 2006. High -frequency plant regeneration through cyclic
secondary somatic embryogenesis in black pepper ( Piper nigrum L.). Plant Cell
Reports. 24: 699-707.
9. Nair RR, Dutta Gupta S, 2003. Somatic embryogenesis and plant regeneration in black
pepper (Piper nigrum L.): I. direct somatic embryogenesis from tissue of germinating
seeds and ontogeny of somatic embryos. J Hort Sci Biotechnol.: 416-421.
10. Nguyễn Tiến Thắng, Boico AL, 2001. Virus v à bệnh virus trên cây hồ tiêu ở Việt
Nam. Hội nghị Quốc tế lần 3, Kiev, Ucraina.
11. Qaher A, Mandeel, 2005. Fungal contamination of some imported spices.
Mycopathologia. 159:291-298.
12. Sarma YR, Kalloo G, 2004. Status of current research towards increased production
and productivity in black pepper in India. Focus on Pepper. 1:69 -86.
13. Schenk RU, Hildebrandt AC, 1972. Medium and techniques for induction and
growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Can J Bot. 50:
199-204.
14. Sim SL, Jafar R, Power JB, Davey MR, 2004. Development of an Agrobacterium -
mediated transformation system for black pepper (Piper nigrum L.). ISHS Acta
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 407
SUMMARY
Establishment of in vitro plant regeneration system of black
pepper (Piper nigrum L.) for gene transfer
The economic importance of black pepper ( Piper nigrum L.) has lead to its
selection and breeding over thousands of year in the world. For successful gene t ransfer
in black pepper, efficient shoot regeneration systems are required. Regeneration
frequencies in black pepper are often low and genotype dependent. Black pepper leaf is
ideal explant source for biolistic transformation, but is not optimal for plant
regeneration. For this reason, A high -frequency shoot regeneration protocol was
developed for two commercial cultivars of black pepper (Phu Quoc and Vinh Linh) and
a range of culture media were tested for development of a highly -efficient regeneration
system from leaf, petiole, root explants and callus which was derived from micropylar
tissues of germinating seeds on SH media in the absence of light at 25 oC. Both cultivars
Phu Quoc and Vinh Linh were response for shoot regeneration using either one -step (for
petiole, internode and leaf explants) or two -step regeneration protocols (for callus).
These genotypes were chosen for further studies.
408 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
MỞ ĐẦU
Cây dâu tây do người Pháp du nhập vào Việt Nam đầu những năm 1930, c ó tên
khoa học là Fragaria vesca L., là kết quả của sự lai giống giữa ( Fragaria chiloensis
Duch và Fragaria virginiana Duch) thuộc nhóm hai lá mầm, họ Rosacea. Trong phần
thịt quả dâu tây có chứa nhiều sinh tố thiết yếu cho con ng ười như A, B1, B2 và đặc biệt
là sinh tố C. Do đó, những dòng dâu tây mang tính thương mại cao đã được chọn và
triển khai canh tác đại trà ở Lâm Đồng như dòng Mỹ Đá, Mỹ Hương (nhập khẩu bởi các
Công ty nghiên cứu giống), dòng HO của Nhật Bản (Phân Viện Sinh học Đà Lạt)…[1]
Hiện nay, với sự phát triển vượt bậc của ngành Công nghệ gen thực vật, đã cho phép đưa
một số gen mã hóa cho những tính trạng có ích theo nhóm sau: kháng bệnh hại (sâu, rầy, côn
trùng chích hút), chống chịu ngoại cảnh bất lợi (hạn, mặn, kháng thuốc trừ cỏ), trong y d ược
(tăng cường vitamin A, vắc-xin ăn được)… thông qua một số kỹ thuật biến nạp gen như bắn
gen (biolistic), vi khuẩn Agrobacterium, xung điện (electroporation). Riêng đối với đối tượng
cây ăn quả, nhiều công trình công bố quốc tế cho thấy cây dâu tây tỏ ra có ưu thế trong việc
ứng dụng công nghệ gen để tạo ra những giống mang đặc tính di truyền mới. Đồng thời cây
dâu tây có khả năng nhân giống nhanh và trồng đại trà tạo điều kiện cho việc thử nghiệm
đánh giá một số tính trạng mới [4][5][6][9][10][11][12][13].
Trong phạm vi bài báo này, chúng tôi trình bày một số kết quả trong việc x ây dựng
phương pháp chuyển nạp gen dùng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens kết hợp xử lý
sóng siêu âm, thông qua hệ thống nuôi cấy tái sinh từ đĩa lá dâu tây [2][3][7][8].
Bảng 1: Tần số tái sinh chồi của thí nghiệm 1 v à 2 trên môi trường chọn lọc chứa
kanamycin nồng độ 20 mg/l sau 45 ng ày
Môi trường nuôi cấy MSDT Số mẫu lá Số mẫu lá Tỉ lệ tái sinh chồi (%)
(có kanamycin 20 mg/l) thí nghiệm tái sinh chồi
Thí nghiệm 1 150 1 0,66
Thí nghiệm 2 150 2 1,33
Hình 1: Mẫu nuôi cấy trên môi trường MSDT+ kanamycin 20 mg/l sau 45 ng ày
A. Mẫu đối chứng
B. Mẫu xử lý chuyển gen tái sinh chồi ở vị trí cuống lá
C. Mẫu xử lý sóng siêu âm+chuyển gen tái sinh chồi ở vị trí r ìa lá
D. Mẫu xử lý chuyển gen tái sinh chồi ở vị trí cuống lá
Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 411
- Kết quả phân tích mẫu chuyển gen có xử lý trước sóng siêu âm:
KẾT LUẬN
Đã thu nhận một số chồi in vitro kháng được kanamycin ở độ 20mg/l trên môi
trường tái sinh bổ sung TDZ 1 ,5mg/l, 2-4D 0,2mg/l, thông qua phương pháp
chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium kết hợp xử lý sóng siêu âm.
Kết quả hóa mô cho thấy sự hiện diện của gen gusA.
Gen npt II mã hóa cho enzyme neomycine phosphotransfer ase, tạo tính kháng
kanamycin đã được kiểm tra bằng kỹ thuật PCR.
SUMMARY
Leaf disk transformation system of strawberry ( Fragaria
vesca L.) using the sonication assisted Agrobacterium method
Mai Truong, Le Tan Duc, Nguyen Huu Ho
Institute of Tropical Biology
Leaf disk regeneration system of strawberry ( Fragaria vesca L.) was carried out
using modified Murashige and Skoog medium ( 1962) with TDZ 1,5 mg.l -1 and 2,4-D
0,2 mg.l-1. Transformation works were performed via Agrobacterium tumefaciens
containing the plasmid pCAMBIA 2301 with gusA and npt II genes. Leaf explants were
pretreated with sonication in 3 seconds by Transsonic 660 unit and a 2 days of
Agrobacterium co-cultivation. After a 45-day culture under the pressure of kanamycin
20 mg.l -1 as a selective agent, shoot regeneration was recovered on the med ium with
TDZ 1,5 mg.l-1, 2,4-D 0,2 mg.l-1. The transformation frequency is low with percentage
of 1.33. Histochemical GUS assay and PCR analysis showed the presense of gusA and
npt II genes in putative transformants.