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GRAM:
Fundamento:
• Fijar al calor, pasando el preparado 3 o 4 veces dentro de la llama del mechero bunsen.
• Cubrir el portaobjeto con cristal violeta durante 1 min. y lavar con agua corriente. Eliminar el
exceso de agua.
• Cubrir el portaobjeto con solución de lugol durante 1 a 2 min. y lavar con agua corriente.
Eliminar el exceso de agua.
• Sostener el porta-objetos entre el dedo pulgar e índice y decolorar con alcohol-acetona. (10 seg.)
La decoloración es el paso más crítico del procedimiento de esta técnica. la tendencia a
sobredecolorar hace que bacterias Gram positivas aparezcan Gram negativas.
• Cubrir el frotis con solución de fucsina o safranina durante 30 – 60 seg. Lavar con agua corriente.
Reactivos:
- Solución 1: sol. madre de cristal violeta. Disolver 10 grs. de colorante en 100ml de alcohol 95%.
Guardar en botella de vidrio durante un año.
- Solución de trabajo: filtrar 10 ml de la solución madre y agregar 40 ml de solución recién
filtrada de oxalato de sodio al 1% o de H2O dest.
- Lugol: Disolver 25 gr de Iodo cristalino + 50 g IK + 500 ml H2O dest. Guardar botella color
caramelo.
- Decolorante: Partes iguales de etanol 95% y acetona. Guardar frasco color caramelo a TA
(temperatura ambiente).
- Contracolorante:
a) Safranina: tomar 20 ml de solución de safranina al 2,5 % en etanol 95% y agregar 180 ml de
H2O dest.
b) Fucsina básica: disolver 0,1 o o,2 g de fucsina básica en 100 ml de H2O dest. Guardar en
botella oscura durante un año.
GRAM WEIGERT
• Lavar con agua y añadir cristal violeta recién filtrado. Dejar 3 min.
• Lavar con agua, secar cuidadosamente con papel, tanto la parte superior como la inferior del
porta-objetos y dejar secar al aire.
• Decolorar con anilina- xileno hasta que no desprenda más color púrpura ( el extendido debe
quedar color rosado ).
Los quistes de P. Carinii y hongos se tiñen de azul oscuro e irregularmnete. Los núcleos celulares
pueden teñirse de azul si no están bien decolorados, pero no son tan oscuros como los quistes de P.
Carinii.
Reactivos:
ZIEHL NEELSEN
Reactivos:
- Fucsina:
a) Disolver 3g de fucsina en 10 ml al 95%
b) Disolver 5g de fenol cristalizado en 100 ml .
c) Mezclar 10 ml de soluc. A con 90 ml de soluc. B y guardar a temp. ambiente durante
3 meses.
- Alcohol ácido: 3ml de HCL + 97 ml de “ ol “ al 95%.
- Azul de metileno: 0,3g de azul de metileno + 100 ml agua dest.
TINTA CHINA
• Mezclar una gota de LCR con una gota de tinta china (Pelikan) o nigrosina, sobre un
portaobjetos. Si la tinta china está muy concentrada diluir con agua destilada.
• Permite observar con claridad microorganismos rodeados de cápsula ( por ej. C. Neoformans ).
KINYOUN
• Cubrir con carbolfucsina durante 5 min. + calor hasta vapores blancos una vez.
Reactivos
FARINGITIS:
Streptococcus pyogenes 15 – 30 %
BACTERIAS
Streptococcus Grupo C y G 5 – 10 %
DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO
1) Método de referencia:
2) Toma de muestra:
Tratamiento previo del paciente por lo tanto los pacientes pretratados con ATB adecuados para
faringitis estreptocococica no deberían ser cultivados, pues esto no tendría costo / efectividad positiva
Se coloca la cabeza del paciente en hiperextensión y se iluminan las fauces en forma
conveniente.
Con hisopo estéril se frotan ambas amígdalas (o ambos pilares en pacientes amigdalectomisados).
Si existiera exudado visible se debería tratar de tocarlo con la punta del hisopo. Se debe evitar el
contacto del hisopo con el paladar y la lengua, por ello se debe utilizar un baja lengua (los
microorganismos presentes en la saliva, lengua o paladar puede ejercer inhibición competitiva en los
medios de cultivos ).
El hisopo se coloca en un tubo de cultivo seco o con gotas de solución fisiológica o en medio
de transporte (Stuart, Cary Blair, etc.) y se lo conserva a temperatura ambiente.
3) Medios de cultivo:
4) Siembra:
• Se utiliza una placa entera de agar sangre (aunque si la siembra se efectúa con cuidado, es posible
emplear solo media placa)
• Se frota el hisopo en una superficie en 1/8 de placa cercana al borde y con el ansa se disemina por
todo la placa con 3 o 4 estrías cruzadas.
• Luego se hunde el ansa en el agar efectuando 2 o 3 estrías oblicuas. (Para resaltar la hemólisis de
las capas de S. Pyogenes de estreptolisinas “O” lábil al oxigeno. La estreptolisina “S” es estable
frente al oxigeno pero no todas las capas la producen).
Esquema de Siembra:
H ISOPO
ESTRIAS
ANSA
5) Condiciones de incubación:
- Atmósfera normal y Tº no mayor de 37º C. Debe prolongarse hasta las 48 hs, si a las 24 hs las
placas no muestran la presencia de colonias de Estreptococos Beta Hemolíticos.
A) CARACTERISTICAS CULTURALES
Colonias típicas:
Colonias atípicas: Circulares de bordes enteros. El
- Puntuales: generalmente no son grupo “A”, tamaño de la zona de hemólisis es
sino grupo “ milleri “, que aglutinan con de 2 a 4 veces el diámetro de la
antisuero para grupo A. colonia.
- Variantes nutricionales
- Colonias con defecto en la producción de hemólisis
(son muy raras las grupo A no hemolíticas).
B) IDENTIFICACION DE S. PYOGENES
A S. pyogenes S + -
S. grupo milleri R(s) - +
B S. agalactiae R - +
a) Con las colonias B-hemolíticas aisladas del cultivo primario se efectúan estrías superpuestas en
tres sentidos cubriendo una superficie de ¼ placa y en el centro se coloca el disco de Bacitracina ó
se sacan dos colonias Beta hemolíticas y se estrían cada una en sentido opuesto y se coloca en el
medio el disco de Bac (b).
Esquema:
b) a)
Bac 0.04 U
Luego de 18 – 24 hs. de incubación se observa la formación o no de un halo de inhibición
alrededor del disco.
Resultados:
ul de SF ( suspensión densa )
• Identificación de Estreptococos C y G
Se deben distinguir entre Estreptococos de los grupos C y G de colonia grande de otros que
presentan colonias puntuales con halos de hemólisis 5 o más veces mayor que su diámetro que
son Estreptococos grupo “ milleri “ que forman parte de los Estreptococos grupo “ viridans “ los
cuales no producen faringitis, a diferencia de los grupo C y G de colonias grandes que si son
patógenos primarios de faringitis y además pueden también producir glomerulonefritis post–
faringea y aumentar los títulos de anticuerpos antiestreptolisina “ O “.
S. equi ss equi - -
S. equi ss zooepidémicus - +
• Sensibilidad a los ATB en S.pyogenes
- Ha aumentado el % a tetraciclinas
- Por ello para el caso de Ex. de fauces se recomienda una única prueba de sensibilidad por
difusión en medio sólido con discos de eritromicina y clindamicina separados 2.5 cm para apreciar el
antagonismo que genera cuando la resistencia a eritromicina es del tipo MLs inducible.
Lavado Broncoalveolar
B.A.L.
Se utiliza en casos de Neumonía en pacientes ventilados.
Volumen de muestra:
( 1º tubo ) ( 2º tubo )
Catéteres
1) TECNICA SEMICUANTITATIVA DE MAKI
Desventajas:
- Solo evalúa los microorganismos adheridos a la parte externa del catéter.
- Es difícil rotar un catéter si es curvo.
- La contaminación de la piel afecta mucho.
2) TECNICAS CUANTITATIVAS
a) CLERI:
• Lavar 3 veces con aguja y jeringa el interior del catéter sumergido en caldo ( 2-10ml )
• Hacer diluciones y sembrar un volumen determinado en Agar sangre
b) LIÑARES:
• Es una modificación de Cleri. Se lava la parte interna del catéter sin sumergirlo en el
caldo o SF y luego se procesa según Maki.
c) BRUN- BUISSON:
CONSERVACION DE CATETERES
- Lo ideal es procesarlo de inmediato.
RECOMENDACIONES FINALES
- No descartar como contaminantes recuentos de 100 – 1000 UFC/ml en Brun Buisson. Consultar
con médico. Ver hemocultivo
- Es convenientes sembrar las dos diluciones: 1/1000 ( B ) para cuantificar la mayoría de las
infecciones y 50 ul del agitado sin diluir ( A ) para poder detectar recuentos entre 100 – 1000
UFC/ml.
- Lo ideal es hacer las 2 técnicas. Si no se puede ( por costo u otra causa ) hacer Maky y guardar el
catéter en SF.
ESQUEMA TENTATIVO
1) Hacer Maki
2) Introducir el mismo catéter en solución fisiológica y hacer Brun-Buisson.
A)
• 1ml SF estéril
• agitar en vortex 1 min.
50 ul de A)
10 ul de B)
1000 ul X
1 ml X
Hemocultivo
Preparación de la piel:
- Alcohol 70%
- Yodo 2%
- Solamente alcohol 70%
- El tapón del frasco no debe limpiarse con yodo, solo con alcohol
Volumen de muestra:
- Adultos 20- 30 ml (nunca menos de 10 ml)
- Niños 1-5 ml
- Neonatos 1-2 ml
El volumen de sangre tiene mayor importancia que otros parámetros lo más práctico es 10 ml por
tubo. Relación sangre-medio: 1/5 a 1/10
Momento de la extracción:
Lo más rápido posible en el curso de un episodio febril, antes de cualquier tratamiento con
antibióticos.
Cantidad de muestras:
Por lo menos 2 muestras de 10 ml c/u cada 20 a 30 min.
- Ventilar uno de ellos para apresurar el desarrollo de Pseudomonas spp. y Cándida spp.
- Incubar los frascos hasta 7 días a 35-37 ºC observándolos diariamente (En este período se
recuperan mas del 95 % de las bacterias significativas).
ESQUEMA TENTATIVO
Hemocultivo
Observación Microscópica
(+) ( -- )
( -- ) (+) (+) ( -- )
AGAR SANGRE y
EMB o CLDE
Anaerobios Subcultivo
Medios p/fastidiosos terminal
Mayor incubación 7º día
Tipificación
y
Antibiograma *
Si se observan :
Cocos GRAM positivos en racimos: OXA, TEICO, CIPRO ,RIFAM, TMS, GENTA
Cocos GRAM positivos en cadenas: AMN, AMS, VANCO, GENTA, ESTREPTO de alta carga,
OXA, CLINDA, Bc y Op.
Bacilos GRAM negativos: CFX, CAZ, AMK, GEN, CIP, IMP, TAZO.
- 8% SCN en contaminaciones
- 60% son resistentes a OXA
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Diagnóstico Micológico
En micología la observación directa del hongo en el material tiene valor diagnóstico por si sola
debida al carácter de patógeno primario del microorganismo: éste es el caso de los dermatofitos.
Cuando desarrolla en cultivo un hongo saprófito o comensal, es necesario determinar su importancia
clínica en base a las características del paciente. De esto surge la importancia de la observación de la
lesión por parte del micólogo y de la buena toma de muestra para llegar a un buen resultado.
Las micosis superficiales se pueden dividir en dos grandes grupos: las queratomicosis o infecciones
cutáneas producidas por especies que utilizan la queratina y las pilonodosis causadas por especies
que crecen formando concreciones ( granos o nódulos ) sobre los pelos. Según los autores americanos
se dividen en: superficiales, donde es invadida la superficie externa de la piel y no hay respuesta
celular del huésped y las cutáneas, que involucran los tejidos queratinizados del cuerpo ( capa externa
de la piel, pelos uy uñas
La calidad del diagnóstico de las micosis depende de las calidad y cantidad del material recogido del
paciente, de las condiciones de envío, conservación, transporte y procesamiento y de la pericia del
micólogo.
Las muestras deben ser representativas, abundantes, libres de contaminantes exógenos o endógenos,
y de sustancias que inhiban o alteren la viabilidad de los hongos.
Para asegurar la calidad de la muestra no hay nada mejor que la toma de muestra la realice el
micólogo, la inocule en los medios de cultivo, y la procese para la observación microscópica.
Es conveniente recoger los espécimen en recipientes estériles irrompibles y tamaño adecuado y
conservarlas a temperatura ambiente.
• Indicaciones previas al paciente:
- Suspender la medicación antifúngica interna y/o externa durante un lapso no inferior a las 72
horas antes de efectuar la toma de muestra; de igual modo se suspende el uso de pomadas, talcos,
tinturas u otras sustancias que enmascaren la presencia, inhiban o alteren la viabilidad de los hongos.
- Lavar la superficie afectada con agua y jabón blanco no perfumado tres veces por día durante tres
días previos a la toma de muestra.
- Las uñas deben higienizarse además con un cepillo blando y no deben estar pintadas.
- En el momento de la toma de muestra se desinfecta con alcohol 70º utilizando una gasa estéril. Si
se sospecha una infección por levaduras desinfectar con solución fisiológica ya que estas pueden se
susceptibles a la acción del alcohol.
- Materiales:
a) cinta adhesiva transparente
b) bisturí
c) pinza de depilar
d) placa de Petri estéril
e) porta-objetos
f) diferentes tipos de ansa
g) agar Saboureaud
h) agar Lacrimel
i) agar DTM
Siempre es necesario tener tubos con medios de cultivo en lugar de la toma de muestra ya que a
veces el material es escaso y en esos casos se recomienda realizar directamente la inoculación a
los medios de cultivo.
b) Raspado: se utiliza para todas las lesiones descamativas de la piel glabra ( sin pelo) en
especial aquellas de gran tamaño. Para obtener el material se raspa el borde activo de la lesión
con bisturí estéril . Cuando la lesión afecta los pliegues interdigitales el material se toma del
borde de las lesiones, junto a la piel sana de los dedos o de la planta del pie, evitando las áreas
maceradas; si la lesión afecta las uñas se raspa la cara profunda de la superficie afectada,
próxima a la región sana de la uñas y el lecho subungueal ( se elidirán las zonas friables, de color
anormal o hiperqueratósicas) Se debe recoger abundante cantidad de material.
c) Depilación: se utiliza en las lesiones de cuero cabelludo y otras áreas pilosas, y para recoger
el vello de la piel cuando el folículo está inflamado (tinea corporis). La muestra se toma con
pinza depilatoria estéril aplicada perpendicularmente a la superficie de la piel y siguiendo el
sentido del pelo. Se deben extraer 20 pelos enfermos y las escamas circulantes.
EXAMEN MICOLOGICO
- Colocar una porción del material entre porta-objetos y cubreobjetos con KOH ( 10 – 40 % ) ó
KOH en partes iguales con tinta Parker azul permanente ( sin hervir ) ó después de dejar durante toda
la noche ( en cámara húmeda ). También se puede utilizar agua glicerinada, lo que permite observar
los preparados hasta 72 hs sin que se alteren ni se sequen.
- Cuando e espécimen a examinar es una impronta tomada con cinta adhesiva por sospecha de
pitiriasis, se coloca entre el portaobjetos y la cinta una gota de azul de metileno 1 %, dejar 10 minutos
a temperatura ambiente
- Si se sospecha eritrasma, se deben digerir las escamas con KOH al 20 – 40 % durante toda la
noche, luego se lavan las escamas 4 – 5 veces con agua destilada . Fijar con suero, hacer coloración
de GRAM y Kinyoun. Se considera positiva cuando se observan filamentos finos y elementos
cocoides irregularmente teñidos Gram positivos ó parcialmente ácido alcohol resistentes con
Kinyoun.
• Cultivos.
De rutina:
• Identificación de cepas
- Dermatofitos: Los dermatofitos pueden ser identificados por sus formas características macro y
microscópicas y el auxilio de unas pocas pruebas complementarias
Recolección y Procesamiento de
Muestras Fecales
Todas las muestras de heces son una fuente potencial de infección por lo tanto deben ser
manipuladas cuidadosamente por el operador teniendo en cuenta todas las precauciones de
bioseguridad : guantes, gafas protectoras, contenedores para descartar el material; etc.
MUESTRA FRESCAS:
Deben ser remitidas inmediatamente en recipiente limpio y seco o en pañal; el examen directo debe
realizarse lo más pronto posible después de la defecación, las amebas y los flagelados resisten
varias horas si por algún motivo se demora en procesar las muestras se debe conservar las muestras
en refrigerador para retrasar el crecimiento de hongos y bloquear la evolución de los huevos de los
parásitos.
En heces líquidas se recomienda observar o preservar la muestra dentro de los 30 minutos luego de
la evacuación.
La recolección de heces frescas pueden ser realizadas con o sin previa administración de laxantes.
Las heces obtenidas con purgantes salinas SO4 Na2 o SO4 Hg.
La cantidad de Sulfato depende de la edad del enfermo y de su estado digestivo. El SO4 Na2 es
menos irritante y mas colagogo que el So 4 Hg. Se lo emplea a una dosis de 6 a 10 gr. para un
adulto. Se puede dar una dosis de 5 gr. la noche anterior y 10 gr. la mañana del examen.
Importante : si el paciente tiene diarrea los purgantes salinos NO deben ser admitidos.
En niños cuyo peso es menor de 14 Kg. Las purgas salinas NO deben ser tomadas.
EL beneficio de trabajar con heces purgados es que dentro del tracto intestinal los purgantes hacen
que las heces se transformen en liquidas esto induce la modulación de los parásitos, se puede
observar muchas mas formas trofozoíticas móviles de ameba en materias fecales hidratadas que en
heces sólidas. Otro beneficio de trabajar con heces purgadas es la facilidad con que pueden ser
procesadas para colorear y además favorecen la eliminación de segmentos de gusanos chatos como
Ascaris lumbricoides y Enterobius vermicularis adultos los que pueden ser detectados en el examen
microscópico.
CONSERVADORES DE HECES
1) Formolina: agua al 5% formolada para heces compactas, para conservar quistes de protozoos.
2) Agua formolada al 10% para heces pastosas para preservar huevos y larvas.
3) Agua formolada al 15% para heces liquidas y preferentemente para las que contengan A.
Lumbricoides para detener su evolución.
Ventajas:
Desventajas:
PAF:
Es un buen fijador que permite, observar detalles en la cromatina de los trofozoitos de amebas.
Las muestras recolectadas en PAF pueden ser observados agregando MIF con lo cual se ve mejor
los detalles nucleares.
COPROPARASITOLÓGICO SERIADO
En caso de diarrea crónica o sospecha de amebiasis se requiere una serie de 6 recolecciones en días
separados dentro de 14 a 20 días (permite detectar un 90% de infecciones por amebas.
Indicar al paciente que defeque sobre una superficie con cubierta plástica o papel parafinado libre
de orina o agua, de allí tomar una porción que debe colocar en un recipiente preferentemente de
plástico y de boca ancha y con una solución fijadora como PAF la que se conservara en un lugar
fresco ó a 40 C. EL volumen de heces deberá ser igual o inferior a la mitad del fijador que contenga
el frasco y la materia fecal se mezclara hasta obtener una emulsión homogénea.
IMPORTANTE
No colocar el recipiente que contenga heces sobre la orden de solicitud del examen.
No recolectar las heces provenientes de inodoros ó retretes ó que estén en contacto con
tierra ó agua sucia para evitar la contaminación ó helmitos libres.
Se recomienda una Dieta de 3 días antes de iniciar la recolección: ingerir carnes magras, pastas
dulces y papas.
Evitar : mantecas, frutas de hollejos, verduras de hoja y lugumbre. Tomar mucho liquido (agua).
Suspender las medicaciones que puedan interferir, los purgantes oleosos, antiparasitarios, sustancias
radiopacas ó compuestos que contengan carbón ó bario.
Método de Enriquecimiento:
Flotación
ESCOBILLADO ANAL
Recolección :
Tomar una muestra diaria durante 7 días consecutivos. Sin higiene previa por la mañana. El
paciente esta acostado boca abajo, se le separan las nalgas para dejar al descubierto la zona
anal. Se toma una gasa doble (5 x 5 cm) humedecido con agua de canilla y se tapa sobre el
ano y luego se coloca en un recipiente que contenga 30 ml de formolina; también se puede
poner en frasco seco , luego colocar la formolina en laboratorio.
IMPORTANTE
TEST DE GRAHAM
Se reemplaza la gasa por un trozo de cinta transparente de celofán adhesiva que luego de ser
aplicada sobre la superficie perianal se retira y se deposita la cinta sobre un porta objeto repitiendo
la misma operación durante 7 días en porta objetos diferentes.
NOTA: todas las muestras parasitológicas deben estar acompañadas de escobillado anal ó test de
Graham.
Exudados vaginales / uretrales
Toma de muestra:
muestra
Búsqueda de Neisseria gonorrhoeae.
En mujeres:
mujeres conducto cervical, y también uretra, vagina, recto y orofaringe.
En varones heterosexuales:
heterosexuales uretra.
En varones homosexuales:
homosexuales uretra, recto y orofaringe.
Uretra masculina:
masculina recoger directamente el pus con un hisopo de dacrón o
alginato de calcio o de algodón atóxicos. Si no hay flujo purulento visible,
exprimir la uretra de atrás a adelante para evacuar el exudado. Si no se obtiene
exudado, introducir un ansa o hisopo 2-3 cm por el meato y girar el hisopo
durante 5-10 segundos. El paciente concurrirá con un mínimo de 3 hs de
retención urinaria para evitar el arrastre mecánico de Neisseria gonorrhoeae.
gonorrhoeae
Cuello uterino:
uterino rotar el hisopo 5-10 segundos en el canal del endocérvix tratando
de exprimir los conductos glandulares que desembocan allí. Previa eliminación
del moco exocervical con una torunda o gasa estéril. Utilizar un espéculo sin
lubricantes humedecido en agua tibia.
Uretra femenina:
femenina hacer un masaje de la uretra comprimiéndola contra la sínfisis
del pubis y aplicar la misma técnica que en los hombres.
Vagina:
Vagina solo se utiliza en mujeres que han sufrido histerectomía, o en niñas
prepúberes, pues el epitelio vaginal es todavía cilíndrico y Neisseria
gonorrhoeae puede provocar la infección inicial (vulvovaginitis). En el caso de
las niñas, aprovechar el llanto o tos para recoger la gota de exudado que
aparecerá en orificio himeneal.
Orofaringe:
Orofaringe frotar con un hisopo la región de las criptas amigdalinas y la pared
posterior de la faringe.
recto:
recto Que el paciente concurra con el intestino evacuado. Tomar la muestra
introduciendo el hisopo 2-3 cm a través del ano y haciendo rotar 10 segundos
para extraer muestra de exudado de las criptas. Descartar si se produjera
contaminación fecal.
Coprocultivo
Infecciones gastrointestinales:
1) Introducción:
La gastroenteritis se define como una enfermedad caracterizada por náuseas, vómitos, cólicos
abdominales, diarrea y a veces fiebre.
Las diarreas agudas de origen infeccioso pueden ser de etiología bacteriana, viral y/o parasitaria
siendo las asociaciones de 20 o más agentes.
Los microorganismos considerados como agentes de diarrea se presentan en la sgte. tabla:
Bacterias Virus Parásitos
2) Patogenia:
Estómago pH ácido
Intestino Peristaltismo
Secreción de mucus
Producción de sustancias antibacterianas
(lactoferrinas, IgA secretora)
Competencia con la flora normal
3) Clasificación de las diarreas
Pueden producirse dos tipos de diarrea según el mecanismo fisiopatogénico del microorganismo:
SALMONELLA SPP
E.COLI EPEC
Actualmente este término s usado para definir cepas de E. coli que causan diarrea pero no
producen toxinas citotónicas ni tienen capacidad invasiva en el test de Sereny.
Los serogrupos asociados mas frecuentemente son: O55, O86, O111, O119, O125, O126, O127,
0128ab, O142. Con menos frecuencia: O18, O44, O112, O114.
E. coli O157 es el prototipo de un grupo de más de 150n serotipos de E. coli. Los serotipos de E.
coli productor de toxina Shiga (STEC ), asociados a enfermedades severas en el hombre
pertenecen a la categoría de E. coli enterohemorrágico ( EHEC ).
VIBRIO CHOLERAE
Existen más de 30 especies de Vibrio de las cuales solo 12 se han encontrado en muestras
clínicas. Entre las especies patógenas, las cepas de V. Cholerae que reaccionan con el antisuero
somático del grupo O1 se denominan V.cholerae O1, mientras que las especies que pertenecen a
otros serovares ( hasta el momento 155 )se denominan V. cholerae no O1.
El cólera epidémico es causado por V. cholerae O1
Vibrio cholerae
No O1 O1
( 155 serogrupos)
Biotipos
CLÁSICO EL TOR
Serotipos
NO TOXIGENICO TOXIGENICO
Recolección de la muestra:
En lactantes: es útil el hisopado rectal. Es aconsejable evitar la toma directa del pañal
salvo cuando la deposición es reciente.
Conservación:
Examen microscópico:
Cultivo:
Materia Fecal
Aislamiento Enriquecimiento
No Fermen. Fermen.
Materia fecal
(suspención)
(+)
Serología H7
No móvil o H7 (+)
Suspención de heces
Diagnostico presuntivo
Medio no selectivo Medio selectivo
TSA ó agar sangre de carnero Agar TCBS
Pruebas bioquímicas
Nota: Remitir para la determinación del biotipo, serotipo, antibiotipo y enterotoxina, al INEI.ANLIS
“ Dr.C.G. Malbrán”
Tratamiento:
ENTEROPATOGENO TRATAMIENTO
Urocultivo
• DATOS DE MUESTRA
- Tipo de muestra:
Chorro medio, al acecho ( lactantes ), punción suprapúbica, cateterización, punción sonda.
• CONSERVACION
• PROCESAMIENTO
1) Siembra:
A. CLDE
Se siembra con ansa en anillo calibrada ( 5 ul ), en media placa de CLDE en tres estrías.
En este medio desarrollan todas las Enterobacterias, Staphylococcus y Enterococcus.
Nota: En caso de muestra con sedimento patológico y sin desarrollo a las 24 hs, se debe
sembrara al otro día en As ( con estría de Staphylo ) o ACH en busca de bacterias
nutricionalmente exigentes. Por ello se deben guardar las muestras por 24 hs. después de ser
sembradas.
B.
EMB AS
Interpretación:
- Crecimiento en 1º estría:
Rto 103 UFC/ml
- Crecimento en 1º y 2º estría:
Rto 104 UFC/ml
- Crecimiento en 1º , 2º y 3º estría:
Rto > 105 UFC/ml
2) Exámen químico:
Se usan tiras reactivas. Los parámetros más importantes a tener en cuenta son:
PH
Proteinas
Densidad
Glucosa
Nitritos
3) Sedimento urinario:
Luego de colocar las tiras reactivas se centrifuga la muestra 10 min a 2000 rpm y se observa al
microscopio una gota del sedimento.
4) Coloración de GRAM
5) Condiciones de incubación
Atmósfera:
Temperatura:
35 +/- 2 ºC
Tiempo:
CLDE: 24 hs.
AS y ACH: 48 hs.
6) Interpretación e Informe:
- La mayoría de las infecciones urinarias son monomicrobianas ( flora única o > 90% de un gérmen
en una mezcla )
Interpretación e informe:
RECUENTO INFORME
Rto de colonias
5
> 10 UFC/ ml con o sin sedimento patológico Especie bacteriana
Antibiograma
Rto de colonias
104 – 105 UFC/ ml con sedimento patológico Especie bacteriana
Antibiograma
Estafilococos
METODO CONDICIONES
Disco Oxa 1 ug
MHA
Difusión 30 – 35 ºC
24 hs.
DISCOS ESPECIE R I S
VANCO >15
Si da menos de 14 hay que
testear con CIM
La resistencia a Oxa se liga a múltiple resistencia. Hay resistencias acompañantes. Esta usualmente
ligada a multi resistencia en: Tetraciclina, aminoglucósidos (preferiblemente Genta ),
Cloranfenicol, Eritromicina. Hay que probarlos ya que son marcadores fenotípicos en todos los
estafilococos
Método de Determinación de
Sensibilidad Antimicrobiana
1) Introducción:
Actualmente hay muchas metodologías de distintos grupos de expertos que más allá de diferir en la
técnica difieren de alguna manera en los puntos de corte.
En Argentina y en la mayoría de los países latinoamericanos se siguen las normas de NCCLS
( Comité Americano de Estandarización de Laboratorios Clínicos ) y nosotros nos guiaremos por
ellas.
El siguiente es un resumen de la Metodología referida como “Método de la OMS” muy similar al
conocido Kirby Bauer.
El principio del método involucra el uso de una cantidad constante de un antimicrobiano que está en
un disco de papel aplicado sobre la superficie del agar en el que está el microorganismo en cuestión.
Se forma así por difusión un gradiente de concentración del antimicrobiano y la sensibilidad está
dada por el tamaño de la zona de inhibición del crecimiento alrededor del disco.
Ese diámetro depende no solo del antibiótico (ATB) y del microorganismo sino también del:
• PH
• Temperatura
Como es una técnica “cualitativa” para que los resultados sean confiables los procedimientos
deberán ser controlados y estandarizados cuidadosamente y remitirse a las tablas de la NCCLS que
se actualizan anualmente.
- Frecuentemente están indicadas en caso de que por ejemplo la especie sea capaz de mostrar
resistencia a los AB usados comúnmente.
- También puede ser indicado con fines epidemiológicos de resistencia y en el estudio de nuevos
ATB.
- Se deben realizar a partir de una cepa aislada. solo en caso de EMERGENCIAS puede hacerse
desde materiales clínicos donde el GRAM sugiere naturaleza monomicrobiana. Luego debe
repetirse la metodología por el método estandarizado.
3) Selección de agentes antimicrobianos para pruebas de sensibilidad
- Se deberá remitir a la s tablas 1 y 1 A (pag...) que sugieren loa ATB a usar en el informe de
rutina al médico.
- El número de agentes a probar debe ser limitado e incluirá solo un representante de cada grupo
de drogas relacionadas.
- El grupo C tiene agentes ATB alternativos o suplementarios que deben ser testeados en caso de
mucha resistencia a varias drogas primarias, o pacientes alérgicos a drogas primarias.
- Existen suficientes datos que avalan la experiencia de las pruebas en este medio
• Volumen: El volumen será tal que pueda obtenerse una altura de 4 mm ( Aproximadamente
25-30 ml para placas de 100 mm )
• pH : Debe ser controlado cuando se prepara el medio. El agar debe tener un pH de 7.2 – 7.4
• Humedad: Si hay exceso de ella en la superficie deben secarse a 35 ºC entre 10 a 30 min. Las
placas deberán estar húmedas pero no mostrar gotas en su superficie.
• Suplementos: están indicados para ciertos microorganismos ( Ej. para St. pneumoniae se
agrega sangre de oveja al 5% )
• Conservación de los discos: deben mantenerse a 8 ºC o en freezer a -14 ºC. Los discos deben
guardarse en contenedores herméticos y sacarse de la heladera 1 o 2 hs. antes de su uso a
fin de lograr equilibrio entre Tº antes de ser abiertos los frascos.
• Inóculo:
- Patrón de turbidez: para estandarizar la densidad del inóculo se usa una suspensión de sulfato
de bario como estándar de turbidez ( 0.5 de Mc Farland ). El estándar se guarda la abrigo de la
luz y se debe agitar antes de su uso.
- Preparación del inóculo: A partir de 4-5 colonias aisladas y de igual morfología preparar una
suspención en 4 – 5 ml de un caldo apropiado (tripteina soja, MHB o SF ) y puede procesarse de
dos maneras:
b) Método directo: el inóculo se realiza directamente ajustando al 0.5 sin inoculación previa .
Este método es de elección para microorganismos fastidiosos, por ej. Haemophilus spp ,
Streptococcus spp y Neisseria gonorrhoeae o Sthaphylococcus potencialmente meticilino
resistente.
Dentro de los 15 min. de ajustado el inóculo se hisopean las placas en 3 direcciones para
asegurar una completa distribución del inóculo.
Las zonas de inhibición serán uniformemente circulares y el desarrollo confluente o casi
confluente.
No usar inóculos no estandarizados para el hisopeado de las placas. Los extremos en la densidad
producen grandes cambios .
• Incubación:
Incubar las placas invertidas a 35 ºC dentro de los 15 min. posteriores a que los discos fueron
aplicados y sin atmósfera de CO2 con excepción de Streptococcus spp , Neisseria gonorrhoeae
y Haemophilus spp.
El tiempo de incubación es de 16 – 18 hs a menos que se trate de una cepa de Sthaphylococcus
spp y Enterococcus spp que para los discos de Oxa y Vanco se necesitan 24 hs completas.
Se debe leer el área que no muestra desarrollo obvio a ojo desnudo no incluyendo velo de
crecimiento o colonias muy pequeñas cerca del borde de crecimiento. Colonias más grandes
dentro de la zona deben ser subcultivadas, reidentificadas y reensayadas. Los tamaños deben
interpretarse con tablas correspondientes 2 A – 2B – 2C – 2D – 2E – 2F – 2G – 2H – 2I . Los
microorganismos se informarán Sensibles, Intermedios o Resistentes frente al ATB ensayado.
Lisina
Descaboxilasa + (98) + (99) - (0) - (0)
Ornitina
Descarboxilasa + (98) + (99) D (20) + (99)
( + ):positivo; ( - ) Negativo
D: diferentes reacciones
( ):% de positividad