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Biología Molecular
Manual de Laboratorio
Tabla de contenidos
CONSIDERACIONES GENERALES ........................................................................................... 4
Introducción ................................................................................................................................. 4
Normas generales del laboratorio ................................................................................................... 5
Normas de bioseguridad............................................................................................................... 5
Reglamento de evaluación ........................................................................................................... 6
La evaluación global ............................................................................................................... 6
Lista de cotejo ......................................................................................................................... 6
Observaciones ......................................................................................................................... 6
Cronograma de Clases ............................................................................................................ 7
Partes del informe de laboratorio ................................................................................................. 8
Las partes de un informe técnico del laboratorio son: ................................................................. 8
Referencias bibliográficas ............................................................................................................ 9
PRÁCTICA Nº 1 ........................................................................................................................... 10
AISLAMIENTO DE ACIDOS NUCLEICOS ............................................................................. 10
Objetivo general ......................................................................................................................... 10
Objetivos específicos ................................................................................................................. 10
Fundamentos teórico teóricos de la práctica .............................................................................. 10
PRÁCTICA Nº 1.1........................................................................................................................ 10
AISLAMIENTO DE ACIDOS NUCLEICOS BACTERIANO ................................................... 10
Objetivo general ......................................................................................................................... 10
Objetivos específicos ................................................................................................................. 10
Fundamentos teórico teóricos de la práctica .............................................................................. 11
Materiales y Reactivos. ......................................................................................................... 12
Procedimiento. ...................................................................................................................... 12
Resultados ............................................................................................................................. 13
Método de eliminación de Residuos .......................................................................................... 13
Referencias bibliográfica ........................................................................................................... 13
PRÁCTICA Nº 1.2 ........................................................................................................................ 14
EXTRACCIÓN DE ADN CROMOSOMICO ANIMAL............................................................. 14
Objetivo general ......................................................................................................................... 14
Objetivo general ......................................................................................................................... 14
Fundamentos teórico teóricos de la práctica .............................................................................. 14
Materiales y Reactivos .......................................................................................................... 14
Procedimiento ....................................................................................................................... 14
Resultados ............................................................................................................................. 15
Método de eliminación de Residuos .......................................................................................... 15
Referencias bibliográficas .......................................................................................................... 15
PRÁCTICA Nº 1.3 ........................................................................................................................ 16
EXTRACCIÓN DE ADN CROMOSOMICO VEGETAL .......................................................... 16
Objetivo general ......................................................................................................................... 16
Objetivo general ......................................................................................................................... 16
Fundamentos teórico teóricos de la práctica .............................................................................. 16
Mini preparación de ADN de soja ............................................................................................. 16
Materiales y Reactivos .......................................................................................................... 16
Procedimiento ....................................................................................................................... 16
Resultados ............................................................................................................................. 18
Método de eliminación de Residuos .......................................................................................... 18
Referencias bibliográfica ........................................................................................................... 18
Manual de Laboratorio
Bioquímica
PRÁCTICA Nº 2 ........................................................................................................................... 19
CUANTIFICACION DE ADN ..................................................................................................... 19
Objetivo general ......................................................................................................................... 19
Objetivo específico ..................................................................................................................... 19
Fundamentos teórico teóricos de la práctica .............................................................................. 19
Cuantificación de ADN .............................................................................................................. 19
Materiales y Reactivos .......................................................................................................... 19
Procedimiento ....................................................................................................................... 20
Resultados ............................................................................................................................. 20
Método de eliminación de Residuos .......................................................................................... 20
Referencias bibliográficas .......................................................................................................... 20
PRÁCTICA Nº 3 ........................................................................................................................... 21
ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA ........................................................................... 21
Objetivo general ......................................................................................................................... 21
Objetivos específicos .................................................................................................................. 21
Fundamentos teóricos de la práctica .......................................................................................... 21
Electroforesis en gel de agarosa al 0,8% .................................................................................... 22
Materiales y reactivos ........................................................................................................... 22
Procedimiento ....................................................................................................................... 22
Resultados ............................................................................................................................. 23
Método de eliminación de residuos ............................................................................................ 23
Referencia bibliográfica ............................................................................................................. 23
PRÁCTICA N° 4........................................................................................................................... 24
REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA ................................................................... 24
Objetivo general ......................................................................................................................... 24
Objetivos específicos .................................................................................................................. 24
Fundamento teórico de la práctica.............................................................................................. 24
Reacción en cadena de polimerasa de Glicine max. .................................................................. 24
Materiales y reactivos ........................................................................................................... 24
Procedimiento ....................................................................................................................... 25
Resultados ............................................................................................................................. 28
Método de eliminación de residuos ............................................................................................ 28
Referencias bibliográfica ............................................................................................................ 29
ANEXOS....................................................................................................................................... 30
Anexo 1: Verificación de la calibración de pipetas automáticas................................................ 30
Anexo 2 ......................................................................................................................................... 33
Normograma para la determinación de la Fuerza Centrifuga Relativa ......................................... 33
Anexo 3 ......................................................................................................................................... 34
Como convertir textos de Word a PDF ...................................................................................... 34
3
Facultad de Ciencias Químicas
CONSIDERACIONES GENERALES
Introducción
La Biología Molecular es el estudio de la vida a un nivel molecular. Está relacionada con otros
campos de la Biología y la Química, particularmente Genética y Bioquímica. La biología molecular
concierne principalmente al entendimiento de las interacciones de los diferentes sistemas de la célula, lo
que incluye muchísimas relaciones, entre ellas las del ADN con el ARN, la síntesis de proteínas, el
metabolismo, y el cómo todas esas interacciones son reguladas para conseguir un afinado
funcionamiento de la célula.
Al estudiar el comportamiento biológico de las moléculas que componen las células vivas, la
Biología molecular roza otras ciencias que abordan temas similares: así, p. ej., juntamente con la
Genética se interesa por la estructura y funcionamiento de los genes y por la regulación (inducción y
represión) de la síntesis intracelular de enzimas y de otras proteínas. Con la Citología, se ocupa de la
estructura de los corpúsculos subcelulares (núcleo, nucléolo, mitocondrias, ribosomas, lisosomas, etc.) y
sus funciones dentro de la célula. Con la Bioquímica estudia la composición y cinética de las enzimas,
interesándose por los tipos de catálisis enzimática, activaciones, inhibiciones competitivas o alostéricas,
etc. También colabora con la Filogenética al estudiar la composición detallada de determinadas
moléculas en las distintas especies de seres vivos, aportando valiosos datos para el conocimiento de la
evolución.
Sin embargo, difiere de todas estas ciencias enumeradas tanto en los objetivos concretos como en los
métodos utilizados para lograrlos. Así como la Bioquímica investiga detalladamente los ciclos
metabólicos y la integración y desintegración de las moléculas que componen los seres vivos, la Biología
molecular pretende fijarse con preferencia en el comportamiento biológico de las macromoléculas
(ADN, ARN, enzimas, hormonas, etc.) dentro de la célula y explicar las funciones biológicas del ser vivo
por estas propiedades a nivel molecular.
Manual de Laboratorio
Bioquímica
Normas de bioseguridad
1. Antes de utilizar un reactivo, asegurarse bien de que es el que se necesita, familiarizarse
con las claves criptográficas que expone de tal manera a tomar a trabajar en las
condiciones que requiere dicho reactivo y así evitar accidentes.
2. No pipetear con la boca, utilizar la propipeta.
3. Recordar que al preparar una dilución partiendo de ácidos concentrados, se debe colocar
el acido sobre el agua, nunca en el orden inverso.
4. Los productos inflamables (alcohol, éter, etc.) no deben estar nunca cerca de fuentes de
calor. Si hay que calentar tubos con estos productos, se harán siempre a baño María,
nunca directamente a la llama.
5
Facultad de Ciencias Químicas
5. Numerosas sustancias orgánicas e inorgánicas son corrosivas o se absorben fácilmente
por la piel, produciendo intoxicaciones o dermatitis, por lo que se ha de evitar su contacto
directo; si esto ocurriera, deberá lavarse inmediatamente con abúndate agua la parte
afectada.
6. Si se rompe algún material de vidrio durante el desarrollo de la práctica, se deberá
desechar en un contenedor de materiales punzocortantes.
7. A continuación se dan algunas recomendaciones para el manejo de algunas sustancias
específicas más utilizadas en el laboratorio:
a. Acido nítrico (HNO3): El ácido nítrico es una sustancia corrosiva que cuando
entra en contacto con los ojos puede provocar dolor, enrojecimiento y
quemaduras profundas graves.
b. Acido sulfúrico (H2SO4), Clorhídrico (HCl): Las soluciones
concentradas lesionan rápidamente la piel y los tejidos internos. En caso
de entrar en contacto lavar con abundante agua la zona afectada y acudir al
médico.
Reglamento de evaluación
La asistencia a todas las sesiones de laboratorio son obligatorias (100% de asistencia)
Las faltas o inasistencias por enfermedad o causas muy graves, serán recuperables hasta 1 (una)
práctica, previa presentación del certificado médico en caso de enfermedad o de una nota dirigida a la
Jefatura de Trabajos Prácticos mencionando el motivo de la ausencia.
La hora de entrada a las prácticas es a las 08:00 hs los días martes y a las 13:00hs los días jueves, se
sancionará cada llegada tardía con 2 puntos menos en lista de cotejo del día.
El alumno queda excluido de rendir la prueba pre- laboratorio del día en el caso de que llegue luego de
los 10min de tolerancia.
La evaluación global
* Lista de cotejo: 10
* Informes: 10
* Prueba pre- laboratorio: 20
* Seminario: 10
* Exámenes parciales : 50
Total 100 puntos
Lista de cotejo
Los puntos a ser evaluados en la lista de cotejo son:
Puntualidad: 2 puntos
Bioseguridad: 2 puntos
Trabajo en clase: 3 puntos
Orden y limpieza: 2 puntos
Respeto: 1 punto
Total: 10 puntos
Observaciones
- La lista de cotejo se evaluará todos los días de trabajo, y al finalizar las prácticas del semestre
se promediará las puntuaciones para cada alumno en forma individual.
- Las pruebas cortas de laboratorio se tomaran al inicio de cada jornada de práctica, los temas a
evaluar son sobre la practica a ser desarrollada en el día.
- Los temas de a ser evaluados en los exámenes parciales serán informados por el profesor una
semana antes de las pruebas.
Manual de Laboratorio
Bioquímica
Cronograma de Clases
Plan 3
Plan 2008
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Facultad de Ciencias Químicas
10 Introducción teórica a las técnicas de reacción en cadena de polimerasa 3 de mayo 5 de mayo
Reacción en cadena de polimerasa
11 Seminario (Discusión y análisis de articulo) 10 de mayo 12 de mayo
12 Introducción a la Bioinformática. Uso de bases de datos para el análisis de secuencias de 17de mayo 19 de mayo
ADN
13 Segundo examen parcial 22 de mayo
Manual de Laboratorio
Bioquímica
utilizados para obtener los resultados.
7. Discusión de los resultados: en esta parte del informe se debe explicar los resultados y cuál es su
significado. Siempre que sea posible, debes comparar los resultados obtenidos con los resultados
esperados y tratar de explicar las posibles razones para las discrepancias entre las cifras. Es aquí
que se podrá demostrar la capacidad analítica e intuitiva.
8. Referencias: se debe citar las referencias de todo lo que se haya usado para comparar, obtener
información o guiarte en la realización del experimento. Mínimo 2.
Es importante señalar que el trabajo de laboratorio en este curso permitirá desarrollar destrezas
analíticas que servirán para entender mejor los procesos biológicos y prepararán adecuadamente para
cursos futuros. En algunos casos dependerá de compañeros de grupo para obtener e interpretar los
datos obtenidos. Es muy importante que se intercambie y discuta resultados. Obtener el mejor
provecho a tu experiencia y acude a tu instructor en caso de dudas.
ENTREGA DE INFORMES
El informe se enviará en formato digital a la dirección de correo mcrr.84@gmail.com. El informe
deberá ser presentado como documento “pdf”, en el ANEXO se explica cómo convertir documentos al
formato pdf.
El nombre del archivo pdf que se enviará deberá tener la siguiente estructura: “Informe N° 3 –
Grupo 3”. Esto significa que es el tercer informe del grupo 3.
LA LIBRETA DE LABORATORIO
La libreta de laboratorio que se utilizará durante todo el semestre y que el profesor podría
recoger en cualquier momento del semestre deberá:
1. Estar identificada con nombre, número de grupo y día de trabajo.
2. Tener las páginas enumeradas de antemano, no tener hojas sueltas y no tener páginas arrancadas.
3. Escrita con tinta (azul o negra), nunca con lápiz. Si es necesario corregir algún dato que ya se
anoto, se debe tachar pasando una sola raya sobre el error (de modo que el dato permanezca
legible) escribiendo el dato correcto al lado del dato erróneo y colocando tus iniciales sobre
ambos datos.
4. Tenerla siempre a mano. De esta manera, se podrá utilizar cada vez que se necesite anotar datos y
se evitará tener que anotarlos en hojas de papel sueltas o en la mano, de donde se pueden perder o
borrar fácilmente.
5. Recoger los datos que generen otros miembros del grupo y que sean necesarios para el análisis
fuera del salón de clases. Indicar sus nombres al lado del dato recogido.
6. El informe recoge el punto más significativo del trabajo que realizado y establece claramente qué
se hizo, quién lo hizo, por qué se hizo, cómo se hizo, cuáles fueron los resultados y cuál es el
significado de esos resultados.
Referencias bibliográficas
1. Benjamin Lewis. Genes VII. 7ª ed. 1999. Oxford University Press. USA
2. Nelson Portillo. Manual de trabajos prácticos de Biología Molecular. 2009
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Facultad de Ciencias Químicas
PRÁCTICA Nº 1
AISLAMIENTO DE ACIDOS NUCLEICOS
Objetivo general
Aislar ADN partiendo de distintas muestras biológicas.
Objetivos específicos
Adquirir conocimientos de extracción y purificación de ADN.
Comprender las diferencias existentes en el proceso de aislamiento de ADN dependiendo del
material biológico de partida.
Desarrollar la capacidad de trabajo en grupo, aplicando normas de bioseguridad y de forma
ordenada.
PRÁCTICA Nº 1.1
AISLAMIENTO DE ACIDOS NUCLEICOS BACTERIANO
Objetivo general
Extraer ADN de plásmido de una bacteria mediante el método de lisis alcalina y
conocer la importancia biológica de los plásmidos así como la de los vectores
moleculares como herramientas para el clonaje de genes.
Objetivos específicos
Adquirir conocimientos de extracción y purificación de ADN.
Comprender las diferencias existentes en el proceso de aislamiento de ADN dependiendo del
material biológico de partida.
Desarrollar la capacidad de trabajo en grupo, aplicando normas de bioseguridad y de forma
ordenada.
Manual de Laboratorio
Bioquímica
Materiales y Reactivos.
Solución I: 50 mM Tris.Cl, pH 8, 10 mM EDTA, 20 mM glucosa 60
Solución II: 200 mM NaOH, 1% SDS
Solución III: 3 M Acetato de potasio
Etanol al 70% y al 95%
Cloroformo
Amortiguador de Tris y EDTA (TE)
Hielo
Tubos descartables de 1.5 ml
Micropipetas y pipetas
Procedimiento.
1. Cultivar por 14 horas las cepas de Escherichi a coli en 5 mL de la medio LB a 37 ° C con
agitación.
2. Colectar las células por centrifugación durante 10 minutos a 2500 RPM.
3. Resuspender las células en 100μL de la solución "I", previamente enfriada. Se agita
vigorosamente para evitar que las células permanezcan juntas.
4. Agregar 200 µl de la solución II (Lisis) preparada recientemente a cada suspensión de
bacterias. Se cierran los tubos y se homogeniza invirtiendo el tubo rápidamente
alrededor de 5 veces. Para prevenir ruptura del ADN genómico y por tanto la
contaminación del ADN del plásmido con el mismo, se debe agitar invirtiendo el tubo
suavemente. Incubar el tubo por 5 minutos exactos en hielo.
5. Agregar 150 µl de la solución III (Neutralización) previamente enfriada. Se cierran los
tubos y se homogeniza invirtiendo el tubo varias veces. El tubo se incuba 3 – 5 minutos
en hielo.
6. Centrifugar el lisado de bacterias a máxima velocidad por 5 minutos a 4 ºC. Tomar el
sobrenadante obtenido luego de la centrifugación y pasarlo a un tubo limpio.
7. Aspirar la fase superior (acuosa) que contiene al ADN, y transferir la a un tubo nuevo.
8. Adicionar a la fase acuosa 1 mL de Cloroformo, y homogenizar por inversión durante 5
minutos. Centrifugar 10 minutos. Aspirar la fase acuosa que contiene al ADN y
transferirla a un tubo nuevo de centrífuga de 2 mL.
9. Repetir el procedimiento (8) hasta obtener una fase acuosa completamente clara.
Manual de Laboratorio
Bioquímica
10. Adicionar 1 volumen de alcohol isopropílico helado, y dejar en reposo por una hora en
hielo. Luego centrifugar por 15 minutos.
11. Eliminar cuidadosamente el sobrenadante, y enjuagar el sedimento con 1 mL de etanol al
70%. Trasladar el contenido a un tubo de microcentrífuga.
12. Centrifugar en la microcentrífuga durante 10 minutos. Eliminar el alcohol y dejar secar a
medio ambiente.
13. Resuspender el sedimento con 300 uL de agua.
Resultados
Se obtendrá ADN plasmídico que se almacenara hasta la práctica de electroforesis para
observar la calidad del material obtenido.
Referencias bibliográfica
Alberts, B; A, Johnson; J, Lewis; M, Raff; K, Roberts & P, Walter. 2007. Molecular
Biology of the Cell. 5th. ed. Garland Science. N.Y., EE.UU
UNAM (Universidad Nacional Autónoma de México). 2000. Bioquímica y Biología
Molecular Manuales departamentales. Editorial Mc Graw-Hill. México.
Ausubel, F. M.; Brent, R.; Kingston, R. E.; Moore, D. D.; Seidman, J. G.; Smith, J. A.;
Struhl, K. 1999. Polymerase Chain Reaction. ln: Current Protocols in Molecular
Biology.
13
Facultad de Ciencias Químicas
PRÁCTICA Nº 1.2
EXTRACCIÓN DE ADN CROMOSOMICO ANIMAL
Objetivo general
Extraer ADN genómico partiendo de una muestra de origen animal.
Objetivo general
Adquirir conocimientos de extracción y purificación de ADN.
Comprender las diferencias existentes en el proceso de aislamiento de ADN dependiendo del
material biológico de partida.
Desarrollar la capacidad de trabajo en grupo, aplicando normas de bioseguridad y de forma
Materiales y Reactivos
100mM Tris HCl pH 8.5
10mM Tris HCl pH 7.5
0.5M EDTA
10% SDS
5M NaCl
20mg/ml Proteinasa K
Isopropanol
agua bidestilada.
Procedimiento
1. Lisis: El buffer de lisis se agrega al tejido o células (usualmente 0.5 mL). La digestión se
completa después de varias horas a 37° (células, 2-3 hrs.) o 55° (tejidos) en agitación.
Buffer de Lisis:
100mM Tris HCl pH 8.5: 5ml
0.5M EDT A: 0.5ml
10% SDS: 1ml
5M NaCl: 2ml
20mg/ml Proteinasa K 0.25ml
Completar hasta 50ml con agua bidestilada.
2. Precipitación: Se agrega un volumen de isopropanol al lisado, y se mezcla por inversión
hasta que se complete la precipitación (unos 10-20 minutos); (debe desaparecer la
viscosidad).
3. Recuperación del Precipitado: El ADN precipitado se recupera levantándolo con una
punta descartable de micropipeta. Debe secarse al ambiente el exceso de líquido. El ADN
luego se debe resuspender en 20 a 500ul de 10mM Tris HCl, 0.1mM EDT A, pH 7.5.,
dependiendo del volumen de células o tejido procesado. La resuspensión total requiere de
varias horas de agitación a 37 ó 55° (mejor overnight). Es importante que el ADN esté
totalmente resuspendido para asegurar se de remoción reproducible en alícuotas par a el
análisis.
Manual de Laboratorio
Bioquímica
Resultados
Se obtendrá ADN genómico animal que se almacenara hasta la práctica de electroforesis
para observar la calidad del material obtenido.
Referencias bibliográficas
Sambrook,
J.,
Rusell,
D.W.
(2001).
Molecular
cloning:
a
laboratory
manual.
3aEd
Cold
Spring
Harbor
Laboratory
Press.
Cold
Spring
Harbor,
New
York,U.S.A.
Ausubel, F. M.; Brent, R.; Kingston, R. E.; Moore, D. D.; Seidman, J. G.; Smith, J. A.;
Struhl, K. 1999. Polymerase Chain Reaction. ln: Current Protocols in Molecular
Biology.
ALBRIGHT L. M.; COEN D. M.; VARKI A. John Wiley & Sons, Inc. United States of
America. pp. 740.
15
Facultad de Ciencias Químicas
PRÁCTICA Nº 1.3
EXTRACCIÓN DE ADN CROMOSOMICO VEGETAL
Objetivo general
Extraer ADN genómico partiendo de una muestra de origen vegetal.
Objetivo general
Adquirir conocimientos de extracción y purificación de ADN.
Comprender las diferencias existentes en el proceso de aislamiento de ADN dependiendo del
material biológico de partida.
Desarrollar la capacidad de trabajo en grupo, aplicando normas de bioseguridad y de forma
Procedimiento
Obtención de Harina de soja
1. Triturar de la semilla se soja
2. Lavar el molino de cuchillas profundamente con agua y detergente.
3. Enjuagar bien con agua para eliminar los restos de detergente
4. Volver a enjuagar esta vez con agua tridestilada varias veces
5. Pasar por todas las superficies del molino etanol al 70% con la ayuda de papel
absorbente. Dejar secar.
Manual de Laboratorio
Bioquímica
6. Exponer el molino a luz ultravioleta por 15 min.
7. Proceder al molinado utilizando 10 gr de la semilla hasta obtener harina de soja.
8. Se tamiza para obtener un polvo bien fino.
Extraccion de ADN
1. Poner en un tubo de 1.5 ml el equivalente a 100 mg. De harina muy fina
(aproximadamente 70 ul)
2. Agregar 700 ul de Buffer de extracción (BE)
a. 50 mM Tris Cl (pH 8)
b. 10 mM EDTA (pH 8)
c. 100 mM NaCl
d. 10 mM mercaptoetanol
e. 1% SDS
3. Incubar 10 min a 65 / 70 °C. Agitar ocasionalmente.
4. Agregar 200 μl de Acetato de Potasio 5M, agitar brevemente e incubar en hielo 20 min.
5. Centrifugar 20 min a 12.000 rpm a 4° C.
6. Tomar 500 μl del sobrenadante y transferir a otro tubo de 1,5 ml rotulado
7. Precipitar el ADN con un volumen de isopropanol, incubar 10 min en hielo
8. Centrifugar 10 – 20 min a 12.000 rpm a temperatura ambiente.
9. Lavar con etanol al 70% (380 μl) y volver a centrifugar (dar un spin)
10. Descartar el sobrenadante. Retirar con pipeta las últimas gotas
11. Repetir el paso 9 y 10
12. Secar el pellet bajo lámpara y resuspenderlo en 50 μl de H2O bidestilada.
Preparación del Buffer de Extracción
1) Tris- Base: Tris (hidroximetil)aminometano.
PM: 121,14, ver PM en la etiqueta del envase
Solución Stock de Tris Cl: 50 ml de Tris-Cl 100 mM
Utilizar agitadores si es necesario: La cantidad necesaria de Tris se disuelven en 35ml de
agua, ajustar el pH con HCl concentrado (se usa aproximadamente entre 1 a 3 ml), una vez
ajustado llevar a 50 ml con agua.
Por dilución calcular el volumen que será necesario para obtener la concentración final
del buffer de extracción.
3) NaCl 100 mM
4) Mercaptoetanol: Se agrega ultimo al Buffer de extraccion, se calculan
cuantos ml se necesitan (tener en cuenta % del reactivo)y se agrega directamente al
buffer de extraccion. Posee un desagrable olor por lo que se realizara el agregado en
otro laboratorio
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Facultad de Ciencias Químicas
Resultados
Se obtendrá ADN genómico vegetal que se almacenara hasta la práctica de electroforesis
para observar la calidad del material obtenido.
Referencias bibliográfica
Sambrook,
J.,
Rusell,
D.W.
(2001).
Molecular
cloning:
a
laboratory
manual.
3aEd
Cold
Spring
Harbor
Laboratory
Press.
Cold
Spring
Harbor,
New
York,U.S.A.
Ausubel, F. M.; Brent, R.; Kingston, R. E.; Moore, D. D.; Seidman, J. G.; Smith, J. A.;
Struhl, K. 1999. Polymerase Chain Reaction. ln: Current Protocols in Molecular
Biology.
Dellaporta, S. L.; Wood J.; Hicks, J. B. 1983. A plan DNA minipreparation: version II.
Plant. Mol. Biol. Reporter. 1:19-21.
Manual de Laboratorio
Bioquímica
PRÁCTICA Nº 2
CUANTIFICACION DE ADN
Objetivo general
Cuantificar el ADN obtenido en las practicas anteriores, utilizando espectrofotometría
UV
Objetivo específico
Cuantificar la cantidad de ADN de las muestras.
Medir el grado de pureza de las mismas por métodos indirectos.
Desarrollar la capacidad de trabajo en grupo, aplicando normas de bioseguridad y de forma
Cuantificación de ADN
Materiales y Reactivos
Solución de ADN extraído en las practicas anteriores
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Facultad de Ciencias Químicas
50mM Tris HCl pH 8
10mM Tris HCl pH 7.5
EDTA
SDS
NaCl
β-mercaptoetanal
Acetato de potasio
Isopropanol
agua bidestilada.
Procedimiento
1. Agregue 15 μl de cada muestra a 735 μl de TE, mezcle bien y lea la DO260 y la DO280 para
determinar la pureza.
2. Después de la cuantificación con UV, diluya la muestra a 0.3 μg/ μl (u otra concentración) con
TE y almacene a 4 ˚C. La muestra se mantendrá utilizable hasta seis meses. Si desea conservarla
más tiempo, manténgala en congelación.
Concentración de ADN (μg/ μl) = DO260 x factor de dilución x 50 μg/ml.1000
3. Es preciso determinar la relación DO260/DO280 para evaluar la pureza de la muestra. Si esa
relación es de 1.8-2.0, es probable que la absorción sea causada por los ácidos nucleicos. Una
relación inferior a 1.8 indica que pueden existir proteínas y/u otros elementos absorbentes de UV
en la muestra; en ese caso, es conveniente volver a precipitar el ADN. Una relación superior a 2.0
indica que las muestras pueden estar contaminadas con cloroformo o fenol y se debe volver a
efectuar la precipitación con etanol.
Resultados
Se obtendrá la cantidad de ADN aisladas de las distintas muestras, que se almacenara hasta
la práctica de electroforesis para observar la calidad del material obtenido.
Referencias bibliográficas
Ausubel, F. M.; Brent, R.; Kingston, R. E.; Moore, D. D.; Seidman, J. G.; Smith, J. A.;
Struhl, K. 1999. Polymerase Chain Reaction. ln: Current Protocols in Molecular
Biology.
CIMMYT. 2006. Protocolos de laboratorio: Laboratorio de Genética Molecular Aplicada del
CIMMYT. Tercera edición. México, D.F.: CIMMYT.
Manual de Laboratorio
Bioquímica
PRÁCTICA Nº 3
ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA
Objetivo general
Caracterizar los ácidos nucleícos usando electroforesis en geles de agarosa, de manera a
validar la utilización del mismo en distintas técnicas.
Objetivos específicos
Realizar un gel de agarosa para visualización de ADN genomico.
Preparar correctamente las soluciones tampón a ser utilizadas en la electroforesis.
Conocer los factores a tener en cuenta en la elección de la concentración de agarosa a ser
utilizada en el experimento.
Desarrollar la capacidad de trabajo en grupo, aplicando normas de bioseguridad de forma
ordenada.
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Facultad de Ciencias Químicas
• En el caso de los SSR utilizados en estudios de mapeo, buscar polimorfismos en líneas
progenitoras en geles de agarosa y volver a correr en poliacrilamida sólo los SSR con diferencias tan
pequeñas o de intensidad tan baja que no se observan claramente en los geles de agarosa.
Electroforesis en gel de agarosa
Hay que considerar estos factores al decidir el tipo y tamaño de geles de agarosa que se deben
utilizar:
• La concentración de agarosa, dependiendo del tamaño de los productos amplificados(cuando se
realiza PCR); generalmente se utiliza 1.5% para fragmentos más grandes (200 a 3500 pb), como los STS,
y 4% para fragmentos más chicos (menos de 400 pb), como los SSR.
• La distancia de migración y la proporción de agarosa de buena calidad a una de calidad
normal son factores que influyen en la resolución de las diferencias en los tamaños de los productos
amplificados. A mayor distancia, mejor resolución
• Se utiliza amortiguador 1X TBE (para preparar el gel y correrlo), en vez de 1X TAE, para
lograr una mejor resolución. Este amortiguador puede volverse a utilizar una o dos veces sin problema ya
que el tiempo de corrida suele ser breve. Otra opción que se puede ensayar en vez de volver a usar el
amortiguador es utilizar 0.5X TBE.
Control de la calidad del ADN
Este paso es esencial para verificar que el ADN aislado es de alto peso molecular. El ADN original
debe emigrar como una banda apretada de peso molecular ≥40 kb. No obstante, es inevitable la
degradación de una parte del ADN aislado y el protocolo presentado a continuación está diseñado para
correr el ADN en condiciones óptimas con el fin de asegurar las cantidades relativas de ADN degradado
y de ADN de alto peso molecular. El procedimiento también permite verificar la cuantificación con UV
antes señalada.
Procedimiento
Preparación de reactivos
Agarosa 0,8%: disolver la cantidad necesaria de agarosa en buffer TAE 1X en el volumen
necesario para el soporte del gel. Calentar en un Baño Maria evitando que la solución
hierva.
Buffer de Electroforesis TAE: Prepare a 10x stock solución en 1 litro de H20: 48,4 g de
Tris base 11,4 ml de acido acético glacial, 20 ml of 0.5 M EDTA (pH 8.0). La solución de
trabajo 1x contiene 40 mM Tris-acetato/1 mM EDTA.
Bromuro de etidio: colocar 20μL de bromuro de etidio en 400mL de TAE 1X. Guardar la
solución en un frasco
Loading Buffer 10X: Bromophenol blue: 0.125g, xylene cyanol: 0.125g, 500mM EDTA
pH 8.0: 0.1ml, Glycerol: 15 ml, milliQ-dH2O: hasta 50ml
Protocolo de preparacion.
Manual de Laboratorio
Bioquímica
1. Preparación de la Cámara Electroforética: Colocar la base del gel sobre la cámara
electroforética, y delimitar con cinta de papel los límites del gel, y luego el peine que
marcara los pozos.
2. Vertir la agarosa cuando este lista, y dejar solidificar. Una vez solido, se agrega un poco
de Buffer de Corrida TAE 1X, y se retira el peine. Lo siguiente será colocar los
electrodos, ayudándose de cinta de papel para sujetarlos.
3. Preparación de las Muestras: Los acidos nucleicos a estudiar se mezclan en una
proporcion 1:10 con el Buffer de Muestra sobre un trozo de parafilm, y cada muestra se
siembra en uno de los pozos del gel.
4. Corrida Electroforetica: Se conectan los electrodos a la Fuente de Poder, y se deja correr
a 60 – 80 voltios durante 1½ - 3 horas, o hasta que el azul de bromofenol haya migrado
2/3 de la longitud del gel.
5. Tincion del Gel de Agarosa: Trasladar el gel a un recipiente que contenga Bromuro de
Etidio (concentracion final 0.5 ug/mL). Agitar por 5 minutos. Luego, enjuagar primero
con agua corriente y después con agua destilada.
6. Visualizacion y Fotografia: El gel teñido se coloca sobre el Trans-Iluminador UV y se
observan teniendo en cuenta el usar lentes de protección. La vista se toma en cuarto
oscuro con una cámara.
Realizar el mismo experimento pero con una agarosa al 2%.
Resultados
Se obtendrá una banda de ADN genómico para cada muestra, en caso de estar integra. Si
aparecen manchas difusas comentar y justificar esos resultados.
Referencia bibliográfica
CIMMYT. 2006. Protocolos de laboratorio: Laboratorio de Genética Molecular Aplicada del
CIMMYT. Tercera edición. México, D.F.: CIMMYT.
23
Facultad de Ciencias Químicas
PRÁCTICA N° 4
REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA
Objetivo general
Amplificar un fragmento de ADN de interés median la reacción en cadena de la
polimerasa.
Objetivos específicos
Seleccionar los cebadores para realizar la amplificación.
Comprender los pasos que incluye la reacción en cadena de la polimerasa.
Comprender la utilidad de la técnica en distintos campos de la ciencia tanto en investigación
y diagnóstico
Colaborar activamente en las actividades grupales.
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Bioquímica
Procedimiento
1. A un tubo nuevo de microcentrífuga de 0.2 mL agregar :
Reactivo Volumen (uL)
Agua 18 MOhm 33.5
PCR Buffer 10X 5.0
MgCl2 25mM 3.0
DNT P mix 2.5 mM 4.0
Primer INTGF 10 mM 1.0
Primer INTER 10 mM 1.0
Mezclar y centrifugar
DNA molde 25 ng/mL 2.0
Taq DNA Polymerase 5 U/mL 0.5
Volumen Final 50mL
2. Cubrir con aceite mineral si el termociclador lo requiere.
Concentraciones Finales.
T r is-HCl , 20 mM pH 8.4 (a 22°C)
KCl, 50 mM
MgCl2, 1.5 mM
Primer s, 200 mM cada uno.
dNT Ps, 200 mM de cada uno.
AmpliTaq DNA Polymerase, 2.5U
3. Realizar el siguiente ciclaje:
Denaturación Inicial 94°C 5´
Denaturación 94°C 45”
Hibr idación 40°C 30”
Extensión 72°C 2´
Extensión Final 72°C 10´
4. Analizar 10 mL de la reacción mediante una electroforesis en gel de agarosa al 2%, o
almacenar la reacción a -20°C hasta su uso.
25
Facultad de Ciencias Químicas
Los primer a ser utilizados son
Gen pirmers Secuencia Temp de annealing Producto
del par amplificado
Endo Soja GM03 GCC CTC TAC TCC ACC CCC ATC C 60º C 118 PB
GM04 GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTG TG
Ciclado
95º C 94º C
10’ 30”+…”
72º C 72º C
1’+…” 3’
50º C
30”+…”
4º C
El promotor 35 S del CaMV (Cauliflower Mosaic Virus) y el terminador NOS del gen Nopalin
Sintetasa de Agrobacterium tumefasciens, son elementos regulatorios de la expresión de los
genes introducidos y se han utilizado en la mayoría de las plantas transgénicas que están siendo
comercializadas.
El gen CP4 EPSPS codifica para la enzima 5-enolpiruvilsikimato-3-fosfato sintasa. El principal
mecanismo de acción del glifosato, es la inhibición competitiva de la EPSPS. Esta enzima forma
parte de la ruta del ácido sikímico implicado en la producción de aminoácidos aromáticos y otros
componentes aromáticos en plantas (Steinrucken y Amrhein, 1990). Cuando las plantas
tradicionales son tratadas con glifosato, no pueden producir los aminoácidos aromáticos
necesarios para su supervivencia.
Las variedades de soja “40-3-2” desarrolladas mediante la tecnología del ADN recombinante,
expresan la proteína CP4 EPSPS, la cual se obtuvo de una bacteria común del suelo. La proteína
CP4 EPSPS es, de forma natural, mucho menos sensible a la inhibición por el glifosato y de este
modo, las plantas que expresan esta proteína son tolerantes al herbicida glifosato.
Manual de Laboratorio
Bioquímica
Por esta razón la amplificación de una de las secuencias (P35S o nos) o de las dos se utilizan
para la detección de OGM en la mayoría de los casos. Una amplificación positiva de cualquiera
de estas secuencias es una fuerte evidencia de la presencia de material OGM. Ante un resultado
positivo siempre debe considerarse la posibilidad de contaminación de la muestra con el CaMV
o con Agrobacterium tumefasciens.
Los primer a ser utilizados son
pirmers Secuencia Temp de annealing Producto
del par amplificado
P35S-U GCT CCT ACA AAT GCC ATC A 54º C 195
P35S-L GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA
Ciclado
95º C 94º C
10’ 20”+…”
72º C 72º C
40”+…” 3’
50º C
40”+…”
4º C
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Facultad de Ciencias Químicas
Técnica de PCR manual
1. El primer punto a tener en cuenta es el problema de la contaminación. Para ello se toma
las siguentes medidas.
a. Limpieza constante de los equipos.
b. Esterilización de materiales a utilizar
c. Tener cuartos de trabajo separado
2. Reconstituir los primers liofilizados. Para ello utilizamos un buffer TE que contiene
a. 10 mM de Tris-Cl, pH:8
b. 1 mM de EDTA
3. Esterilizar todos los elementos a utilizar. Puntas, eppendorf, Pipetas.
4. Preparación del master mix. Normalmente la mezcla de los reactivos se realiza en un
tubo eppendorf y de allí se alícuota la cantidad estipulada a otros tubos para realizar ya la
reacción.
5. Alícuotar el master mix en cada tubo de reacción y etiquetarlo con un pincel indeleble.
Mantener siempre en hielo.
6. Agregar la muestra de DNA (2.0 ul - 200 ng/uL), mantener en hielo hasta que se inicie la
PCR
Preparación del MASTER MIX.
Seguir el orden de cargado!:
Manual de Laboratorio
Bioquímica
Referencias bibliográfica
Robyt, John y White, Bemard (1990). "Biochernical Techniques- Theory and Practice
".Waveland Press, INC. USA.
Frank Stephenson. (2003). Calculation for Molecular Biology and Biotechnology.
Elesevier. USA.
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Facultad de Ciencias Químicas
ANEXOS
Anexo 1: Verificación de la calibración de pipetas automáticas
Para que la cuantificación de proteínas, ácidos nucleídos o cualquier analito sea adecuada se requiere la
habilidad de medirlo de manera exacta y reproducible. El transferir volúmenes pequeños de líquidos es
crítico para obtener resultados confiables es por ello que en los laboratorios de ciencias para medir
volúmenes pequeños, se utiliza un dispositivo conocido como micropipeta (Fig 1). Las micropipetas
tienes diferentes capacidades de medida, 0.1-1 μL, 0.5-10 μL, 10-100μL, 20-200 μL, 100-1000 μL, 1000-
5000 μL. .
Figura 1: Micropipeta. Se muestran las diferentes partes de la pipeta así como puntas de diferente tamaño
para la medición de diferentes volúmenes.
Objetivos
Conocer las partes y el funcionamiento de las micropipetas.
Adquirirá destreza en la utilización de pipetas para la medición de volúmenes pequeños
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Bioquímica
Materiales
1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por grupo
Agua desionizada
Balanza analítica con límite de 0,0001 g
Tapas de cajas de petri de plástico
Puntas de diferentes capacidades (10, 200 y 1000 μL)
Procedimientos
Importante: Para el uso adecuado de la micropipeta asegúrese que está usando la micropipeta correcta
para el volumen que necesita medir. También, asegúrese que la micropipeta está realmente lista para el
volumen que necesita revisando la “ventana de volumen”. Si es necesario, cambiar el volumen mediante
el “dispositivo” del control o mando del volumen hasta que la micropipeta corrija el volumen (la
micropipeta no lee su mente; varias personas usarán las pipetas, no siempre se encontrará como usted la
necesita).
NO trate de colocar la micropipeta para volúmenes mayores que el máximo, o para volúmenes menores
del cero, esto descalibrará y dañará la micropipeta.
1) Partes de la micropipeta
a) Identificar las partes de la micropipeta ayudándose de la imagen en la Figura 1.
b) Observar las diferencias entre la micropipeta a usar y la mostrada en la Figura
2) Llenado de la pipeta
a) Colocar una punta según corresponda.
b) Colocar el pulgar sobre el mando o émbolo de pipeteado.
c) Oprimir el émbolo hasta el primer un punto de resistencia “alto” o "tope". Si continúa
presionando encontrará un punto donde el émbolo ya no se mueve hacia abajo, este corresponde al
segundo punto de resistencia “alto” o "tope".
d) Oprimir el émbolo hasta el primer tope y colocar la punta dentro del líquido hasta una
profundidad menor a 1 mm. De una manera lenta y controlada, disminuya la presión del émbolo para
permitir que se desplace hacia arriba. No suelte el émbolo abruptamente, al permitirlo causará que el
líquido pueda salpicar dentro de la punta produciendo volúmenes inexactos y generando contaminación
de la pipeta. Una vez el émbolo se haya desplazado hasta arriba mantenga la micropipeta en el líquido
durante un segundo, esto evita que se aspire aire en la parte final.
3) Expulsión de la muestra
a) Llevar la micropipeta al tubo de polipropileno de 1.5 mL.
b) Se apoya la punta en la pared inferior del tubo.
c) Oprimir el émbolo hasta el primer tope y luego hasta el segundo tope. Haga este procedimiento a
una velocidad moderada, hacerlo muy rápido hará que queden gotas de muestra en la punta. Si observa
cuidadosamente, entonces notará que al oprimir hasta el segundo alto se expele todo el líquido de la
punta.
d) Lo anterior es cierto para la mayoría de soluciones acuosas, excepto para las soluciones
de alta viscosidad como el Glicerol. Si es usada inadecuadamente, la micropipeta transferirá
volúmenes inexactos.
4) Calibración de Micropipeta
La micropipeta puede perder su calibración. Comprobar la calibración de la pipeta es un
procedimiento simple que puede ahorrar tiempo considerable, energía, y reactivos. En esta
práctica aprenderá a usar la micropipeta de tamaños diversos medir su exactitud, precisión y
calibración.
Para cada micropipeta revisar el porcentaje de exactitud (E%) y el coeficiente de variación
(CV%) en todo el rango usando al menos dos volúmenes diferentes; por ejemplo: Para la
micropipeta P1000 revisar los volúmenes de 300 μL y 1000 μL. Para P200 revisar los volúmenes
de 60 y 200 μL. Para P10 revisar 3 y 10 μL.
a) Seleccionar la micropipeta y las puntas adecuadas.
b) Colocar la tapa de la caja de petri en la balanza y tarar a cero.
c) Tomar el volumen de agua destilada con la micropipeta y dispénselo en la tapa de la
caja de petri. Registre el peso del agua añadido. La densidad del agua es 1 g/mL a 25ºC, por lo
31
Facultad de Ciencias Químicas
tanto un volumen de 1 mL corresponde aproximadamente a una masa de 1 g, 300 μL a 0.3 g, 200
μL a 0.2 g, 60 μL a 0.06 g, 10 μL a 0.01 g y 3 μL a 0.003 g.
d) Repita el procedimiento cinco veces para cada volumen.
e) Repetir todo el procedimiento para glicerol. La densidad del glicerol es de 1,2656 g/mL
a 25 ° C.
f) Calcular la masa esperada para cada volumen
5) Cálculo de la exactitud (E%) y del coeficiente de variación (CV%)
Valor medio
X = Σ Xi /n
Donde Xi= pesadas, n= numero de pesadas
Volumen medio
V=X.Z donde X= valor medio y Z= factor z (1/densidad)
Valore del control a 21,5 ° C (Z = 1,0032)
Exactitud E (%)= ((V-Vnominal)/Vnominal) *100
Los valores de exactitud aceptados deben ser proveídos por los fabricantes.
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Bioquímica
Anexo 2
Normograma para la determinación de la Fuerza Centrifuga
Relativa
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Anexo 3
Como convertir textos de Word a PDF
Normalmente los informes son hechos en formato doc. Esto es utilizando el programa de Microsoft
Word.
Los pasos para convertir el archivo a pdf depende de las versiones utilizadas de programa Word
Si utilizas Microsoft Word 2003
Aunque Word 2003 o versiones anteriores no proporcionan una forma directa de guardar documentos
en el formato pdf, muchos programas ofrecen la capacidad de convertir documentos de Word en
archivos PDF y viceversa.
El programa recomendado se denomina “CutePDF Writer” es un software gratuito que se puede
descargar de internet (http://cutepdf-writer.softonic.com/). CutePDF Writer (antes CutePDF Printer),
se instala como una impresora virtual
Una vez instalado el programa seguimos los siguientes pasos para convertir el documento a pdf:
1. Abrir el informe en formato Word (.doc) que ya has escrito
2. Ir al menú Archivo seleccionar el menú de impresión y una vez allí seleccionar de la lista
desplegable CutePDF como impresora.
Manual de Laboratorio
Bioquímica
Figura 2
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